Динамiка змiни показникiв імунно-нейроендокринного комплексу людини під впливом рунної психографії

48

Размещено на http://allbest.ru

ЗМІСТ

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

ВСТУП

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1 Психографiя як спосіб впливу на психоемоційний стан людини

1.2 Рунна писемнiсть як основа рунної психографії

1.3 Нейрофiзiологiчнi механiзми cтресу: нервова вісь

1.4 Нейрофiзiологiчнi механiзми cтресу: нейроендокринна вісь

1.5 Система реакції гіпоталамо-гіпофізарно-кортікоідої системи

1.6 Клітинний механізм дії кортизолу

1.7 Вегетативні типи реагування на стимул

1.8 Додатковi показники сироватки крові, що вивчаються у дослідженні

2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА МАТЕРІАЛИ

2.1 Об'єкт та постановка експерименту

2.1.1 Рунні символи які були використані в експерименті

2.2 Метод виявлення гормону кортизолу у сироватці крові

2.3 Метод виявлення циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові

2.4 Метод виявлення пептидів середньої молекулярної маси у сироватці крові

2.5 Методи математичної статистики

2.6 Охорона праці в галузі

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

КРГ -- кортикотропiн-релізинг гормон або кортіколіберін

АКТГ -- адренокортикотропін

цАМФ -- циклічний аденозинмонофосфат

ДНК -- дезоксирибонуклеїнова кислота

РНК -- рибонуклеїнова кислота

ШКТ -- шлунково-кишковий тракт

ЦНС -- центральна нервова система

ВНС -- вегетативна нервова система

ТМБ -- 3,3',5,5'-тетраметилбензидин-дигідрохлорид

ПСМН -- пептиди середньої молекулярної маси

ТХО -- трихлороцтова кислота

ІФА -- імуноферментний аналіз

ЦІК -- циркулюючі імунні комплекси

ПЕГ -- поліетиленгліколь

ЕІ -- ендогенна інтоксикація

СМП -- середньомолекулярні пептиди

МСМ -- молекули середньої маси

ПК -- персональний комп'ютер

ДСН -- державні санітарні норми



ВСТУП

Актуальнiсть. Сучасна людина все менше взаємодіє з природними біологічними стресорами, які вимагають негайних дій, і все більше відчуває тиск психологічних факгорiв, обумовлених цивілізацією, на які вона не може реагувати звичайними способами, властивими її природі. Тим не менш, стрес сучасної людини, будучи психосоціальним по сутi, реалізується через цілком певні біологічні механізми, що зачіпають незмінну біологічну сутність людини. XXI столiття характеризується досягненням нового рівня знань в області біомедичних наук, в цілому, і успіхами досліджень нейроендокрінологіі стресу, зокрема. На тлі різноманітності моделей, визначень і підходів до розумiння стресу з'являються можливості глибше зрозуміти складні взаємозв'язки соціальних, психологічних та біологічних факторiв. Індивідуум як носій генів і як особистiсть, з властивою їй психологією, в силу взаємодії генів і середовища в широкому сенсі слова за посередництва поведінкових реакцій, в процесі розвитку формує в кінцевому підсумку вразливість або стійкість, хворобу або здоров'я. Особлива увага в науці сьогодні приділяється маркерам стресу і способам нівелювання стресових реакцій. У роботі ми вивчали роль гормону стресу кортизолу, циркулюючих імунних комплексів і пептидів середньої молекулярної маси, також досліджували динаміку зміни цих біохімічних показників під впливом методу рунної психографії.

Мета дослідження: визначити рівень гормону кортизолу, циркулюючих імунних комплексів і пептидів середньої молекулярної маси за умов пливу рунної психографії.

Завдання: рунний психографія кортизол нейроендокринний

Аналіз сучасної літератури з теми «психографія» та розкриття сутності рунної психографії, аналіз теоретичних підходів до природи стресу.

Дослідити вплив рунної психографії на рівень гормону кортизолу у сироватці крові людини за методом імуноферментного аналізу.

Дослідити вплив рунної психографії на рівень циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові людини за методом Ю.А. Гриневич.

Дослідити вплив рунної психографії на рівень молекул середньої маси у сироватці крові людини за методом Н.І. Габріелян.

Об'єкт дослідження: гуморальний імунітет та рівень гормонів при відповіді на подрезнення.

Предмет: динамiка змiни показникiв імунно-нейроендокринного комплексу людини під впливом рунної психографії.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в дослідженні впливу графічних архаїчних символів на показники імуннонейроендокринного комплексу людини в контексті психогенного стресу.

Методи дослідження:

метод іммуноферментного аналізу для виявлення кількості кортизолу у сироватці крові;

метод спетрофотометрії для виявлення циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові;

метод спетрофотометрії для виявлення концентрації пептидів середньої молекулярної маси;

методи математичної статистики.

Практичне значення отриманих результатів: отриманні результати сприятимуть індивідуалізації рекомендацій із застосуванням графічних рунних символів з оздоровчою метою.



РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1 Психографiя як спосіб впливу на психоемоційний стан людини

Психографія - психодіагностичний метод дослідження особистості шляхом реєстрації її енергії і енергоінформаціі. Психограмма - запис енергії і енергоііформаціі протягом якогось проміжку часу. Метод психографії - новий напрямок у вивченні людини, де ми можемо вивчати особистість у створеному підсвідомим мисленням образі на її ж власному рівні: це дослідження енергоінформаційних повідомлень, що відносяться до людини, до живого і неживого світу в образах писемності психічної енергії. Психограмму ще можна назвати писемністю психіки, вона розкриває, пояснює, вивчає інформацію психічних процесів, які не виражаються в словах, досліджує причини захворювань і проблем, характеризує людину за якістю з енергетичної точки зору, визначає джерело і рівень негативних енергій в організмі. Спосіб впливу на цю негативну енергію - зміна лінії псіхограми, її образного змісту, створення позитивних образів розвитку процесу. Дослідження реалізується перенесенням психічної енергії людини на матеріал писемності, перетворенням її в механічну енергію в рухах руки міокінетічним способом. В отриманій психограмі інформація про об'єкт зображується у вигляді закодованої і зашифрованої графіки. За рахунок образного мислення та уяви і за допомогою творчої енергії психограмма читається і розшифровується. Порівнюючи інформацію, отриману шляхом психоаналізу та діагностики з інформацією від клієнта, ми визначаємо навіть ті елементи, які йому не відомі, але мають відношення до нього. Результатом роботи в метаморфозі є переведення енергетичних взаємодій людини в більш тонкі вібрації шляхом звільнення від нечистих впливів і негативної інформаційної енергії, перебудови і очищення фізичного тіла роботою свідомості [38,143].

«Підсвідомість кожної людини геніальна: вона пам'ятає і знає все, що сталося з організмом (коли з'явилися чужерідні вібрації, ким накладені, в якій формі, на якому часовому відрізку життя, які органи, фізіологічні структури, тканини, клітини пошкоджені тощо). Підкоряючись загальному закону виживання, універсальному для всіх живих істот у Всесвіті, підсвідомість на запит свідомості видасть інформацію, яка вас цікавить. Крім того, з усіх варіантів зцілення, наявних у розпорядженні в свідомості, підсвідомість видасть найоптимальніший і ефективний метод зцілення. Треба тільки навчитися свідомо зв'язуватися з підсвідомістю і витягувати звідти необхідну інформацію. Це і є система діагностики і зцілення, закладена в природі людини» [22, 54]. В цьому сенсі на підставі методу психографії ми отримуємо можливість побачити особистість по образам, створеним високою свідомістю у вивченні психологічного суб'екта. Отже, суть методу психографії полягає в наступному: відновлюючи гармонію в графічному «записі» психіки, створюючи нормальний дизайн ліній і штрихів, ми здійснюємо енергетичний вплив на психіку людини і організм в цілому.

1.2 Рунна писемнiсть як основа рунної психографії

Рунна психографiя - це спосіб впливу на психоемоційний, як наслідок і фізичний стан людини за допомогою рунних символів.

Руни - писемність давніх германців, вживалася з I-II по XII століття на території сучасної Данії, Швеції і Норвегії, у X-XIII столітті в Ісландії та Гренландії, а у шведській провінції Даларна аж до XIX століття [5, 79].

Руни (англ. Runes) являють собою графічні знаки, складені у найдавнішій асоціативній знаковій системі, що містить у собі символічні значення, які далеко виходять за рамки уявлень матеріалістичної теорії інформації. Цей символічний лад являє собою відображення культури, вірувань і світогляду древніх скандинавів, німецьких і британських народів. Це магічна система, чітко вивірена і має як сакральний зміст, так і конкретні прикладні застосування [5, 82].

Рунний «алфавіт», який був утворений німецькими і скандинавськими народами, називається Футарк. Футарк - не просто алфавіт, це рунний лад або ряд, тобто чітко закріплений перелік рун, з їх фонетичними і метафізичними значеннями та іменами. Назва послідовності рун виникла в результаті виявлення фонетичного відповідності перших шести букв старшого рунічного алфавіту: f, u, ю, a, r, k. Ця система містить 24 знака, розбитих на три групи - Атта (att); кожен атт складається із восьми рун [5, 89].

Кожна руна складається з трьох елементів:

Звуку (пісні).

Одне з найбільш ймовірних першоджерел значень рун - «Рунічні поеми»: «Ісландська рунічна поема», «Норвезька рунопіснь» і «Англосаксонська рунічна поема». Особливої уваги заслуговують Старша Едда і Молодша Едда. Руни та рунічні комбінації, що вважалися заклинаннями, неодноразово згадуються в даному скандинавському епосі.

Знака (форми).

Форма рунічного знака - це просторове або зриме якість руни. Геометрична форма є першоелементом, найбільш елементарним проявом архетипу. Утворюючи значний шар універсальних знаків і символів, геометричні форми, виступаючі вже як символічні коди зовнішнього світу, впливають на структури психіки, моделюючи тим самим нову смислову реальність [3, 126].

Василь Павлович Гоч, засновник Школи Причинності, вказує на наступне: «Геометрична символіка рун являє собою прості геометричні форми (фігури, символи), які є джерелом інформації джерелом сил, здатними вводити внутрішній світ людини в резонанс з собою. Руни є резонаторами, які як камертон налаштовують організм людини, як єдиний з Всесвіту, на відповідний лад і звучання».

Прихованого закону.

Кожен рунічний знак несе в собі таємничий закон Всесвіту, неповторну частинку буття.

Кожна руна є сховищем прихованого потенціалу природи і містить енергії, які, будучи вивільненими, можуть виробляти реальні зміни в нашому матеріальному світі. Руни відбивають у собі структурно-функціональний аспект архетипів, тому багато науковців ототожнюють ці символи з специфічними прототипами, введеними вперше психологом К. Юнгом, як частина колективно-несвідомого. Для повсякденного сприйняття поняття архетипу тотожне поняттю інстинкту в біології. Кожна руна-це згортка архетипу, що має власний внутрішній зміст (батьківщина, мати, відьма, і т.д.). Але варто нам активувати цей узагальнений образ і він, розвертаючись в багатовимірному просторі, відновлює свою структуру. У згорнутому стані вона являє собою безструктурну "частку" - символ, це образ, що має багатовимірну структуру, яка повністю відповідає його первозданному вигляду [14, 23].

1.3 Нейрофiзiологiчнi механiзми cтресу: нервова вiсь

Будь-який стимул, до того, як він зможе викликати стресову реакцію, повинен якимось чином зіткнутися з організмом. Першими його сприймають сенсорні рецептори периферичної нервової системи. Отриманий сигнал не несе ніякої інформації про важливість подразника. Далі цей сигнал по сенсорним шляхам передається в головний мозок, де і відбуватиметься вся його обробка. Спочатку по розгалуженій системі мереж нервових колатералей інформація надходить в ретикулярну формацію, яка оцінює ступінь важливості сигналу. Несуттєвий сигнал в більш складні структури мозку допущений не буде, а так і залишиться на несвідомому рівні. На цьому рівні може проявлятися так звана «емоційна реакція внутрішніх органів» [20, 33].

Якщо ж інформація важлива, або надзвичайно небезпечна, то вона набуває емоційне забарвлення і направляється в гіпоталамус і лімбічне коло, а потім і в неокортекс. Розпочата на цьому рівні когнітивна інтерпретація стимулу завершується знову в лімбічному колi. Якщо ця неокортикально-лімбічна інтерпретація оцінює вплив як загрозливий або неприємний, то слідом за цим настає емоційне збудження. Якщо стресор є не зовнішнім, а являє собою внутрішню психічну діяльність самого організму (спогади, фантазія), відповідно, стимул мине фазу периферичного сенсорного сприйняття. Таким чином, як зазначалося Сельє, людина реагує не на сам стимул, а на його когнітивну інтерпретацію або емоційне збудження [28, 59].

Першими основними шляхами активації стресової реакції є симпатичний і парасимпатичний відділи автономної нервової системи, тому що їх вплив здійснюється через швидкодіючі нервові механізми. Сигнал, що пройшов неокортикально-лімбічну інтерпретацію і оцінений як загрозливий, передається або в задні відділи гіпоталамуса (при симпатичнiй активації), або в передні відділи (при парасимпатичнiй активації). Далі нервовий імпульс по симпатичних нервових шляхах спускається через грудний і поперековий відділи спинного мозку, через ланцюжок симпатичних гангліїв у відповідні внутрішні органи, де відбувається соматична реакція. По парасимпатичних нервових щляхах він спускається через черепний і крижовий відділи спинного мозку до кінцевих органiв. Зміна активності внутрішніх органів відбувається під впливом медіатора норадреналіну в симпатичних нервових закінченнях. У парасимпатичних його замінює нейротрансміттер ацетилхолін. Симпатична активація являє собою загальне збудження внутрішнього органу, «ерготропну» реакцію по Нессу [20, 35]. Активація через парасимпатичну систему викликає гальмування, уповільнення або нормалізацію (після надмірного збудження) функціонування органу, «трофотропну» реакцію [20, 39]. У людини симпатична реакція збудження при стресі виникає частіше, але при сильному ступені емоційного і вегетативного реагування вона змінюється парасимпатичним гальмуванням, що повертає внутрішні органи до їх нормального функціонування.Однак стресова реакція на рівні нервових осей носить короткочасний і негайний характер. Це пояснюється тим, що організм не може тривалий час виробляти потрібні гормони у великій кількості. Тому для збільшення часу протікання стресовій активації організм задіє другу психофізіологічну вісь стресу, що отримала назву «вісь битви-втечі».

1.4 Нейрофiзiологiчнi механiзми cтресу: нейроендокринна вicь

Центральним органом реакції «битви-втечі» є мозковий шар наднирникiв, що визначає нейрогенний (за участю автономної нервової системи), і ендокринний (через гормональну регуляцію) характер. Ця реакція може бути викликана безліччю психологічних або психосоціальних подразників. Вона мобілізує ресурси організму, готує м'язи до активних дій, дозволяючи індивіду або боротися із загрозою, або від неї втекти [36, 123]. Нервовий імпульс виникає в дорсомедіальнiй частинi мигдалеподібного тіла, потім йде до латеральної і задньої областям гіпоталамуса. Далі нервові імпульси спускаються через грудний відділ спинного мозку, сходячись в чревнiй ганглії, в мозковий відділ надниркових залоз, де відбувається його іннервація. Під дією нервової іннервації в систему кровообігу виділяються адреналін і норадреналін, які посилюють генералізовану активність організму, призводять до порушення, тобто їх дія тотожня симпатичнiй іннервації, тільки гормональна регуляція здійснюється повільніше нервової, але зберігає свою дієвість в десятки разів довше. Дія цих катехоламінів на соматичному рівні призводить до таких змін, як підйом артеріального тиску, підвищення рівня вільних жирних кислот в плазмі, збільшення серцевого викиду, зниження кровотоку до нирок, підвищення рівня холестерину в плазмі. Ці зміни сприяють кращій адаптації організму до нових умовфункціонування. Однак нейроендокринна вісь викликає не найтривалішу стресову реакцію. Більш тривала фаза забезпечується активацією ендокринної вісі [25, 16].

1.5 Система реакції гіпоталамо-гіпофізарно-кортікоідої системи

В рамках останнього механізму особлива роль належить гіпоталамо-гіпофізарно-кортікоідній осі, особливо коли мова йде про довготривалі (хронічні) негативні сигнали соціального середовища. Центральною ланкою цього механізму є гiпоталамічна зона мозку - головний регулятор метаболічних процесів, насичений скупченнями нейросекреторних клітин. Як частина лімбічної системи, гіпоталамус тісно взаємодіє з префронтальною корою мозку, лімбічною системою, центрами обробки сенсорної інформації та стовбуровими структурами, тим самим беручи участь в інтеграції емоційних реакцій, сфери прийняття рішень і нейро-ендокринній регуляції обміну речовин і різних видів поведінки. Нейрони гіпоталамуса не тільки мають великі вхідні та вихідні зв'язки в межах мозкових структур, вони також є колектором інформації про всі внутрішні процеси в організмі через рецептори до гормонів, метаболітів та інших фізіологічно активних молекул [19, 27].

Під впливом зовнішніх негативних стимулів (стресових сигналів) або внутрішніх переживань (емоційних реакцій, пов'язаних, наприклад, з фрустрацією чи очікуванням неприємного події), опосередкованих вищезазначеними мозковими структурами, включається механізм міжклітинних взаємодій, який охоплює нервову, ендокринну та імунну системи і відбивається на стані всіх органів і тканин [10, 98].

Ключовим внутрішньоклітинним сигналом при цьому є активація нейронів паравентрикулярного ядра гіпоталамуса, які продукують поліпептид, відомий як кортикотропiн-релізинг гормон або кортіколіберін. КРГ - це поліпептид, що складається з 41 амінокислоти. Він секретується в первинному капілярному сплетінні гіпофізарної портальної системи в серединному підвищенні гіпоталамусу і потім переноситься в аденогіпофіз.

Останнім часом стало ясно, що кортіколіберін служить не тільки для трансляції сигналу від гіпоталамуса до гіпофіза, але і є центральним медіатором, який утворюється в різних відділах мозку і бере участь у багатьох нейрональних процесах, впливаючи на поведінку і настрій [29,101]. КРГ через міжклітинний простір мігрує в передній гіпофіз, де клітинами-меланотрофами стимулює продукцію проопіомеланокортину - великого поліпептиду, що є попередником цілого ряду регуляторів: АКТГ, ендорфіну, ліпотропіну і меланотрофінів. Безпосередньо в нервовій тканині його продуктами є АКТГ і ендорфін. Певну роль у регуляції викиду АКТГ також відіграють гормони задньої долі гіпофіза - оксітоцин і аргінін вазопресин, особливо при хронічному стресі.

АКТГ був виділений в чистому вигляді з передньої долі гіпофіза. Це великий поліпептид, що складається з 39 амінокислотних залишків. Цей гормон, також названий кортикотропіном або адренокортикотропіном, регулює викид кортизолу, також може стимулювати і секрецію адреналових андрогенів.Передня частка гіпофіза при відсутності КРГ продукує мізерно малу кількість АКТГ. Навпаки, більшість факторів, що підвищують швидкість продукції АКТГ, ініціюють допомогою сигналу з базальних відділів мозку, включаючи гіпоталамус, і потім передають його за допомогою КРГ аденогіпофізу. АКТГ спонукає адренокортікальні клітини продукувати стероїди завдяки збільшенню циклічного аденозинмонофосфату. Головним впливом АКТГ щодо адренокортікальних клітин є активація аденілатциклази в мембрани клітин. Це призводить до утворення цАМФ в цитоплазмі, що досягає свого максимуму протягом 3 хв. цАМФ в підсумку активує внутрішньоклітинні ферменти, що і призводить до наступного утворення адренокортікальних гормонів [34, 56].

Найбільш важливим етапом у стимуляції АКТГ у процесі синтезу адренокортікальних гормонів є активація ферменту протеїнкінази А, що приводить до початкового перетворенню холестеролу в прегненолон. Цей початок перетворення є лімітуючим етапом у синтезі всіх видів адренокортікальному гормонів, чим і пояснюється необхідність присутності АКТГ для синтезу всіх стероїдних гормонів пучкової і сітчастої зон. Довготривала стимуляція кори надниркових залоз за допомогою АКТГ не тільки активує секреторні процеси, а й призводить до гіпертрофії і проліферації клітин кори надниркових залоз, головним чином пучкової і сітчастої зон, які продукують кортизол і андрогени.

Вiдомий гальмовий вплив кортизолу на гіпоталамус і аденогіпофіз, який веде до зниження продукції АКТГ. Кортизол безпосередньо шляхом негативного зворотного зв'язку діє на: гіпоталамус, знижуючи утворення КРГ; передню частку гіпофіза, знижуючи утворення АКТГ. Обидві зворотні зв'язки опосередковані концентрацією кортизолу в плазмі, тому якщо концентрація кортизолу стає занадто великою, зворотній зв'язок автоматично знижує продукцію АКТГ для забезпечення нормального рівня кортизолу в плазмі крові.Тим самим формується кілька контурів негативного зворотного зв'язку, який забезпечує «утримування в рамках» всієї цієї системи, не дозволяючи їй занадто сильно реагувати на різні стимули. Це принципово важливо, оскільки ГГКО, з одного боку, зобов'язана реагувати на подразники, як зовнішні (травма, біль, конфліктна ситуація, несправедливість), так і внутрішні (переживання негативних емоцій, фрустрація або очікування неприємної події), а з іншого - повинна в ідеалі залишатися в межах фізіологічних інтервалів своїх основних регуляторів. Основним патологічним проявом є зрив механізмів зворотного зв'язку, порушення биоритмики і стабільно високий рівень гормонів стресу. Однак при деяких станах (важкий хронічний стрес, на фоні розвиненого посттравматичного синдрому або важкої депресії) можлива й інша ситуація - гіпокортікозолізм, тобто стабільно низький рівень кортизолу. Мабуть, це обумовлено гіперактивністю механізму зворотного зв'язку за рахунок підвищеної чутливості центральних рецепторів до кортизолу [58].

Постійні аперіодичні короткочасні стресові дії стимулюють всю систему ГГКО і, завдяки успішному подоланню виникаючих ситуацій, створюють відчуття самодостатності та успішності, формуючи тим самим важливе почуття задоволеності і благополуччя - ключовий компонент відчуття здоров'я. Інакше розгортаються події, якщо стрес дуже сильний і нестерпний, або якщо він стає хронічним. Такий стрес пов'язаний з численними порушеннями психічного та фізичного здоров'я, які опосередковані несприятливими впливами кортизолу і кортіколіберіна [24].

1.6 Клітинний механізм дії кортизолу

Кортизол, як і інші стероїдні гормони, здійснює свій вплив насамперед шляхом взаємодії з внутрішньоклітинними рецепторами клітин-мішеней. Внаслідок того, що кортизол розчинний у ліпідах, він легко дифундує через мембрану. Опинившись у клітці, кортизол зв'язується з білком-рецептором в цитоплазмі, потім гормон-рецепторний комплекс взаємодіє зі специфічним регулятором зчитування послідовності ДНК, названим глюкокортікоїдним фрагментом реагування. Інші білки клітини, названі факторами транскрипції, також необхідні для відповідної взаємодії гормон-рецепторного комплексу і фрагмента реагування глюкокортикоидного гормону в ДНК.

Глюкокортикоїди стимулюють або гальмують транскрипцію багатьох генів, змінюючи синтез мРНК для білків, чим і опосередковується різноманіття їх фізіологічних ефектів. У силу цього метаболічні впливу кортизолу реалізуються не миттєво, а вимагають 45-60 хв для синтезу білка і кілька годин або днів для свого повного розвитку. Справедливо припущення, що глюкокортикоїди, особливо у високій концентрації, можуть діяти не тільки на рівні генома, але й швидко втручатися в процеси іонного транспорту на рівні мембран, чим пояснюється швидкий терапевтичний ефект глюкокортикоїдів.

Істотним впливом кортизолу на метаболізм білка є зменшення вмісту білків практично у всіх клітинах організму, крім клітин печінки. Це викликано як зниженням синтезу білків, так і повсюдно зрослим рівнем їх катаболізму. Обидва ефекти можуть бути пояснені зниженням транспорту амінокислот у клітці, виключаючи клітини печінки. Можливо, це не головна причина, тому кортизол знижує також продукцію РНК і подальший синтез білків, особливо в м'язовій і лімфоїдної тканинах.

На фоні великого надлишку кортизолу м'язи стають настільки слабкими, що хворий навіть не може встати. Імунні функції лімфоїдної тканини різко падають, складаючи незначну частку вихідних можливостей.

Кортизол збільшує кількість білка в плазмі крою печінки. Поряд з повсюдним зниженням білків в організмі кортизол збільшує вміст білка в печінці. Більше того, зростає рівень білків плазми крові (продукуються печінкою і вивільняються в кров). Це збільшення є єдиним винятком на тлі загального виснаження резервів білка в органи. Припускають, що ця різниця пояснюється можливим впливом кортизолу на надходження амінокислот в гепатоцити (але не в інші клітини організму) і збільшенням кількості ферментів, необхідних для процесів синтезу.

Підвищення концентрації кортизолу є небезпечним для організму, тому спочатку його надлишкові кількості зв'язуються з білками сироватки крові. Якщо концентрація кортизолу продовжує зростати, частина його починає циркулювати в крові у вільному вигляді і з'являється в сечі. Вільний кортизол легко проникає через плазматичні мембрани і бар'єри і зв'язується зі специфічним рецепторним бiлком, який представлений у всіх видах тканин і клітин, включаючи нервову тканину. Комплекс кортизолу з рецепторним білком є транскрипційним фактором, він бере участь в активації цілого ряду генів, стимулюючи утворення нових білків-ферментів, биорегуляторов і модуляторів різних систем організму, включаючи імунну систему. У підсумку відбуваються значні метаболічні перебудови в різних тканинах, особливо в м'язах, жировій тканині, кістках і в печінці [31, 28].

Кортизол підсилює глюконеогенез, підвищує рівень глюкози в крові і знижує інтенсивність її утилізації тканинами, протидіючи тим самим інсуліну. Цей ефект головним чином забезпечується двома впливами кортизолу.

1. Кортизол збільшує кількість ферментів, необхідних для перетворення амінокислот в глюкозу в клітинах печінки. Це є результатом активації глюкокортикоїдами процесів транскрипції ДНК, подібно до того, як альдостерон активує їх у тубулярних клітинах нирок, з подальшим утворенням мРНК, провідним до збільшення спектру ензимів, необхідних для глюконеогенезу.

2. Кортизол здатний мобілізувати амінокислоти з позапечінкових тканин, головним чином з м'язів. В результаті зростає кількість готівки амінокислот, які можуть надходити в печінку і служити сировиною для утворення глюкози.

Одним із проявів збільшеного глюконеогенезу є збільшення запасів глікогену в клітинах печінки. Цей вплив кортизолу дозволяє гліколітичні гормонам, таким як адреналін, мобілізовувати глюкозу в міру необхідності, наприклад в проміжках між прийомами їжі.

Одночасно кортизол посилює ліполіз і протеоліз, збільшуючи вільний пул амінокислот і жирних кислот, а також пригнічує здатність імунних клітин реагувати на різні хімічні сигнали, послаблюючи запальну реакцію. Мобілізація жирних кислот. Мобілізацію жирних кислот з жирової тканини кортизол здійснює подібним чином, як і мобілізацію амінокислот з м'язів. Збільшення концентрації вільних жирних кислот в плазмі підвищує їх використання для енергетичних цілей. Можливо, що кортизол надає прямий вплив на окислення жирних кислот в клітинах. Механізм мобілізації жирних кислот кортізолом не цілком зрозумілий. Якась частина ефектів опосередкована зниженням надходження глюкози в жирові клітини. Вже говорилося, що а-гліцерофосфат (один з дериватів глюкози) необхідний для вступу та збереження тригліцеридів у клітинах, і його відсутність в адипоцитах веде до вивільнення жирних кислот. Збільшення мобілізації жирів кортізолом поряд зі збільшенням окислення жирних кислот в клітинах забезпечує зрушення метаболічних систем в клітці в бік використання жирних кислот замість глюкози як джерела енергії при голодуванні та інших стресах. Цей механізм вимагає для свого формування кілька годин. Він не є таким швидким і настільки ж потужним, як ефект схожого зсуву, викликаного зниженням інсуліну. Тим не менш, збільшення використання жирних кислот в якості джерела енергії є важливим моментом у здійсненні довгострокових процесів перетворення глюкози і глікогену.

Кортизол в довгостроковій перспективі також знижує рівень колагену в шкірі, порушує обмін речовин у м'язах і особливо в кістковій тканині, підсилюючи остеопороз. В цілому хронічне підвищення рівня кортизолу загрожує діабетом, ослабленням міцності кісток і передчасним старінням. Систематичні стреси призводять також до перенапруження катехоламінових механізмів, а оскільки кортизол посилює ефекти адреналіну і норадреналіну, формується стійкий гіпертонус судин. Все це закономірним чином приводить організм до того чи іншого хронічного захворювання, що вражає серцево-судинну систему, ниркову тканину, печінку, м'язи або кістковий скелет. Іншими словами хронічний або важкий ушкоджує стрес поступово руйнує фізичне здоров'я, роблячи вплив, мабуть, і на ймовірність виникнення злоякісних пухлин [28, 79].

1.7 Вегетативні типи реагування на стимул

Вища нервова діяльність іннервує внутрішні органи, гладкі м'язи, залози, кровоносні і лімфатичні судини, здійснює адаптаційно-трофічну функцію по відношенню до всіх тканин і органів (ШКТ, сечовий міхур, статеві органи), а також регулює артеріальний тиск та дихання. Функціональний стан симпатичної і парасимпатичної частин ЦНС регулює гіпоталамус.

Вища нервова система завжди функціонує несвідомо, ми не знаємо яку з важливих завдань вона виконує щохвилини кожен день. ВНС ділиться на дві підсистеми: симпатичну нервову систему і парасимпатичну нервову систему. За твердженням Кеннона, основна функція симпатичного відділу вегетативної нервової системи полягає в регуляції внутрішніх вегетативних функцій, у зв'язку з зовнішньою діяльністю, особливо в екстремальних ситуаціях. Іншими словами, симпатична нервова система бере участь у підготовці організму до боротьби і втечі, впливаючи на вегетативні процеси так, щоб вони були максимально корисні в екстремальній ситуації. При підготовці до боротьби і втечі, а також при здійсненні самих цих дій вона гальмує всі анаболічні процеси. Тому вона стає інгібітором шлунково-кишкової діяльності. Однак вона стимулює діяльність серця і легенів і перерозподіляє кров, відводячи її від вісцеральної області та підбиваючи до м'язів, легким і до головного мозку; де потрібна додаткова енергія для їх інтенсивної діяльності. Одночасно підвищується кров'яний тиск, вуглеводи виводяться з депо, стимулюється мозкова речовина надниркової.

Парасимпатична нервова система надає заспокійливу, розслаблюючу дію на більшість функцій організму; знижується збудливість ЦНС і міокарда, зменшуються інтенсивність метаболізму, сила і частота серцевих скорочень, кров'яний тиск, об'єм легеневої вентиляції, температура тіла; збільшується секреція інсуліну. При цьому одночасно посилюються моторна, секреторна, всмоктувальна функції шлунково-кишкового тракту.

Характер ендокринного компонента стрессорного відповіді розрізняється у залежно від психологічного типу: люди подiляються на тих, у кого переважає симпатична система, і тих, у кого переважає парасимпатична. Існує маса назв кожної з груп класифікації, проте ми використовували тільки деякі.

Симпатотоники - ті, для кого в стресі більшою мірою характерна реакція «бий» або «біжи». У них вища секреція адреналіну, активніше працює симпато-адреналова система. На фізичному рівні виплеск в кров адреналіну з подальшою реалізацією стратегії «flight» проявляється наступним чином. Прискорене серцебиття, підвищується тонус насамперед скелетних м'язів - тобто підготовка до реалізації активних дій з порятунку свого життя. Безсумнівнопристосувальне значення має розслаблення мускулатури бронхів під впливом адреналіну, завдяки чому поліпшується легенева вентиляція, більше кисню надходить у кров. На психологічному рівні цю реакцію можна коротко сформулювати так: потреба в русі, в емоційної розрядки, не «знаходжу собі спокою», тривога аж до паніки, метушливість, автоматичне повторювання рухiв (стукання пальцями по столу, механічні однотипні дії). Це стан найбільш виснажує (хоча ще гірше, якщо воно не знаходить виходу, наприклад, через необхідність дотримуватися соціальні норми: у такому випадку страждає вже не тільки соматика, але й психіка). Ця категорія людей ще носить назву - тип А.

Парасимпатотоніки (ваготонікі) в ситуації стресу, навпаки, завмирають, ціпеніють (посилена секреція ацетилхоліну). Ця категорія відповідно носить назву люди типу Б. У організмів з психічним типом Б в ендокринному стресорному відповіді переважають глюкокортикоїди, більш високий вміст яких відзначається у них також і в стані спокою . Тут має місце уповільнення частоти серцевих скорочень, зниження артеріального тиску, стан заціпеніння, загальмованості. Характерний застиглий погляд «в нікуди». Мляві, уповільнені, обережні реакції. Слабка, бідна міміка. Бліда, холодна шкіра (млявий кровообіг). На психологічному рівні цю реакцію можна коротко сформулювати так: відчуття байдужості, жертовності, покірності долі, нереальності того, що відбувається (людина немов спостерігає себе з боку).

Отже, типи А і Б характеризуються протилежними стилями поведінки, тобто полярними типами стресорної реакції. Відмінності не обмежуються протилежною поведінкою при стресі - активними спробами перетворення середовища існування у типу А і реакцією затаювання, тобто активною спробою пристосуватися до виниклих змін середовища, у типу Б. Відмінності між психологічними типами А і Б охоплюють і ендокринну сферу. Як було зазначено, у людей з поведінкою типу А переважає секреторна активність мозкового шару надниркових залоз, а у людей типу Б - коркового. Відповідно, основним стресорним гормоном для типу А є адреналін, а для типу Б - кортизол. Відмінності в організації ендокринного компонента стресорної реакції тісно пов'язані з відмінностями в поведінці при стресі. Висока активність коркового шару надниркової залози забезпечує реакцію затаювання (визначальний тип поведінкової реакції Б), взаємодіючи безпосередньо зі структурами ЦНС, а адреналін модулює мобілізацію енергетичних ресурсів при активних спробах змінити зовнішнє середовище, що становлять сутність поведінкової реакції типу А.

1.8 Додатковi показники сироватки крові, що вивчаються у дослідженні

Пептиди середньої молекулярної маси. Це речовини білкової природи з молекулярною масою 300-5000 дальтон (Да), у зв'язку, з чим їх часто називають молекулами середньої маси (МСМ) або середньомолекулярними пептидами (СМП) [9].

Ця фракція включає в себе гормони, нейропептиди, медіатори імунної відповіді та інші продукти білкового обміну, що визначає високу біологічну активність МСМ. В даний час до них відносять деякі гормональні регулятори (інсулін, глюкагон, різні «тропіни» та їх комплекси, деякі вітаміни, нуклеотиди, спермін тощо). МСМ поділяються на дві великі групи - речовини середньої молекулярної маси і олігопептиди; речовини середньої молекулярної маси або катаболічний пул МСМ являють собою небілкові похідні різної природи: сечовина, креатинін, сечова кислота, глюкоза, молочні органічні кислоти, амінокислоти, жирні кислоти, холестерин, фосфоліпіди, продукти вільнорадикального окислення, проміжного метаболізму, нуклеопротеїдні обміну та інші речовини,що накопичуються в організмі в надлишку. Основная частина МСМ - олігопептиди - представлена речовинами пептидної природи, які виконують регуляторні і нерегуляторні функціі. Ослаблення екскреторної функції нирок і неповний протеоліз призводять до збільшення рівня МСМ в плазмі (сироватці) крові. Накопичення МСМ в плазмі крові - показник ендогенної інтоксикації. Розвиток ЕІ - результат дисбалансу між надходженням токсинів в кров і їх детоксикацією.

Накопичення МСМ є не тільки маркером ендотоксікаціі, а й фактором, що посилює перебіг патологічного процесу: МСМ у ролі вторинних токсинів викликають розлад гематоенцефалічного бар'єру, мікроциркуляторного русла, інгібують мітохондріальні процеси окислення, порушують транспорт амінокислот [11]. Виявлено майже повне роз'єднання окислення і фосфорилювання, порушення механізмів регуляції інтенсивності дихання аденілових нуклеотидів під впливом МСМ. Одним з можливих механізмів нейротоксичності дії МСМ є інгібування механізму активного транспорту іонів натрію і калію через мембрану клітинних елементів тканин ЦНС.

Циркулюючі імунні комплекси. Представляють собою гетерогенну за розмірами і складом антитіл і антигенів популяцію, яка утворюється і циркулює в кров'яному руслі у відповідь на введення чужорідного агента. ЦІК - комплекси, що складаються з антитіл, антигену і компонентів комплементу.[30]

Утворення ЦІК - фізіологічний механізм захисту організму, що призводить до швидкого видалення ендогенних і екзогенних антигенів (віруси, паразити, бактерії, мікроорганізми, антигени рослин, пилок, харчові продукти) через ретикуло-ендотеліальну систему, тобто це комплекси здатні стимулювати розвиток імунної відповіді організму. Утворені циркулюючі імунні комплекси в нормі захоплюються фагоцитами і руйнуються ними. У здоровому організмі ці комплекси швидко елімінуються з крові, великі імунні комплекси руйнуються в селезінці і печінці [17]. При надмірній кількості антигену, надмірному формуванню імунних комплексів та їх неефективнійелімінації може виникнути хвороба імунних комплексів. При цьому дрібні імунні комплекси можуть накопичуватися в різних органах і тканинах, викликати запальний процес і пошкодження біологічних структур.



РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1 Об'єкт та постановка експерименту

Дослідження проводилося на базі інституту невідкладної хірургії імені В.Т. Зайцева в діагностичній лабораторії з імуноферментним імунофлюоресцентним аналізом.

В експерименті брали участь юнаки та дівчата, вік яких знаходиться в діапазоні від 17 до 23. Загальна кiлькiсть учасників - це 6 осіб, серед яких три особи - жіночої статі і три - чоловічої. За суб'єктивними оцінками випробуваних, вони перебували в здоровому стані.

Експериментальні дослідження проводились у весняний період. Початковим етапом було взяття крові з ліктьової вени у кожного з учасників, при цьому студентів просили перед процедурою не снідати. після забору крові членам груп презентувалася стисла інформація про суть і зміст конкретних рунічних знаків Старшого Футарка, був представлений ретельний опис чотирьох рунічних символів, з яких кожен учасник повинен був вибрати один актуальний для себе знак, який би імпонував його особистості в даний час. Наступним етапом був сам акт рунного письма, де студенти усвідомлено, вникаючи в суть знака, відображали графічну форму обраного символу на дерев'яному матеріалі, після чого проводився повторний забір крові. Останнім етапом був довгостроковий вплив написаного знака, учасники носили з собою букву рунічного алфавіту протягом двох тижнів. Після закінчення терміну був проведений повторний забір крові.

Об'єктом дослідження була сироватка крові учасників експерименту. Для отримання сироватки кров піддавалася коагуляції шляхом інкубації без перемішування при кімнатній температурі протягом 30 хв. Коагулянт облягали шляхом центрифугування при 1500 g протягом 10 хв. Після центрифугування сироватка відбирається в чисті пробірки за допомогою піпетки Пастера.

У сироватці крові визначали рівень гормонів кори надниників - кортизолу, циркулюючих імунних комплексів, а також пептидів середньої молекулярної маси.

2.1.1 Рунні символи які були використані в експерименті

Гебо. Дар часу. Дар

Рис. 2.1. - Рунний сивол Гебо

Руна єдності протилежностей, руна партнерства і руна дару. Щоб зрозуміти її, необхідно чітко відчувати світовий закон єдності і боротьби протилежностей, в якості яких в даному випадку виступають, наприклад, свобода і партнерство. Щирий і плідний союз неможливий там, де члени його не володіють повною свободою. Так, узи істинного братства завжди виявляються міцніше сил, що підтримують цілісність тиранії. Але і свобода - у найглибшому значенні цього слова - неможлива там, де «кожен тягне ковдру на себе». Так зберігають чітку ієрархію Світлі, залишаючись вільними, бо самі вибрали свій шлях. Ця руна містить в собі енергію двох або більше осіб, які об'єдналися і стали силою, недосяжною ні для одного з них окремо. Незалежно від того, чи виступає вона як основна або як додаткова руна, дія її завжди позитивно. Часто вона застосовується в любовній і, зокрема, в сексуальній магії, оскільки, укладаючи в собі гармонію і єднання чоловічого і жіночого начал, сприяє завершенню внутрішніх конфліктів. Формули з рунню Gebo допомагає знайти не просто фізичну рівновагу, але рівновагу духовного і фізичного початків в людині. Виключно дієва ця руна і в тому випадку, якщо застосовується для зміцнення любовних і дружніх зв'язків, здатних вилитися у вільний і щасливий партнерство. Незалежно від сфери, в якій лежать ці відносини, волшби Gebo не припускав розчинення однієї людини в іншому і жодною мірою не зазіхає на індивідуальність жодного з партнерів. Всі системи тлумачення значень рун сходяться в тому, що одним з аспектів Gebo є дар як встановлення зв'язку з вищими силами. За допомогою цієї руни можна з успіхом спробувати «встановити зв'язок з найбільш давньою і мудрою частиною власної душі». Крім того, Gebo може бути дієва для накопичення особистої магічної сили. Руна допоможе у вірному виборі партнера, закріпить і підтримає налагоджені контакти.

Вуньо. Кульмінатор. Радість.

Рис. 2.2. - Рунний сивол Вуньо

Світла, радісна руна. Магічне призначення - викликати радість, приплив енергії, відчуття піднесеності і гарний настрій. Здатна викликати благотворне очищення тонкого тіла, зняття енергетичних блоків та поліпшення самопочуття. Використання руни Wunjo, яка належить до рун думки, відноситься скоріше до зовнішнього, ніж до внутрішнього світу людини. Дія цієї руни завжди позитивна і спрямована на те, щоб дарувати радість тому, хто з нею працює. Формули на основі цієї руни сприяють завершенню будь-якого підприємства і, що важливо, підтримують у людині прагнення домагатися «поставленої мети». Wunjo приносить успіх подорожуючим. Вуньо пробуджує усвідомлення самоцінності і сприйняття божественного у всіх істот, а тому може розглядатися також як руна самооцінки.

Лагуз. Енергетичні потоки. Проточна вода.

Рис. 2.3. - Рунний символ Лагуз

Руна внутрішнього кола магії, "того, що веде". Руна Лагуз - руна інтуїції, основне призначення її є посилення психічних здібностей. Робота з цим знаком сприяє позбавленню від комплексів і страхів, стабілізований емоційної або ментальної несприятливої ситуації - тобто повернення втраченого душевної рівноваги. Побудовані на руні Laguz формули загострюють і підсилюють інтуїтивне сприйняття світу, надають допомогу не тільки у вивченні таємних наук, а й у встановленні так званого контакту з підсвідомістю. Laguz дуже ефективна для відшукання або розкриття того, що було приховано, причому стосується це як таємного знання, так і скарбів або тих речей, які були колись заховані, але місцезнаходження схованки з ними виявилося з яких-небудь причин забуто. Cама руна Laguz сприяє укладенню шлюбу, встановлення нових дружніх зв'язків і відновленню старих, прекра-щенію сварок і розбратів.

Ейваз. Безперервність життя. Захист.

Рис. 2.4. - Рунний символ Ейваз

Руна Захисту або - точніше - руна Оборони, руна "здобичі сил" і подолання. Використання руни Eihwas в цілях волшби досить широко, але весь спектр можливостей так чи інакше пов'язаний зі священним Світовим Деревом Півночі - Іггдрасиля. Традиція вважає, що до сил руни Eihwas зверталися з метою проникати в загадки Іггдрасиля, в таємниці життя і смерті. У цьому аспекті свого магічного застосування Eihwas ставала рунню мудрості. Як символ Світового Древа з'єднує всі дев'ять світів, Eihwas використовували для встановлення зв'язку між ними. Сучасні джерела тлумачать це як встановлення зв'язку між різними пластами або рівнями реальності. Ця руна Eihwas відноситься до групи рун прибою, хоча за характером магічного впливу її слід було б віднести до рун трансформації. Другою важливою областю її застосування в волшбі є захист, причому необхідно відзначити, що Eihwas - одна з найсильніших захисних рун.

2.2 Метод виявлення гормону кортизолу у сироватці крові

Імуноферментним аналізом називають лабораторні дослідження, що базуються на специфічності і високого ступеня вибірковості імунологічної реакції "антиген-антитіло". Прийнято розрізняти кілька десятків варіацій ІФА. Найбільшою популярністю користується гетерогенний твердофазний імунний аналіз. Основою цього методу є реакція “антиген - антитіло”, тобто специфічне зв'язування антитіла з певною речовиною.

Рис. 2.5. - Імуноферментний твердофазний аналіз

Для кількісного аналізу застосовують в основному два види виконання імуноферментного аналізу. Першим етапом їх здійснення виступає зв'язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. Дальше стає можливим проведення реакції конкурентного або непрямого (сендвіч) типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують з імобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решта суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв'язуються вже імобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, які містять речовину, що визначають, поміщають у лунки планшету для мікротитрування, на стінках якого сорбовані антитіла, здатні специфічно зв'язувати дану речовину, наприклад гормон. Одночасно в інкубаційну суміш вносять невелику кількість гормону, хімічно зв'язаного з ферментом, так званий кон'югат. Кон'югат і гормон, який визначають, конкурують між собою за зв'язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після цього як зв'язування антигенів відбулося, незв'язані молекули відмивають.

Для визначення кількості зв'язаного кон'югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і забарвлені продукти ферментативної реакції визначають фотометрично. Чим більше гормону в тестованій пробі, тим менше кон'югату буде зв'язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється за допомогою калібрувальної кривої, яку будують за стандартними зразками з відомою концентрацією.

Для проведення аналізу використовувався набор «Стероид ИФА-кортизол» від Алкор-Біо (Росія) з використанням варіанту конкурентного твердофазного імуноферментного аналізу.

Рис.2.6. - Набор «Стероiд IФА-кортизол»

В лунках, при додаванні досліджуваного зразка та кон'юганту кортизол-перксидази, під час інкубації встановлюється рівновага між кон'югантом та ендогенним кортизолом сироватки крові в процесі зв'язування з антитілами, іммобілізованими на внутрішній поверхні лунок.

Незв'язані компоненти видаляються промиванням. Кількість зв'язаного антитілами кон'юганту зворотно пропорційна кількості кортизолу в дослідженому зразку крові.

Під час інкубації з розчином ТМБ відбувається забарвлення розчину в лунках. Ступень забарвлення зворотньопропорціна концентрації кортизолу в аналізуємих пробах. Після зміни оптичної щільності розчину у лунках на основі калібрувального графіку розраховується концентрація кортизолу в досліджуванних зразках.

Стрiпи. Перед відкриттям пакету зі стрипами вони витримувалися при кімнатній температурі (+18…25°С) не менше ніж 30 хвилин. Після відкриття пакет ставиться на вільну рамку необхідна кількість стрипів.

Перед відкриттям флакони були злегка простукані для того, щоб стряхнути частинки, що поприлипали до стінок флаконів. Відкриваті флакони та кришки було перегорнуто та покладено на суху поверхню. До кожного флакону з калібрувальною пробою та контрольною сироваткою додали по 0,5 мл дистильованої води та закрили кришками. Флакони були витримані впродовж 10 хвилин при кімнатній температурі (+18…25°С) без перемішування. Потім, акуратно нахиляючи та обертаючи флакони, перемішали їх зміст до повного розчину, уникаючи піноутворення. Впродовж наступних 10 хвилин флакони були витримані при кімнатній температурі, періодично помішуючи.

Кон'югант у наборі готовий до використання. Витрати кон'юганту на один стрип склали 1,5 мл.

Промивний розчин. Необхідну кількість буферу Р було розведено дистильованою водою у 20 разів. Потім ретельно перемішішано, уникаючи піноутворення.

Розчин тетраметилбензидину (ТМБ) готовий до використання. Витрата ТМБ на один стрип складали 1,15 мл.

Стоп-реагент у наборі готовий до використання. Витрата стоп-реагенту на один стрип складали 1,15 мл.

Усі реагенти перед проведенням аналізу ретельно перемішали та довели до кімнатної температури.

Постановка аналізу.

Був складений протокол маркірування лунок:

А1 А2 - № 1 - для вимірювання величини оптичної щільності ТМБ;

В1 В2 - № 2 - для виміру величини оптичної щільності КП №1;

С1 С2 - № 3 - для виміру величини оптичної щільності КП №2;

D1 D2 - № 4 - для виміру величини оптичної щільності КП №3;

Е1 Е2 - № 5 - для виміру величини оптичної щільності КП №4;

F1 F2 - № 6 - для виміру величини оптичної щільності КП №5;

G1 G2 - № 7 - для виміру величини оптичної щільності КП №6;

H1 H2 - № 8 - для виміру величини оптичної щільності контрольної сироватки.

У відповідні лунки додали по 50 мл калібрувальних проб, контрольної сироватки, у лунки, що залишилися додли по 50 мкл досліджуваної сироватки крові у дублікатах.

Загальний час внесення калібрувальних проб, контрольної сироватки та досліджуваних сироваток крові не перевищував 15 хвилин (згідно методики), щоб час інкубації різних зразків не відрізнятися, що могло б призвести до невірних результатів.

В усі лунки, окрім лунок А1 та А2, додали по 150 мкл кон'югантів.

Стрипи інкубуювалися впродовж 60 хвилин при стряхувані у термостійкому шейкері при температурі +37°С зі швидкістю 500-800 об/хв.

По закінченню інкубації зміст лунок був видалений у контейнер з дезінфікуючим розчином (1% розчином гіпохлориту натрію або 6% розчин перекису водню), лунки були промиті чотири рази. При кожній промивці в усі лунки додавалося по 300 мкл промивного розчину, потім рамка була стряхнена на шейкері впродовж 5-10 сек з наступним декантируванням. Після останнього декантирування були ретельно видалені залишки рідини з лунок постукуванням рамки зі стрипами у перегорнутому стані по фільтрувальному паперу.

Потім було негайно додано в усі лунки по 100 мкл розчину ТМБ. Стрипи інкубувалися у темряві при кімнатній температурі (+18…25°С) впродовж 15-30 хвилин в залежності від ступеню розвитку забарвлення або 10 хвилин у термостатуємо у шейкері при температурі +37°С зі швидкістю 500-800 об/хв.

В усі лунки з тією ж швидкістю і в тій же послідовності, як і розчин ТМБ, додали по 100 мкл стоп-реагенту для зупинки ферментної реакції, перемішали у шейкері впродовж 1-2 хвилин при кімнатній температурі.

Забарвлення у лунках планшету стабільне не більше, ніж 20 хвилин при кімнатній температурі.