Изучение степени распространения высоко контагиозного птичьего гриппа и определение напряженности иммунитета в поствакцинальный период у вакцинированных птиц Акмолинской области

Рисунок 7 - Выпадение перьев при гриппе птиц

При классической чуме птиц (грипп Н7) наблюдают кровоизлияния преимущественно в серозных покровах, паренхиматозных органах, скелетных мышцах, пищеварительном тракте. Характерны катары желудочно-кишечного тракта с сильным утолщением слизистой оболочки и обилием слизистых выделений, очаговые некрозы в селезенке, печени, почках и центральной нервной системе.

Три штамма вируса гриппа птиц А5, как и вирус КЧП, оказывают пантропное действие. При вскрытии обнаруживали венозный застой и цианоз кожи, мышечной ткани и внутренних органов, кровоизлияния в строму фолликул и желточный перитонит у несушек, а также энтериты, выраженные в различной степени. У кур, зараженных штаммом крачка /Южная Африка/ 61, преобладал катарально-геморрагический гастроэнтерит вплоть до язвенного воспаления [31].

Рисунок 8 - Поражение центральной нервной системы при гриппе птиц

Рисунок 9 - Геморрагии в жире, на поверхности мышечного желудка и миокарде



Рисунок 10 - Кровоизлияния и геморрагии на железистом желудке и на серозных оболочках в области живота

Рисунок 11 - Геморрагии на брыжейке и язвы в тонком отделе кишечника

Рисунок 12 - Кровоизлияния на слизистой трахеи и некротическое поражение зоба



Рисунок 13 - Геморрагическое поражение фолликул яичек и геморрагии на грудной мышце

1.6 Руководящие принципы ВОЗ по взятию образцов у животных для лабораторной диагностики инфекции гриппа (от 12 января 2005 г.)

Общая информация

Успешное проведение диагностики вирусных инфекций, в значительной степени, зависит от качества образцов и условий, в которых они перевозились и хранились до проведения их исследований в лаборатории. Образцы для выделения респираторных вирусов в клеточных культурах или куриных яйцах с развивающимися эмбрионами и для прямого выявления вирусных антигенов или нуклеиновых кислот, как правило, следует брать в течение первых трех дней после появления клинических симптомов гриппа. У млекопитающих, включая людей, свиней и лошадей, грипп представляет собой, главным образом, инфекцию дыхательных путей, в то время как у птиц он может проявляться в виде инфекции как дыхательных путей, так и кишечника.

Типы образцов

Для диагностики вирусных инфекций верхних дыхательных путей подходят различные образцы, взятые у млекопитающих и птиц:

· назальный мазок

· мазок из зева

· мазок из трахеи

В дополнение к мазкам из верхних дыхательных путей, взятие образцов у птиц для диагностики гриппа должно включать:

· мазок из клоаки

· образец фекалий

По возможности мазки из клоаки необходимо брать у живых или только что забитых птиц. Часто образцы фекалий можно взять только из клеток или окружающей среды, что исключает полную уверенность в их принадлежности конкретным особям.

Если в ходе расследования обнаружены мертвые животные, необходимо предположить наличие высоко патогенного птичьего гриппа и, помимо образцов из дыхательных путей и кишечника, взять репрезентативные образцы внутренних органов, включая мозг, селезенку, сердце, легкие, поджелудочную железу, печень и почки.

Образцы для лабораторной диагностики инфекции гриппа необходимо брать в порядке следующей очередности:

· У живых животных

· Из трахеи

· Из зоба/носа

· Из клоаки

· Фекалии (из окружающей среды)

· Питьевую воду

· У мертвых животных

· Легочные смывы

· Смешанную ткань (в том числе трахеи и легких)

· Фекалии (из окружающей среды)

· Из клоаки

· Питьевую воду

Процедуры взятия образцов

Необходимый материал:

· 1-3 мл пластмассовые пробирки с завинчивающимися крышками

· Полиэфирные зонды с волоконными наконечниками (зонды-тампоны)

· Транспортная среда для вирусов

· Инструменты для аутопсии

Транспортная среда для вирусов:

(А) Транспортная среда 199

1. Среда для тканевых культур 199, содержащая 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА)

2. В 1 литр 0,5% раствора БСА добавить: - бензилпенициллин (2 x 106 IU/литр) - стрептомицин (200 мг/литр) - полимиксин B (2 x 106 IU/литр) - гентамицин (250 мг/litre) - нистатин (0.5 x 106 IU/litre) - офлоксацин гидрохлорид (60 мг/литр), and - сульфаметоксазол (0.2 г/литр)

3. Провести стерилизующую фильтрацию и разлить в 1,0-2,0 мл пробирки с завинчивающимися крышками.

Примечание: При растущем применении антибиотиков в животноводстве стало необходимым использование высоких концентраций противобактериальных и противогрибковых средств.

(Б) Глицериновая транспортная среда

1. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS):

NaCl	8 г
KCl	0.2 г
Na2HPO4	1.15 г
KH2PO4	0.2 г
Дистиллированная вода	до получения 1 литра

2. Стерилизовать ЗФФР в автоклаве и соединить в соотношении 1:1 со стерильным глицерином до получения 1 литра

3. К 1 литру ЗФФР/глицерина добавить:

- бензилпенициллин (2 x 106IU/литр) - стрептомицин (200 мг/литр) - полимиксин B (2 x 106 IU/литр) - гентамицин (250 мг/литр) - нистатин (0.5 x 106 IU/литр) - офлоксацин гидрохлорид(60 мг/литр) и - сульфаметоксазол (0.2 г/литр).

Для правильного выбора среды см. ниже раздел "Подготовка к взятию образцов".

Подготовка пробирок для взятия образцов

В стерильные пластмассовые пробирки с завинчивающимися крышками разлить по 1,0-2,0 мл транспортной среды. Предпочтительно хранить пробирки до их использования при температуре - 20°С. Однако в течение 48-96 часов (оптимальный период - менее 48 часов) их можно хранить при 4°С, а в течение более короткого периода времени (1-2 дня) - при комнатной температуре.

Подготовка к взятию образцов

Пробирки должны быть пронумерованы в соответствии с номерами, указанными в Форме для сбора данных в полевых условиях. По возможности, в Форме для сбора данных в полевых условиях необходимо указывать следующую информацию: тип животного, вид животного, тип образца, дату и место взятия образца и др.

Среда для тканевых культур (А) широко применяется для взятия и транспортировки клинических образцов у всех видов животных. Среда на основе глицерина (Б) обеспечивает более длительную устойчивость образцов в условиях, когда их незамедлительное охлаждение невозможно; она подходит для инокуляции яиц, но не подходит для инокуляции тканевых культур.

Клинические образцы необходимо брать указанными ниже способами и помещать в транспортную среду. Все образцы следует хранить в емкостях со льдом или при температуре 4 °С.

Всегда следует соблюдать стандартные меры предосторожности, а при взятии образцов у пациентов необходимо применять барьерные методы защиты.

Назальный мазок

Сухой полиэфирный зонд-тампон ввести на несколько секунд в ноздрю параллельно нёбу. Затем вращательными движениями медленно вынуть зонд, прижимая его к нижней внутренней поверхности носа. Образцы из обеих ноздрей берутся одним и тем же зондом. Наконечник зонда ввести в пробирку, содержащую 2-3 мл транспортной среды, и отломить стержень аппликатора.

Мазок из зева

Энергично потереть заднюю стенку зева и поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Мазок из трахеи

Для взятия мазка из трахеи живых птиц ввести полиэфирный зонд-тампон в трахею и осторожно потереть им о стенки. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Мазки из трахеи мертвых животных, включая свиней на скотобойнях, можно брать после удаления легких и трахеи из туши. Надеть перчатки, взять трахею рукой, ввести зонд-тампон на максимальную длину и энергично потереть им о стенки трахеи. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Мазок из клоаки

Для взятия мазка из клоаки живой птицы ввести зонд-тампон глубоко в отверстие клоаки и энергично потереть им о стенки. Зонд-тампон должен быть сильно испачкан фекалиями. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Образцы фекалий

Образцы фекалий из клеток живых домашних птиц на птичьих рынках или образцы фекалий диких птиц из окружающей среды необходимо собирать из свежего влажного помета; зонд-тампон должен быть сильно испачкан фекалиями. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Взятие сывороток для диагностики гриппа и эпиднадзора за ним

Образцы тканей

Образцы тканей, в идеале, необходимо немедленно замораживать без транспортной среды, а позднее измельчать и помещать в транспортную среду перед инокуляцией яиц или тканевых культур.

Для диагностики образец сыворотки острой фазы (3-5 мл цельной крови) необходимо брать вскоре после появления клинических симптомов и не позднее 7 дней после их появления. Образец сыворотки фазы выздоровления необходимо брать через 2-4 недели. Для серологических исследований животных на скотобойнях или свободно летающих диких птиц, выпускаемых на волю после взятия крови, берется один образец сыворотки. Свернувшуюся кровь центрифугировать при 2500 оборотах в минуту в течение 15 минут для отделения красных кровяных клеток от сыворотки. Сыворотку отпипетировать, а красные кровяные клетки можно утилизировать. Образцы сыворотки хранить при температуре -20°С [32].

1.7 Иммунитет и специфическая профилактика

Антигенная изменчивость вируса гриппа птиц, затрагивающая поверхностные белки вириона - гемагглютинин и нейраминидазу, изменяющиеся независимо друг от друга, создает существенные трудности в решении проблемы вакцинопрофилактики гриппа. Поэтому необходимы своевременное выделение новых эпизоотических вариантов вируса и подбор адекватных вакцинных штаммов, для чего необходимо применять эффективный метод оценки антигенного соответствия вакцинных штаммов циркулирующим эпизоотическим (рисунок 14). Для этого широко используют радиоиммунологический метод.

Для профилактики гриппа, вызываемого вирусом H7N1, применяют живые вакцины из аттенуированных штаммов Ру и Р5. С целью профилактики гриппа птиц, вызываемого вирусами подтипов А1-А8, применяют активную инактивированную вакцину, которая производится биофабриками.

Для специфической профилактики в Англии применяют живую нейраминидазо-1Ч-специфическую вакцину, преимущество которой в том, что она не интерферирует при серологической диагностике болезни в РЗГА.

В США успешно применяют масляно-эмульсионную вакцину против гриппа птиц на цыплятах-бройлерах и курах-несушках [33].

Рисунок 14 - Стратегии разработки современных вакцин против гриппа птиц

1.8 Организационно-карантинные мероприятия

1. Ограничение контактов с территориями, неблагополучными по ГП: при выявлении в стране ВГП независимо от его антигена запрещение ввоза птицеводческой продукции из соответствующей страны или ее части; разрешать импорт продукции птицеводства из неблагополучных регионов спустя 6 мес. после ликвидации последнего случая гриппа, вызванного высоковирулентным штаммом возбудителя; при возникновении вспышек гриппа, вызванных низковирулентными штаммами, установленные ограничения по ввозу продукции сокращаются до 3 мес. после последнего случая болезни; разрешение на ввоз птицеводческой продукции из стран-экспортеров, где установлено неблагополучие по гриппу, можно выдавать только после квалифицированного экспертного всестороннего обследования ветспециалистами страны-импортера птицеводческих хозяйств и птицеперерабатывающих предприятий неблагополучных регионов и получения документальных доказательств, подтверждающих ликвидацию заболевания.

2. Осуществление эффективных программ биологической безопасности: выбор высококачественных и эффективных дезинфектантов; применение эффективной наружной защиты птицехозяйства от заноса возбудителей болезней с учетом известных факторов риска; сокращение до минимума движения транспорта и посетителей; очистка и дезинфекция всех транспортных средств и оборудования, поступающих на производственные участки; эффективное использование дезинфекционных ковриков для обработки обуви; исключение попадания диких птиц в производственные помещения и их контакта с товарным стадом; очистка территории птицехозяйства, особенно под кормовыми бункерами и на пути следования кормовозов, чтобы не привлекать рассыпавшимся кормом диких птиц; устранение застоя воды, отказ от использования в качестве питьевой воды для товарной птицы поверхностных вод, которые могут быть загрязнены пометом диких птиц; контроль перемещения птицы; проведение периодического серомониторинга от каждой партии птиц.

Целесообразно на угрожаемых территориях проводить и серомониторинг людей, обслуживающих производство птицы (птичницы, работники убойных цехов, ветеринарные специалисты птицехозяйств).

3. Поголовный убой всей птицы в инфицированном хозяйстве. Ряд ученых и специалистов государственной ветеринарной службы обоснованно считают, что предпочтительный способ контроля за ситуацией заключается в своевременном убое всех птиц, инфицированных и из хозяйств соседних районов. Таким образом, создается свободная от домашней птицы зона для препятствия дальнейшего распространения вируса.

Однако техническое обеспечение, необходимое для оперативного, безопасного (в том числе для людей) и гуманного убоя и утилизации большого поголовья домашней птицы (включая при необходимости частный сектор), организация отчужденных мест зимовок перелетных птиц для большинства стран (Россия здесь не исключение), являются задачей, требующей огромных материальных затрат.

4. Оперативная вакцинация поголовья в угрожаемых зонах. Перед угрозой громадных материальных потерь проведение специфической профилактики в хозяйствах, где по каким-либо причинам (административные, организационные, хозяйственные, профессиональные и др.) своевременная иммунизация против ГП птиц не осуществлялась как плановое мероприятие. Другим поводом может быть, например, применение вакцины, более полно совпадающей по антигенному профилю входящих в нее штаммов по сравнению с ранее применявшимся в хозяйстве или хозяйствах препаратом. Реально характеристику "оперативная" следует принимать весьма условно и только в приложении к быстроте исполнения, так как суть вакцинации - толерантность к возбудителям инфекционных заболеваний, а она формируется лишь спустя 2-4 недели после введения вакцины.

Вакцинация как дополнительное профилактическое мероприятие по контролю за ГП применялась во многих странах, среди которых США, Мексика, Италия, Пакистан, Индонезия, Китай и в Гонконге. При этом итоги иммунизации, как правило, были положительными.

Какие доводы, отрицающие специфическую профилактику, можно услышать сегодня:

- вакцинация создает потенциальную возможность для скрытой циркуляции уличных вирусов;

- наиболее распространенный диагностический тест реакция торможения гемагглютинации не позволяет дифференцировать антитела, индуцированные в результате болезни и вакцинации.

Непонятно почему эти вопросы не адресуются к тем же нозологическим формам, как известные всему миру инфекционная бурсальная болезнь, ньюкаслская болезнь или болезнь Марека. И почему этим неудобствам не противопоставить громадную биологическую, экологическую и социальную опасность вируса гриппа птиц.

В мировой практике именно иммунизация привела (по данным лабораторных и полевых наблюдений, проведенных в Гонконге) к тому, что иммунизированные куры опытной группы после их заражения массивными дозами уличного штамма ГП выделяли во внешнюю среду примерно в 10 тыс. раз меньше вирулентного вируса по сравнению с контрольными невакцинированными. Конечным результатом применения вакцины в Гонконге стала успешная ликвидация вспышки ГП на соответствующих фермах.

Установлено, что своевременная вакцинация приводит к снижению абсолютной (по всем органным структурам) вирусной нагрузки у птицы. Одновременно уменьшается количество инфицированных особей в стаде, что эффективно пре пятствует расширению очага болезни. Отсутствие среды воспроизводства ВГП существенно снижает риск инфицирования людей, обслуживающих потенциально зараженную птицу.

Для дифференцирования антител, при желании, можно применять диагностические тесты, основанные на выявлении антител к нейраминидазе, М - и NS-белкам, ИФА-тесты. Были бы полезны здесь и молекулярно-биологические методы (полимеразно-цепная реакция, геномное секвенирование), позволяющие выявлять различные и сходные геномные фрагменты вируса, и более доступные вирусологические приемы (заражение отобранными образцами куриных эмбрионов, монослойных клеточных культур), нацеленные на изоляцию полевых вирусов и их дальнейшую идентификацию [34].

В качестве еще одного аргумента в пользу вакцинации против ГП необходимо привести американские исследования, продемонстрировавшие, что антитела, синтезированные в результате иммунизации, подавляют репродукционную активность вируса ГП, что снижает возможность мутационных изменений в геноме. В этих же работах показано, что для эффективной защиты не требуется полного антигенного соответствия между полевыми и вакцинными штаммами. Более высокая эффективность вакцинации против ГП отмечена, если оба штамма (вакцинный и полевой) принадлежат к одному сероподтипу по характеристике гемагглютинина.

Заключение. Вследствие того что карантинные меры обеспечивают не более чем временный, непродолжительный и частный результат, отличающийся крайне высокими дестабилизирующими финансовыми затратами и структурными технологическими разрушениями хозяйств, а также системным деструктивным воздействием на всю отрасль, необходимо в РФ оперативно переходить к тотальной иммунизации домашней птицы (инактивированными вакцинами, с первых часов жизни цыплят). Проводить контроль ГП комплексно, с учетом перечисленных выше принципов. Такая стратегия профилактики ГП может быть реализована только при государственной поддержке на самом высоком уровне, точнее, административном патронаже, как это уже было успешно отработано в деталях с ньюкасловской болезнью.

Предлагаемая стратегия при несущественном давлении на ценообразование конечной продукции (для сравнения - в отрасли повсеместно применяется до 10 вакцин) сохранит отечественное высокотехнологичное промышленное птицеводство как один из основных источников продовольственного благополучия страны, а при прогнозируемом драматическом развитии событий защитит еще от подневольности, и диктата импорта.

2. Основная часть

2.1 Характеристика объекта

Исследовательский центр Государственного учреждения "Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологи в ветеринарии" МСХ РК (ИЦ ГУ "НЦМР") является самостоятельным юридическим лицом и аккредитована на техническую компетентность Госстандартом РК.

ИЦ возглавляет Директор ГУ "Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии" МСХ РК и в своей деятельности подчинен Учредителю (Учредителем государственного учреждения является государство в лице Правительства Республики Казахстан).

Органом Государственного управления Республиканского государственного учреждения "Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологи в ветеринарии", а также органом, осуществляющим по отношению к нему функции субъекта права государственной собственности является Министерство сельского хозяйства Республики Казахстан.

В своей деятельности ИЦ руководствуется действующим законодательством Республики Казахстан, организационными и методическими документами Госстандарта.

Организация и проведение исследования материала, анализ и оформления их результатов находятся в компетенции исследовательского центра.

Прием и увольнение работников ИЦ и установление им должностных окладов производит Директор ГУ "Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии" МСХ РК в пределах установленного Учредителем фонда оплаты труда.

Распределение обязанностей между работниками ИЦ и утверждение должностных инструкции производит Директор ГУ "Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии" МСХ РК.

Штаты ИЦ ГУ "НЦМР" укомплектовываются специалистами, имеющими соответствующее образование, профессиональную подготовку, квалификацию и опыт проведения исследования. Их обязанности, права и ответственность устанавливаются должностными инструкциями.

Сотрудники ИЦ допускаются к работе после ознакомления с обязанностями и инструкциями. Повышение квалификации сотрудников обеспечивается через прохождение курсов повышения квалификации в соответствии с должностной инструкцией.

ИЦ ГУ "НЦМР" проводит исследование материала на соответствие требованиям межгосударственных и государственных стандартов, или других нормативных документов.

Основные задачи:

1. Осуществление лабораторных исследований материалов особо опасных заразных болезней животных по утвержденному перечню Правительством Республики Казахстан;

2. Привлекается в установленном порядке к работам по отбору проб для проведения исследований.

3. Обеспечение полноты и правильности проведения исследований, объективности и достоверности результатов.

4. Научная разработка нормативно-методических документов по ветеринарному лабораторному делу.

5. Обеспечение непрерывного функционирования системы качества услуг, оказываемых заказчиками.

6. Принимать участие в информационном обмене с другими ИЛ аналогичного профиля для внедрения в практику деятельности согласованных методик и получения сопоставимых результатов исследований.

Права:

Исследовательский центр имеет право:

- указывать в рекламных материалах, в различных документах (в том числе, содержащих результаты испытаний), что он аккредитован в Государственной системе сертификации Республики Казахстан, Системе аккредитации;

- заключать договоры о взаимодействии с другими организациями; (если ИЦ ГУ "НЦМР" аккредитован на техническую компетентность, договор заключается от юридического лица, в состав которой он входит);

- участвовать в работе отечественных и международных организаций по стандартизации, исследованиям, оценки и контролю качества;

- проводить арбитражные исследования по поручению соответствующих органов;

- расширять область аккредитации, в установленном порядке;

- передавать материалы в судебные органы при нарушении заказчиками условий контракта (договора), препаратов и оборудования.

Исследовательский центр обязан:

- проводить исследования и выдавать акты экспертиз в соответствии системы аккредитации в пределах области аккредитации;

- ссылать на факт своей аккредитации только применительно к установленной области аккредитации;

- обеспечивать достоверность, объективность и требуемую точность результатов исследований;

- проводить исследования для постановки диагноза и четко идентификации образцов материалов, сопровождаемые актом отбора;

- доводить до соответствующих органов государственного надзора информация об отрицательных результатах исследований по требованиям, обеспечивающим безопасность жизни и здоровья людей, имущества граждан и окружающей среды;

- предоставлять заказчику возможность наблюдения за проводимыми для него исследованиями;

- соблюдать установленные сроки проведения исследований;

- проводить по требованию Госстандарта контрольные исследования для проверки или подтверждения технической компетентности своей или другой лабораторий;

- предоставлять при необходимости, образцы исследуемых материалов для проведения меж лабораторных сличений;

- принимать участие в программах меж лабораторных сличений;

- создавать необходимые условия для проведения государственного контроля за деятельностью исследовательского центра;

- вести учет предъявляемых претензий по результатам исследований;

- обеспечивать конфиденциальность информации при проведении исследований;

- своевременно информировать Госстандарт об изменениях юридического статуса ИЦ, наименования, адреса, организационной структуры;

- в случае приостановления или аннулирования Аттестата аккредитации немедленно прекратить деятельность по исследованиям в соответствии с требованиями нормативных документов системы аккредитации и нормативных правовых актов Республики Казахстан.

2.2 Материалы и методы исследований

Отбор проб проводят из трахеи, легких, воздухоносных мешков, экссудата, костного мозга, подглазничных синусов, содержимое кишечника и клоаки, из печени, головного мозга, селезенки, крови (рисунок 15). От больных и трупов павших утят, кроме этого, берут соскобы со слизистой оболочки носа, гортани и подглазничных синусов. Материал для последующих исследовании хранят в охлажденном, лучше замороженном виде. Для выделение вируса ГП используют 9-11 - дневные куриные эмбрионы, которые заражают в аллантоисную или амниотическую полость. Все штаммы вируса А1 (классической чумы птиц) вызывает гибель эмбрионов через 25-36 часов после заражения, с возрастанием вирулентности возбудителя по мере увеличения количества пассажей, до 107-108 ЭЛД 50/мл.

После выделения проводят серологическую идентификацию вируса, определяя специфическую антигенные способности штамма в РЗГА, РН в эмбрионах кур, ИФА, реакция торможения нейраминидазой активности (РТНА), реакция радиального гемолиза, в РДП (определяя сходство гемагглютинина и нейраминидазы), в полимеразой цепной реакции (ПЦР) - для определения генома вируса, выявленные вирусной нуклеиновой кислоты в пробах патологического материала и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также для дифференциации антигенных подтипов вируса. Биопроба проводиться внутривенным заражением цыплят аллантоисной жидкостью эмбрионов кур, инфицированных выделением изолятом вируса ГП. Если из 10 цыплят в течение 10 дней гибнет 6 голов, то выделенный вирус ГП считается высокопатогенным.

Рисунок 15 - Отбор проб материалов (сердце, селезенка)

Схема лабораторной диагностики птичьего гриппа показана на рисунке 16. Применяемые в настоящее время методы лабораторной диагностики гриппа птиц можно разделить на четыре группы:

Серологические реакции

- Реакция гемагглютинации (РГА)

- Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

- Иммуноферментный анализ (ИФА)

- Реакция нейраминидазы (РИНА)

- Реакция нейтрализации (РН)

Выделение вируса

- Реакция на куриных эмбрионах

- Культура клеток MDCK, Vero

Молекулярно-генетические исследования

- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

- Реал-тайм ПЦР

- Расшифровка генома вируса

Электронно-микроскопические исследования

- Изучение морфологии вируса

- Электронно-микроскопическое фотографирование РГА

Для идентификации вируса в патологическом материале можно использовать РГА. Надосадочную жидкость после центрифугирования суспензии проб из органов и тканей больной птиц, а также смывов исследуют в капельной или пробирочной РГА с 1% суспензии эритроцитов кур или 0,5% взвесью эритроцитов морской свинки. Реакцию учитывают через 20 минут и 1 час. Специфичность определяют в РТГА [35].

Идентификацию испытуемого вируса проводят с набором эталонных штаммоспецифицеских гриппозных сывороток к его антигенным вариантам. Для дифференциации в реакцию вводят сыворотку против вируса БН. РТГА ставят микро- или макрометодом по общепринятой методике [36].



Рисунок 16 - Лабораторная диагностика птичьего гриппа

Диагностика гриппа комплексная с обязательным выделением, идентификацией вируса и постановкой биопробы. Для ретроспективной серологической диагностики используют РЗГА. Для серологических исследований используют РДП, РНГА, МФА, РСК, а также метод иммуноферментного анализа (ИФА), предназначенный для экспресс титрования антител к вирусу ГП по гемагглютинину и нейраминидазе.

При проведении иммуноферментного анализа (ИФА) используют оборудование, показанное на рисунке 17. На рисунке 18 показаны схемы проведения ИФА.

Рисунок 17 - Оборудование для проведения ИФА



Рисунок 18 - Схемы метода ИФА

Схема метода ИФА двойных антител "сэндвича" для определения антигена

Схема "непрямого" метода ИФА для определения антител

В полимеразой цепной реакции (ПЦР) - определяют геном вируса, выявленные вирусной нуклеиновой кислоты в пробах патологического материала и в аллантоисной жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также для дифференциации антигенных подтипов вируса. При постановке реакции используют следующие оборудование (рисунок 19):

Рисунок 19 - Оборудование для ПЦР

2.3 Результаты собственных исследований

Учитывая эпизоотическую ситуацию по данному заболеванию в Казахстане за предыдущие годы, а также мировую ситуацию вероятность возникновения эпизоотии остается высокой. Основная угроза в распространении отводится диким перелетным птицам, в особенности утке, гусю, лебедю (рисунок 20).

Весенний миграционный поток перелетных птиц на территорию Сибири проходит через Казахстан по трем основным направлениям (рисунок 21) - с Африканских и Южно-Европейских зимовок охватывает территории Западно-Казахстанской, Атырауской, Мангистауской областей; с пакистанских зимовок миграция проходит через южные и центральные области Казахстана; с индийских зимовок поток охватывает восточные и северные регионы Республики. Осенняя миграция проходит теми же путями.

Рисунок 20 - Пути миграции птиц в мире



Рисунок 21 - Основные участки миграционных потоков птиц

Всю миграцию можно разделить на три этапа - ране прилетные птицы, средне и поздние прилетные также как и ране отлетные, средне и поздние отлетные. Данное обстоятельство зависит от режима температуры воздуха окружающей среды. Весенний пролет ране прилетной птицы, в которую входят наиболее подверженные вирусоносительству виды - утка, гусь, лебедь происходит, когда средне суточный показатель температуры воздуха приходится на интервал 5-10єС. Массовый прилет приходится примерно на двадцатые числа февраля в Южных областях Казахстана и во второй декаде апреля в северной части.

Весной происходит занос латентной инфекции при посредстве вирусоносителей, в июль-сентябрь месяцах происходит естественный пассаж вируса через организм водоплавающих птиц, усиление вирулентности и развитие инфекции. В связи с этим, Национальным центром мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологи в ветеринарии была продолжена и разработана схема зонирования территории РК для проведения мониторинга по высокопатогенному гриппу птиц (рисунок 22). Согласно схемы были определены: зона реальной угрозы (Северно-Казахстанская, Павлодарская, Акмолинская, Мангистауская и северные районы Восточно-Казахстанской областей), угрожаемая зона (Костанайская область, южные районы Восточно-Казахстанской области, северные районы Алматинской, Жамбылской, Южно-Казахстанской, Кызылординской областей, южные районы Актюбинской и Атырауской областей.) и зона наблюдения (южные и западные области Казахстана).

Рисунок 22 - Зонирование территории РК по высокопатогенному птичьему гриппу в 2007 г.

В 2007 году в мире птичий грипп зарегистрирован в 33 странах. В основном это страны юго-восточной Азии, Африка, Европа. Прогноз зависит от того, где будет регистрироваться птичий грипп. Если это будут страны юго-восточной Азии, то будет существовать реальная угроза заноса гриппа весной на территории Алматинской, Восточно-Казахстанской, Карагандинской, Северо-Казахстанской, Павлодарской, Костанайской, Акмолинской областей. Если это будет Европа или Африка то заносу гриппа подвержены западные области Казахстана. При осенней миграции угроза будет исходить от приграничных областей Российской Федерации, следовательно под угрозой заноса птичьего гриппа будут находиться восточные, северные и западные области Казахстана.

Птичьи грипп в 2005 года зарегистрирован в следующих областях Республики Казахстан (рисунок 23):

В крестьянском хозяйстве "Нан", расположенного на территории села Голубовка Абайского сельского округа Иртышского района Павлодарской области. Дата наложения карантина 1 августа 2005 года. В данном хозяйстве уничтожено путем сжигания 2 800 голов птицы.

В селе Виноградовка Наумовского сельского округа Аккольского района Акмолинской области. Дата наложения карантина 3 августа 2005 года. Изъято и уничтожено 467 голов.

В селе Ушсарт Кызылсайского сельского округа Коргалжынского района Акмолинской области. Дата наложения карантина 1 августа 2005 года. Дата наложения карантина 4 августа 2005 года. Изъято и уничтожено 2 745 голов.

В селе Тумсык Шетского сельского округа Шетского района Карагандинской области. Дата наложения карантина 10 августа 2005 года. Изъято и уничтожено 510 голов.

В селе Дубровное Дубровинского сельского округа Мамлютского района Северо-Казахстанской области. Дата наложения карантина 12 августа 2005 года. Изъято и уничтожено 2722 голов.

В селе Талапкер Амангельдинского сельского округа Есильского района Северо-Казахстанской области. Дата наложения карантина 15 августа 2005 года. Изъято и уничтожено 3408голов.

В селе Нолобино Нолобинского сельского округа Кызылжарского района Северо-Казахстанской области. Дата наложения карантина 17 августа 2005 года. Изъято и уничтожено 211 голов.

В целях предупреждения распространения птичьего гриппа в полном объеме проведен комплекс мероприятий по локализации и ликвидации очагов.

По всем указанным неблагополучным пунктам изъято и уничтожено 12 860 голов домашней птицы [ГУ "НЦМРЛДМВ" МСХ РК] (Государственное учреждение Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии).



Рисунок 23 - Эпизоотическая состояние Республики Казахстан по птичьему гриппу в 2005-2006 гг.

В 2007 году из 8 областей Республики Казахстана в лабораторию микробиологии и вирусологи ГУ "НЦМРЛДМВ" МСХ РК на исследование поступило 154 проб патологического материала от домашних и диких птиц, которые были подвергнуты тщательному патологоанатомическому и лабораторному исследованию, результаты исследований которых были отрицательными (таблица 2).

В лабораторию микробиологии и вирусологии АФ ГУ "НЦМР" за 2007 г. поступило 949 проб для вирусологического и бактериологического исследований. Изучение биоматериала проводилось с использованием молекулярно-биологических и иммунологических методов исследований (таблица 3). В результате гистологического исследования обнаружены нуклеопротеиды вируса гриппа в отдельных ячейках нерва (рисунок 24), островках поджелудочной железы (рисунок 25), в цитоплазме и ядре мозговых нейронов (рисунок 26), в гранулированном слое мозжечка (рисунок 27).



Рисунок 24 - Обнаружение нуклеопротеидов вируса гриппа в отдельных ячейках нерва

Рисунок 25 - Выявление нуклеопротеидов вируса гриппа в отдельных островках поджелудочной железы

Таблица 2 - Сведения лабораторных исследований на вирусные инфекции

№ п/п	Наименование заболевания	Количество материала	Биологическая проба	Проведены лабораторные исследования
				РИД	РГА	РСК	ИДАФ	ИФА	Иммуннохроматография	Получено положительных результатов	Всего проведено исследований
Болезни птиц
1	Птичий грипп	154			18			154	99		271
Болезни КРС
2	Лейкоз	212		152				212		115	364
3	Ящур	3668				690		3668	21	24	4379
Болезни плотоядных
4	Бешенство	5					1			-	5
5	Чума плотоядных	4								4	4
Болезнь свиней
6	Классическая чума свиней	41	2					41			43
	Итого:	4084	2	152	18	690	1	4075	120	143	5062

Таблица 3 - Результаты лабораторно-диагностических исследований

На какие болезни проводились исследования и по каким видам животных	Кол-во проб	Из них проведено исследований	Получены положительные результаты
		Пат. - анат	Микроскоп	Бактериол	Вирусолог	Биологич	Серологич	Гематолог	Капролог	Химич (биохимич)	Гистологии
Бруцеллез сыворотка крови КРС	56						56					-
Бруцеллез цельная кровь МРС	21		21	63
Колибактериоз	19		19	38								-
Пастереллез диких животных пат.материал	88		88	176								-
Сальмонелл ез	54		54	54								-
Сибирская язва пат.материал	30		30	30								-
Ящур сыворотка крови КРС наИФА	62				62							-
Ящур сыворотка крови МРС на ИФА	10				10
Листериоз пат.материал	41		41	82								-
Грипп птиц пат.материал ПЦР	358				358							-
Грипп птиц сыворотка крови ИФА	210				210							-
Всего:	949		253	443	640		56

Рисунок 26 - Выявление нуклеопротеидов вируса гриппа в цитоплазме и ядре мозговых нейронов

Рисунок 27 - Выявление нуклеопротеидов вируса гриппа в гранулированном слое мозжечка

7-9 ноября 2005 г. состоялось совещание по птичьему гриппу и пандемическому гриппу человека, совместно созванное ВОЗ, Продовольственной и сельскохозяйственной организацией, Всемирной организацией здоровья животных и Всемирным банком. В ходе этого совещания был проведен обзор состояния заболеваемости животных птичьим гриппом, вызываемым высокопатогенным вирусом H5N1, и оценены сопутствующие риски для здоровья человека, в том числе риски, которые возникнут с появлением пандемического вируса. Обеспокоенность последствиями такого события предопределила ход обсуждения вопросов здоровья человека в направлении рассмотрения двух основных наборов действий. Последние были нацелены на предупреждение появления пандемического вируса или, если это окажется невозможным, на отсрочку первоначального международного распространения пандемии, и на подготовку всех стран к такому противодействию пандемии, чтобы сократить заболеваемость и смертность, а также ослабить экономические и социальные потрясения.

Участники пришли к ряду выводов и согласовали план действий из 12 пунктов. Основных, из которых 5. Эти пять мероприятий составляют основу стратегического плана, который нацелен на решение двух всеобъемлющих задач:

1 использовать все практически осуществимые возможности для предупреждения развития у вируса H5N1способности вызвать пандемию и в случае безуспешности этих усилий,

2 обеспечить принятие мер по снижению высокой заболеваемости и смертности и ослаблению социально-экономических потрясений, которых можно ожидать в ходе следующей пандемии.

Перед каждым стратегическим мероприятием ставится цель, достижение которой способствует решению этих более масштабных задач.

Профилактика и меры борьбы с высококонтагиозным птичьим гриппом включают в себя общую профилактику и меры при вспышках.

Общая профилактика состоит из 1) исключения контактов домашней птицы с дикими птицами, особенно с водоплавающими; 2) недопущения в хозяйство птицы с неизвестным эпизоотическим статусом; 3) контроля перемещения людей (персонала); 4) тщательной очистки и дезинфекции хозяйства; 5) разведения птицы одной возрастной группы (все пусто - все занято). Меры при вспышках должны включать: 1) карантин; 2) убой всей птицы (стемпинг-аут) в радиусе 3-10 км; 3) утилизацию всех трупов и всей продукции; 4) очистку и дезинфекцию; 5) зонирование; 6) мониторинг за дикой фауной; 7) вакцинацию по паказаниям ("Инфлювак" - Нидерланды, "Вакцигрипп" - Франция, "Флюарикс" - Бельгия, "Гриппол" и "Грипповакс" - Россия.

3. Экономическое обоснование

Основной задачей проведения научных исследований является определение экономической эффективности ветеринарных мероприятий, выявление резервов повышения их эффективности, изучение экономического ущерба, причиняемого заразными болезнями животных, определение экономического эффекта, получаемого в результате внедрения достижений ветеринарной науки и практики в производство.

При определении экономических показателей эффективности данных научных исследований определяли следующие экономические показатели: фактический экономический ущерб, предотвращенный ущерб, затраты на проведение ветеринарных мероприятий и экономическую эффективность ветеринарных мероприятий.

Экономический ущерб от уничтожения больных гриппом птиц определяем формуле (1):

У=МЧЖЧЦ, (1)

где: М - количество павших, вынужденно убитых птиц,

Ж - средняя масса птиц разных видов, кг

Ц - средняя реализационная цена единицы продукции, тенге

Например, в птицеводческом хозяйстве зарегистрирован высококонтагиозный грипп птиц. Заболело и пало 1000 кур, живой массой 3,5 кг. Карантин был снят через 21 день после уничтожения последнего трупа. Средняя реализационная цена 1 кг живой массы составляет 300 тенге. Трупы павших животных сожжены. Ущерб от падежа составил:

У1=МЧЖЧЦ=1000 Ч3,5Ч300=1050000 тенге

Ущерб от падежа 1000 кур составил 1050000 тенге.

Таким образом, экономический ущерб в случае возникновения высококонтагиозного птичьего гриппа в хозяйстве с птицепоголовьем в 1000 кур составит 1 050 000 тенге, что говорит о высокой опасности данного заболевания, тем более, что оно является опасным и для человека.

4. Охрана окружающей среды

В настоящее время в Республике Казахстан сложилась неблагоприятная экологическая обстановка. Этому во многом способствует то, что на протяжении многих десятилетий в Казахстане складывалось преимущество сырьевая система природопользования. Это сопровождалось экстремально высокими техногенными нагрузками на окружающую среду. Поэтому кардинального улучшения экологической ситуации не произошло, и она по прежнему характеризуется деградацией природных систем, что ведет к дестабилизации биосферы, утрате ее способности поддерживать качество окружающей среды, необходимое для жизнедеятельности общества.

Годы независимости в Казахстане стали годами образования экологической безопасности, управление охраной окружающей среды и природопользования - хорошо организованной и территориально разветвленной системой исполнительных органов в области охраны окружающей среды РК.

С момента принятия данной концепции в РК произошли серьезные перемены в общественном развитии. Разработаны стратегические документы развития государства, создана основа природоохранного законодательства, подписан ряд международных конвекций по вопросам окружающей среды, создана система управления природоохранной деятельностью.

Задачей законодательства РК в области охраны окружающей среды является урегулирование отношений в сфере взаимодействия общества и природы с целью улучшения качества окружающей среды, укрепление законности и правопорядка.

Каждый гражданин обязан охранять окружающую среду и бережно относиться к природным ресурсам, соблюдать законодательство об охране окружающей среды, повышать уровень своих экологических знаний и содействовать экологическому воспитанию подрастающих поколений. Земля и ее недра, вода, растительный и животный мир, другие природные ресурсы составляют материальную основу суверенитета РК и находятся в государственной собственности [37].

Одной из важнейших экологических проблем в пищевой промышленности является выброс в атмосферу вредных веществ, объем которого в 2000г. составил 181,8 тыс.т. Основные компоненты выбросов: оксид углерода (40% общего объема выбросов в отрасли), диоксид серы (28%), твердые вещества (13%) и оксид азота (12%). Показатель улавливания и обезвреживания вредных веществ в 2000 г. достиг максимального.

Воздействие на атмосферный воздух объектов пищевой промышленности определяется тем, что в выбросах, помимо общих для промышленности вредных веществ, присутствуют сильно пахнущие компоненты, сухие продукты животного происхождения, канцерогенные вещества. Решение этих вопросов осложняется тем, что объем выбросов загрязняющих веществ распределяется между многочисленными предприятиями

Не менее важной и сложной проблемой является использование водных ресурсов. В пищевой промышленности в 2000 г. использовано 573,6 млн. куб.м. воды. В структуре сброса значительную часть составляют загрязненные сточные воды (56%), на нормативно чистые воды приходится 38%.

Сбрасывая в поверхностные водные объекты преимущественно загрязненные производственные воды с высоким содержанием вредных веществ предприятия загрязняют водоемы органическими веществами, сульфатами, фосфатами, нитратами, щелочами и кислотами.

Таким образом, основной экологической задачей всех пищевых производств на современном этапе является достижение должного уровня качества окружающей среды [38].

В число эффективных мер по охране окружающей среды следует отнести, прежде всего, широкое внедрение прогрессивных технологических процессов; улучшение работы очистных сооружений и установок; усиление охраны атмосферного воздуха; обеспечение рационального использования и защиты земель; улучшение работы по охране, воспроизводству и рациональному использованию растительного и животного мира; воспитание у людей чувства ответственности за сохранение и преумножение природных богатств и др.

Эксплуатация объектов сельскохозяйственного назначения должна осуществляться с учетом установленных экологических требований и с использованием экологически обоснованных технологий, необходимых очистных сооружений и санитарно-защитных зон, исключающих загрязнение окружающей среды. При эксплуатации данных объектов должны внедряться малоотходные и безотходные технологии и производства, они должны оснащаться эффективными средствами для очистки, обезвреживания и утилизации вредных отходов, выбросов и сбросов, загрязняющих веществ, применять безопасные виды топлива, экономно и рационально использовать природные ресурсы, принимать меры по экологической безопасности.

Должностные лица и специалисты, связанные с деятельностью, охватывающей вредное воздействие на окружающую среду, обязаны иметь необходимую экологическую подготовку и обладать знанием основ законодательства об охране окружающей среды. Профессиональная экологическая подготовка руководителей и специалистов учитывается при их назначении на должность аттестацией и переаттестацией.

Охрана окружающей среды - одна из насущных задач человечества. Научно-техническая революция, ставшая возможной в результате великих открытий в биологии, физике, химии, и многих других науках, намного расширяет возможности интенсивного использования природных ресурсов, необходимых для дальнейшего развития производительных сил, удовлетворения материальных и духовых потребностей общества. В то же время научно-техническая революция нередко усложняет взаимоотношение человека с окружающей природной средой, вносит весьма заметные и непредвиденные изменения в экологические системы, в регуляцию биосферы в целом. Нередко они связаны с загрязнением воздушного бассейна, морских акваторий и пресноводных водоемов, нарушением почвенного покрова и ценных ландшафтов, водных и лесных ресурсов, уменьшением численности полезных видов животных и растений [39].

Химические и бактериологические загрязнения пищевых продуктов происходит как в результате загрязнения окружающей среды, так и по причине отсутствия элементарных гигиенических условий в местах производства и потребления пищевых продуктов.

Учеными Республики установлено, что во всех неблагополучных регионах отмечаются высокие уровни общей заболеваемости: рост бронхитов и тонзиллитов в 5-15 раз, осложнений беременности и родов более в чем в 5 раз, гастритов, дуоденитов, холециститов в 10 раз, ишемической болезни сердца, инфарктов миокарда в 7 раз, гипертонии в 5 раз.

Следовательно, экономические исследования, экологический подход - условия при планировании вмешательства человека в природу, в том числе и путем природоохранительных мероприятий.

Специалист сельского хозяйства должен быть организатором и проводником мероприятий по охране природы в сочетании с задачами сельскохозяйственного производства. Для решения этой проблемы он должен овладеть полученными основами комплексной охраны природы и практически применять полученные экологические знания с учетом особенностей ведения сельского хозяйства в конкретном регионе.

Природа, ее богатства - общие достояние забота о том, чтобы ее красота и щедрость были сохранены, приумножены и для грядущих поколений, должна быть всенародной.

Сельскохозяйственное производство, как никакое другое, тесно и неразрывно слито с природой. Его развитие и конечные результаты во многом определяются качеством и состоянием основных компонентов биосферы - земли, воды и атмосферы.

Человечество постоянно стремится наращивать производство продукции. Но такое увеличение нельзя оправдать, если оно сопровождается нерациональной тратой природных ресурсов и пагубно действует на окружающую среду, которая в сложившейся ситуации особенно нуждается в охране.

Целью государственной политики в области экологической безопасности является обеспечение защищенности природных систем, жизненно важных интересов общественных прав личности от угроз, возникающих в результате антропогенных и природных последствий на окружающую среду.

Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

- снижение антропогенного воздействия, ведущего к изменению климата и разрушение озонового слоя Земли;

- сохранение биоразнообразия и предотвращение опустынивания и деградации земель;

- реабилитация зон экологического бедствия, полигонов военно-космического и испытательного комплексов;

- предупреждение загрязнения шельфа Каспийского моря;

- предупреждение истощения и загрязнения водных ресурсов;

- ликвидация и предотвращение исторических загрязнений, загрязнения воздушного бассейна, радиоактивного, бактериологического и химического загрязнений, в том числе трансграничного;

- сокращение объемов накопления промышленных и бытовых отходов;

- предупреждение чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера.

Территория Республики Казахстан разнообразна по своим природным и географическим условиям. Ее фауна насчитывает множество видов, через ее пространства проходят пути сезонных миграций диких животных и птиц, что не может не оказывать влияние на экологию вирусов. Кроме того, в последние годы повысилась интенсивность взаимных контактов с зарубежными странами. Указанные факторы способствуют значительному усилению циркуляции и увеличению вероятности заноса в природу республики разнообразных патогенных микроорганизмов, в том числе и вирусов, ранее здесь не регистрировавшихся. Данные ряда неполных исследований показывают, что у сельскохозяйственных животных страны отмечаются инфекционные болезни неизвестной этиологии, отдельные случаи которых остаются незамеченными или неисследованными.

Тема дипломной работы: "Эпизоотический мониторинг и организация ветеринарно-санитарных мероприятий против высокопатогенного гриппа птиц". То есть при выполнении цели и задач данных исследований, мы в огромной степени увеличиваем экологическую безопасность нашей страны, путем предупреждения распространения инфекционного высококонтагиозного заболевания, которым болеет и человек.

5. Охрана труда

Охрана труда включает в себя мероприятия по облегчению и оздоровлению условий труда, внедрение производственных процессов управления рабочего труда и замещение его механизации и автоматизации трудоемких и вредных процессов, внедрение совершенных технологий и техники безопасности, устранению причин вызывающих вред и травматизм работающим и служащим. А также включает в себя нормы гигиенических и санитарно-бытовых условий.

В настоящее время в каждом хозяйстве, объединении, области республики имеются комплексные планы улучшения условий, охраны труда и социально-оздоровительных мероприятий. На их осуществление выделены необходимые материальные ресурсы и денежные средства, что способствует улучшению работы по охране труда в колхозах и совхозах [40, 41].

Кодекс законов по охране труда от 15 мая 2007 г. регулирует общественные отношения в области охраны труда и направлен на обеспечение безопасности, сохранение жизни и здоровья работников в процессе трудовой деятельности, а также устанавливает основные принципы государственной политики в области безопасности и охраны труда.

Основными принципами в области безопасности и охраны труда являются:

1) приоритет жизни и здоровья работников по отношению к результатам производственной деятельности;

2) недопущение необратимых последствий вредного воздействия производственных факторов на жизнь и здоровье работника;

3) гарантирование государством защиты прав работников на условия труда, соответствующие требованиям безопасности и охраны труда;