Изменение синтеза аденозинтрифосфата митохондриями при изменении pH

Увеличение концентрации АТФ при снижении значений внеклеточной рН зарегистрировано и для клеток дрожжей. Клетки дрожжей, которые культивировали при повышенном содержании молочной кислоты, что приводило к снижению рН до 2,5, характеризовались сниженными темпами роста. Метаболомный анализ таких клеток выявил повышенную концентрацию АТФ (Nugroho et al., 2015).

Интересные данные о влияние рН среды на метаболизм митохондрий были получены в работе Вильсона с соавторами (Wilson et al., 2012), которые пытались ответить на вопрос о зависимости синтеза АТФ от парциального давления кислорода в среде. Как отмечают авторы, в литературе отсутствует единое мнение по данному вопросу. Согласно одной точке зрения, критическое значение парциального давления кислорода для осуществления окислительного фосфорилирования составляет около 0.05 торра (0.08 мM). Если же концентрация кислорода выше этого критического значения, то кислородзависимое регулирование клеточного метаболизма не играет значимой роли. В то же время другими авторами были получены данные об изменениях степени восстановления цитохрома с и энергетического метаболизма в ответ на изменение содержания кислорода при значениях давления свыше 30 торров (то есть соответствующих обычному содержанию кислорода в межклеточной жидкости и в смешанной венозной крови). В этом случае окислительное фосфорилирование должно быть высокочувствительно к изменению содержания кислорода в стандартных физиологических условиях.

Данное исследование проводили на митохондриях, изолированных из клеток печени крыс. Для изоляции митохондрий образцы ткани гомогенизировали в среде, содержащей 0,22 M маннитола, 0,75 M сукрозы, 0,5 mM ЭДТА, 5 mM буфера MOPS (pH 7.3). Затем с помощью центрифугирования при низких скоростях (750 оборотов в мин, 8 мин) отделяли клеточный дебрис.

Фракцию митохондрий отделяли с помощью центрифугирования при высокой скорости (7500 оборотов в мин, 8 мин), после чего ресуспензировали. Данные, полученные Вильсоном с соавторами, подтверждают последнюю точку зрения о зависимости эффективности окислительного фосфорилирования от содержания кислорода при физиологических значениях рН pH 7.4. Однако эта кислородная зависимость снижается при снижении значений рН, то есть в более кислой среде (Wilson et al., 2012).

Наряду с этим имеются данные о том, что ацидоз, который развивается в скелетных мышцах in vivo (рН ниже 6,88) ингибирует процессы окислительного фосфорилирования и приводит к снижению содержания АТФ (Jubrias et al., 2003). Возможно, эти результаты связаны со сложностью оценки интенсивности процессов фосфорилирования в условиях целостного организма (авторы использовали магнитную резонансную спектроскопию на интактных мышцах).

Активирующее влияние пониженных значений рН внеклеточного окружения (в частности, при ацидозе, вызванном молочной кислотой) показано также на клетках злокачественных опухолей, в которых при культивировании в среде с рН 6,6-6,8 происходило переключение энергетического метаболизма на путь окислительного фосфорилирования (Peppicelli et al., 2016; Wu et al., 2016).

В частности, Ву с соавторами (Wu et al., 2016) провели количественную оценку синтеза АТФ путем гликолиза и путем окислительного фосфорилирования в 9 различных линиях опухолевых клеток. В отсутствие молочной кислоты продукция АТФ за счет гликолиза и за счет окислительного варьировала в пределах 23,7--52,2 % и 47,8--76,3 %, соответственно. При добавлении молочной кислоты (рН 6,7) эти показатели составляли 5,7--13,4 % и 86,6--94,3 %, соответственно.

Поскольку внешняя мембрана митохондрий проницаема для ионов Н+, рН в межмембранном пространстве соответствует значению рН цитоплазмы. Так как концентрация ионов Н+ в матриксе митохондрий ниже, чем в межмембранном пространстве, на внутренней мембране митохондрий создается разность электрических потенциалов, которая служит источником так называемой протондвижущей силы. Благодаря ей ионы водорода движутся обратно в матрикс через АТФ-синтетазу, образуя АТФ из АДФ и неорганического фосфата. При незначительном уменьшении рН цитоплазмы Н+ может служит сигналом для активации окислительного фосфорилирования. Если же концентрация Н+ в цитоплазме продолжает увеличиваться, то ионы водорода поступают по градиенту концентраций в межмембранное пространство митохондрий, увеличивают там свою концентрацию без участия комплексов электронтранспортной цепи, не нарушают условия работы АТФ- синтетазного комплекса, но могут замедлять при этом окисление NAD(P)H в дыхательной цепи. Таким образом, происходит подавление поглощения кислорода клетками, но сохраняется фосфорилирование. Более значительное подкисление цитоплазмы приводит к функциональным и ультраструктурным перестройкам митохондрий, направленным на сохранение метаболической активности органелл, а при необратимом сдвиге рН цитоплазмы - к деэнергизации и гибели клеток (Полыгалова, Пономарева, 2010).

2.4 Изменение синтеза АТФ при повышении рН среды

Особенности синтеза АТФ при повышении рН среды, то есть при ее сдвиге в щелочную сторону изучались в работе И.В. Маленковой, как на интактных митохондриях, так и на митохондриях, в которых проводили разобщение процессов окислительного фосфорилирования. Исследование проводили на изолированных митохондриях, которые выделяли по стандартной методике. Измельченные фрагменты печени гомогенизировали в охлажденной среде (0,25 М сахарозы, 0,03 М ТРИС HCl pH 7,4 и 0,001 М этилендиамин- тетрауксусной кислоты), после чего центрифугировали в течение 10 мин при 600 об/мин для осаждения ядер и клеточных мембран. Надосадочную жидкость собирали и повторно центрифугировали в течение 15-20 минут при 6000 об/мин. Затем осадок митохондрий ресуспензировали с 1-2 мл среды в стеклянном гомогенизаторе.

В подобных моделях в присутствии субстратов фосфорилирования и сукцината, при быстром изменении рН от 5-7,5 до 8,3-10 синтезировалось до трех молекул АТФ в пересчете на одну транспортную цепь электрона.

И.В. Маленкова отмечает, что для образования АТФ в подобной системе необходимо, чтобы в процессе изменения конечное значение рН превышало значение 8,0. При этом величина эффекта не зависела от разницы между конечным и начальным значениями рН. На основании этого, она делает вывод о том, что регистрируемый в эксперименте АТФ образуется в результате срабатывания комплекса АТФ-синтетазы, вызванном быстрым повышением рН, а не за счет диссоциации нуклеотидов, в обычных условиях прочно связанных с АТФ-синтетазой, и их выходом в раствор (Маленкова, 1984).

Использование различных субстратов (сукцината, НАДН и др.) и ингибиторов переноса электронов дыхательной цепи (ротенона, антимицина, СО), а также изменение содержания кислорода в системе показало, что эффективное действие АТФ-синтетазы при резком повышении рН возможно в том случае, если электрон-транспортная цепь находится в частично восстановленном состоянии.

В случае добавления к анаэробной суспензии нативных митохондрий с исходным рН 7,4 буферного сахарозного раствора с рН 12, в результате чего конечный рН среды митохондрий становится 9,6, за 1 секунду синтезируется около 0,6 нмолей АТФ (в пересчете на 1 мг митохондриального белка). В аналогичных условиях, но при использовании буферного раствора с рН 7,4 синтез АТФ составлял 0,15 нмолей АТФ/мг белка, то есть синтезировалось значительно меньшее количество АТФ. В пересчете на одну электрон- транспортную цепь дополнительный к обычному синтезу в нативных митохондриях синтез АТФ, при скачкообразном повышении рН соответствует молекулам АТФ. Уменьшение конечного рН от 9,6 до 8,5 не влияло на количество дополнительно синтезируемого АТФ (Маленкова, 1984).

Таким образом, в экспериментах И.В. Маленковой было обнаружено, что быстрое повышении рН в фосфорилирующих митохондриях приводит к увеличению выхода АТФ. Анализ результатов по действию ингибиторов электронного транспорта дыхательной цепи и АТФ-синтетазы, а также значения исходного и конечного рН на величину наблюдаемого эффекта, показал, что увеличение синтеза АТФ, по-видимому, связано со структурными изменениями в олигомицин-чувствительном АТФ-синтетазном комплексе. И.В. Маленкова предполагает, что эти изменения могут возникать вследствие быстрой ионизации некоторых функциональных групп белковых молекул, инициируемой быстрым защелачиванием среды (Маленкова, 1984).

И.В. Маленкова отмечает, что возможно два альтернативных объяснения дополнительного синтеза АТФ в митохондриях при скачкообразном повышении рН. Основу одного из них составляют представления об усилении окислительного фосфорилирования за счет образования более активной формы митохондрий, индуцированного скачкообразным увеличением рН. В соответствии с другим объяснением при повышении рН АТФ-синтетаза переходит в конформационно-неравновесное состояние, а в ходе ее возвращения в исходную форму происходит фосфорилирование АДФ (Маленкова, 1984).

Автор предполагает, что при каждом акте переноса электронов могут возникать подобные промежуточные состояния компонентов электрон- транспортной цепи с измененной конформацией. Это может приводить к изменению структуры АТФ-синтетазного комплекса, либо за счет непосредственного взаимодействия с переносчиком-трансформатором, либо за счет изменения мембранного окружения. В данном промежуточном состоянии АТФ-синтетаза характеризуется пониженной рК и увеличенной доступностью каких-либо групп атомов, которые при резком повышении рН подвергаются ионизации. В свою очередь, ионизация этих групп может привести к возникновению тех функционально активных промежуточных состояний, которые и являются причиной усиления синтеза АТФ (Маленкова, 1984).

Следует обратить внимание, что в экспериментах И.В. Маленковой имело место кратковременное повышение рН. По-видимому, описанный автором эффект не смог бы сохраняться в течение длительного времени. Как показали исследования системы окислительного фосфорилирования бактерий, постоянно живущих в условиях высоких значений рН (10 и более), процессы синтеза АТФ у них имеют ряд функциональных особенностей. Эти адаптивные особенности, сформировавшиеся в ходе эволюции, позволяют успешно преодолевать биоэнергетические проблемы, связанные с высокими значениями внеклеточных рН, когда энергия потока протонов является слишком низкой для эффективного синтеза АТФ. К числу этих особенностей можно отнести своеобразие доменной организации АТФ-синтетазы, а также систему сопряжения синтеза АТФ не только с трансмембранным переносом Н+, но и с трансмембранным переносом Na+ (Hicks et al., 2010).

В частности, показано, что алкалофильные Bacillus spp. при росте в среде с высоким рН содержат больше цитохрома с. Кроме того, цитохром с, изолированный из их клеток имеет низкий окислительно-восстановительный потенциал (менее +100 мВ) по сравнению с цитохромом с нейтрофильных бактерий (приблизительно +220 мВ). С другой стороны, окислительно- восстановительный потенциал акцептора, получающего электрон от цитохрома c, то есть, цитохром c оксидазы является нормальным (окислительно- восстановительный потенциал цитохрома а + 250 мВ). Эти значительные различия в значениях окислительно-восстановительного потенциала между цитохромом c и цитохромом а связаны с особенностями передачи электрона. Например, за счет этого создается большая электроотрицательность на внутренней поверхности мембраны, чем на ее наружной поверхности, что способствует привлечению H+ к внутриклеточной мембране. Эти особенности могут быть важны для адаптации биоэнергетических процессов к условиям высоких рН, а дыхательная система алкалофильных бактерий обеспечивает более быстрый и эффективный поток H+ и электронов через мембрану (Goto et al., 2005).

В этой связи можно упомянуть результаты, полученные Ахмедовым с соавторами (Akhmedov et al., 2010), на бета-клетках поджелудочной железы. Как известно, увеличение уровня глюкозы приводит к усилению синтеза АТФ в этих клетках. В свою очередь, активация энергетического метаболизма увеличивает соотношение молекул АТФ и АДФ в цитоплазме и приводит к электрической стимуляции плазматической мембраны и экзоцитозу гранул инсулина. Параллельно с этим увеличивается рН матрикса митохондрий. Как обнаружили авторы, это увеличение рН имеет регуляторное значение в процессах синтеза АТФ. Искусственное снижение рН матрикса митохондрий снижало темпы синтеза АТФ, а также приводило к снижению темпов экзоцитоза (Akhmedov et al., 2010). На этом основании авторы делают вывод о том, что рН матрикса митохондрий является новым сигнальным компонентом в системе клеточной активации. С нашей точки зрения, однако, данные результаты все же могут быть, в первую очередь, связаны с физико- химическими механизмами, лежащими в основе работы АТФ-синтетазы, и с изменением градиента протонов в межмембранном пространстве и в матриксе митохондрий.

Таким образом, при относительно небольших или кратковременных отклонениях рН от физиологических значений (7,4), как в сторону его снижения (до 6,5), так и в сторону повышения (до 8,5) наблюдается усиление синтеза АТФ. Более выраженные изменения рН в кислую сторону приводят к изменению проницаемости ионных каналов и активации программ программируемой гибели клеток. Длительное существование клеток в условиях высоких значений рН (10 и более) требует существенных адаптивных изменений ферментных систем митохондрий, что имеет место у алкалофильных бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ