Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки РФ

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Институт Биологии и Биомедицины

Кафедра нейротехнологий

Работа выполнена на базе отдела молекулярно-клеточных технологий ГБОУ ВПО НижГМА

Изменение окислительного фосфорилирования митохондрий при стрессе

Оглавление

Введение

1. Функциональная роль и структурная организация митохондрий

2. Работа дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии

3. Структурные и функциональные изменения митохондрий в условиях гипоксии

4. Антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)

Заключение

Цитированная литература

Введение

Не вызывает сомнений, что действие различных стрессорных факторов приводит к изменению метаболизма клеток и, как следствие, к гибели клетки, а в ряде случаев и целого организма. Одно из воздействий стресса на клетку касается жизненно важных органелл - митохондрий, ответственных за обеспечение организма энергией. Такие стрессовые факторы, как гипоксия, утрата факторов роста, повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и оксидативный стресс, способны оказывать на митохондрии действие, в результате которого они становятся активными продуцентами реактивных форм кислорода (РФК) и начинают высвобождать апоптогенные белки, что в результате приводит к нарушению окислительного фосфорилирования, а значит и нарушению синтеза аденозинтрифосфата (АТФ). Таким образом, поврежденные митохондрии представляют значительную опасность для клетки и могут привести к активации программы ее гибели (апоптоза)(Menna-Barreto, Castro, 2014).

Исследования в этой области являются актуальными и представляют большой интерес, поскольку нарушение окислительного фосфорилирования и повреждение митохондрий наблюдается прицелом ряде патологий, таких, как нейродегенеративные заболевания, инфаркт и инсульт. Изучение изменений митохондриальных процессов, происходящих вследствие такого фактора стресса, как гипоксия, позволит сделать новый шаг на пути поиска эффективных методов борьбы с этими заболеваниями. Особый интерес в отношении превентивного использования для предотвращения негативных последствий, вызванных гипоксией, представляет нейротрофический фактор головного мозга (BDNF). Исследование его гипоксической активности также является актуальным на сегодняшний день (Сахарнова, 2014).

Целью настоящей работы является проведение анализа современной литературы для изучения влияния гипоксии на биоэнергетические процессы, происходящие в митохондриях, в частности, на окислительное фосфорилирование.

Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи:

· рассмотрение структурной организации и метаболизма митохондрий в норме и в условиях стресса;

· изучение антигипоксической активности нейротрофического фактора головного мозга (BDNF).

§ 

1. Функциональная роль и структурная организация митохондрий

Митохондрии достаточно велики для того, чтобы их можно было увидеть в световой микроскоп. Впервые их обнаружили в XIX веке. Однако прогресс в понимании их функции зависел от методов выделения митохондрий, разработанных в 1948 году. По техническим причинам многие биохимические исследования проводили на митохондриях, выделенных из печени; каждая клетка печени содержит 1000 - 2000 митохондрий, которые в общей сложности занимают одну пятую клеточного объёма(Альбертс и др., 2013).

Митохондрия является органеллой, окруженной двумя высокоспециализированными мембранами и ответственной за обеспечение организма энергией. Она вовлечена в процессы роста, дифференцировки, поддержания кальциевого гомеостаза иокислительно-восстановительного баланса клетки. Особое строение митохондрии, а именно, наличие внешней и внутренней мембран, межмембранного пространства и матрикса обеспечивает оптимальную среду для многих других реакций распада и синтеза, таких, как в-окисление, биосинтез гема, синтез стероидных гормонов, глюконеогенез, а также для метаболизма аминокислот (Menna-Barreto, Castro, 2014).

Несмотря на то, что митохондрии обычно изображают как жесткие, вытянутые цилиндры, на деле эти органеллы весьма подвижны и пластичны, постоянно меняют свою форму. Форма митохондрии и ее расположение в клетке тесно связаны с явлениями разделения и слияния, дисбаланс между этими явлениями может привести к нарушению морфологии и жизнеспособности органеллы. Процессы разделения требуются как для биогенеза органелл, так и для ликвидации старых или поврежденных митохондрий с помощью аутофагии (митоптоза), что позволяет осуществлять распад и переработку содержимого этих органелл.Митохондриальное разделение обеспечивает динаминоподобныйбелок Drp1 (dynamin-1-like protein), концентрирующийся по поверхности митохондрий. Слияние - это двухступенчатый процесс соединения внешней и внутренней мембран, производимый посредством разобщенных событий в клетке. У млекопитающих слияние внешних мембран митохондрий контролируется особой ГТФ-азой (гуанозинтрифосфат) - митофьюзином (mitofusin, Mfn 1 and 2), в то время как слияние внутренних мембран находится под контролем динаминоподобного белка OPA1 (Opticatrophy 1), который в том числе отвечает и за поддержание структуры крист(Альбертс и др., 2013, Menna-Barreto, Castro, 2014, Westermann, 2012).

Также следует отметить, что процессы разделения и слияния позволяют митохондриям активно подстраиваться под нужды клетки. Слияние внутренних мембран и матриксов митохондрий позволяет максимизировать синтез АТФтам, где это необходимо. Процесс слияния митохондрий так же является ответом клетки на действие факторов стресса: он позволяет оптимизировать выработку и потребление клеткой энергии в периоды перенесения оной неблагоприятных условий.Согласно митохондриальной теории старения, неизбежные побочные продукты дыхания, активные формы кислорода(reactiveoxygenspecies, ROS), индуцируют образование мутаций и повреждений в митохондриальной ДНК. Накопление таких мутаций на протяжении жизни организма приводит в итоге к нарушению биоэнергетических способностей митохондрий, что ведет за собой развитие патологий и смерть. Однако, по данным Б.Вестерманна (2012), было показано, что в результате слияния митохондрий с мутантными ДНК и ДНК дикого типа происходит восстановление дыхательной активности посредством комплементации, что обеспечивает механизм защиты против старения (Westermann, 2012).

С другой стороны, процесс фрагментации присущ «отдыхающим» клеткам и может быть назван морфологическим состоянием компартмента митохондрий «по умолчанию», когда клетке не требуется активное дыхание. Помимо этого, расщепление митохондрий способствует протеканию митоптоза, что в свою очередь позволяет клетке избавляться от митохондрий с необратимыми повреждениями. Это является не менее важным для клетки, поскольку из-за воздействия активных форм кислорода на митохондриальную ДНК и нарушения синтеза АТФ активируются программы клеточной гибели. Одним из важных этапов инициации апоптозаявляется пермеабилизация (изменение проницаемости) внешней мембраны митохондрии, что приводит к выделению проапоптотических белков. Во время стресса происходит стимуляция как процесса апоптоза, так и процесса митоптоза, который в случае ранней активации обеспечивает выживание клетки посредством устранения поврежденных митохондрий. Однако с увеличением степени повреждений апоптоз начинает превалировать над митоптозом, что в конечном итоге приводит к смерти клетки (Menna-Barreto, Castro, 2014, Westermann, 2012).

Уникальные ориентацию и распределение митохондрийв разных типах клеток определяет их связь с цитоскелетом. В результате разделения образуются митохондриальные единицы, подходящие для перемещения вдоль цитоскелета по клетке. В некоторых клетках слияние митохондрий обеспечивает образование протяженных сетей, которые, как предполагается, функционируют как внутриклеточные передатчики энергии. Согласно этой гипотезе, таких цепи дыхательных комплексов генерируют мембранный потенциал в области клетки с высокой концентрацией кислорода. Этот потенциал передается по митохондриальным филаментам в отдаленные отделы клетки, где он может быть использован на синтез АТФ и генерацию энергии в зонах с низким содержанием кислорода. В других клетках митохондрии фиксированы в определенном положении и синтезируют АТФ в той части клетки, где они особенно активно расходуются, например, они могут быть плотно обернуты вокруг жгутика сперматозоида(Альбертси др., 2013, Westermann, 2012).

Вместе мембраны митохондрии создают два отдельных друг от друга компартмента: внутренний матрикс и значительное более узкое межмембранное пространство. Каждая из мембран и окруженные ими пространства содержат разные наборы белков. Белки-предшественники митохондрий синтезируются в цитозоле свободными рибосомами и импортируются внутрь органеллы посредством транслоказвнешней (TOM - Translocase of the OuterMembrane) и внутренней (TIM - TranslocaseoftheInnerMembrane) мембран. Особые шапероны и сигнальные пептиды направляют белки-предшественники в соответствующие компартменты. TOM ответственна за первичное узнавание белков-предшественников, TIM, в свою очередь, принимает участие в переносе легко расщепляемых препептидов в матрикс (Альбертс и др., 2013,Menna-Barreto, Castro, 2014).

Внешняя мембрана содержит множество молекул поринов, транспортных белков, образующих в липидном бислое широкие водные каналы. Таким образом, эта мембрана похожа на сито и проницаема для всех молекул массой до 5000 дальтон, включая небольшие белки. Такие молекулы могут проникать в межмембранное пространство, но большинство их них не способно пройти через непроницаемую внутреннюю мембрану.

Внутренняя мембрана высоко специализирована. Ее липидному бислою свойственно высокое содержание «двойных» фосфолипидов кардиолипинов, которые содержат четыре жирные кислоты, а не две, и усиливают непроницаемость мембраны по отношению к ионам. Эта мембрана несет также различные транспортные белки, которые делают её селективно проницаемой для тех малых молекул, которые метаболизируются располагающимися в матриксемитохондриальными ферментами. В число ферментов матрикса входят ферменты метаболизма пирувата и жирных кислот с образованием ацетил-КоА (ацетил-коэнзим А) и ферменты окисления ацетил-КоА в цикле лимонной кислоты. Ферменты дыхательной цепи встроены во внутреннюю митохондриальную мембрану и играют ключевую роль в процессе окислительного фосфорилирования. Внутренняя мембрана обычно сильно изогнута и образует множество выступающих в матрикс складок, известных как кристы. Кристы значительно увеличивают площадь внутренней мембраны (Альбертс и др., 2013).

2. Работа дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии

В качестве топлива митохондрии способны использовать пируват, получаемый из глюкозы и других сахаров, и жирные кислоты, получаемые из жиров (рис. 1.). Необходимые молекулы транспортируются через внутреннюю митохондриальную мембрану и превращаются ферментами митохондриального матрикса в ключевой интермедиат метаболизма - ацетил-КоА. Ацетильные группы ацетил-КоАокисляются в матриксе в цикле лимонной кислоты, где углеродные атомы ацетил-КоА превращаются в CO₂, который клетка выделяет в качестве побочного продукта. Самой важной функцией окисления является получение высокоэнергетических электронов в составе активированных молекул-переносчиков NADH и FADH₂.Эти высокоэнергетические электроны переносятся далее во внутреннюю митохондриальную мембрану, где они входят в электрон-транспортную цепь. Потеря электроновNADH и FADH₂также регенерирует NAD⁺и FAD, которые необходимы для непрерывного окислительного метаболизма.

Рис. 1. Общая схема энергетического метаболизма митохондрий (Альбертс и др., 2013)

Несмотря на то, что цикл лимонной кислоты считается частью аэробного метаболизма, в нем не используется кислород. Молекулярный кислород (О₂) напрямую поглощается только в финальных катаболических реакциях, протекающих во внутренней митохондриальной мембране. Почти вся энергия, доступная из сжигания углеводов, жиров и других пищевых молекул на ранних стадиях их окисления, сначала запасается в форме высокоэнергетических электронов, отрываемых от субстратов NAD⁺и FAD . Эти электроны, переносимые NADH и FADH₂, затем присоединяются к О₂посредством дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрии, которая использует большое количество высвобожденной энергии для синтеза АТФ из АДФ+P_i. Отсюда термин окислительное фосфорилирование используется только для описания заключительных реакций (Альбертс и др., 2013).

Рис. 2. Начальный этап транспорта электронов (Альбертс и др., 2013)

Дыхательная цепь переноса электронов (ЭТЦ, электрон-транспортная цепь) состоит из пяти белковых комплексов, локализованных во внутренней митохондриальной мембране. Процесс электронного транспорта начинается с удаления гидрид-иона с NADH(с образованием NAD⁺) (рис. 2) и превращения его в протон и два электрона (H^-=H⁺ + 2e^-).Два электрона передаются на первый из более чем пятнадцати различных переносчиков дыхательной цепи. Сначала энергия электронов очень велика, но она постепенно теряется по мере транспорта по цепи. В основном, электроны переходят с одного иона металла на другой, каждый из которых крепко связан с белковой молекулой, изменяющей сродство электрона к металлу. Большинство участвующих в процессе белков объединено в три крупных ферментных комплекса дыхательной цепи, каждый из которых содержит трансмембранные белки, крепко удерживающие комплекс во внутренней мембране митохондрии. Каждый следующий комплекс имеет большее сродство к электрону, чем предыдущий, и электроны последовательно передаются от одного комплекса на другой до тех пор, пока не окажутся на кислороде, сродство которого к электронам наиболее велико.I, IIIи IVкомплексы также перекачивают протоны через внутреннюю мембрану, устанавливая электрохимический протонный градиент, в форме которого запасается энергия, впоследствии используемая комплексом V (АТФ-синтазой) для синтеза АТФ(Альбертс и др., 2013, Markhametal., 2014).

В отношении дыхательной цепи, комплекс I (NADH-дегидрогеназа/ убихинон или коэнзимQ₁₀)главным образом контролирует синтез АТФ, катализируя окисление NADH с переносом двух электронов через флавинмононуклеотид и цепь железосерных кластеров на убихинон (с восстановлением оного до убихинола). Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа) также является точкой поступления электронов в ЭТЦ, осуществляя окисление сукцината до фумарата с восстановлением FADдо FADH₂ и убихинона до убихинола, однако этот комплекс не создает протонный градиент. Комплекс III (цитохром c-оксидоредуктаза) производит перенос электронов с убиквинола на цитохромc. Наконец комплекс VI (цитохромоксидаза) осуществляет перенос электронов с цитохромасна конечный акцептор - молекулярный кислород (Crofts, 2004, Horsefieldetal., 2004, Yoshikawaetal., 2006, Markhametal., 2014).

Перенос электронов сопряжен с ориентированным захватом и высвобождением протонов и аллостерическими изменениями энергопреобразующих белковых насосов. В конечном результате протоны перекачиваются через внутреннюю мембрану - из матрикса в межмебранное пространство - за счет энергетически выгодного потока электронов. Движение протонов приводит к двум важным последствиям. Во-первых, оно создает градиент pHчерез внутреннюю мембрану митохондрии (pHв матриксе больше, чем в цитозоле, где он обычно около 7 и равен значению pH в межмебранном пространстве из-за высокой проницаемости внешней мембраны). Во-вторых, оно создает градиент электрического напряжения (мембранный потенциал) через внутреннюю мембрану митохондрии (которая внутри отрицательна, а снаружи положительна в результате суммарного выходного потока положительных ионов). Градиент pH «тянет» протоны обратно в матрикс, что усиливает влияние мембранного потенциала, способствующего вхождению положительных ионов в матрикс и выходу из него отрицательных. Вместе градиент pH и мембранный потенциал составляют электрохимический протонный градиент, который в свою очередь создает протондвижущую силу. Электроны в конце пути акцептируются молекулярным кислородом, который вследствие этого переводится в H₂O₂. Энергетически выгодная реакция H₂ + 1/2O₂ = H₂Oпротекает в несколько маленьких стадий, поэтому большая часть высвобождаемой энергии может быть запасена и не выделяется в окружающую среду в форме тепла (Альбертс и др., 2013).

Рис. 3. Строение АТФ-синтазы (Альбертс и др., 2013)

АТФ-синтаза, представленная на рисунке 3, также называемая F0F1-АТФазой, является мультисубъединичным белком, работающим путем роторного канала. Большая часть фермента, состоящая из шести субъединиц, выступает в матрикс митохондрии. Работа фермента основана на преобразовании энергии движения протонов по градиенту в механическую энергию трения белков, которая в дальнейшем преобразуется в энергию химической связи. Так АТФ-синтазаспособна синтезировать более 100 молекул АТФ в секунду. КомплексVсоздает гидрофильный проход через внутреннюю мембрану митохондрий, позволяющий протонам двигаться по электрохимическому градиенту. По мере прохождения протонов через АТФ-синтазу, они используются в качестве движущей силы для протекания энергетически невыгодной реакции синтеза АТФ из АДФ и P_i (Альбертс и др., 2013). митохондрия нормоксия антигипоксический

Таким образом, несмотря на то, что в дыхательной цепи энергия собирается посредством отличного от других катаболических реакций механизма, принцип остается тем же. Атомы водорода разделяются на протоны и электроны. Электроны транспортируются по нескольким переносчикам во внутренней мембране митохондрий. Через несколько стадий протоны и электроны временно вновь соединяются. Электрохимический градиент протонов служит движущей силой не только для синтеза АТФ, но и для сопряженного транспорта через мембрану. В конце электрон-транспортной цепи протоны используются для нейтрализации отрицательных зарядов, появляющихся в результате добавления электронов к молекуле кислорода. И так, помимо своей основной функции, ЭТЦ играет ключевую роль в поддержании мембранного потенциала, контролирует внутриклеточный гомеостаз Ca²⁺, инициацию апоптоза и регуляцию выработки ROS, включая супероксидный анион (O₂^-), пероксид водорода (H₂O₂), гидроксильный радикал и синглетный кислород (Альбертс и др., 2013, Chengetal., 2010, Markhametal., 2014).

Рис. 4. Работа митохондриальной дыхательной цепи, условиянормоксии (Лукьянова, 2013) ЦТК - цикл трикарбоновых кислот МФК I, II, III, VI - митохондриальные ферментные комплексы I, II, III и VI соответственно HADH - НАД-зависимые субстраты

Как показано на рисунке 4, в условиях нормоксииработа дыхательной цепи чаще всего зависит от окисления НАД-зависимых субстратов, которые являются основным поставщиком восстановительных эквивалентов для дыхательной цепи через МФК I (митохондриальный ферментный комплекс I). Вклад этого пути в интактных клетках, оцениваемый по потреблению кислорода, может составлять до 55-65 %. Тем не менее 25-30 % митохондриального дыхания в этих условиях связано с МФК II (митохондриальный ферментный комплекс II) и окислением сукцината, содержание которого в матриксе митохондрий невелико (0,2-0,4 ммоль/л) (Лукьянова, 2013, Kushniretal., 2001).

3. Структурные и функциональные изменения митохондрий в условиях гипоксии

Мозг является одним из наиболее зависимых от кислорода органов. Несмотря на то, что вес мозга составляет всего 2% от общего веса организма, он использует до 20% потребляемого кислорода. Этот орган характеризуется также высоким потреблением энергии при низких ее запасах. Более того, в обеспечении энергозависимых процессов используется 80% АТФ, продуцируемого нейрональными митохондриями. По этой причине мозг чрезвычайно чувствителен к действию гипоксии. В особенности чувствительны такие отделы мозга как кора и гиппокамп. Поэтому важно понять, как функционирует митохондриальный аппарат мозга в условиях недостаточного обеспечения его кислородом.

Способность к обеспечению кислородного гомеостаза и, соответственно, зависимость от кислорода присуща всем высшим организмам, чья жизнеспособность напрямую связана с аэробным путем синтеза энергии, который обеспечивается работой дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий. У млекопитающих до 98% потребляемого организмом кислорода связано с процессом окислительного фосфорилирования, протекающим непосредственно в составе дыхательной цепи, где кислород выступает финальным акцептором электронов, переносимых с помощью НАДН и флавопротеинов. Энергия переноса электронов используется для генерации мембранного потенциала и синтеза АТФ, что играет ключевую роль в обеспечении разнообразных энергозависимых реакций, протекающих в клетке и способствующих поддержанию ее жизнеспособности.

Митохондрии, как кислород-зависимые органеллы, страдают от гипоксии в первую очередь. Снижение концентрации кислорода в клетке ведет к ухудшению аэробного синтеза, а значит, и к уменьшению содержания высокоэнергетических соединений (АТФ), а также снижению мембранного потенциала. Это, в свою очередь, приводит к подавлению ряда энергозависимых реакций, вовлеченных в транспорт ионов, электрогенную и рецепторную функции клетки, обеспечение мышечных сокращений, дыхания и так далее. Самым распространенным нарушением является деполяризация мембраны, бесконтрольный вход ионов Ca²⁺ через потенциал-зависимые кальциевые каналы, активация Ca-зависимых фосфорилаз и протеаз, неконтролируемое разбухание клеток, гидролиз большинства клеточных компонентов и, наконец, некроз (Lukyanova, Kirova, 2015).

При гипоксии в нервных клетках, как правило, наблюдается набухание митохондрий с разрушением крист и внутренних мембран. У некоторых митохонодрий внутренняя мембрана не выявляется и органелла превращается в вакуоль. Нередко в митохондриях наблюдаются лишь фрагментация и распад крист, при этом степень повреждения митохондрий варьирует не только в различных клетках, но и в пределах одной клетки. Распад крист и набухание митохондрий при гипоксии нередко сочетаются с повышением осмиофилии цитоплазмы, перераспределением полисом и другими изменениями (Боголепов, 1979).

Кислород, являющийся субстратомтерминального фермента дыхательной цепи - цитохромоксидазы, принимает участие в реакциях аэробного синтеза. Следовательно, его дефицит в окружающей клетку среде может подавлять аэробный синтез и снижать содержание макроэргов, а также мембранный потенциал. В результате происходит угнетение широкого спектра энергозависимых реакций: ионного транспорта, электрогенной и рецепторной функции клетки, мышечного сокращения и др.

Ответ организма на гипоксию включает различные адаптивные реакции, способствующие устранению функционально-метаболических нарушений, и направленных, прежде всего, на сохранение функции митохондрий. При этом используются 2 типа механизмов: 1) срочный компенсаторный, цель которого - предотвращение последствий острой гипоксии и быстрое восстановление в постгипоксический период, и 2) долгосрочные механизмы адаптации к гипоксии, которые формируются в течение более длительного периода и способствуют увеличению неспецифической резистентности к дефициту кислорода. Эти механизмы базируются на регуляторном репрограммировании активности митохондриальных ферментных комплексов (Лукьянова, 2013).

Рис. 5. Репрограммирование работы митохондриальной дыхательной цепи в условиях гипоксии (Лукьянова, 2013) ЦТК - цикл трикарбоновых кислот МФК I, II, III, VI - митохондриальные ферментные комплексы I, II, III и VI соответственно HADH - НАД-зависимые субстраты

Как показано на рисунке 5, гипоксия индуцирует изменение функции дыхательной цепи и её программы: переход от окисления НАД-зависимых субстратов (комплекс I) к окислению сукцината (комплекс II). За обратимым подавлением электронно-транспортной функции МФК I следует кратковременная, обратимая, компенсаторная активация дыхательной цепи комплекса II, необходимая для синтеза энергии на основе сукцината в условиях недостатка кислорода, - это основной механизм незамедлительной адаптации к гипоксии и формирования необходимой устойчивости организма. Этот механизм принимает участие в обеспечении как минимум четырех важных регуляторных функций. Во-первых, это сенсорная функция, связанная с изменением кинетических свойств комплексов I и II в ответ на постепенное снижение концентрации кислорода во внешней среде. Эта функция необходима для подбора наиболее эффективного способа окисления субстрата в условиях гипоксии. Во-вторых, это компенсаторная функция, обеспечивающая формирование незамедлительного адаптивного ответа и необходимой защиты организма в условиях гипоксии. В-третьих, это транскрипционная функция, которая обеспечивает активацию экспрессии HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor 1) и других генов, обеспечивающих долгосрочную адаптацию к низкому парциальному давлению кислорода. И наконец, рецепторная функция, обеспечивающая участие митохондрий во внутриклеточной сигнальной системе вместе с сукцинат-зависимым рецептором, GPR91(G Protein-coupledReceptor 91) (Lukyanova, Kirova, 2015).

При активации МФК IIрезко возрастает содержание сукцината в крови и тканях. Вклад сукцинатоксидазного окисления в общее дыхание может достигать 70- 80 %. Кроме того, имеются многочисленные данные, свидетельствующие об особой роли сукцината в окислительном метаболизме ткани на ранней стадии гипоксии. Установлено, что его содержание в тканях и в крови уже в первые 30 минут гипоксии возрастает на порядок, достигая 4-7 ммоль/л, и продолжает увеличиваться в ранний период реоксигенации. При гипоксии наблюдается активация сукцинатдегидрогеназы и сукцинатоксидазного окисления, а также увеличение вклада последнего в дыхание и синтез энергии. Пути образования эндогенного сукцината при этом могут различаться. Однако в их основе лежат аспартат- и глутаматзависимые аминотрансферазные реакции. При гипоксии мощным источником глутамата в мозге может быть специфическая для него активация в этих условиях глутаматергической системы. Однако скорость образования эндогенного сукцината, по-видимому, может быть недостаточной для оптимальной компенсации энергетического дефицита в условиях недостатка кислорода. Именно этим можно объяснить тот факт, что экзогенно введенный сукцинат или сукцинатсодержащие препараты обладают выраженными антигипоксическими свойствами, способствуя увеличению внутриклеточного пула АТФ и предупреждая ранние нарушения энергетического обмена (энерготропное действие сукцината). При этом одновременно увеличивается переносимость животными острой гипоксии.Увеличение содержания эндогенного сукцината при гипоксии в цитозоле и в крови говорит о его способности проникать из матрикса митохондрий через плазматические мембраны. Имеются данные о том, что при гипоксии увеличивается пассивная проницаемость мембран для сукцината, его анионного антипорта с малатом, а также транспорта по концентрационному градиенту с использованием различных переносчиков. Возможен и обратный процесс - транспорт экзогенного сукцината в клеткуТаким образом, необходимый результат достигается путём активации сукцинат-зависимого пути окисления, что позволяет рассматривать сукцинат как сигнальную и маркерную молекулу (Лукьянова, 2013, Kushniretal., 2001, Correaetal., 2007,Sekineetal., 2006,Sadagopanetal., 2007, Lukyanova, Kirova, 2015).

Обратимая инактивация электронно-транспортной функции МФК I в условиях гипоксии и при прочих патологиях (так или иначе включающих гипоксическую компоненту) является одной из трех стадий развития митохондриальных нарушений при гипоксии, что также известно в литературе как митохондриальная дисфункция. В литературе имеется немалое количество экспериментальных подтверждений нарушения электронно-транспортной функции МФК I в условиях гипоксии, которая сохраняется и даже усиливается в постгипоксический период (первые 30 минут - 2 часа реоксигенации) (Лукьянова, 2013, Aganietal., 2002, Sadeketal., 2004).

Таким образом, переключение путей окисления субстратов дыхательной цепи от НАД-зависимого на сукцинатоксидазный путь при разных формах воздействия гипоксии предупреждает или ослабляет характерные для гипоксии нарушения синтеза АТФ и оказывает нормирующее действие на жизненно важные функции организма, способствует устранению гипоксического ацидоза, а также увеличению резистентности организма к дефициту кислорода и формированию срочной резистентности. По данным Л. Лукьяновой (2013), переключение путей окисления субстратов дыхательной цепи, а именно изменение кинетических показателей основных ферментов МФК I и МФК II происходит очень быстро - уже через 30 минут после различных гипоксических воздействий. Однако если такое переключение не происходит (некомпенсированная дисфункция МФК I), наблюдается более ранняя деэнергизация клеток, сопровождающаяся гораздо более выраженными нарушениями функционально-метаболических показателей, контролирующих жизнедеятельность клетки(Weinbergetal., 2000).

Ведущая роль в формировании молекулярных механизмов долгосрочной адаптации к гипоксии принадлежит специфическому белковому фактору, индуцируемому при гипоксии - HIF-1. Прямыми или опосредованными мишенями HIF-1 являются около 180 генов, экспрессирующих специфические белки, необходимые в условиях сниженного снабжения О₂ для активации альтернативных компенсаторных аэробных и анаэробных реакций, ответственных за синтез энергии и сохранение функциональной активности. Регуляция активности HIF-1 определяется преимущественно субъединицей HIF-1б, еёэкспрессия (или подавление экспрессии) определяются состоянием митохондриальной дыхательной цепи. По данным Л. Лукьяновой (2013) было показано, что дефицит активности МФК Iприводил к резкому снижению гипоксической индукции HIF-1б, однако в присутствии сукцината она восстанавливалась. Иными словами, индукция HIF-1б усиливается в условиях низкой активности МФК I и высокой активности МФК II. В то же время показано, что HIF-1б может влиять на работу дыхательной цепи: через активацию пируватдегидрогеназыкиназы I он способствует ингибированию пируватдегидрогеназы и тем самым подавляет окисление пирувата, что может быть одной из причин инактивации МФК I(Kimetal., 2006, Semenza, 2007).

Интермедиаты цикла Кребса - сукцинат и б-кетоглутарат, помимо их участия в электронно-траспортной функции митохондриальной дыхательной цепи, являются специфическими лигандами двух G-белок-сопряженных рецепторов: GPR91 и GPR99 соответственно. Поступая из клеток в кровь, в которой эти субстраты обнаруживаются в микромолярных концентрациях, они выполняют регуляторную функцию сигнальных молекул, ответственных в конечном счете за поддержание метаболического гомеостаза на системном уровне. Помимо этого, с усилением сукцинатоксидазного окисления при гипоксии связывают увеличение содержания Са²⁺ в цитозоле и матриксе и сопряженный процесс активации фосфолипазы А2, набухание митохондрий, снижение постгипоксического ацидоза, активацию митохондриального К_АТФ-зависимого канала (Лукьянова, 2013, Hakaketal., 2009, Vargasetal., 2009).

4. Антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)

Нейротрофины являются важнейшими регуляторными белками, обеспечивающими основные процессы жизнедеятельности человека и животных. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF, brain-derivedneurotrophicfactor) - это один из ключевых представителей семейства нейротрофинов, функции которого в основном связаны с работой центральной нервной системы (ЦНС).BDNFобладает способностью контролировать уровень метаболизма клетки в условиях сниженного уровня содержания кислорода (Сахарнова и др., 2012, Сахарнова, 2014).

BDNF связывается с двумя типами мембранных рецепторов: низкоафинным рецептором к NGF (low-affinitynervegrowthfactorreceptor, LNGFR), или p75, и высокоаффинным тирозинкиназным рецепторомB-TrkB (Сахарнова и др., 2012).

BDNF секретируется в качестве своего гликозилированного предшественника (24-30 кДа), который протеолитически расщепляется для получения зрелой формы (13 кДа). До недавнего времени зрелые нейротрофины считались единственным функционально активным типом, но новые свидетельства показывают, что пронейтрофины обладают высоким сродством для p75 рецепторов. Связавшись с p75, комплекс про-BDNF:p75 связывается с другим структурно несвязанным рецептором, сортилином, чтобы образовать комплекс ко-рецепторов, стимулирующий проапоптическиесигнальные пути (Markhametal., 2014).

BDNF обеспечивает рост и развитие головного мозга в эмбриогенезе, способствует росту, дифференциации и выживанию нервных клеток. Нарушение работы ключевого нейротрофина, следовательно, можетпривести к негативным изменениям в отношении синаптической передачи, роста и развития мозга. Это, в свою очередь, может стать причиной развития целого ряда нейродегенеративных заболеваний. BDNF взаимодействует с возбуждающими глутаматэргическими и тормозящими GABA-эргическими системами посредством тирозинкиназного рецептора, оказывая нейротрофическое воздействие в зависимости от нейрональной активности(Сахарнова, 2014, Markhametal., 2014).

Как в норме, так и в условиях гипоксии действие BDNF опосредовано взаимодействием с тирозинкиназным рецептором В (TrkB) и запуском основных сигнальных метаболических каскадов, важным компонентом которых является цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (СREB). Показано, что CREB способствует выживанию нейронов в центральной нервной системе путем активации антиапоптотической экспрессии генов на ранних стадиях постнатального развития. Нейротрофический фактор головного мозга является компонентом эндогенной антигипоксической системы защиты клеток мозга в постнатальном периоде, способствует повышению выживаемости нейронов и сохранению функциональности нейронных сетей как в условиях гипоксии/реоксигенации, так ив отдаленном постгипоксическом периоде. Применение блокатора тирозинкиназных рецепторов В k252а нивелирует положительные эффекты BDNF при действии гипоксии (Сахарнова, 2014).

По данным Т. Сахарновой (2014), показано, что превентивное применение BDNF предупреждало резкое снижение активности нейронов при гипоксии in vitro, сохраняя сетевую пачечную активностькультур диссоциированных клеток гиппокампа на минимальном функциональном уровне во время гипоксии с дальнейшим быстрым восстановлением в реоксигенационном периоде без последующей массивной гибели нейронов. Антигипоксическое защитное действие BDNF зависело от активности тирозинкиназных рецепторов В.Invivo было установлено, что превентивное применение нейротрофического фактора повышало устойчивость особей к условиям гипоксиинаравне с эффектом известного препарата антигипоксического действия Реамберина.

Таким образом, нейротрофический фактор головного мозга обладает выраженными антигипоксическим свойствами вследствие повышения эффективности синаптической передачи импульсов по нейронным сетям, опосредованной взаимодействием с TrkB рецептором. Предполагается, что в дальнейшем применение BDNF в качестве лекарственного средства может свести к минимуму возможность развития побочных эффектов при действии гипоксии и обеспечить восстановление нейронных сетей в постгипоксическом периоде (Сахарнова, 2014).

Заключение

Таким образом, изучение изменений биоэнергетических процессов, происходящих в митохондриях и имеющих место при целом ряде патологий, сопряженных с гипоксическим воздействием на клетки организма, позволит найти эффективные методы борьбы с этими заболеваниями и негативными эффектами, являющимися их следствием. Исследование антигипоксического действия нейротрофического фактора головного мозга остается актуальным в этом отношении.

Цитированная литература

1. Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Д. и др. Молекулярная биология клетки: в 3-х томах. Т. 2. М. - Ижевск: Регулярная и хаотическая динамика, Институт компьютерных исследований, 2013. С. 1738.

2. Боголепов Н. Н. Ультраструктура мозга при гипоксии. М.: Медицина, 1979. С. 168.

3. Лукьянова Л. Д. Сигнальная роль митохондрийпри адаптации к гипоксии// Фізіологічний журнал. 2013. Т. 59, № 6. С. 141-154.

4. Сахарнова Т. А. Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) invivoи invitro. Автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.03.01. Санкт-Петербург, 2014. 21 с.

5. Сахарнова Т. А., Ведунова М. В., Мухина И. В. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и его роль в функционировании центральной нервной системы // Нейрохимия. 2012. Т. 19, № 4. С. 269-277.

6. Agani F. H., Pichiule P.,Chavez J. С., LaManna J. C.Inhibitors of mitochondrial complex I attenuate the accumulation of hypoxia-inducible factor-1 during hypoxia in Hep3B cells // Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2002. V. 132, № 1. P. 107-109.

7. Cheng A., Hou Y., Mattson M. P. Mitochondria and neuroplasticity // ASN Neuro. 2010. V. 2, № 5. P. 243-256.

8. Correa P. R., Kruglov E. A., Thompson M. et al. Succinate is a paracrine signal for liver damage // Journal of Hepatology. 2007. V. 47, № 2. P. 262-269.

9. Crofts A. R. The cytochrome bc1 complex: function in the context of structure // Annual Review of Physiology. 2004. V. 66. P. 689-733.

10. Hakak Y., Lehmann-Bruinsma K., Phillips S. et al. The role of the GPR91 ligand succinate in hematopoiesis // Journal of Leukocyte Biology. 2009. V. 85, № 5. P. 837-843.

11. Horsefield R., Iwata S., Byrne B.Complex II from a structural perspective // Current Protein & Peptide Science. 2004. V. 5, № 2. P. 107-118.

12. Kim J. W., Tchernyshyov I., Semenza G. L., Dang C. V.HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: A metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia // Cell Metabolism. 2006. V. 3, № 3. P. 177-185.

13. Kushnir M. M., Komaromy-HillerG., Shushan B. et al. Analysis of Dicarboxylic Acids by Tandem Mass Spectrometry. High-Throughput Quantitative Measurement of Methylmalonic Acid in Serum, Plasma, and Urine // Clinical Chemistry. 2001. V. 47, № 11. P. 1993-2002.

14. Lukyanova L. D., Kirova Y. I. Mitochondria-controlledsignalingmechanismsofbrainprotectioninhypoxia// Frontiers in Neuroscience. 2015. V. 9, № 320. P. 1-15.

15. MarkhamA., Bains R., Franklin P., Spedding M. Changes in mitochondrialfunction are pivotal inneurodegenerative andpsychiatric disorders:How important is BDNF? // British Journal ofPharmacology. 2014. V. 171, № 8. P. 2206-2229.

16. Menna-Barreto R.F., Castro S.L. The double-edged sword in pathogenic trypanosomatids: the pivotal role of mitochondria in oxidative stress and bioenergetics // B. Med Research International. 2014. V. 2014. Р. 14.

17. Sadagopan N., Li W., Roberds S., Major T. et al. Circulating Succinate is Elevated in Rodent Models of Hypertension and Metabolic Disease // American Journal of Hypertension. 2007. V. 20, № 11. P. 1209-1215.

18. Sadek H. A., Szweda P. A., Szweda L. I.Modulation of mitochondrial complex I activity by reversible Ca2+ and NADH mediated superoxide anion dependent inhibition // Biochemistry. 2004. V. 43, № 26. P. 8494-8502.

19. Sekine T., Miyazaki H., Endou H. Molecular physiology of renal organic anion transporters // American Journal of Physiology - Renal Physiology. 2006. V. 290, № 2. P. 251-261.

20. Semenza G. L. Oxygen-dependent regulation of mitochondrial respiration by hypoxia-inducible factor 1 // Biochemical Journal. 2007. V. 405, № 1. P. 1-9.

21. Vargas S. L., Toma I., Kang J. J., Meer E. J., Peti-Peterdi J. Activation of the succinate receptor GPR91 in macula densa cells causes renin release// J Am SocNephrol. 2009. V. 20, № 5. P. 1002-1011.

22. Weinberg J. M., Venkatachalam M. A., Roeser N. F., Nissim I.Mitochondrial dysfunction during hypoxia/reoxygenation and its correction by anaerobic metabolism of citric acid cycle intermediates // PNAS. 2000. V. 14, № 97. P. 2826-2831.

23. Westermann В. Bioenergetic role of mitochondrial fusion and fission // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 2012. V. 1817, № 10. P. 1833-1838.

24. Yoshikawa S., Muramoto K., Shinzawa-Itoh K. et al. Proton pumping mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase // Biochimica et BiophysicaActa (BBA) - Bioenergetics. 2006. V. 1757, № 10. P. 1110-1116.

Размещено на Allbest.ru