Оценка действия цинка и эпибрассинолида на растения ячменя на дерново-подзолистой почве и черноземе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Факультет почвоведения

Кафедра агрохимии

Москва

2009 год

Содержание

I. Введение

II. Обзор литературы

II.1 Цинк как элемент минерального питания растений. Роль цинка в системе регуляции растения

II.2 Хелатная форма цинка

II.3 Явление эффективности цинка. Влияние корневой системы на доступность почвенного цинка

II.4 Механизмы поглощения и барьерная функция растений

II.5 Понятие о фитогормонах. Физиологические эффекты брассиностероидов

III. Материалы и методы

III.1 Культура

III.2 Вегетационные опыты

III.3 Аналитические методы

III.4. Статистические методы

IV. Результаты и их обсуждение

IV.1 Влияние цинка на дерново-подзолистой почве

IV.2 Влияние эпибрассинолида на дерново-подзолистой почве

IV.3 Влияние цинка на черноземе

V. Заключение

VI. Выводы

VII. Список литературы

VIII. Приложение

I. Введение

В современном сельском хозяйстве человек способен изменять естественные природные условия за счет грамотной и научно обоснованной обработки почвы, внесения удобрений и агрохимических средств защиты растений. В настоящее время идет активный поиск, изучение и внедрение в производство новых химических соединений, способных воздействовать на рост, развитие и продуктивность растений. Большой простор для научных исследований создает проблема дефицита биогенных микроэлементов в почве, в частности цинка. Цинк является жизненно важным трофическим элементом, который также выполняет регуляторные функции, то есть способен изменять гормональный статус растений. Одной из таких разработок является применение хелатных форм металлов в микроудобрениях. Известно, что хелатированный металл гораздо проще усваивается растениями. До сих пор остаются актуальными вопросы, связанные с их применением: поиск оптимальных концентраций, доз и сроков внесения, форм удобрений. Представляется важным исследовать их взаимосвязь с уровнем минерального питания и естественного плодородия почвы, а также взаимодействие с различными средствами химизации.

Вместе с тем не только недостаток, но и избыток микроэлементов (вследствие токсичности высоких концентраций) является лимитирующим фактором для растений, поэтому всегда существует опасность загрязнения среды и продукции тяжелыми металлами при неправильном применении удобрений и техногенных выбросах. Следовательно, применение микроудобрений требует выявления оптимальных и максимально допустимых концентраций цинка.

Кроме того, с экологической точки зрения интересны и другие научные разработки - препараты на основе фитогормонов. В растительном организме существует внутренняя система регуляции, способная поддерживать гомеостаз растения - гормональная. Гормоны в растении осуществляют координацию между отдельными клетками, тканями и органами и регулируют большинство физиологических процессов, влияя на рост, и развитие растений. Они же играют ведущую роль в адаптации растения к факторам среды. Исследования последних лет показывают, что с помощью экзогенных гормонов можно искусственно регулировать процессы развития растений в соответствии с потребностями человека. Предпосылками к этому служат чрезвычайно малые концентрации, стимулирующие рост и развитие, широкий спектр влияния и экологическая безопасность гормонов роста растений. Между тем, условия минерального питания, соотношение макро- и микроэлементов - это мощный фактор действия на развитие растений.

В литературе обсуждается взаимосвязь гормонального статуса растений и условий минерального питания, однако в целом - данный вопрос о взаимодействии двух физиологических систем - гормональной и трофической - мало изучен. Исследования в этом направлении могут способствовать повышению эффективности агротехнических мероприятий, направленных на повышение урожайности и адаптацию растений в условиях стресса.

Целью данной работы являлось изучить действие дозы хелатной формы цинка в комплексе с минеральным питанием на рост и развитие ярового ячменя на разных типах почв и поиск способа нивелирования негативного действия его высоких концентраций (влияние экзогенного гормона эпибрассинолида (ЭБ)).

В задачи исследования входило:

1. Проследить взаимосвязь между содержанием цинка в почве и его накоплением в различных частях растения.

2. Оценить влияние хелата цинка в дозе 25 мг/кг на урожай ячменя на дерново-подзолистой почве и черноземе.

3. Определить влияние цинка на содержание азота, фосфора и калия в соломе и зерне ячменя.

4. Оценить изменение поступления цинка под действием фитогормона ЭБ.

5. Оценить влияние гормона ЭБ на урожай ячменя на двух типах почв в присутствии исследуемых формы и дозы цинка.

Для выполнения поставленных задач изучались следующие показатели:

· Биомасса и структура урожая

· Аккумуляция основных макроэлементов (азот, фосфор, калий) растениями

· Аккумуляция цинка растениями

II. Обзор литературы

II.1 Цинк как элемент минерального питания растений. Роль цинка в системе регуляции растения

В растительном организме существует несколько эволюционно сформировавшихся систем регуляции, обеспечивающих целостное поведение растительного организма. На межклеточном уровне это трофическая, гормональная и электрофизиологическая системы, на внутриклеточном - метаболическая, генетическая и мембранная системы регуляции.

Трофическая регуляция - взаимодействие с помощью питательных веществ - наиболее простой способ связи между клетками, тканями и органами. Среди трофических веществ важную роль играют микроэлементы, в частности, цинк.

Первые сведения о цинке как необходимом элементе питания растений были получены во второй половине XIX века. В 1869г. французский ученый J. Raulin выявил необходимость цинка для жизнедеятельности гриба Aspergillus niger. В 1872г. К.А.Тимирязев установил, что внесение цинка способствует устранению хлороза у растений. В 1926г. А.Зоммер и С.Липман доказали необходимость цинка для высших растений. Исследования, проведенные в США, показали, что внесение цинка на почвах, где наблюдается его дефицит, положительно сказывается на развитии растений. Так, в штате Флорида, на почвах, бедных цинком, наблюдалось массовое заболевание растений кукурузы (побеление верхушек). Внесение цинка не только устранило симптомы заболевания, но и способствовало повышению урожая на 35-74%. Цинк улучшает водоудерживающую способность растений, повышает их устойчивость к засухе, бактериальным и грибковым заболеваниям (Harsharn et al., 2001).

Цинк входит в состав многих ферментов в качестве интегрального компонента, выполняя при этом каталитическую или структурную функции. Он входит в состав фермента карбоангидразы, катализирующего гидратацию CO2 и играющего важную роль в поддержании запасов CO2 для процесса фотосинтеза. Наблюдается прямая связь между интенсивностью фотосинтеза, активностью карбоангидразы и обеспеченностью растений цинком. Также структурную роль цинк выполняет, входя в состав фермента алкогольдегидрогеназа и Zn-содержащих белков, включенных в процессы репликации ДНК и экспрессии генов. Цинк также тесно связан с белковым обменом: он входит в состав энзимов, РНК-полимеразы, активирует многие ферменты.

Гормональная система - важнейший фактор регуляции и управления у растений. Известно, что ауксин и цитокинины необходимы для индукции деления растительных клеток. Избыток ауксина в этой паре фитогормонов включает генетическую программу корнеобразования, а избыток цитокинина - программу развития побегов. Цинк влияет не только на ход физиологических процессов, но и на гормональный баланс растений, участвуя в синтезе предшественника фитогормона ауксина (ИУК) - аминокислоты триптофан. Цинк, таким образом, влияет на темп роста растений; в условиях дефицита цинка уровень ИУК в тканях растений уменьшается. Опыты с растениями картофеля (Король и др., 2001) показали, что внесение сульфата цинка в сочетании с экзогенными фитогормонами на фоне оптимального минерального питания значительно повышает содержание в листьях растений цитокининов, зеатина и его рибозидов, но снижает содержание абсцизовой кислоты. Важно подчеркнуть, что в целом растительном организме осуществляется принцип иерархии систем регуляции. Таким образом, межклеточные системы регуляции на клеточном уровне действуют только через внутриклеточные системы регуляции, то есть через метаболическую, генетическую и мембранную системы. Следовательно, участие цинка в регуляциях осуществляется следующими механизмами:

§ Изменение функциональной активности ферментов при метаболической регуляции, т.к интенсивность работы фермента определяется наличием кофакторов: коэнзимов для двухкомпонентных ферментов, ингибиторов, либо специфически действующих ионов двухвалентных металлов (Mg2 +, Mn2+,Zn2+).

§ Дифференциальная активность генов зависит от действия различных факторов, в том числе и фитогормонов (например, ауксина). Для реализации генетической информации, хранящейся в ДНК хромосом, в клетке существует сложная система управления, не все стороны которой в настоящее время известны.

§ Мембранная регуляция осуществляется благодаря изменениям в мембранном транспорте, связыванию или освобождению ферментов и регуляторных белков и путем изменения активности мембранных ферментов. Цинк является важным структурным компонентом биологических мембран, играя роль в их интеграции. Он защищает липиды и белки от окислительной деструкции. Повышение проницаемости мембран рассматривается как типичный признак дефицита элемента (Полевой, 1986).

Таким образом, цинк не только играет важную роль в минеральном питании растений, но и влияет на их гормональную систему.

Цинк широко распространен в природе, его среднее содержание в земной коре составляет около 83 мг/кг, а в поверхностных слоях почв изменяется от 17 до 125 мг/кг. Однако среди неблагоприятных абиотических факторов, связанных с минеральным питанием, недостаток цинка является одним из наиболее распространенных лимитирующих факторов для урожайности; он характерен для 30% почв в мире.

На территории Российской Федерации дефицит цинка характерен для 95,5% почв. Недостаток цинка вызывает серьезные физиологические расстройства (нарушение углеводного и фосфатного обмена, уменьшение содержания сахарозы и крахмала, распад белков), повышает проницаемость мембран, что приводит к накоплению в растении токсических концентраций бора и хлоридов, приводит к резкому торможению роста и развития растений. Характерными внешними признаками недостатка цинка являются заторможенный рост, короткие междоузлия, маленькая поверхность листа, хлороз. Рост побега обычно подавляется больше, чем рост корней; урожай семян снижается больше, чем вегетативных органов.

Среднее содержание цинка в растениях 15-22 мг/кг сухого вещества. В целом оно колеблется в пределах от 1,2(яблоки) до 73(салат) мг/кг сухого вещества (Кабата-Пендиас, 1989). Верхняя критическая концентрация цинка в растениях - 300 мг/кг сухого вещества. Из органов растений повышенным содержанием цинка отличаются листья, генеративные органы и точки роста. Симптомы дефицита наблюдаются (для ряда растений), если содержание цинка в органах растений не превышает 15 мг/кг сухой массы (Битюцкий, 1999).

Недостаток цинка проявляется, прежде всего, на карбонатных, сильно известкованных почвах, где мало подвижного цинка. Разные виды растений, а также генотипы отдельных видов проявляют различную, генетически обусловленную степень толерантности к дефициту цинка. К недостатку цинка особенно чувствительны плодовые деревья, а также бобы, кукуруза, соя, фасоль, хмель и лен; менее чувствительны картофель, томаты, лук, люцерна, просо, свекла, красный клевер; совсем не реагируют овес, пшеница, горох, спаржа, горчица, морковь (Кабата-Пендиас, 1989). Некоторые генотипы растений способны поддерживать нормальный уровень роста и урожайности при низком содержании цинка в почве; данное явление называется эффективностью цинка (ЭЦ). Некоторые растения, например, Thlaspi caerulescens (ярутка), способны извлекать цинк из малодоступных источников в почве и накапливать его значительные количества (до 1-2%).

Агрохимические приёмы позволяют регулировать уровень дефицита микроэлементов за счет ряда механизмов, которые связаны как с поведением микроэлемента в почве, так и физиологических особенностей растения. При этом необходимо учитывать, что положительное действие цинка в полной мере проявляется на фоне оптимального минерального питания в целом. Особенно важную роль играет содержание фосфора, так как при повышенном содержании фосфатов в почве снижается доступность цинка растениям за счет образования труднодоступных соединений. Возникает так называемый индуцированный недостаток одного элемента, обусловленный избытком других. Основной причиной индуцированного недостатка элементов является нарушение доз и соотношений элементов во вносимых удобрениях. Возникающий дисбаланс влечет за собой цепь изменений в метаболизме растений, вызывает нарушения. Следовательно, для успешного совместного применения макро- и микроудобрений необходимо установление оптимальных доз и сочетаний азотно-фосфорно-калийных удобрений.

С явлением дефицита цинка можно бороться путем применения удобрений, но при этом необходимо учитывать, что цинк относится к приоритетно токсическим элементам (наряду с Hg, Cd, Pb, Cr, Cu, Ni и As), поэтому его избыток также может привести к губительным последствиям. Следовательно, при применении микроудобрений очень важную роль играет оптимальная концентрация микроэлемента. Так, при внесении сульфата цинка на темно-каштановой среднесуглинистой почве значительное увеличение высоты и биомассы проростков яровой пшеницы наблюдалось при дозе цинка 125 мг/кг почвы. При дозах цинка 250-1500 мг/кг, напротив, наблюдалось угнетение роста проростков (Панин, Касымова, 1999). Рассматриваются в связи с загрязнениями среды тяжелыми металлами и возможности использования способов фиторемедиации - регуляции избыточных концентраций того же цинка с использованием растений - гипераккумуляторов.

II.2 Хелатная форма цинка

Цинк может быть ограничивающим фактором для роста растений. Реакция зерновых на внесение цинковых удобрений меняется в зависимости от источника цинка и почвенных физико-химических свойств. Из цинковых удобрений для устранения дефицита цинка главным образом использовались неорганические соли, синтетические хелаты, естественные органические комплексы, и неорганические комплексы. Несколько авторов сообщили о том, что хелаты цинка более эффективны, чем неорганические формы цинка (Prasad, et al., 1976). В соответствии с Андерсоном эффективность воздействия Zn-ЭДTA и Zn-ДTПA на рост превосходит таковую у ZnSO4 как источника цинка (Anderson, 1972). Андерсон сообщает, что относительная эффективность различных форм цинка сказываются на росте урожая в следующем порядке: Цинк-DTPA > Цинк-EDTA > Цинк-EDDHA > ZnSO4> Цинк-Rayflex (полифлавонид). Рико нашел, что внесение цинк-EDTA и цинк-лигносульфоната привело к большим увеличениям сухой массы урожая кукурузы, по сравнению с неорганическими источниками (Rico, 1996).

Цинк может быть найден в следующих формах в почвах:

(I) свободные и комплекcные ионы в растворе почвы, (II) специфично и неспецифично адсорбированные катионы, (III), ионы карбонатов почвы и гидроксидов, (IV) в биологических остатках и живых организмах, и (V) в структурной решетке первичных и вторичных полезных минералов (Emmerich et al., 1982).

Фракции металлов в почвах могут быть классифицированы так: водорастворимая, обменная, легкорастворимая, кислоторастворимая, фиксированная, прочнофиксированная формы цинка. Распределение металлов по различным фазам и формам, в которых они могут находиться в почвах, может быть определено путем однократного или последовательного выделения, причем зависит от типа экстрагирующих реагентов и последовательности экстракции. Измерение общего содержания цинка в почве не дает точную информацию о количестве этого микроэлемента в форме, доступной растениям. Когда в почву вносится концентрированный раствор цинкового удобрения, химический состав почвенного раствора резко меняется и изменяется химическая доступность цинка как питательного вещества. Т.о. доступность Zn растениям управляется скорее динамическим равновесием между различными формами, чем общим содержанием катиона в почвах (Elsokkary et al., 1978). Растениям доступны растворимые формы цинка. Корни растений поглощают Zn2+ (максимально подвижная форма), в том числе и гидратированную форму, а также комплексные ионы и Zn-органические хелаты.

В кислых дерново-подзолистых почвах содержание подвижных форм цинка выше (0,12-20 мг/кг), чем в почвах с близкой к нейтральной и щелочной реакцией среды. В черноземах, сероземах, каштановых и бурых почвах содержание подвижных форм цинка обычно не превышает 0,25 мг/кг (Битюцкий, 1999).

Стабильность химической связи металл - хелата способствует увеличению количества хелатного металла, доступного растениям. Хелаты - единственные вещества в почве, в которых скорость замещения хелатного металла на другие катионы достаточно низкая.

При применении хелатных форм удобрений необходимо учитывать такие факторы, как устойчивость и подвижность комплексов. Среди факторов, которые решительно влияют на подвижность, и экстрагируемость Zn - pH и концентрация CaCO3 (Adriano, 1986).

В известкованных почвах в случае внесения в качестве цинкового удобрения в виде растворимой неорганической соли цинк выщелачивается, если это - устойчивый комплекс. Подвижность тяжелых металлов в почвах может анализироваться использованием почвенных колонок (Emmerich, et al., 1982). Использование этого метода позволяет изучить перемещения и распределения Zn в почве. ALVAREZ и RICO провели опыты по определению относительных подвижностей Zn-EDTA и Zn-лигносульфоната (LS) - хелатов, добавленных в качестве удобрений в колонки карбонатных почв (1996). В случае внесения негранулированного Zn-EDTA приблизительно 51 % цинка перемещается через субстрат благодаря ирригации и выщелачивается, но только 10 % при использовании гранулированной формы, процент от наиболее лабильных фракций в некоторой степени увеличился относительно контрольного образца по всей колонке. Zn-LS мигрировал в малой степени, особенно с гранулированными удобрениями; Zn в лабильных формах оставался обычно в верхней зоне столбца. Т.о. сопоставление между гранулированными удобрениями и не гранулированными показывает, что внесение первых улучшает действие Zn- EDTA, уменьшая выщелачивание и увеличивая количество доступного Zn, но почти не оказывает полезного эффекта для Zn - LS удобрений.

Также Alvarez и др. нашли различия для почв Aquic Haploxeralf (кислые) и Haploxeralf (нейтральные) после применения в эксперименте колонки Цинк-EDDHA, Цинк-EDTA, Цинк-гептаглюконата, Цинк-полифлавонид, Цинк лигносульфоната, и Цинк-фенолята. В кислой почве, внесение шести органических комплексов цинка привело к очень малому перемещению цинка по колонке и очень небольшому выщелачиванию цинка в колонках почвы. Тот же самый эффект оно имело и в нейтральной почве, за исключением внесения Цинк-EDTA, который привел к потере цинка через выщелачивание. Чтобы оценить косвенно потенциальную подвижность и биодоступность металлов в почвах были использованы последовательные процедуры извлечения.

Подвижность цинка на глубине зависит от гранулометрического состава. Движение цинка, включенного в почвенный раствор, тесно связано с проницаемостью профиля. Отмечено большее влияние на проницаемость структуры почвы, чем гранулометрического состава.

II.3 Явление эффективности цинка. Влияние корневой системы на доступность почвенного цинка

Некоторые генотипы растений способны поддерживать нормальный уровень роста и урожайности при низком содержании цинка в почве; данное явление называется эффективностью цинка (ЭЦ). Исследования показали отсутствие связи между ЭЦ и количеством цинка, поглощенного корнями, транспортом цинка в побеги или аккумуляцией цинка побегами. Многие ранние исследования ЭЦ основывались на сравнении корневых систем эффективных и неэффективных генотипов растений (часто пшеницы); особое внимание уделялось их способности «добывать» цинк из почвы за счет повышения его доступности в ризосфере (Rengel et al., 1998). Некоторые химические (рН почвы, о-в потенциал, взаимодействие элементов), физические (органическое вещество, текстура почвы, содержание глины) и биологические явления (формирование микоризы, действие фитосидерофор), возникающие на границе корни - почва, могут влиять на доступность и поглощение цинка и, соответственно, на ЭЦ.

Строение корневой системы у разных видов и сортов растений различно; доступность цинка растениям и ЭЦ зависит также от этого фактора. Следовательно, более тонкие корни с высокой площадью поверхности способны повысить доступность цинка и других элементов питания за счет более полного распределения в почве (Rengel, Graham, 1995). Кроме того, корни некоторых растений взаимодействуют с микоризными грибами, что усиливает поглощение многих элементов, включая фосфор, медь и цинк. В частности, везикулярно-ветвящаяся микориза (ВВМ) оказала положительное действие на растения за счет увеличения площади распространения корневой системы и, следовательно, усиления поглощения цинка. Однако, генетические различия в ЭЦ, обнаруженные в полевых условиях, можно также заметить и у растений, выращенных с помощью гидропоники (без образования микоризы), поэтому ЭЦ не может объясняться только ролью микоризы для ЭЦ.

Химические изменения в ризосфере, включающие, в частности, изменение рН или освобождение органических лигандов, могут вызвать образование хелатов почвенного цинка, что повышает его доступность. При повышении рН почвы доступность цинка растениям снижается, а когда рН достигает значения выше 5,5, цинк адсорбируется почвенными соединениями, такими как гидроксиды алюминия, железа и марганца или осаждается специфическими соединениями (Marschner, 1995). Следовательно, процессы, регулируемые корневой системой, которые способны снизить рН в ризосфере, повышают доступность цинка растениям за счет его извлечения из органических и неорганических компонентов твердой фазы почвы.

Помимо влияния корневых выделений на ЭЦ, в ряде исследований изучалось также действие фитосидерофор (ФС). Фитосидерофоры - это небелковые аминокислоты, хелатирующие ряд микроэлементов, включая железо и цинк, и выделяемые корнями некоторых трав при дефиците железа (Marschner, 1995). Широко известно, что выделение ФС и корневая адсорбция Fe(III)-ФС являются важнейшими факторами питания трав железом. Некоторые исследователи считают, что ФС также принимают участие в питании трав цинком и, таким образом, влияют на ЭЦ. Например, травянистые растения при дефиците цинка выделяют ФС и таким образом повышают мобилизацию цинка и железа в почве (N. von Wiren et al.,1996). Данные по влиянию выделения корневых ФС на ЭЦ часто противоречивы. В работах некоторых ученых показано, что у Zn-эффективного генотипа ржи степень высвобождения ФС при дефиците цинка выше, чем у Zn- неэффективной твердой пшеницы. Однако в другом исследовании было обнаружено, что выделение ФС не связано с уровнем эффективности потребления цинка у разных генотипов пшеницы в условиях дефицита цинка (Erenoglu et al., 1996). В ряде других исследований роль фитосидерофор (ФС) в цинковом питании и ЭЦ отрицается. Исследователи пришли к выводу, что результаты предыдущих экспериментов по выявлению взаимосвязи между дефицитом цинка и выделением ФС зависели от методов выращивания растений и могут объясняться наличием дефицита железа, но не цинка. Очевидно, процесс выделения фитосидерофор не может играть ведущую роль для ЭЦ. Упомянутые выше наблюдения, что генотипические различия в ЭЦ, характерные для почв с дефицитом цинка, присутствуют также в том случае, когда те же растения выращивают методом гидропоники, опровергают важность роли ризосферных процессов в ЭЦ.

Поглощение цинка корнями и транспортировка в побеги Корни растений в основном поглощают цинк в виде иона Zn2+ , хотя у травянистых растений возможен второй путь, включающий поглощение Zn-ФС (Von Wiren et al., 1996). Корневое поглощение иона Zn2+ регулируется двумя различными транспортными системами: с высокой скоростью и низким сродством и низкой скоростью и высоким сродством, которая, вероятно, доминирует при недостатке цинка в почве.

Механизмы эффективности цинка в побегах

Как сказано выше, транспорт цинка из почвы в корни, а затем в побеги не является наиболее важным фактором ЭЦ. Из этих наблюдений можно сделать очевидный вывод, что ЭЦ в растении регулируется в основном за счет побегов. Подтверждением этому выводу могут служить данные, полученные в серии экспериментов с бобами. Максимальная ЭЦ наблюдалась только в случае прививки побегов эффективного вида бобов на корневую систему эффективного или неэффективного вида. Предположительно, два наиболее вероятных механизма ЭЦ, регулируемые побегами, таковы: 1) изменения во внутриклеточном распределении цинка и гомеостаз, направленный на то, чтобы эффективные генотипы поддерживали более высокое содержание цинка в клетках листьев; 2) более эффективная биохимическая утилизация цинка в клетках, за счет которой макромолекулы, нуждающиеся в цинке, могут эффективно использовать цинк в качестве кофактора в условиях его дефицита.

Внутриклеточное распределение цинка и гомеостаз

Все организмы обладают механизмом гомеостаза для поддержания необходимых концентраций основных элементов питания для оптимальных биохимических и физиологических условий существования. Ясно, что клеточный гомеостаз цинка - сложный процесс, который регулируется за счет совместного действия транспортировки, хелатирования, и т.д. Исследование внутриклеточного распределения цинка - задача, сложная в техническом отношении, поэтому информации относительно данного явления пока недостаточно.

Один из способов изучения распределения ионов в клетках растений - радиоволновой анализ или разделительный анализ. Эта технология широко применялась для получения данных о перемещении ионов в клетках растений, кинетических параметрах мембраны и концентрациях ионов в клетке. Santa Maria, Cogliatti (1988) обнаружили, что распределение 65Zn в корнях пшеницы подчиняется экспоненциальной функции, и предположительно 8% корневого цинка находится в цитоплазме, 76% в вакуолях, а остальное количество - в клеточной стенке. В случае применения данной технологии к тканям листьев Zn-эффективных и неэффективных растений пшеницы, выращенных в условиях дефицита цинка, результаты показали, что как Zn-эффективные, так и неэффективные растения содержали одинаковое количество цинка в вакуолях (83-85%) и цитоплазме (9-11%). Т.о результаты данного исследования показывают, что внутриклеточное распределение цинка мало влияет на явление ЭЦ, но данное направление работы требует дальнейших исследований.

Возможно, в данную проблему помогут внести ясность исследования в области бактерий и других организмов. У бактерий содержание свободного иона Zn2+ в цитозоли очень невелико, так как цинк всегда прочно закреплен в составе органических лигандов, а его перемещение контролируется хелатами и протеинами. Учитывая тот факт, что клеточная активность свободного Zn2+ очень низкая, очень важным становится вопрос, как цинк распределяется внутри клетки. Металлотионин - клеточный белковый резервуар для цинка, способный доставлять цинк туда, где он требуется. Следовательно, металлотионины могут быть транспортными веществами, выполняющими функции донора или акцептора цинка.

Еще один возможный компонент гомеостаза цинка может включать регуляцию генов, связанных с цинковым питанием за счет изменений статуса цинка в клетках. Данный процесс может контролироваться за счет совместного действия нескольких ответственных элементов. В гомеостазе цинка могут принимать участие металл - отзывчивые элементы (МОЭ), то есть цис-элементы ДНК, участвующие в контроле экспрессии генов с учетом изменений содержания металлов в растении. У млекопитающих транскрипционный фактор-1(МТФ1), связанный с МОЭ, регулирует действие нескольких генов, вовлеченных в гомеостаз цинка, включая реакцию на недостаток и избыток цинка у эукариот. МТФ1 также участвует в регуляции концентраций свободного цинка в клетке за счет соединения цинка с МОЭ и последующей генной транскрипции с помощью металлотионина. Кроме того, металлотионины являются частью механизма утилизации цинка, необходимого для выживания клеток в условиях дефицита цинка. В опытах с кадмием и цинком исследователи изучали механизмы внутриклеточного распределения и активность МТФ1, связанную с ДНК. Эксперименты показали, что увеличение содержания цинка в клетке сопровождалось транслокацией МТФ1 из цитозоли в ядро, где он предположительно функционирует, осуществляя экспрессию генов, вовлеченных в гомеостаз цинка (Smirnova et al., 2000).

Биохимическая утилизация цинка. Критический уровень дефицита цинка в листьях растений оценивается как 15-20 мг цинка на 1 кг сухой массы (Marschner, 1995). Известно, что у Zn- эффективных и неэффективных растений концентрации цинка в листьях одинаковы при условиях, когда только Zn-неэффективные растения испытывают явный дефицит цинка; таким образом, внутренняя утилизация цинка является важным механизмом ЭЦ (Rengel, Graham, 1995). Цинк является неотъемлемым компонентом более чем 300 энзимов, поэтому биохимические процессы, вовлеченные в соединение цинка клеток с данными металлоэнзимами, могут быть характерной частью ЭЦ. Несмотря на существование большого количества цинксодержащих энзимов, лишь небольшая их часть изучалась в связи с явлением ЭЦ. К примеру, карбоангидраза (КА) - это каталитический цинксодержащий металлоэнзим, обратимо катализирующий гидратацию CO2 до HCO3- - Rengel (1995) предполагает, что Zn- эффективные генотипы пшеницы способны поддерживать несколько более высокую активность КА, чем Zn-неэффективные генотипы при дефиците цинка. Исходя из этого открытия, авторы предполагают, что Zn-эффективные генотипы пшеницы получают значительную пользу от высокого уровня активности КА, так как это способствует повышению уровня фотосинтеза и увеличению продукции сухой массы.

В ходе систематического изучения роли корневых и стеблевых процессов в ЭЦ на примере бобов и пшеницы Hacisalihoglu и коллеги (2001, 2003) установили, что из всех изученных процессов, локализованных в корне и стебле (включая корневое поглощение цинка, транспорт цинка в побег и распределение цинка в побеге), только один связан с ЭЦ; это действие нескольких цинксодержащих энзимов, локализованных в стебле. При выращивании генотипов пшеницы и бобов, различных по ЭЦ, в условиях дефицита цинка, вызывавших явные симптомы недостатка цинка только у Zn-неэффективных генотипов, для Zn- эффективных генотипов было характерно более высокое содержание цинксодержащих энзимов карбоангидразы и Zn/Cu пероксида дисмутазы. Zn/Cu пероксид дисмутазы (ПД)- это цинксодержащий энзим, который уменьшает токсичное действие пероксид-радикалов и локализован в строме хлоропластов (Marschner, 1995). Эти данные, а также более ранние работы других исследователей, свидетельствуют о том, что биохимическая утилизация цинка может быть фактором ЭЦ. Кроме того, можно предположить, что эти энзимы также играют ведущую роль в адаптации к условиям дефицита цинка, т.к. недостаток цинка является одним из негативных абиотических факторов, которые вызывают увеличение количества активного кислорода и/или уменьшение активности энзимов - антиоксидантов, например Zn/Cu ПД и вызывать симптомы некроза. Результаты последних работ с черным горошком (Vigna mungo) позволяют предположить, что активность энзимов КА и Zn/Cu ПД положительно связана с обеспеченностью цинком и может использоваться в качестве индикатора дефицита. На молекулярном уровне было обнаружено, что экспрессия генов Zn/Cu ПД у Zn- эффективных генотипов пшеницы была выше, чем у Zn- неэффективных генотипов, выращенных в условиях дефицита цинка (Hacisalihoglu et al., 2003). Данное исследование также демонстрирует, что Zn- эффективные генотипы пшеницы способны поддерживать более высокую активность энзимов Zn/Cu ПД. Таким образом, можно предположить, что изменения в регулируемом цинком уровне экспрессии основных цинксодержащих энзимов, таких как Zn/Cu ПД, могут играть важную роль в ЭЦ. Данный механизм будет значительно отличаться от механизма, основанного на биохимической утилизации цинка, учитывая его роль в качестве кофактора некоторых протеинов.

В целом, имеющихся данных еще недостаточно для полного описания действия механизмов ЭЦ, и необходимы дальнейшие исследования в этом направлении. Основываясь на существующей доступной информации, которая позволяет предположить, что ЭЦ - это процесс, локализованный в побегах, можно сделать вывод, что биохимическая утилизация цинка и регуляция экспрессии генов, кодирующих цинксодержащие энзимы, могут являться частью механизма ЭЦ (в частности, для растений пшеницы) (Rengel, 1995, 1999; Hacisalihoglu et al., 2003). Это доказывает, что данный неизученный механизм характерен для Zn-эффективных генотипов и позволяет им более эффективно использовать скудные запасы цинка цитоплазмы для таких биохимических процессов, как синтез и активация энзимов при условиях дефицита цинка.

II.4 Механизмы поглощения и барьерная функция растений

Тяжелые металлы являются протоплазматическими ядами, токсичность которых возрастает по мере увеличения относительной атомной массы. Цинк является легким биогенным элементом, и размах его приемлемых концентраций в среде обитания растений очень широк. Ионы Cd, Zn и др. относят к группе умереннотоксичных элементов. Умереннотоксичными принято считать те элементы, которые оказывают ингибирующее действие при концентрациях от 1 до 100 мг/л. Накопление многих из них в растении представляет определенную опасность для здоровья людей и животных, отрицательно сказывается на гигиеническом качестве продукции, приводит к снижению урожайности. Проявление признаков токсичности Zn у растений наступает при содержании его в тканях 300-500 мг/кг сухого вещества и может проявляться по-разному. Многие металлы при токсичных концентрациях ингибируют активность ферментов. Токсическое действие на растения высоких концентраций цинка может проявляться в нарушении поступления и распределения других элементов. Выступая в качестве антагониста железа, цинк вызывает хлороз растений, при этом уменьшается поглощение железа и нарушается его продвижение. Отдельные тяжелые металлы взаимодействуют с клеточными мембранами, изменяя их проницаемость и другие свойства. Cd иногда вызывает разрыв клеточных мембран. Некоторые тяжелые металлы конкурируют с необходимыми растению металлами и нарушают их важнейшие функциональные роли. Высокая фитотоксичность кадмия объясняется его близостью по химическим свойствам к цинку. Поэтому кадмий может выступать в роли цинка во многих биохимических процессах, нарушая работу таких ферментов, как карбоангидраза, различные дегидрогеназы, фосфатазы, связанные с дыханием и другими физиологическими процессами, а также протеиназ и пептидаз, участвующих в белковом обмене, ферментов нуклеинового обмена и др. Как химический аналог цинка кадмий может заменять его в энзиматической системе, необходимой для фосфорилироваиия глюкозы и сопровождающей процесс образования и потребления углеводов. Замещение цинка кадмием в растительном организме приводит к цинковой недостаточности, что в свою очередь вызывает угнетение и даже гибель растения.

Фитотоксичность металлов и устойчивость к ним растений зависят от многих условий. Существенное значение имеет количество металла, находящегося в почвенном растворе. На фитотоксичность металлов влияют почвенные факторы, такие, как рН, катионная обменная способность почвы, содержание органического вещества. Сохранение рН в пределах 7,0 в почвах с существенным содержанием тяжелых металлов предотвращает фитотоксичность многих из них, но те же концентрации металлов при рН 5,5 и ниже могут стать летальными для растений. Кислотность почв влияет на подвижность металлов и усвоение их корневыми системами растений.

Органическое вещество почвы неодинаково удерживает различные металлы. Одни из них фиксируются им сильно, другие -- слабо. Изменение таких условий выращивания растений, как освещенность, температура и увлажнение, влияет на передвижение и трансформацию тяжелых металлов в почвенной среде и растениях, а также на взаимодействие между растением и металлами.

Большое влияние на поступление ТМ в различные органы растений оказывают другие ионы. Обеспечение сельскохозяйственных культур элементами питания влияет на толерантность к тяжелым металлам. Агротехнические приемы, такие, как удобрение, известкование и др., могут снижать или усиливать токсический эффект металлов.

Одной из причин токсического эффекта ТМ и высоких доз МЭ является их негативное действие на поступление питательных элементов. В исследованиях Н.Ю. Гармаш (цит. по Воскресенская, 1987) отчетливо проявилось негативное влияние избытка Zn в среде обитания на элементный химический состав сельскохозяйственных культур: при обилии этих металлов резко уменьшалось количество фосфора, кальция, магния. Увеличение содержания Zn, Pb и Cd способствует повышению содержания в растениях азота. ТМ оказывают стимулирующее действие на поступление азота в растения клевера. Так содержание общего азота возрастало на 12% в вариантах с внесением Pb и Cd (Ильин, 1991). При высоком содержании Zn и Cd происходит его взаимодействие с фосфат-ионами. Вследствие образования малоподвижных солей фосфорное питание растение становится недостаточным, отмечается обеднение этим элементом тканей.

Величина оптимальной концентрации питательного раствора меняется и влияет на роль микроэлемента цинка в зависимости от внешних условий (сезона года, интенсивности ФАР, температуры раствора). Эксперименты с яровой пшеницей выполнены в условиях водной культуры с основными элементами питания в среде - 29:13:59 (N:P:K). Предполагалось, что при низких концентрациях ионов около 1мМ переносчики ионов или ионные насосы системы поглощения I функционируют с максимальной скоростью, а с повышением концентрации ионов более 10мМ активная система поглощения I - пиноцитоз - должна уступать пассивной системе поглощения. Апоплазматический путь - по свободному пространству клеточных оболочек и межклеточников, по принципу диффузии. Этим путём могут поступать и не нужные для метаболизма элементы. Вероятность их поступления этим путём возрастает c увеличением их концентрации. Симплазматический - между клетками по плазмодесмам - носит избирательный характер. Биологический фильтр - поступление в вегетативную массу - по апопласту, а репродуктивные органы - по симплазматическому пути. В связи с этим влияние цинка и его поступление во многом зависит от фазы развития растения. Это весьма существенно для понимания поведения цинка в агроценозе. Поступление веществ может регулироваться транспирацией и др. экзогенными изменениями, и в частности уровнем концентрации питательных элементов, а так же их избирательным взаимодействием с исследуемым элементом, в данном случае, с цинком. Активная физиологическая (процесс поглощения) и синтетическая (экзоосмос) деятельность корневой системы растений, а также прикорневой микрофлоры способствует процессам аккумуляции и мобилизации цинка ризосфере. Интенсивность данных процессов в ризосфере зависит от различных факторов: вида растения, типа почвы, степени ее загрязненности и др.

Однако регулирование растением поступления металлов имеет место только при оптимальном питании растений, из уравновешенных растворов (не высокой концентрацией минеральных веществ). При повышенных концентрациях равновесные процессы регуляции в значительной степени подавляются.

Исследования, проведенные Ильиным в Новосибирске (Ильин В. Б. 1991), касались изучения массопотока ТМ в растительную продукцию. В Новосибирске свинец является общегородским загрязнителем почвы, а цинк -- часто встречающимся. Источники этих поллютантов - выбросы в атмосферу, стоки, твердые отходы, а их конкретные "продуценты" -- в первую очередь предприятия цветной и черной металлургии и автотранспорт. Здесь валовое количество цинка и свинца может локально превышать местный фон в десятки раз и более. Казалось бы получение на таких почвах экологически чистой растительной продукции невозможно. Но это не так. Исследования в городах Западной Сибири показали, что основные огородные культуры в состоянии сохранять экологическую чистоту продукции. Этот факт объясняется тремя причинами: низкая растворимость поступающих в почву атмосферных выбросов, способность почвы в значительной мере инактивировать их подвижную часть и защитные (барьерные) возможности сельскохозяйственных культур.

Совокупность буферной способности почвы по отношению к тяжелым металлам и защитных приспособлений растений по ограничению поступления избыточных ионов принято называть экологическим потенциалом системы почва-растение. Очевидна, следовательно, необходимость изучения барьерных свойств пахотных земель и выращиваемых на них сельскохозяйственных культур.

Было установлено, что в условиях загрязнения увеличивалось поступление цинка и свинца в растения. Между валовым содержанием тяжелых металлов в почве и их концентрацией в растениях существует прямая корреляционная связь, которая, однако, никогда не бывает полной. Массопоток Zn и Рb в системе почва-сельскохозяйственная культура очень небольшой: в опытах на фоновых вариантах в фитомассе накапливается около 0.1 % от его валового количества в почве. Из загрязненной почвы по сравнению с фоном поступление Zn и Рb в растения увеличивается в десятки-сотни раз, однако большая часть поллютантов (до 95% от суммарного содержания в надземной и подземной фитомассе) задерживается в корнях. В основной же продукции обнаруживаются лишь сотые-тысячные доли процента от наличия металлов в почве, что в абсолютном выражении часто оказывается меньше величины гигиенического норматива (ОДК). Анализируя принципиальный подход к оценке токсичности цинка, по-видимому, можно ориентироваться на следующие цифры: 300-500мг/кг при выращивании растительной продукции (не листовой), 70мг/кг - для животного корма, т.к. вегетативная часть растений является основным рационом животных, 23 мг/кг - влияние выражено на почвенную микрофлору и ферментативную активность. Основным условием должно являться не превышение нормативов в продукции при загрязнении почвы. Очень важно учитывать фазу развития растений при определении в них ТМ. Уровень Zn и Cd к моменту уборки в листьях свёклы снизился в 3-5 раз (Алексеев, 1987).

Пороговые концентрации по цинку следующие - 70 мг/кг - патологическое воздействие через корм на сельскохозяйственных животных (Ковальский, 1973); 23 мг/кг - ПДК (ГН 2.1.7.2041-06); 500мг/кг (Гринь, 1980); 300мг/кг (Kloke, 1980).

Первым барьером на пути ТМ из почвы в надземную часть является покровная ткань корней, обладающая значительной адсорбирующей способностью. Корневые выделения являются мощным фактором инактивации ионов тяжелых металлов. Согласно оценочным данным, корневые выделения могут составлять до 5-6% от вегетативной массы растений. Годичная масса углерода в корневых выделениях зерновых культур колеблется в пределах 450-990 кг/га, что в два раза превышает массу этого элемента, заключенную в корнях на момент уборки урожая. В выделениях присутствуют разнообразные органические соединения-комплексообразователи. В корне ТМ передвигаются по аппопласту до эндосперма и с трудом проходят эндотермальный барьер. При проникновении токсичных элементов в цитоплазму растительных клеток там образуются аналоги антител у животных - фитоалексины и фитохеланины. Эти вещества хелатируют до 90% металлов, поступающих в клетку (Пищулина, 1989). Некоторую защитную роль могут выполнять клетки пояска Каспари. Поступление и накопление биофильных элементов, таких как цинк, происходит по-другому. Отсутствие влияния ингибиторов дыхания на процесс поглощения 65Zn свидетельствовали о его преимущественно пассивном поступлении в растение.

Поступившие в растения избыточные ионы не распределяются равномерно по всей фитомассе. Происходит дифференциация концентрации поллютантов по отдельным органам растения: наибольшее количество обнаруживается в корнях, меньшее - в стеблях и листьях, минимальное - в органах запасания ассимилятов (плодах, семенах и т.д.) - главном ресурсе пищи для человека и корма для животных.

Корневая система ячменя способна накапливать значительные количества тяжелых металлов, препятствуя тем самым их поступлению в вегетативные и особенно генеративные органы растения. По данным Лукина С.В. и соавт. (1999) концентрация Cd в соломе зерновых была в 1,7-4,7 раза выше, чем в зерне. Выращивание ячменя на почве загрязненной Cd в дозах 1; 5 и 10 мг/кг почвы приводило к увеличению содержания токсиканта в соломе, по сравнению с зерном, в 2,3; 6,6 и 7,7 раз соответственно на неокультуренной почве и в 22 раза на окультуренной почве (доза Cd 10 мг/кг).

Такое распределение свидетельствует, о наличии механизмов защиты от опасных для процессов метаболизма концентраций химических элементов, а заботу о постоянстве их содержания именно в семенах допустимо трактовать как эволюционное приспособление - генетически закреплённое свойство растительного организма.

Реализация этого, по-видимому, общего для высших растений процесса (аналогичную закономерность распределения поллютантов по органам в различных культурах обнаружили многие исследователи), протекает у цинка и кадмия неодинаково (сравнивались равные дозы).

Распределение металлов по органам пшеницы, выросшей на незагрязненной почве, резко различное: для цинка характерна базипетальная направленность (увеличение концентрации от корней к зерну), для свинца - противоположная ей - акропетальная. Т.е поступление цинка в надземные органы происходит более успешно. Такое распределение, надо полагать, отражает неодинаковую биофильность цинка и свинца. Различие в распределении обусловлено повышенной потребностью генеративных органов растений в цинке-микроэлементе (самая высокая концентрация цинка отмечена в зерне) и проявлением защитных (даже на незагрязненной почве) свойств растений по отношению к "ненужному" свинцу (самое высокое содержание свинца обнаружено в корнях). Лукин и соавт. (1999) отмечают, что накопление Zn в ячмене имеет прогрессивный характер, т.е. при линейном увеличении содержания этого металла в почве темпы его поступления в растения имели тенденцию к ускорению. Содержание Zn в зерне возрастало с 21,7 до 115,1, а в соломе с 17,4 до 110,3 мг/кг. Таким образом, различие объясняется эволюционно закрепленной реакцией растений на постоянный дефицит микроэлемента - цинка в почвах, о чем уже говорилось выше. Защитные реакции у растительного организма на вдруг возникшее его обилие оказываются не столь совершенными или же они отсутствуют вовсе. Возможно, именно это обстоятельство, как показали опыты с высоким содержанием доступного цинка в почве, приводит растения к гибели (Ильин, 2004).

Для оценки влияния одних элементов на поведение в почве других могут быть использованы различные подходы. Чаще всего используются методы, позволяющие получить параметры уравнений сорбции и на их основе сравнить поведение элементов. Другой подход к оценке взаимного влияния ионов ТМ на их поглощение почвой основан на изучении перераспределения ионов между почвенными реакционными центрами при помощи методов последовательных селективных вытяжек (ПСВ). На сегодняшний день получено много данных о содержании в почвах разных типов различных соединений ТМ и разработаны методы их разделения (фракционирования).

В исследованиях Д.В.Ладонина и О.В.Пляскиной (2003) изучались распределения тяжелых металлов (меди, цинка, кадмия и свинца) по фракциям при полиэлементном загрязнении на четырех вариантах эксперимента - варианты с разным внесением в почву ТМ: 0 (фон) , 1, 5, 10 ммоль/кг.

По мере увеличения степени загрязнения почв ТМ происходит последовательное изменение фракционного состава всех четырех элементов. При слабом уровне загрязнения наблюдается относительно высокое увеличение содержания фракций металлов, более прочно связанных с почвой, затем по мере заполнения ионами металлов почвенных реакционных центров содержание менее прочно связанных с почвой фракций металлов увеличивается. Процентное содержание остаточной фракции при увеличении загрязнения уменьшается. Это объясняется тем, что внесенные загрязняющие вещества не успевают связаться с минеральной частью, а фиксируются другими способами или остаются в растворе.

Результаты исследования образцов дерново-подзолистой почвы показали, что наибольшее количество цинка в незагрязненной почве соответствует остаточной фракции, т.е. прочно связанной с кристаллическими решетками минералов, около 30% находится во фракциях, связанных с органическим веществом. Хорошо выраженной является фракция цинка, связанного с несиликатными соединениями железа, т. е. цинк достаточно сильно адсорбируется на поверхности оксидов и гидроксидов железа. Количество переходящего в водную вытяжку цинка в фоновом варианте незначительно (<1%). В случае слабого загрязнения процентное содержание прочно связанного с органическим веществом цинка понижается, а увеличивается фракция специфически сорбированных ионов (до 22%). Уже начиная со среднезагрязненной почвы (третий вариант) становится ясно, что такое количество цинка почва фиксировать не в состоянии: резко увеличивается процентное содержание обменного и переходящего в водную вытяжку цинка. При дальнейшем увеличении уровня загрязнения дополнительно поступивший в почву цинк практически перестает прочно удерживаться почвой и остается во фракции, переходящей в водную вытяжку.

Кадмий и цинк объединяет более низкая способность этих элементов (по сравнению с медью и свинцом) образовывать с почвенными реакционными центрами прочные связи. Даже в фоновом варианте наибольшее количество кадмия находится в ионообменном состоянии (28%). Среди ионов кадмия, связанных с органическим веществом, преобладает непрочно связанная фракция, извлекаемая ЭДТА. При низком уровне загрязнения (второй вариант) дерново-подзолистая почва не способна прочно закреплять большое количество этого элемента. Около половины кадмия, связанного почвой, переходит в обменную фракцию и около 40% - во фракцию специфически сорбированных ионов. С увеличением степени загрязнения доля обменного кадмия увеличивается, пока не доходит до некоторого максимального количества (около 62%). Весь оставшийся кадмий почвой закрепиться не может и остается в растворе. Таким образом, кадмий проявляет небольшое сродство как к минеральным, так и к органическим почвенным компонентам.