Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ

РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Витебская ордена «Знак Почёта»

Государственная академия ветеринарной медицины»

Диагностика хламидиоза свиней

ВИТЕБСК - 2012



Содержание

Введение

1. Определение болезни

2. Этиология

3. Эпизоотологические данные

4. Клинические признаки

5. Патологоанатомические изменения

6. Лабораторная диагностика

7. Дифференциальная диагностика

Приложения



Введение

Значительный экономический ущерб свиноводству Республики Беларусь наносят инфекционные болезни, в том числе и хламидиоз свиней.

Хламидиоз свиней регистрируют во многих странах мира, в том числе и в хозяйствах Республики Беларусь. Болезнь наносит ощутимый экономический ущерб, который складывается из недополучения прироста живой массы, приплода, падежа и вынужденного убоя животных, а также затрат на проводимые мероприятия по профилактике, ликвидации болезни и за счет многократных осеменений. К тому же возбудитель хламидиоза свиней представляет большую опасность для здоровья человека.

Своевременная и достоверная диагностика - необходимое условие для успешной борьбы с любой инфекционной болезнью, в том числе и с хламидиозом свиней.

В настоящих методических указаниях представлены наиболее современные и практически приемлемые методы диагностики хламидиоза свиней. Нами дана характеристика хламидий, приведены эпизоотологические данные и клинические признаки болезни, указаны правила отбора, упаковки, оформления и пересылки патматериала, подготовки его к исследованию, определены критерии, на основании которых диагноз считают установленным.



1. Определение болезни

Хламидиоз свиней - контагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся ринитом, бронхопневмонией, гастроэнтеритом, полиартритами, кератоконьюнктивитом, энцефаломиелитом, абортами, эндометритом, задержанием последа, маститом, рождением нежизнеспособного молодняка. У хряков наблюдается орхиты, эпидедимиты. Хламидиозом болеет и человек.

2. Этиология

Уникальность хламидиозной патологии состоит в том, что хламидии вызывают различные по патогенезу и клиническому проявлению болезни, но принадлежат они к одному роду - Chlamydia.

В соответствии с руководством Д. Берджи, 9-е изд., (1993) возбудитель хламидиоза отнесён к царству Procariotae, отделу Gracilicutes, группе 9 Риккетсии и хламидии, порядку Chlamydiales, семейству Chlamydiaceae, роду Chlamydia в который входят следующие виды: Chl. trachomatis, Chl. psittaci, Chl. pneumoniae, Chl. pecorum. Chl. psittaci (болеют люди и птицы, у животных наблюдаются аборты и другая патология); Chl. pecorum (вызывает у животных аборты, полиартриты, энцефаломиелиты, кератоконъюнктивиты, пневмонии, энтериты и маститы); Chl. trachomatis (патогенны для человека, регистрируют трахому, лимфогранулему, цервицит, конъюнктивит); Сhl. pneumoniae (пневмонию и конъюнктивит человека).

Возбудитель неподвижен, спор и капсул не образует, грамотрицателен. В настоящее время разработано и предложено ряд методов окраски хламидий. Наиболее практически приемлемыми и употребляемыми являются методы окраски по Стампу, Маккиавелло, Романовкому-Гимзе.

Хламиидии имеют уникальный цикл развития. Они могут существовать в виде ретикулярных телец, которые не превышают в диаметре 1,2 мкм, а средний диаметр наиболее многочисленных и опасных в плане заражения промежуточных телец хламидий составляют 0,3 - 0,4 мкм, то есть размеры их соизмеримы с крупными вирусами. Самые высоко инфекционные формы хламидий (элементарные тельца) - это мелкие сферические клетки диаметром 0,25 - 0,3 мкм. Элементарные тельца являются внеклеточной формой существования, а ретикулярные (инициальные) тельца - внутриклеточной формой имеющие структуру типичных грамотрицательных бактерий.

Несмотря на то, что хламидии отнесены к царству Procariotae, особенности биологических свойств (культивирование на 6-7 дневных куриных эмбрионах, культуре клеток) приближают их к вирусам. В своем составе они содержат, ДНК и РНК (чем существенно отличаются от вирусов), около 40% липидов, 35% белка, соляную и фолиевую кислоты, имеют несколько автономных ферментных систем. Размножаясь в цитоплазме живых клеток они образуют мембранно-ограниченные цитоплазматические включения, состоящие из микроколоний (1-12 мкм в диаметре), которые распадаясь высвобождают сотни элементарных телец. Морфология хламидий зависит от цикла их развития, который слагается из следующих этапов:

1) адсорбция элементарных телец на оболочке клетки и их фагоцитоз;

2) трансформация элементарных телец в инициальные тельца;

3) деление ретикулярных телец с образованием промежуточных форм хламидий;

4) созревание промежуточных форм до элементарных телец.

Патогенные для свиней виды хламидий весьма аналогичны по морфологии, химической структуре, циклу развития, метаболизму и чувствительности к антибиотикам.

Из лабораторных животных к хламидиозу чувствительны морские свинки, кролики, белые мыши. Хорошей биологической моделью являются обезьяны.

Хламидии сравнительно устойчивы во внешней среде, хорошо сохраняются при низких температурах. В воде не теряют жизнеспособности до 17 дней, в лиофилизированном состоянии - до 3 лет, в не пастеризованном молоке - 23 дня. Возбудитель инактивируется дезсредствами в обычных концентрациях (2-3% раствор натрия гидроокиси, 3% раствор фенола, 2-3% раствор формальдегида и др.) Чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда (геомицин ретард, террамицин, хлортетрациклин, окситетрациклин и другие). Трудности лечения больных свиней связаны с тем, что возбудитель является внутриклеточным облигатным паразитом и на определенных этапах инфекционного процесса становится недоступным для антибиотиков и других применяемых средств, поэтому курс лечения длительный и зачастую оказывается малоэффективным. Встречаются лекарственно-устойчивые L-формы возбудителя.

3. Эпизоотологические данные

Хламидиозом болеют свиньи всех возрастов независимо от породы и пола. Источником возбудителя болезни являются больные и переболевшие животные, которые в течение 7-12 месяцев являются хламидионосителями и выделяют возбудителя с истечением из глаз, носа, с фекалиями, со спермой (хряки-производители), с мочой, молоком, с абортированном плодом, с околоплодными водами и оболочками, обсеменяя при этом все, что окружает животных. Заражение свиней происходит алиментарным, аэрогенным и половым путями. Хламидии легко преодолевают плацентарный барьер у супоросных свиноматок и инфицируют плоды (до 30%), в таком случае рождаются больные поросята (чаще с поражением желудочно-кишечного тракта, дыхательной системы и суставов).

Для хламидиоза характерна стационарность, которая объясняется длительным хламидионосительством, наличием резервуара возбудителя (мышевидные грызуны и многие дикие животные). Природная очаговость обусловлена тем, что хламидии циркулируют у рыб, растений, моллюсков вызывая различные патологические состояния.

Для хламидиозной инфекции свиней характерна также сезонность. Наибольшее количество абортов приходится на зимне-весенний период. В летнее время количество заболевших животных резко снижается и заболевание переходит в латентную форму. Зимой и весной с наступлением холодов, особенно на фоне нарушений условий содержания животных, инфекция активизируется, увеличивается количество абортов и мертворождений, болезнь проявляется клиническими признаками у различных возрастных групп свиней.

Заболеваемость и летальность среди поголовья свиней зависит от формы проявления болезни. При респираторной форме течения болезни, заболеваемость составляет до 60%, летальность до 30%, при кишечной соответственно 25 - 50% и 20 - 30%. При энцефалитной форме летальность составляет 100%. Заболеваемость и летальность может увеличиваться, если хламидиоз осложняется бактериальными и вирусными инфекциями.

Несмотря на высокую инфекционность хламидий, болезнь у свиней не всегда клинически проявляется. В большинстве случаев заражение приводит к инаппарантной, хронической инфекции и к длительному хламидионосительству.

Выяснено, что хламидии, поражающие животных обладают тканевым тропизмом, но не обладают хозяиноспецифичностью.

4. Клинические признаки

Инкубационный период - от нескольких часов до 3 - 4 месяцев.

Различают: респираторную, артритную, кишечную, генитальную, энцефаломиелитную и кератоконъюнктивальную формы хламидиоза.

Хламидиоз может протекать: остро, подостро и хронически.

У хряков хламидиоз протекает хронически. При этом наблюдают полиартриты, хромоту, чаще на одну из тазовых конечностей, увеличение семенников (орхит), надсеменниковых лимфоузлов, уретриты, искривление шеи за счет пареза отдельных групп мышц, поражение желудочно-кишечного и респираторного тракта.

Основным клиническим признаком у свиноматок являются аборты и мертворождения. Обычно аборты регистрируются у 30 - 50% разовых свинок. Введение в хозяйство здоровых ранее не болевших свиноматок и покрытие их больными хряками-производителями заканчивается абортами у большинства или у всех животных. У основных свиноматок наблюдается мертворождение (по 2 - 3, иногда 4 - 7) поросят, остальные поросята остаются живыми, но уже больными. Они погибают в течение 2 - 3 недель.

Поросята - сосуны, выжившие до месяца, растут и развиваются нормально. Однако после отъема, как правило, наблюдаются рецидивы заболевания. У поросят развивается бронхопневмония, поражается желудочно-кишечный тракт. Плохой аппетит, депрессия, сонливость, повышение температуры тела до 41 - 41,5С, поносы, сухой кашель, отставание в росте - таковы основные клинические признаки болезни. У некоторых животных развиваются артриты. Поражаются скакательные, карпальные, пальцевые суставы - они увеличены, болезненны. Многие поросята страдают коньюнктивитом, нередко у них наблюдают поражение нижней части ушной раковины, развитие очаговых дерматитов, кольцевую гангрену хвоста и его отторжение. Зачастую на первое место выступают признаки поражения центральной нервной системы: дрожание кожи, волнообразное сокращение поверхностных мышц, парезы тазовых, реже грудных конечностей. Поросята могут внезапно падать, визжать, совершать плавательные движения, но также, неожиданно поднимаются и кажутся здоровыми.

При респираторной форме наблюдается подъем температуры тела до 40 - 40,5С. Наблюдается серозное или серозно-слизистое истечение из носовой полости, слезотечение, кашель, учащение дыхания. На 3-5-й день болезни появляется редкий сухой кашель и в легких прослушиваются хрипы. В крови отмечается лейкопения с нейтропенией. Симптомы респираторного заболевания у свиней вызванные хламидиями непостояны. Клиническое проявление болезни варьирует от латентного до тяжелой пневмонии с острым, подострым и хроническим течением. Как осложнение может быть выражен гепатит, нефрит, миокардит.

Наряду с поражением органов дыхания у некоторых животных может развиться артритная форма. При этом преимущественно поражаются скакательные суставы, реже воспалительный процесс распространяется на карпальные и пальцевые. Сутавы увеличены, болезненны. При затянувшемся хроническом процессе возможно образование свищей из суставной капсулы.

Кишечная форма заболевания характеризуется повышением температуры тела до 41С, отсутствием аппетита, угнетением, учащением пульса и дыхания. Наиболее характерным признаком данной формы было расстройство деятельности желудочно-кишечного тракта. Затяжные поносы сопровождались тенезмами, в жидких каловых массах было много слизи с примесью крови. Больные животные заметно худели, у них западали глаза, а у некоторых отмечается серозно-слизистые истечения из носа и кашель. Временами этот симптомокомплекс несколько смягчается, а затем снова усиливается.

Генитальная форма характеризуется абортами у свиноматок, преждевременными опоросами, рождением мертвых и больных поросят. Ранние аборты могут происходить на втором месяце супоросности. Такие случаи проходят незамеченными и животное остается холостым. Свиноматки абортируют чаще в последние недели супоросности. Если опорос проходит в срок, то часть или все поросята рождаются мертвыми. Потери поросят могут достигать 70% от числа родившихся. У абортировавших животных наблюдаются маститы, эндометриты, задержание последа.

При энцефалитной форме первый признак болезни - внезапное повышение температуры тела до 40,5 - 42С. Затем постепенно исчезает аппетит, наступает истощение и физическая слабость, наблюдается слезотечение и кашель, затем может наступить выздоровление животных. Но в большинстве случаев развивается симптомы нервного заболевания. Движения животных становятся не координированными. Конечности в путовых суставах непроизвольно сгибаются, суставы иногда бывают отечны, мягки и болезненны. У некоторых животных отчетливо проявляется хромота, наблюдается истечения из носа, у других - диарея. Больные животные обладают повышенной чувствительностью и иногда упираются головой в твердые предметы. Физическая слабость сопровождается прострацией и глубоким угнетением. В некоторых случаях незадолго до смерти отмечаются судорожные сокращения шейных и затылочных мышц. Кроме того, отмечается статическая и динамическая атаксия, дрожание головы, судороги верхних век, глаз ушей и губ.

Конъюнктивальная форма характеризуется односторонним конъюнктивитом. При этом из пораженного глаза появляются истечения, веки опухают, возникает сильная светобоязнь. На поверхности отечной слизистой оболочки видна мелкая зернистость. Воспалительный процесс может распространяться и на роговицу, вызывая кератит, а иногда и изъязвления ее. Через 8-10 дней животные выздоравливают.

Многообразие клинического проявления хламидиоза свидетельствует о том, что возбудитель поражает весь организм. Интенсивность и сочетаемость клинических признаков болезни зависит от возраста животного, иммунобиологического состояния организма, влияния факторов внешней среды.



5. Патологоанатомические изменения

Макро- и микроскопические изменения в органах и тканях при хламидиозе у свиней различных возрастных групп имеют свои особенности. Возбудитель заболевания, проявляя тропизм к репродуктивной системе, у супоросных свиноматок преодолевает плацентарный барьер, вызывает заболевание плодов, вследствие чего часть их погибает в утробе матери. Оставшиеся поросята рождаются живыми, но уже зараженными и больными.

У абортированных плодов и поросят-сосунов, погибших в первые дни жизни, наблюдается цианоз кожи в области пятачка, подгрудка, лобных костей, копытец и слизистой оболочки преддверия ротовой полости и конъюнктивы. У некоторых поросят месячного возраста в области ушей и корня хвоста обнаруживаются очаги некроза величиной около 2 см с последующим отторжением мертвой ткани. При вскрытии у них обнаруживается водянистый отек кожи и подкожной клетчатки в области затылка, подчелюстного пространства, промежности, грудных и тазовых конечностей. В подкожной клетчатке в области лобной и затылочной костей, кроме отека, просматриваются кровоизлияния. В грудной и брюшной полостях, перикардиальной сумке в большинстве случаев отмечается скопление транссудата соломенно-желтого цвета, иногда с красноватым оттенком, в легких, как у абортированных плодов, так и у павших поросят-сосунов - венозное полнокровие, часто сочетающееся с отеком. Могут наблюдаться признаки интерстициальная пневмонии или катаральной, катарально-гнойной бронхопневмонии. Кроме того, легкие у плодов находятся в состоянии фетально-тотального ателектаза.

В желудке и тонком отделе кишечника обнаруживается серозно-слизистый катар. Слизистая толстого отдела кишечника, в особенности ободочной кишки, чаще у плодов, в состоянии водянисто-студневидного отека. У отдельных плодов просвет толстых кишок заполнен красно-бурой массой студневидной консистенции. Печень в состоянии венозной гиперемии, под капсулой обнаруживаются белесовато-сероватые участки размером 11,5 см., не имеющие четко выраженных границ. В почках под капсулой видны точечные кровоизлияния, в мозговом слое на разрезе выражен венозный застой. Развивается зернистая, жировая дистрофия почек, печени и миокарда.

У 8 - 40-дневных поросят или убитых вначале заболевания наиболее сильно выраженные изменения обнаруживаются в сердце: на эпикарде, иногда на внутренней поверхности перикарда видны серо-желтые наложения фибрина. Одновременно может развиваться серозно-фибринозный перитонит.

У свиноматок, убитых в первые сутки после родов или аборта, слизистая оболочка рогов матки отечна и гиперемирована, шейка матки и влагалище местами геморрагически инфильтрированы. Наблюдается катарально-гнойный эндометрит, цервицит и вагинит. В регионарных лимфоузлах серозный лимфаденит. На плаценте возможны кровоизлияния и некрозы.

У хряков наблюдается увеличение семенников и надсеменниковых лимфоузлов в 1,5 - 2 раза, семяпроводы геморрагически воспалены. В предстательной железе, слизистой уретры и возле головки полового члена - кровоизлияния.

При гистологическом исследовании обнаруживают элементарные тель-ца и цитоплазматические включения в различных органах и тканях.

6. Лабораторная диагностика

Диагностика хламидиоза базируется на проведении комплексных исследований и наблюдений. При постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные, клиническую, патологоанатомическую картину, результаты гистологических исследований. Решающее значение имеет лабораторная диагностика болезни.

Диагностика хламидиоза включает:

Микроскопический метод - обнаружение хламидий в исследуемом материале с помощью световой и люминесцентной микроскопии (флуорохромирование), а также иммунофлуоресценцией);

Метод выделения и культивирования хламидий на куриных эмбрионах, культуре клеток, в организме восприимчивых животных с последующей идентификацией возбудителя;

Серологический метод - выявление нарастание титра антител в парных пробах сыворотки больных или переболевших животных в: РСК (реакция связывания комплемента), РДСК (реакция длительного связывания комплемента), РНСК (реакция непрямого связывания комплемента), РНГА (реакция непрямой гемагглютинации), ИФА (иммуноферментный анализ);

Молекулярно-генетический метод идентификации хламидий - ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Диагностика микроскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами проводится согласно инструкциям по применению соответствующих диагностикумов и тест-систем.

Материал для исследования.

От больных и подозрительных по заболеванию свиней берут фекалий, соскобы с конъюнктивы, гениталий, используя при этом стерильные инструменты, посуду или упаковочную тару. Исследуемый материал вносят в стерильные пробирки с физиологическим раствором в количестве 1 мл. Пробирки помещают в сосуд со льдом и направляют нарочным в лабораторию. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 24 часов.

От подозрительных по заболеванию и абортировавших животных берут кровь дважды: первый раз в период клинического проявления болезни, второй - спустя 14 - 21 день после первого взятия с целью получения сыворотки. Сыворотку крови получают по общепринятой методике, и в количестве 1 - 2 мл направляют в лабораторию, где её хранят при - 20С. Сыворотку полученную от первого и второго взятия крови, исследуют одномоментно. Гемолизированная, проросшая сыворотка исследованию не подлежит.

От абортировавших свиноматок направляют в лабораторию кусочки плаценты, влагалищную слизь. Абортированные плоды можно отсылать целиком или же их паренхиматозные органы и желудок.

От павших или вынужденно убитых свиней посылают кусочки паренхиматозных органов, семенников, головной мозг, пораженные суставы. Материал для исследования отбирают не позднее 2 часов после гибели, аборта или вынужденного убоя свиней.

Пробы эякулята или сперму в количестве 1 мл доставляют в лабораторию в пробирках с сухим льдом или в контейнере с жидким азотом.

Доставку исследуемого материала в лабораторию осуществляют с соблюдением правил, исключающих распространение возбудителя болезни.

Микроскопический метод

Световая микроскопия. Из исследуемого материала готовят препараты-отпечатки или препараты-мазки. Препараты окрашивают по Стемпу, Маккиавелло, Романовскому-Гимзе, по Маккиавелло в модификации Здродовского, по модифицированному методу Гименеж (см. приложение 1). В препаратах хламидии, располагаются отдельно или скоплениями внутри и вне клеток. При окраске по Стемпу хламидии ярко-красные, цитоплазма клеток бледно-зеленая, ядра клеток окрашены в бледно-зеленый цвет несколько интенсивнее, чем цитоплазма. При окраске по Маккиавелло хламидии приобретают рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток - светло-синяя, ядра - темно-синие, а по Романовскому-Гимзе - возбудитель хламидиоза окрашивается в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма клеток фиолетово-голубая, ядра сине-фиолетовые.

Успех микроскопического исследования во многом зависит от качества приготовленных препаратов, возможностей и технического состояния светового микроскопа и опыта бактериолога. Для работы необходимо использовать микроскопы с высоким разрешением (0,14 - 0,2 мкм) и общим увеличением в 1350 - 2000 раз.

Люминесцентная микроскопия. Для индикации хламидий в исследуемом материале используют метод флуорохромирования. Техника окраски: препараты (мазки) фиксируют жидкостью Корнуа в течение 5 мин; двукратно отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 -- 4 мин; наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10 -- 20 мин; трижды отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 мин и больше; заключают в этот буфер, прикрепляя покровное стекло парафином.

Исследуют в люминесцентном микроскопе (лучше в падающем свете) с комбинацией фильтров СЗС, БС, ФС.

Элементарные тельца хламидий флуоресцируют ярко-зеленым светом, их промежуточные формы -- от соломенно-темного до оранжевого свечения. Подобные структуры обнаруживают, как внутри, так и вне клеток.

Метод дает хорошие результаты при исследовании мазков из патологического материала, особенно плодовых оболочек абортировавших свиней (см. приложение 2).

Идентификация хламидий проводится с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Используют прямой и непрямой варианты.

Для приготовления препаратов используют стекла с матовой площадкой у края и надписи ведут простым карандашом.

Прямой метод иммунофлуоресценции. Фиксированные холодным ацетоном препараты после промывания ФСБР обрабатывают синькой Эванса 30-40 с, промывают водопроводной водой.

При отсутствии синьки Эванса препараты обрабатывают смесью в равных объемах, состоящей из флуоресцирующей хламидийной сыворотки (содержит антитела против хламидий, меченые ФИТЦ) и бычьего альбумина, меченного родамином, взятого в удвоенном титре.

В случае применения синьки Эванса препараты обрабатывают только меченой флуоресцирующей хламидийной сывороткой (в термостате при +37°С в течение 30-40 мин во влажной камере). Тщательно промывают ФСБР, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой вариант реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Готовят следующие растворы: фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) --6,8 г NаС1, 0,63 г КН₂РО₄ и 1,48 г Nа₂НРО₄ последовательно растворяют в 1 л дистиллированной воды рН 7,2; забуференный глицерин - смешивают одну часть ФСБР с девятью частями глицерина; раствор синьки Эванса: 1 г синьки растворяют в 100 мл дистиллированной воды во флаконе из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора красителя (1: 10000) берут 0,1 мл раствора 1: 100 и объем доводят дистиллированной водой до 10 мл.

Техника окраски: мазки из патологического материала, инфицированных клеточных культур и т. п. фиксируют ацетоном на холоде в течение 5--10 мин, промывают ФСБР и подсушивают на воздухе. Для устранения неспецифической люминесценции фона на мазки на 30- 40 с наносят рабочий раствор синьки Эванса (1: 10000), которую смывают слабой струей водопроводной воды. Наносят на каждый препарат 1-2 капли кроличьей (или другого вида животного) иммунной антихламидийной сыворотки, содержащей обычные немеченные антитела против хламидий в титре не ниже 1:32-1:64. Препарат помещают во влажную камеру и помещают в термостат при температуре - 37°С на 30-40 мин.

Тщательно промывают ФСБР три раза по 5--10 мин; на препараты наносят антивидовую (содержащую меченые ФИТЦ антитела против глобулинов того вида животного, с использованием которого получена первая иммунная сыворотка) сыворотку и выдерживают в термостате при температуре +37°С во влажной камере на 30-40 минут. Тщательно промывают ФСБР. На каждый препарат наносят по капле забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, которое прикрепляют расплавленным парафином. Исследуют под люминесцентным микроскопом в падающем свете при комбинации светофильтров ФС 1-2, БС-8-2, СЗС 7-2 и запирающем ЖС 18, объектив иммерсионный.

Препараты, обработанные синькой Эванса, в ультрафиолетовых или сине-фиолетовых лучах, имеют красный фон разных оттенков, тогда как элементарные тельца хламидий, их колонии (включения) флуоресцируют зеленым изумрудным светом.

При отсутствии синьки Эванса можно использовать для контрастирования фона бычий альбумин, меченный родамином, который в удвоенном титре смешивают с первой сывороткой 1:1.

Бычий альбумин уступает синьке Эванса в том смысле, что каждый раз дополнительно необходимо определять его рабочую дозу методом титрации.

Фон препаратов, обработанных меченым бычьим альбумином, оранжевый, хламидийные структуры -- изумрудно-зеленые.

Контроли: первый тест блокировки -- после обработки препарата обычной иммунной (немеченой) хламидийной антисывороткой, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна вызвать свечения хламидиозного антигена (элементарных телец, промежуточных форм хламидий или их включений);

второй тест нейтрализации -- после инкубации со специфическим (хламидийным) антигеном, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна давать заметного окрашивания хламидийного антигена;

третий -- нормальная, не иммунная меченная ФИТЦ сыворотка того же вида животного, продуцента иммунной хламидийной антисыворотки, не должна окрашивать хламидийный антиген;

четвертый -- в контрольных препаратах, приготовленных из тканей заведомо здоровых животных, флуоресцирующая хламидийная антисыворотка не должна окрашивать цитоплазму клеток.

Метод выделения и культивирования хламидий.

Выделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала.

Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл и стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл.

Пробы спермы, эйякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эйякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% сузпензии желточных мешков.

Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды.

Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей.

Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторокального заражения морских свинок. Наиболее приемлимым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов).

Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах.

Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии.

Для культивирования хламидий используют первичные и перививаемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят метериалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли:

1. контроль монослоя в норме;

2. контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом;

3. контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий.

Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).

Серологический метод

Хламидии имеют групповой термостабильный антиген, который выявляют в серологических реакциях: РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА. Наибольшее применение в практике получила РДСК, основанная на выявлении специфических антител в сыворотке крови абортировавших свиноматок (нарастание титра в 2 и более раз). Абортировавших свиноматок исследуют дважды. Кровь от свиноматок берут в день аборта и спустя 21 день после него. С помощью РСК проводят массовое обследование поголовья, что позволяет выявлять бактерионосителей и оценивать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве. Наличие комплементсвязывающих антител к хламидийному антигену в низких титрах - показатель инфицированности животных.

Постановку РДСК осуществляют согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ МСХ СССР 15.04 1986 г. Для постановки РСК Российский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности выпускает «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных».

В Республике Беларусь разработаны «Методические указания по постановке реакции непрямого связывания комплемента при серологической диагностике хламидийных инфекций у животных» (Фомченко И.В., Максимович В.В., Тюликов С.И.).

Методические рекомендации по постановке реакции непрямого связывания комплемента в серологической диагностике хламидийных инфекций у животных.

1. Сущность РНСК заключается в том, что неполные (блокирующие) антитела, содержащиеся в сыворотке крови больных или переболевших животных образуют комплекс антиген-антитело, не связывая комплемент, поэтому они не могут быть обнаружены методом РДСК. Для выявления таких антител в реакцию вводят дополнительный компонент в виде позитивной сыворотки, содержащей полные антитела против возбудителя хламидийной инфекции (условно-индикторная сыворотка). При наличии в испытуемой сыворотке неполных антител их взаимодействие с антигеном происходит без участия комплемента, который оставшись свободным обеспечивает гемолиз эритроцитов в гемолитической системе (реакция положительная). Если испытуемая сыворотка не содержит неполные антитела, то антиген соединяется с антителами введённой позитивной (индикаторной) сыворотки, образуя комплекс антиген-антитело-комплемент, в результате гемолиз эритроцитов не произойдёт (реакция отрицательная).

2. В РНСК используют следующие компоненты: комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген, контрольный антиген, позитивную (иммунную) сыворотку крови содержащую группоспецифические хламидийные антитела, негативную (отрицательную) сыворотку крови, комплемент (свежая консервированная или лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки), гемолизин, эритроциты барана, испытуемые сыворотки, физиологический раствор. Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах. Антиген применяют в РНСК и РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.

3. Гемолизин в РНСК используют в удвоенном титре.

4. Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 минут до полной прозрачности надосадочной жидкости. Для РНСК применяют 2,5%-ную взвесь эритроцитов из осадка.

5. Приготовление гемолитической системы. Перед работой смешивают одну часть 2,5%-ной взвеси эритроцитов и одну часть гемолитической сыворотки в удвоенном титре. Полученную гемолитическую систему ставят в водяную баню (термостат) при 37°С на 30 минут для сенсибилизации. Во время работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 2-4°С.

6. Для серологического исследования пригодны свежие испытуемые сыворотки. Допускаются к исследованию и замороженные (однократно). Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

7. Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2-7,4) готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.

8. Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на этикетке и готовят основное разведение 1:20. Каждую сыворотку, разведённую 1:5 (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора) и инактивированную при 58-60°С 30 минут, разливают по 0,2 мл в два ряда пробирок штатива Флоринского.

Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом по 0,02 мл. Добавляют в каждую пробирку недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора. В первые ряды пробирок с позитивной, негативной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении по 0,2 мл и по 0,2 мл физиологического раствора, а во вторые ряды по 0,4 мл физиологического раствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 минут при 37-38°С. Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 мл, встряхивают и ставят в водяную баню на 30 минут при 37-38°С.

Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает полный гемолиз эритроцитов с негативной и испытуемыми сыворотками в пробирках первого и второго рядов и с позитивной сывороткой - в пробирках второго ряда (без антигена). В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, равен 0,1 мл, что и будет являться его рабочей дозой.

Примечание: если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более чем на два интервала по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки содержат специфические (к данному антигену) антитела. И в таком случае рабочую дозу комплемента определяют по негативной сыворотке и безантигенным рядам позитивной и испытуемых сывороток.

Расчет количества чистого комплемента, необходимого для постановки главного опыта, делают по формуле:

Х=АхВ/С,

где А - рабочая доза комплемента, В - количество пробирок, занятых в реакции, С - основное разведение комплемента.

Пример: 0,1х100/20=0,5. Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2х100), поэтому к 0,5 мл чистого комплемента следует добавить 19,5 мл физиологического раствора.

9. Главный опыт РНСК. Сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном, 1:5 с контрольным антигеном и без антигена. Реакция протекает в три этапа. На первом этапе инкубируют испытуемые сыворотки со специфическим антигеном в дозах по 0,2 мл в течение 60 мин при 37-38°С. На втором этапе в реакцию вводят дополнительно позитивную (индикаторную) сыворотку, разведенную физиологическим раствором до предельного титра, по 0,2 мл, и одновременно во все пробирки разливают комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении согласно результату титрования его. Смесь (испытуемая сыворотка, антиген, позитивная индикаторная сыворотка и комплемент) инкубируют в течение 60 мин при температуре 37-38°С. На третьем этапе добавляют гемолитическую систему по 0,4 мл и реакцию выдерживают 30 мин в водяной бане при 37-38°С.

10. Контроли главного опыта РНСК. Контроли негативной и позитивной сывороток для каждой реакции ставят в двух вариантах: в одном варианте на втором этапе добавляют во все пробирки 0,2 мл индикаторной сыворотки, а во втором - 0,2 мл физиологического раствора. Контроли антигена и гемолитической сыворотки ставят с добавлением во все пробирки 0,2 мл физиологического раствора.

11. Учёт реакции.

Таблица 1. Процент гемолиза.

Компоненты	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Гемолизированая жидкость, мл	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Физиологический раствор, мл	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Процент гемолиза	10	20	30	40	50	60	70	80	90



Из реакции выбирают пять пробирок, где произошёл 100%-ный гемолиз эритроцитов, их содержимое сливают в одну пробирку. Из её готовят разведение с меньшим процентом гемолиза по схеме (см. таблицу 1) и готовят перед учётом реакции.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путём сравнения со степенью гемолиза в стандартных пробирках. Процент гемолиза выражают в крестах.

+ + + + -- гемолиз эритроцитов 0-10%

+ + + -- гемолиз эритроцитов 10-40%

+ + -- гемолиз эритроцитов 40-70%

+ -- гемолиз эритроцитов 70-90%

- -- гемолиз эритроцитов 90-100%

Учёт реакции РНСК проводят визуально дважды: первый раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (3-4 часа после бани).

Оценка результатов по проценту гемолиза:

Положительная - от двух крестов до полного гемолиза в разведении 1:10.

Сомнительная - в разведении 1:5 от трёх крестов до полного гемолиза эритроцитов, в разведении 1:10 на три креста.

Отрицательная - четыре креста в разведениях 1:5 и 1:10.

Дважды сомнительная считается положительной.

При выделении положительной сыворотки в реакции проводится раститровка её до предельного титра (см. положительный контроль).

В случае нарастания титра антител в парных пробах сыворотки в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.

Иммуноферментный анализ применяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с псоледующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Техника постановки ИФА

Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:

В состав набора входят:

специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный - 1 амп.;

специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;

отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;

пероксидазный антивидовой конъюгат,, лиофилизированный -1 амп.;

Химический набор, в состав которого входят:

КН₂ РО₄ - 1 амп.;

К₂НРО₄ - 1 амп.;

NaCI - 1амп.;

Твин - 20 (-40,-80, Тритон Х- 100) - 1 амп.;

Лимонная кислота - 1 амп.;

К₂НРО₄ - 1 амп.;

О- фенилендиамин 2 амп.;

гидроперит - 1 табл.;

две 96- луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;

стоп- раствор - 1 флакон.

Оборудование:

одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 см³ до 1 см³;

стеклянные пипетки на 1-2 см³;

промывающее устройство;

спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.

Приготовление рабочих растворов:

Буфер № 1 - ( 0,01М калий фосфатный, рН 7,2 - 7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 см³ дистиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН корректируют 0,1 N КОН или НСI.

Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 см³ буфера №1 добавляют содержимое ампулы №8.

Буфер №3 - (фосфатно- цитратный) предназначен для приготовления субстрата (рН 5,0 - 5,2). Состоит из двух компонентов: А и Б.

А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 см³ дистиллированной воды в мерной колбе.

Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 см³ дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 см³ раствора А добавить 25,7 см³ раствора Б и 50 см³ дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы №11 растворить в 2 см³ спирта-ректификата и добавить 48 см³ буфера №3, внести 0,8 см³ перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 см³ дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4-6 С не более 3 мес.

Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 см³ буфера №1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 см³ буфера №2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 см³ буфера №2 получая разведение 1:200.

Растворенный антиген , сыворотки , антивидовой конъюгат хранят при 4-6 С в течении 3-4 дней.

Разведение проб сыворотки крови.

Испытуемую сыворотку крови разводят 1:200 буфером №2 в отдельных пробирках или микропанели.

Постановка иммуноферментной реакции.

Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.

Сорбция антигена на микропанели.

Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4-5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.

Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда А₁, В₁, С₁, вносят по 0,1 см³ специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки D₁, E₁, F₁ вносят по 0,1 см³ отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п.3.4.2. В лунки G₁, Н₁, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 см³ буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с лунок А₂ и Е₂ по 0,2 см³ исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п.3.4.3. и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с разведения 1:200 до 1:6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37С в термостате в течении часа.

Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 см³ рабочего раствора иммуноферментного конъюгата подготовленного согласно п.3.4.2., и инкубируют в термостате при 37С в течении 1 часа.

Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.

Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4.1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см³ субстратно-индикаторный раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30-40 мин.

В каждую лунку вносят по 10 мкл стоп-раствора.

Учет результатов реакции.

Результаты учитываются в течении 30-40 мин. после внесения стоп-раствора.

Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле.

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП490).

Положительными считаются пробы, ОП490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствуют об отрицательной реакции.

Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

Молекулярно-генетический метод.

Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР в патологическом материале от животных.

Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента in vitro с последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.

ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.

В ПЦР используют следующие наборы:

- набор для выделения ДНК (набор № 1);

- набор для проведения ПЦР (набор № 2);

-набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор № 3);

- набор контрольных образцов (набор №4).

Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:

- лизирующий раствор -1 пробирка, 30 см³;

- отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 см³;

- концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 см³;

- суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 см³;

- буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 см³.

Набор.для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:

- смесь праймеров "Chla" -1 пробирка, 0,25 см³;

- смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,25 см³;

- 5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 0,5 см³;

- деионизованная вода -1 пробирка, 1 см³;

- фермент Taq-полимераза -1 пробирка, 0,05 см³;

- воск для ПЦР -1 пробирка, 1,0 см³;

- масло минеральное -1 пробирка, 5,0 см³.

Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:

- концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 см³;

- агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.

Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:

-ОКО (отрицательный контрольный образец) -1 пробирка, 1 см³;

- положительный контрольный образец для ПЦР- К+ ДНК (ДНК Chlamydia psittaci) - 1 пробирка, 0,1 см³.

Отбор материала для исследования. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

Для исследования используют:

- паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг абортированных плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта).

Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 см³, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см³ (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).

Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при минус 20 °С в течение 30 дней. Пробы мочи доставляют в тот же день.

Подготовка исследуемого материала

Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-точными дозаторами переменых объёмов (типа "Ленпипет") с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 см³ и 10,0 см³ (ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.