Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

"Кубанский государственный университет"

(ФГБОУ ВПО "КубГУ")

Географический факультет

Кафедра геоэкологии и природопользования

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Экология и расовый состав возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника Plasmopara Halstedii в агроценозах Краснодарского края

Краснодар, 2013

Содержание

Введение

1. Ложная мучнистая роса подсолнечника (обзор литературы)

1.1 История исследований возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

1.2 Симптомы ложной мучнистой росы подсолнечника

1.3 Биология и морфология возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

1.4 Взаимоотношения хозяин-паразит

1.5 Физиологические расы Plasmopara halstedii

1.6 Методы борьбы с возбудителем ложной мучнистой росы подсолнечника

1.7 Генетическая устойчивость подсолнечника к ложной мучнистой росе

1.8 Морфометрическое исследование спороношения Plasmopara halstedii на проростках подсолнечника

2. Природные условия Краснодарского края

2.1 Географическое положение

2.2 Рельеф

2.3 Климат

2.4 Почвы

2.5 Гидрология

2.6 Растительность

3. Материалы и методы исследований

3.1 Идентификация рас Plasmopara halstedii

3.2 Уточнение методики определения расовой принадлежности изолятов P. Halstedii

3.3 Тестирование исходных образцов подсолнечника на устойчивость к возбудителю ложной мучнистой росы

4. Расы возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в Краснодарском крае и выделение устойчивого к ним исходного материала (результаты исследований)

4.1 Определение расового состава возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

4.2 Тестирование исходных образцов подсолнечника на устойчивость к расам Plasmopara halstedii

Заключение

Список используемых источников

возбудитель роса мучнистый подсолнечник

Введение

Актуальность темы. Среди многих масличных культур, возделываемых в РФ, подсолнечник - основная. На его долю приходится 75% площади посева всех масличных культур и до 80% производимого растительного масла. Серьезным препятствием для получения высоких урожаев подсолнечника зачастую становятся различные болезни. Ложная мучнистая роса, вызываемая оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, относится к числу наиболее вредоносных. Потери урожая при условиях, благоприятных для развития патогена, могут составлять 50-70%.

По последним данным, в мировой популяции P. halstedii насчитывают 36 патотипов [Gulya, 2007, p. 121]. Из них можно выделить 6-7 рас доминирующих в мире. Так, во Франции доминируют расы 710 и 703, в Германии - 730 и 710. В Италии и Болгарии преобладает раса 700. В Испании, по данным 2000 года, на тот период преобладала раса 310 (50%). В Аргентине доминирует раса 770, а в США - расы 730 и 770.

В России структура популяций этого оомицета на подсолнечнике долгое время оставалась практически неизученной со времён выпуска монографии Н.С. Новотельновой в 1966 году. До начала 80-х годов прошлого века считалось, что на территории бывшего СССР распространена европейская раса 1 (или 100 по современной номенклатуре). Однако сорта подсолнечника, имевшие устойчивость к ней, стали поражаться в те годы в Краснодарском крае [Тихонов, 1981, с. 20]. С созданием линий-дифференциаторов подсолнечника, с помощью которых можно было идентифицировать патотипы оомицета, в Краснодарском крае были обнаружены расы 310 и 330, из которых первая встречалась спорадически, а вторая - повсеместно [Антонова, 2000, с. 21-23]. Раса 310 была обнаружена также в Белгородской области. Кроме неё, там были выявлены расы 100, 300 и 730.

С началом 90-х годов ХХ столетия, когда в Россию начали завозить семенную продукцию подсолнечника иностранных фирм (Франции, Испании, США и других), увеличилась вероятность ввоза новых рас патогена с семенами из-за рубежа. Кроме того, с интенсификацией возделывания подсолнечника и увеличением разнообразия сортимента ускорился естественный процесс сопряжённой эволюции паразита и хозяина, способствующий формированию новых рас. Сложившаяся ситуация потребовала контроля над вирулентностью возбудителя болезни в районах возделывания подсолнечника в России [Якуткин, 2002, с.217].

Контроль над расовым составом популяции возбудителя болезни - необходимое условие для успеха селекции подсолнечника на устойчивость к нему. Кроме того, отслеживание процесса расообразования и соотношения рас в популяции дает возможность размещать сорта и гибриды с учетом их устойчивости к биотипу патогена, свойственному данной местности. Это позволяет получать урожаи с минимальными потерями.

Объект - возбудитель ложной мучнистой росы подсолнечника Plasmopara halstedii

Цель работы - дифференцировать расовый состав возбудителя ложной мучнистой росы Plasmopara halstedii подсолнечника в Краснодарском крае.

Задачи исследования:

- определить расовый состав возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника;

- протестировать исходные образцы подсолнечника на устойчивость к расам Plasmopara halstedii на устойчивость к расам Plasmopara halstedii.

В данной работе используются следующие методики:

- идентификация рас Plasmopara halstedii;

- тестирование исходных образцов подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе.

Научная новизна:

- установлено, что доминирующее положение в большинстве районов занимает раса 710;

- обнаружена ранее не встречавшийся в крае патотип 334.

Практическая значимость:

Выделен селекционный материал подсолнечника, устойчивый к расам 330, 710, 730.

Работа излагается на 71 странице и состоит из введения, четырех глав, заключения и списка используемых источников, который включает в себя 36 наименований. В работе представлены 11 рисунков и 9 таблиц.

1. Ложная мучнистая роса подсолнечника (обзор литературы)

На пути к увеличению продуктивности подсолнечника стоит ряд серьезных препятствий в виде чрезвычайно вредоносных заболеваний культуры, среди которых - ложная мучнистая роса.

Болезнь способна вызывать гибель всходов, а также влечь за собой значительные потери урожая семян подсолнечника вследствие того, что поражение резко изменяет фенотип растения. В результате образуются неполноценные органы плодоношения: во много раз сокращается размер корзинок и уменьшаются количество, величина, масса и масличность семян.

Вполне очевидно, что для разработки эффективных мер борьбы с ложной мучнистой росой подсолнечника требуется основательное изучение ее возбудителя - оомицета Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni. Данные о его биологических особенностях были получены далеко не сразу. Долгое время оставались неясными и запутанными вопросы относительно действительного круга растений-хозяев, географического ареала и таксономии оомицета, сведения о роли семян в передаче инфекции, физиологических расах и т.п.

1.1 История исследований возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

Впервые морфология оомицета P.halstedii, обнаруженного в Америке в 1876 году, описана в работе американского миколога Уильяма Джилсона Фарлоу. Паразит тогда был найден на растениях, принадлежащих к многолетним дикорастущим видам pода Helianthus и другим сложноцветным. Автор еще в то время подметил различия в признаках паразита на разных растениях-хозяевах и предположил, что это разные виды. Он считал P. halstedii одним из характерных американских видов. Однако интродуцированный на культурном подсолнечнике в Европу, возбудитель сохранял данную ему характеристику на протяжении почти ста лет.

В 40-х годах ХХ века ложная мучнистая роса, распространившись на полях подсолнечника, нанесла удар по экономике многих стран Восточной Европы. Ученые этих стран принялись за изучение болезни и ее возбудителя. Появились работы, рассматривающие вопросы распространения, вредоносности и патогенеза болезни, морфологии и биоэкологии возбудителя, его резервации. В них уделялось внимание и мероприятиям по защите подсолнечника [Новотельнова, 1966, с. 19].

1.2 Симптомы ложной мучнистой росы подсолнечника

Системно пораженные растения подсолнечника имеют карликовый вид, слаборазвитую корневую систему, крайне сближенные междоузлия, хлоротичные листья, на нижней стороне которых образуется спороношение возбудителя в виде обильного белого войлочного налета. В условиях избыточной влаги спороношение оомицета иногда появляется на верхней стороне настоящих листьев. Отдельные из этих растений усыхают, другие образуют корзинки с щуплыми семенами. Этот тип болезни проявляется до цветения подсолнечника и является наиболее распространенным и вредоносным.

По Новотельновой симптомы заболевания дифференцируются на четыре формы [Новотельнова, 1966, с. 37-38]:

1 - резкое отставание в росте и недоразвитие всех органов; типичное обильное спороношение на нижней стороне листовой пластинки. Такие растения быстро погибают, хотя часть из них может достигать фазы цветения и образовывать крохотные соцветия диаметром 1-3 см. Семена в таких корзинках не развиваются;

2 - растения выглядят карликовыми. Они долго вегетируют и проходят все фазы развития - вплоть до образования семянок. Листья с угловатыми хлоротичными пятнами, крупные, иногда курчавые и скрученные, как у капусты, но завернуты книзу; снизу под пятнами - спороношение оомицета;

3 - подавления роста растений нет, но болезнь проявляется на листьях в виде отдельных пятен светло-зеленого цвета, ограниченных жилками. С нижней стороны листа - спороношение оомицета;

4 - скрытое течение болезни. Растения выглядят здоровыми, но при помощи специального анализа удается выявить их поражение милдью.

1 и 2 формы обнаруживаются одновременно весной на полях подсолнечника, являются результатом как первичной, так и вторичной инфекции и диффузного распространения оомицета в тканях хозяина. 3 форма - следствие вторичного заражения, и, не оказывая заметного влияния на урожай, способствует накоплению зимующей инфекции. 4 форма - результат инфекции семян или заражения растений в поле; возбудитель локализуется в подземной части растений, не всегда способен продвигаться в надземные органы. Такой характер болезни - своеобразное проявление устойчивости, но иногда на растениях со скрытой формой болезни внезапно проявляются все признаки поражения ложной мучнистой росой (2 форма). Это связано с изменением условий окружающей среды и состоянием растения-хозяина.

О.И. Тихонов дополнил эту дифференциацию еще двумя формами поражения корзинок подсолнечника, вызванными вторичной инфекцией [Тихонов, 1966, с. 24]:

1) больные растения не отличаются от здоровых по высоте и размеру корзинок, но несут внешние признаки болезни. С лицевой стороны корзинки - участок с засохшими цветками и мелкими семенами, с тыльной - соответствующий сектор уплотненной ткани с более зеленой окраской. На обмолоченной корзинке четко выражен темно-коричневый участок семенных ячеек на светло-коричневом общем фоне.

2) скрытое течение болезни: материнское растение само не заболевает, но бессимптомно передает возбудителя своему потомству. Дочернее растение в течение всего периода своего развития оно находится в состоянии скрытого заражения.

В.Ф. Пересыпкин выделил пять форм заболевания [Пересыпкин, 1988, с. 114]:

1 - растения резко отстают в росте, высотой 15-30 см, стебли тонкие; листья мелкие, хлоротичные, на нижней стороне - налет спороношения патогена. Больные растения, как правило, погибают; некоторые достигают фазы цветения с корзинками диаметром 3-3,5 см, с мелкими, щуплыми семенами или без семян;

2 - растения отстают в росте, высотой 50-100 см, стебли утолщенные, с укороченными междоузлиями, листья с верхней стороны имеют угловатую хлоротичность, с нижней - налет спороношения. Растения долго вегетируют, проходят все фазы развития, но семена часто недоразвитые и щуплые;

3 - проявление вторичной инфекции в виде отдельных пятен на листьях со спороношением на нижней стороне;

4 - скрытое течение болезни;

5 - растения приостанавливают рост, но развитие корзинок продолжается; часть семянок остается пустой и корзинки из-за этого не сгибаются (масса 1000 семян в 1,5 раза меньше, чем у здоровых растений).

1.3 Биология и морфология возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

Мицелий P. halstedii несептированный, бесцветный или желтоватый, распространяется внутри тканей растения-хозяина. Толщина - от 4 до 38 мкм. Характерная особенность - образование многочисленных гаусторий, проникающих в клетки питающего растения. Гаустории одиночные или скученные, по 2-3 или более в одной клетке хозяина, бесцветные или желтоватые до коричневых, по форме округлые, немного сплющенные, с оболочкой; диаметр - до 27 мкм, обычно 5-10 мкм. Мицелий однолетний, но в тканях семянок может сохраняться и дольше [Новотельнова, 1966, с. 41].

Распространение мицелия в растении может быть как диффузным, так и локальным. Диффузный мицелий пронизывает все части растения, включая пестики, тычинки, прицветники и семена. В листьях он проходит в палисадной и губчатой паренхиме, а также между клетками отдельных сосудов и жилках. Его можно обнаружить во всех частях стебля, кроме сосудисто-волокнистых пучков.

М. Нисимура находил мицелий и в сосудах корня молодых проростков, когда пучки еще не были хорошо дифференцированы. При этом отсутствовали характерные для оомицета хорошо развитые гаустории. Он предполагал, что в таком случае питание оомицета осуществляется за счет остального мицелия, проходящего в коре корня и стебля [Nishimura, 1922].

Локальный мицелий встречается в отдельных частях надземных и подземных органов растения. На листьях площадь его распространения достигает чаще нескольких квадратных сантиметров, иногда не превышает 2-3 мм?. В некоторых случаях локальный мицелий способен пройти из листьев через черешки вверх и вниз по стеблю и стать диффузным. Локальный мицелий в корнях подсолнечника при определенных условиях также может развиваться диффузно.

Ооспоры, как результат полового процесса, - основной источник инфекции многих оомицетов. Они обильно образуются на мицелии в корнях и листьях, стебле, преимущественно в периферийных тканях (часто прямо под эпидермисом). Большое количество ооспор формируется в листовых черешках и жилках, а также в ложе корзинки прямо под семенами; они обнаружены даже в семенах подсолнечника. Закладываются в межклетниках, однако часто оказываются и в самих клетках: в результате действия оомицета клетки подсолнечника отмирают и клеточные оболочки разрушаются. Единичное появление ооспор в проростках подсолнечника зарегистрировано на восьмой день после заражения, а массовое их образование - через 4-6 недель в главных и боковых корнях растений. Их образование продолжается до конца вегетации подсолнечника. Размеры ооспор - 23-37 мкм с толщиной оболочки до 3 мкм, оогониев - 36-72 мкм, антеридиев - 12-37 мкм [Христова, 1960, с. 385-386].

Зооспоры имеют бобовидную форму, их размер - 6-12 мкм. Тело зооспоры состоит из внутренней части - экзоплазмы и периферийной - эндоплазмы, более прозрачной, чем внутренняя, почти стекловидной, окутывающей экзоплазму снаружи в виде чехла. Внутри них выделяются 1-2 вакуоли и ядро. От боковой выемки тела зооспоры отходят длинные тонкие эктоплазматические жгутики, длина их 25-40 мкм, один из них длиннее другого почти в полтора раза. Концы жгутиков булавовидно расширены, на одном из них расположены реснички длиной до 1 мкм; этот жгутик часто сворачивается в кольцевидный пучок. При контакте с инфицируемым растением зооспоры теряют жгутики, инцистируются (покрываются оболочкой) и прорастают в мицелий, в противном случае подвергаются автолизу [Новотельнова, 1966, с. 48].

Зооспоры формируются в зооспорангиях. Н.С. Новотельнова писала, что по 7-30 зооспор в зооспорангии. Зооспорангии образуются одиночно на разветвленных стеригмах, которыми заканчиваются спорангиеносцы, имеющие 2-3 уровневое ветвление [Новотельнова, 1966].

Еще M. Нисимура заметил, что оомицет образует спороношение как на листьях, так и на подземной части растений [Nishimura, 1922]. Позднее и Н.Д. Новикова , изучая оомицет в условиях Краснодарского края, подтвердила этот факт, отметив в своей работе выявленное ею сходство между обоими видами спороношения [Новикова, 1960]. Н.С. Новотельнова , раскритиковав многое из заключений Н.Д. Новиковой, обозначила спороношение на листьях как б-спороношение (типичное по морфологии для Plasmopara sp.), а на корнях - как в-спороношение (типичное по морфологии для Phytophthora sp.) [Новотельнова, 1966].

Несмотря на резкие морфологические различия, б- и в- типы спороношения идентичны по своим функциональным особенностям - способности к прорастанию зооспор и заражению растений.

Наблюдения за процессом развития P. halstedii внутри тканей растений показали, что в разных органах он протекает своеобразно. После определенного периода роста внутри хозяина, при благоприятных условиях среды оомицет переходит к образованию спороношения. Мицелий накапливается в подустьичных полостях и затем через устьица выходит в воздушную среду, образуя спорангиеносцы. Благодаря большому количеству устьиц на листьях, оомицет образует плотный войлочный налет с нижней (иногда и с верхней) стороны листовой пластинки. В корнях растений сосредотачивается большое количество питательных веществ, которые используются оомицетом и ведут к обильному росту мицелия с толстыми ветвящимися гифами. На поверхности тонких, еще не одревесневших, боковых корешков появляются отдельные группы спорангиеносцев. На главном корне с толстой корой и на нижней части стебля спороношение обычно появляется в трещинках коры, возникающих из-за механических повреждений. Возможно, что разрыв наружных тканей корня происходит под давлением разрастающегося под ними мицелия патогена [Новотельнова, 1966, с. 50-51].

Цикл развития P. halstedii схематически представлялся разными авторами. У М. Ниcимура из схемы выпадала половая стадия развития патогена; показано, что зимовка оомицета осуществляется лишь за счет многолетнего мицелия в корневище растения-хозяина [Nishimura, 1922]. У Н.С. Новотельновой [Новотельнова, 1966] учтена динамика накопления заразного начала и его резервации (при условии сохранения ооспор в растительных остатках). Также обращено внимание на значение в цикле развития оомицета мицелия, сохраняющегося в зараженных семенах.

О том, что именно с семенами патоген мигрировал с континента на континент, высказали свое мнение еще в начале ХХ века П. Янг и Х. Моррис [Young, 1927]. Результаты многолетних исследований показали, что семена, содержащие в себе мицелий или даже ооспоры P. halstedii, лишь в редких случаях дают растения с типичными признаками заболевания.

Ооспоры - основной источником сохранения инфекции (жизнеспособны в течение 8-10 лет) и первичного заражения растений. Прорастают промицелиями, на которых формируются зооспорангии. Заражение осуществляют зооспоры, вышедшие из этих зооспорангиев. При контакте с растением они инцистируются, образуют промицелий и пронизывают корневые волоски или эпидермальные клетки корня или гипокотиля [Антонова, 2000, с. 22]. После проникновения внутрь паразит развивает межклеточные гифы и внутриклеточные гаустории, продвигается дальше по растению. Это ведет к системному заражению. Установлено, что иногда к системному развитию болезни может вести вторичная инфекция при проникновении патогена аэрогенно через ткани листьев (до фаз 4-6 пар настоящих листьев) или через верхушечную почку растений.

В течение вегетационного периода оомиет P. halstedii в фазе бесполого размножения на пораженном подсолнечнике формирует несколько генераций зооспор. За день на поверхности листовой пластинки площадью 200 см? может образовываться около 200 000 зооспорангиев. Зооспоры, переносимые ветром, дождем, насекомыми вызывают новые заражения подсолнечника ложной мучнистой росой. От очага инфекции они могут переноситься на расстояния более 1500 м и попадать на территории, свободные до этого от патогена. Критический период восприятия патогена для подсолнечника в полевых условиях - фаза до появления первой пары настоящих листьев, так как подсолнечник наиболее восприимчив к заражению при длине корешка проростка от 2 мм до 2 см [Viennot-Bourgin, 1981].

Условия развития P. halstedii. Основные факторы, которые влияют на возникновение и развитие ложной мучнистой росы подсолнечника - температура, влажность, возраст растения, тип и концентрация инокулюма возбудителя. Оптимальными условиями для прорастания ооспор являются высокая влажность почвы в пределах 95% и ее температура от 12-14°С.

Заражение подсолнечника находится в прямой зависимости от наличия капельно-жидкой влаги. Это необходимое условие для формирования спороношения, отрождения и прорастания зооспор, так как заражение растений возбудителем болезни происходит в каплях воды непосредственно при контакте зооспор с корневыми волосками или листьями. Для выхода зооспор из зооспорангиев оптимальна температура 16°С [Новотельнова, 1966, с.60].

Из зрелых зооспорангиев выходят подвижные зооспоры. Через некоторое время они прорастают ростком мицелия, с помощью которого осуществляется заражение. Иногда при пониженной температуре и некоторых других условиях из спорангиев выходят не зооспоры, а несформировавшаяся протоплазма. Продолжительность жизни зооспор - от нескольких минут до часов, редко - до 2-3 суток. Установлено, что это зависит от температуры: при 22°С жизнеспособность сохраняется в течение девяти часов, при 2-10°С - трое суток [Христова, 1960, с.386].

Зооспорангии паразита чувствительны к изменениям реакции среды. Для прорастания зооспорангиев необходима рН среды в пределах 8,5-7,0. Наиболее активно прорастание проходит в нейтральной среде (рН = 7,0) и при небольшом подкислении. Отклонение реакции за пределы рН = 6,5-7,0 резко снижает образование зооспор [Тихонов, 1969].

1.4 Взаимоотношения хозяин-паразит

Механизм патогенеза. Причины появления биоморфозов растений из-за поражения их P. halstedii: наблюдается изменение водного режима больных растений - под воздействием токсинов оомицета повышается транспирация и снижается водоудерживающая способность из-за повышения водопроницаемости плазмы клеток. Также в больных растениях увеличивается интенсивность дыхания вследствие активирования пероксидазы и увеличение активности каталазы - фермента завершающего этапа дыхания и отвечающего за расщепление и обезвреживание образующихся перекисей. Усиление активности пероксидазы и каталазы в тканях пораженных растений - проявление защитной реакции растения против паразита [Новикова,1960, с.154-155].

Результаты исследований показали значительное уменьшение количества хлорофилла и каротина. Это сказывается отрицательно на фотосинтетической деятельности листьев, ведет к истощению растений и может вызывать преждевременную их гибель. Снижение активности фотосинтеза из-за резкого уменьшения количества хлорофилла в листьях пораженного подсолнечника ведет к уменьшению содержания углеводов в органах растения. Нарушение углеводного обмена, в свою очередь, сказывается на изменении обмена азотсодержащих веществ, что характерно и при других болезнях растений. В результате подавления фотосинтеза и недостаточного снабжения сахарами тканей листьев поступающий в листья азот полностью не используется на синтез сложных органических соединений. Поэтому накапливается меньше белков и больше небелкового азота.

Также имеются данные о выявленной разнице в физиологических процессах растений разных форм поражения ложной мучнистой росой - I и II. I форма - результат столь сильного воздействия паразита на растение, что последнее перестает нормально вегетировать и погибает на ранних стадиях развития. В данном случае растение проявляет абсолютную восприимчивость, а оомицет - высокую степень патогенности. При II форме изменение обмена веществ растения под действием P. halstedii приводит к затормаживанию роста и другим последствиям, однако нет резких нарушений функций хозяина. Между растением и паразитом устанавливаются типичные для облигатного паразитизма взаимоотношения, обеспечивающие их длительное прижизненное существование. Поэтому больное растение производит корзинки, хотя мелкие и с щуплыми семенами [Новотельнова, 1966, с. 55-57].

Механизм устойчивости подсолнечника к паразиту. Блокировка проникновения зооспоры в корень, а также отсутствие системного поражения у инфицированного растения могут быть связаны с механическим или биохимическим барьером в районе гипокотиля. Таким образом, зооспоры инцистировались, но не могли проникнуть в корни растения. Был запущен механизм гиперчувствительности и эпидермальные клетки отмирали до того, как патоген проникал внутрь растения. Это предположение было опровергнуто, так как в инокулюме были обнаружены антибиотики, выделяемые подсолнечником, токсичные для P. halstedii.

Исследования показали, что как восприимчивые, так и устойчивые линии могут подвергаться внедрению оомицета через корни. Примерно через пять дней после такого заражения внутри устойчивого гипокотиля проявлялась реакция гиперчувствительности (HR - hypersensitive reaction). Вследствие нее в большинстве случаев патоген не мог достичь листьев. Это - так называемая "ограниченная семядольным узлом инфекция". Зачастую проявление гиперчувствительной реакции (HR) ведет к отмиранию клеток, что останавливает распространение патогена. HR определяется множеством физиологических и молекулярных изменений: деполяризацией плазменной мембраны, изменением дыхания, окислительными процессами (образование оксида азота (NO), окислением соединений различных компонентов клеточной стенки), а также образованием протеинов, связанных с патогенезом. Было установлено, что в течение HR патоген в месте проникновения блокируется небольшим количеством клеток посредством их отмирания в течение 12-24 часов после инокуляции.

При HR были обнаружены некоторые молекулы, присущие фитогормонам стресса (салициловая и жасмоновая кислоты, этилен). Они могут играть ключевую роль в приобретенной локальной (local-acquired resistance, LAR) и системной устойчивостях (systemic-acquired resistance, SAR). HR представляет собой механизм, убивающий клетки как патогена, так и хозяина [O`Connell, 2006].

1.5 Физиологические расы Plasmopara halstedii

В 1970-е в Европе и Северной Америке начали интенсивно возделываться гибриды подсолнечника, и ложная мучнистая роса стала одним из наиболее вредоносных заболеваний. Было заявлено о существовании у патогена физиологических рас, хотя ситуация в то время была относительно простой. До 1978 года на подсолнечнике были известны только две расы, названные по их географическому происхождению: раса 1 (европейская) - в Европе и раса 2 (Red River Valley) - в долине Красной реки штатов Северная Дакота и Миннесота (США) и в прилегающей части Канады. Также раса 2 имелась в Италии и Румынии [Zimmer, 1974, p. 1465-1467]. Расы определялись по восприимчивости к ним линий подсолнечника с геном устойчивости Pl1. На этой стадии еще не было стандартизированных линий-дифференциаторов подсолнечника и международной договоренности по номенклатуре рас.

С начала 80-х прошлого столетия несколько рас было идентифицировано в США такими учеными, в то время как в Европе новые расы не обнаруживались. Однако с начала 90-х ХХ века, новые расы P. halstedii были выявлены и в США, и в нескольких странах Европы. К 2007 году в мире идентифицировано не менее 36 рас P. halstedii. Но это вовсе не означает, что все эти расы по-прежнему существуют, или что все найденные в той или иной стране расы все еще в ней присутствуют и что выявленный расовый состав популяций именно таков. Это связано с тем, что количество идентифицированных рас в данном районе зависит не только от эволюции патогена, но и от того, насколько лимитирована или обширна коллекция собранных изолятов оомицета. Так, в таких странах, как Франция, Канада, США, где были предприняты значительные усилия для сбора изолятов P. halstedii, идентифицировано большое количество рас. При этом в странах, где патологией подсолнечника занимается ограниченное число ученых или где лимитирующим фактором является климат, имеется всего несколько сообщений об идентификации рас.

Значительна разница по количеству рас P. halstedii и их вирулентности на разных континентах. В Азии и Южной Америке их обнаружено четыре и пять соответственно, в Африке - 10, в Европе - 21. Максимальное количество - в Северной Америке: 24, что неудивительно, так как именно оттуда и произошел патоген. Большое количество рас в Европе объяснимо тем, что здесь подсолнечник возделывается давно и интенсивно [Gulya, 2007, p.130-134].

Наибольшее количество рас P. halstedii выявлено в таких странах, как Канада, Франция и США - 20, 14 и 13 соответственно.

1.6 Методы борьбы с возбудителем ложной мучнистой росы подсолнечника

Защита растений от вредных организмов - обязательное звено в технологии возделывания сельскохозяйственных культур. Это особенно важно в условиях интенсивного сельскохозяйственного производства, отдельные элементы которого часто способствуют развитию болезней. Так, при высоком насыщении севооборотов одной культурой создаются идеальные условия для быстрого накопления и последующего распространения патогенов. Внесение удобрений в высоких дозах часто приводит к тому, что возрастает восприимчивость растений к патогенам. Возделывание преобладающих сортов сельскохозяйственных культур на больших площадях в благоприятных для болезни условиях может вызвать эпифитотийное развитие болезни. Мероприятия по защите растений от болезней должны основываться на всестороннем изучении самой болезни, биологических особенностей патогена и защищаемого растения. Легче предупредить болезнь, чем бороться с самим заболеванием или вылечить уже заболевшее растение.

Профилактические мероприятия можно разделить на несколько групп:

1) меры, направленные на уничтожение источников первичной инфекции;

2) мероприятия, ограничивающие распространение патогена от растения к растению;

3) мероприятия, повышающие устойчивость растений к болезни.

Защитные мероприятия можно осуществлять с помощью различных методов: селекционно-семеноводческого, агротехнического, химического, биологического и др.

Селекционно-семеноводческий метод. Наиболее надежный метод защиты растений от болезней - возделывание устойчивых сортов. Селекционерами созданы сорта подсолнечника, устойчивые к отдельным расам возбудителя ложной мучнистой росы. Задача агрономов - внедрять в производство устойчивые сорта и в дальнейшем поддерживать эту устойчивость специальными приемами. Среди них решающее значение имеет организация семеноводства и питомниководства, обеспечивающая поддержание сортовой устойчивости на должном уровне и получение здорового посевного и посадочного материала. Один из важнейших элементов этой работы - создание семенных или маточных участков, на которых в обязательном порядке осуществляется комплекс защитных мероприятий. Цель этих мер - полное исключение болезней на растениях [Шкаликов, 2010, с. 90-91].

Агротехнический метод. Агротехника - это фон, на котором развиваются взаимоотношения между растением и патогеном. Агротехнические приемы не всегда могут полностью исключить развитие болезни, но такие мероприятия, как севооборот, выбор оптимальных сроков и способов посева (посадки), регулирование уровня минерального питания, дают возможность снизить ее вредоносность. Севооборот - универсальный агротехнический прием защиты от большинства оомицетных и бактериальных заболеваний. Чередование культур предотвращает накопление патогенов, особенно таких, которые сохраняются с растительными остатками или свободно в почве. При включении культур в севооборот и планировании очередности их выращивания в первую очередь учитывают такие биологические особенности возбудителей болезней, как длительность сохранения патогенов в почве и филогенетическая специализация [Шкаликов, 2010, с. 91-92]. Учитывая возможность распространения P. halstedii с семенами, ветром, через почву, в совокупности с наличием инфицированных патогеном сорняков и падалицы, а также со способностью многолетнего сохранения ооспор в растительных остатках, использование агротехнических методов для контроля заболевания весьма ограничено. Безусловно, важно уничтожение падалицы и сорных растений, которые могут служить источниками и резерватами инфекции. Рекомендуемые семилетние ротации подсолнечника в севооборотах не соблюдаются по коммерческим причинам. Некоторыми зарубежными практиками рекомендуется хотя бы четырехлетняя ротация, но и она зачастую не выдерживается [Анащенко, 1978, с. 12-13].

Применение биопрепаратов. Попытки подбора биологических препаратов для борьбы с оомицетами предпринимались неоднократно. Существует несколько примеров коммерческого использования препаратов, созданных на основе штаммов оомицетов Trichoderma spp., Gliocladium spp., Pythium spp. и бактерий Bacillus spp., Enterobacter spp. и Pseudomonas spp. Некоторыми исследователями [Ban, 2004; Bonas, 1999; Bouterige, 2000; Cachinero, 1996; Tosi, 1998] были выделены миковирусы из P. halstedii, но использование их в производстве биопрепаратов не представляется в настоящее время возможным. К наиболее перспективным среди биологических методов контроля заболевания можно отнести индукторы устойчивости растений к патогену. Имеются данные об успешном их применении, однако и этот ресурс пока не находит широкого применения.

Химический метод. Этот метод занимает важное место в защите сельскохозяйственных культур от болезней. Он основан на использовании фунгицидов - органических и неорганических соединений, токсичных для фитопатогенов. Применяя фунгициды, стремятся исключить возможность первичного заражения и появления болезни, а затем не допустить или ограничить повторное ее распространение. Фунгициды, предупреждающие заражение, но не способные вылечить заболевшие растения, называют защитными, а препараты, способные подавлять возбудителя, внедрившегося в ткани растения, - лечащими, или терапевтическими. По действию на патогены выделяют контактные и системные фунгициды. Контактные препараты оказывают местное действие на возбудителя, а системные способны не только проникать в растение, но и передвигаться в нем, подавляя возбудителя в процессе его распространения по тканям растения. К фунгицидам контактного действия относят бордоскую смесь, каптан и др. Системным действием обладают фундазол, байтан универсал, беномил, топсин-М, тилт, альто, реке и др. По целевому назначению все фунгициды можно разделить на следующие группы: протравители семян, препараты для обработки вегетируюших растений, препараты искореняющего действия (для обработки растительных остатков и многолетних растений в период покоя), фунгициды для обеззараживания почвы. Протравливание семян и посадочного материала направлено в первую очередь на обеззараживание от патогенов, находящихся на поверхности или внутри. Вторая цель протравливания семян - защитить проростки от инфекции, сохраняющейся в почве. Само протравливание проводят полусухим способом или с использованием пленкообразующих веществ. В любом случае поверхность семян должна быть покрыта препаратом. Обеззараживание почвы и почвенных субстратов проводят главным образом в защищенном грунте, так как там выращивают одни и те же культуры на одном месте, что ведет к быстрому накоплению возбудителей. В открытом грунте обеззараживание почвы химическими препаратами проводят только при выявлении очагов опасных карантинных заболеваний. Для обработки вегетирующих растений фунгицидами применяют опрыскивание. Используют различную аппаратуру, способную нанести препарат в виде водного раствора или водной суспензии (обычно то и другое называют рабочим раствором) на всю поверхность растений. Эффективность химической обработки зависит от срока обработки, ее качества и выбора препарата. Химический метод по объему применения занимает ведущее место в защите растений. Однако этот метод не лишен серьезных недостатков. Использование химических препаратов приводит к загрязнению окружающей среды и растительной продукции, поэтому применять фунгициды следует согласно инструкции.

В США, странах Европы и многих других использование фунгицидов против ложной мучнистой росы подсолнечника первостепенно и обязательно. Резкое повышение вредоносности болезни там в конце 60-х годов прошлого века привело к необходимости повсеместного использования против семенной и почвенной инфекции протравителя апрон. Его действующее вещество - металаксил, высокоэффективный долгое время. В начале 80-х годов ХХ столетия в Венгрии, в 1996 - во Франции и в 1998 - в США у отдельных изолятов P. halstedii проявилась устойчивость к ядохимикату. С того момента количество таких изолятов неизменно растет. В настоящее время наиболее эффективно используется фунгицид на основе мефеноксама - изомера металаксила - и ведется поиск новых средств, в том числе - смесей металаксила с другими фунгицидами.

Биологический метод. Основан на использовании микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности для подавления возбудителей болезней, включая ложную мучнистую росу подсолнечника. Основой биологической защиты служит явление антагонизма в природе. Антагонистические взаимоотношения микроорганизмов характеризуются тем, что один вид подавляет другой. Например, при одновременном высеве на субстрат актиномицеты вытесняются бактериями из-за более высокого темпа размножения последних. Но этого не происходит, если актиномицет выделяет специфические продукты обмена, подавляющие развитие бактерий, так называемые антагонистические вещества. Они обладают высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам организмов (вирусам, бактериям, простейшим, оомицетам). Следует шире применять биологический метод защиты от болезней как наименее опасный для человека и животных, экологически безвредный.

1.7 Генетическая устойчивость подсолнечника к ложной мучнистой росе

В связи с резким нарастанием вредоносности ложной мучнистой росы подсолнечника, были начаты интенсивные исследования по созданию устойчивого сортимента. В 1955-1956 годах были получены межвидовые гибриды при скрещивании топинамбура (Helianthus tuberosus) с культурным подсолнечником (сорт ВНИИМК 8931). Они и послужили исходным материалом для получения форм, устойчивых к ложной мучнистой росе, а также к заразихе и ржавчине [Пустовойт, 1988, с.66-67].

Характер наследования устойчивости к болезни впервые установили румынские ученые, в результате чего была создана резистентная линия подсолнечника AD 66. С ее помощью на европейском и американском континентах в популяциях P.halstedii была впервые идентифицирована "европейская", или физиологическая раса 1 (100). Линия AD 66 к расе 1 была устойчива. После того, как в США было зарегистрировано поражение данной линии ложной мучнистой росой, у возбудителя болезни была идентифицирована "Red River race", или физиологическая раса 2 (300) [Zimmer, 1974, p.1467]. В дальнейшем эта раса была выявлена в разных странах, где возделывался подсолнечник.

В мире создано множество линий-дифференциаторов подсолнечника, с помощью девяти из которых в настоящее время идентифицируются расы P.halstedii.

Как показали исследования, устойчивость подсолнечника к болезни, а точнее, к физиологическим расам ее возбудителя, контролируется отдельными независимыми генами. Их обозначают индексом Pl. Прослеживая расовый состав милдью, проводились исследования по выявлению этих генов, которых заявлено 12. Они широко используются в селекции подсолнечника.

После выявления рас в популяции P.halstedii, оценку устойчивости подсолнечника к паразиту в большинстве стран стали осуществлять с учетом физиологической специализации возбудителя болезни. Расоспецифическая устойчивость - надежная защита культуры и имеет преобладающее значение в работе многих селекционеров. Однако при формировании новых рас патогена растение оказывается незащищенным, если оно не содержит генов иммунитета к новой расе.

Так, ген устойчивости Pl 2 давал полный контроль болезни во Франции в течение десяти лет - с 1978 по 1988 годы. Гены Pl 6, Pl 7 также были эффективны десять лет (с 1991 по 2001 годы). Опыт Франции показал, что после относительно продолжительных периодов стабильности генетической устойчивости к милдью, наступают периоды дисбаланса вследствие появления новых рас патогена. Учеными постоянно ведется поиск ресурсов генов устойчивости, в том числе и среди дикорастущего подсолнечника.

Несмотря на то, что обнаружены гены устойчивости и выведены различные линии подсолнечника, несущие их, до сих пор не удалось создать ни одного коммерческого гибрида, резистентного одновременно ко всем расам P. halstedii. Поэтому селекция ведется адаптировано к местным условиям, с учетом присутствующих рас патогена [Vear, 2004, p.15-18].

Исследованиям биологических свойств возбудителя болезни, оомицета Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, и разработке мер борьбы с ним уделяли большое внимание многие ученые нашей страны. Интенсивные исследования, в том числе и по созданию устойчивого сортимента, проводились ими в связи с резким нарастанием вредоносности ложной мучнистой росы в 50-60-е годы ХХ столетия. Результатом стали первые межвидовые гибриды подсолнечника, устойчивые к паразиту.

Однако с тех пор прошло более 50 лет: изменились климатические условия, проведено неоднократное сортообновление подсолнечника, появились отечественные гибриды, а также произошла экспансия в страну иностранных. У патогена появились физиологические расы, которых, по последним данным, более 30. Кроме того, у оомицета все чаще стала проявляться резистентность к фунгицидам. Этот фактор обусловил использование других методов контроля, среди которых основополагающим является селекция на устойчивость к заболеванию.

Как показали описанные исследования ученых, устойчивость подсолнечника к болезни, а точнее, к физиологическим расам ее возбудителя, контролируется отдельными независимыми генами и их комплексами. В связи с этим во многих странах постоянно изучается расовый состав популяции P. halstedii. Селекция подсолнечника ведется адаптировано к местным условиям - с учетом присутствующих рас оомицета. В то время как в большинстве стран мира структура популяции паразита хорошо изучена, по России эти сведения крайне ограничены.

В связи с этим перед нами была поставлена цель - изучить расовый состав возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в Краснодарском крае.

1.8 Морфометрическое исследование спороношения Plasmopara halstedii на проростках подсолнечника

При идентификации рас с помощью стандартного набора линий-дифференциаторов подсолнечника не всегда удается четко дифференцировать некоторые патотипы P. halstedii. Всевозможные маркерные признаки для дифференциации рас были бы полезны. Одним из таких маркеров могли бы послужить размеры и форма зооспорангиев у разных рас патогена.

Нахождение морфологических особенностей патотипов патогена могло бы способствовать разрешению спорных вопросов, которые возникают при идентификации рас с помощью линий-дифференциаторов подсолнечника. Кроме того, эти признаки помогли бы выявить связь между расами патогена, обнаружить внутрирасовую изменчивость, обусловленную накоплением признаков адаптации к генетическим изменениям хозяина и к условиям обитания.

Известно, что P. halstedii образует спороношение как на листьях и стеблях, так и на корнях растений, что отмечали Н.Д. Новикова [Новикова, 1960] и Н.С. Новотельнова [Новотельнова, 1966]. Н.С. Новотельнова [Новотельнова, 1966] обозначила спороношение на листьях как б-спороношение (типичное по морфологии для Plasmopara sp.) и в-спороношение - на корнях (типичное по морфологии для Phytophthora sp.). Спороношение оомицета на разных частях растений подсолнечника различается морфологически, что и было отмечено в работах указанных авторов. Безусловно, это явление было очевидным и в исследованиях ВНИИМК (рисунок 1).

Задача исследования заключалась в сравнении форм и размеров зооспорангиев у разных рас патогена из идентичных участков растения-хозяина в одинаковых условиях выращивания. При проведении исследований было принципиально важным создать равные условия для всех образцов: одинаковые температурный режим, генотип подсолнечника, возраст проростков и спороношения, локализация исследуемого спороношения на проростках.

Как было предусмотрено методикой, ежедневно с первых по шестые сутки с момента образования наблюдалось спороношение оомицета, образовавшееся на верхней стороне семядолей одновозрастных проростков

сорта ВНИИМК 8883.

Установлено, что в созданных условиях (влажность 100%, температура 17°С) максимального размера зооспорангии достигали на 4-е сутки после образования спороношения. Пределы варьирования их максимальных размеров составили 31-58,9х40,3-108,5 мкм без существенных межрасовых различий (таблица 1).

Таблица 1 - Морфометрическое исследование зооспорангиев рас Plasmopara halstedii с верхней стороны семядольных листьев проростков подсолнечника



Рисунок 1 - Спороношение P. halstedii на семядолях, стебле и корнях проростка подсолнечника, ВНИИМК, 2004-2007

В указанных условиях, благоприятных для роста и развития оомицета, образование новых спорангиеносцев и зооспорангиев продолжалось непрерывно (рисунок 2).

Рисунок 2- Зооспорангии и спорангиеносцы Plasmopara halstedii (4-дневное спороношение): зооспорангии: a - старые (уже без зооспор); b - молодые

ИДШ (индекс отношения длины зооспорангия к его ширине) на вторые сутки после образования спороношения у расы 700 составил 1,671,71 в сравнении с индексами 1,151,73, 1,361,66 и 1,251,58 у рас 330, 710 и 730 соответственно. В доверительный интервал расы 330 входили доверительные интервалы остальных рас, при этом доверительные интервалы рас 710 и 730 не перекрывались с 700-ой.

Также была изучена форма зооспорангиев у реизолятов разных рас. Наблюдали ее варьирование. Молодым была присуща шаровидная. Зрелые зооспорангии у реизолятов рас 330, 700 и 730 могли быть эллипсовидными, яйцевидными, лимоновидными и грушевидными. Среди реизолятов расы 330 наблюдался широкий диапазон варьирования также и по форме зооспорангиев. У некоторых преобладали округлые зооспорангии и эллипсоидные, у других были преимущественно грушевидные, у отдельных грушевидные отсутствовали вовсе. Для реизолятов расы 700 было характерно большое количество зооспорангиев грушевидной формы уже в первые сутки образования спороношения, в то время, как у рас 330 и 730 на этом сроке грушевидные зооспорангии присутствовали лишь спорадически. На протяжении всего срока исследований, в спороношении с семядолей проростков подсолненика ни у одного из реизолятов расы 710 коллекции не отмечено грушевидных зооспорангиев (рисунок 3).

Таким образом, раса 330 имела наибольший диапазон варьирования индекса отношения длины к ширине зооспорангиев в фиксированных условиях развития на верхней стороне семядольных листьев проростков подсолнечника. Ее доверительный интервал включал в себя пределы варьирования индексов рас 700, 710 и 730. Доверительный интервал индекса отношения длины к ширине зооспорангиев у расы 700 не перекрывался с таковыми у рас 710 и 730, что свидетельствовало о существенных различиях между ними по размерам зооспорангиев.

Зооспорангии изученных рас на семядольных листьях проростков подсолнечника имели разнообразную форму: округлую, овальную, лимоновидную, яйцевидную, ланцетовидную и грушевидную. Раса 710 отличалась от других отсутствием зооспорангиев грушевидной формы.

2. Природные условия Краснодарского края

2.1 Географическое положение

Краснодарский край расположен в западной части Большого Кавказа.

Территория края лежит в пределах следующих координат:

на севере - 46°50' с.ш. - х. Молчановка (Щербиновский район);

на юге - 43°30' с.ш. - с. Веселое (Адлерский район Большого Сочи);

на западе - 36°36' в.д. - мыс Тузла (Темрюкский район);

на востоке - 41°44' в.д. - х. Зеленчук (Отрадненский район).

Протяженность с севера на юг составляет около 372 км, с запада на восток - 380 км. Географические координаты исторического центра г. Краснодара - 45°02' с.ш. и 39° в.д.

Площадь края - 76 тыс. км². Границы края имеют протяженность 1540 км, из них морские - около 740 км, в том числе Черноморское побережье Краснодарского края протянулось на 390 км. Краснодарский край имеет государственную границу с Грузией и Украиной. В Черном море морская граница (акватория) ограничивается 12-мильной (22,4 км) зоной государственных территориальных вод России [Нагалевский, 2001, с. 5-6].

2.2 Геология и рельеф

Современный рельеф края сформировался в результате взаимодействия внутренних тектонических сил, определивших крупные его черты, и внешних денудационных сил, придавших этим крупным формам различный облик. В крае прослеживается четкая взаимосвязь между рельефом и геологическим строением территории.

Основными тектоническими структурами, определяющими движение земной коры и историю ее развития на территории края, являются Скифская платформа и сформировавшиеся в альпийскую складчатость горы Большого Кавказа и предгорные прогибы. Четкая выраженность геологических структур в рельефе прослеживается и к северу от Главного и Передового хребтов, где в результате поднятий образовалась полоса пологого поднятия пластов горных пород с пологими северными и крутыми или обрывистыми южными склонами - куэсты. Самой крупной куэстой является Скалистый хребет, начинающийся у долины р. Белой в районе п. Каменномостского и ст-цы Даховской.