Изменение синтеза аденозинтрифосфата митохондриями при изменении pH

Митохондрии имеют длительную историю изучения (Ernster, Schatz, 1981; Скулачев, 1989; Ченцов, 2004) однако интерес к этим клеточным органеллам со стороны исследователей не снижается. В результате большого числа работ, выполненных с использованием как классических ультраструктурного и биохимического анализа, так и современных методов физико-химической биологии, наши представления о структурной организации и функциях митохондрий существенно расширились. В настоящее время митохондрии рассматриваются как чрезвычайно динамичные структуры, способные изменять свою ультраструктурную организацию и метаболизм в зависимости от молекулярного состава внутренней среды организма (Mannella, 2006; Zick et al., 2009). Параллельно с разработкой идей о митохондриях, как «энергетических фабриках» клетки происходило понимание значимости митохондрий в целом ряде других жизненно важных функций, определяющих поддержание гомеостаза не только на клеточном, но и на организменном уровне (Mayer, Oberbauer, 2003; Судаков и др., 2006; Бунеева, Медведев, 2011; Титов, 2012).

Сегодня актуальность исследований митохондрий существенно возрастает в связи с развитием представлений о митохондриальных болезнях и зарождением митохондриальной медицины (Seppet et al., 2009; Мазунин и др., 2010; Бунеева, Медведев, 2011). Понятие о митохондриальных расстройствах появилось после выявления мутаций в геноме митохондрий. В основе митохондриальной дисфункции могут находиться сотни первичных биохимических дефектов. Несмотря на это, при митохондриальных заболеваниях проводимая коррекция недостаточности митохондрий направлена на ту часть дефектов, которые имеют наибольшее патогенетическое значение, включая непосредственно процессы синтеза АТФ. При этом, несомненно, разработка новых эффективных мер коррекции энергетической дисфункции может проводиться только с учетом фундаментальных данных о механизмах функционирования как отдельных ферментных митохондриальных систем, так и хондриома клетки в целом в нормальных и патологических условиях.

Особую фундаментальную и практическую значимость в данном аспекте имеет анализ особенностей синтеза АТФ при отклонениях значений рН от физиологических показателей. Как известно, внутриклеточные процессы высокочувствительны к изменениям содержания водородных ионов, которые могут выступать в качестве катализатора ряда процессов, быть реагентом или продуктом реакции. В митохондриях ионы водорода непосредственно вовлечены в завершающие этапы синтеза АТФ, поэтому изменение их концентрации не может не сказаться на эффективности данного процесса (Скулачев, 1989; Ченцов, 2004).

Следует отметить, что изменение рН вне и внутри клетки имеет место при целом ряде часто встречающихся патологических состояний. Метаболический ацидоз сопровождает многие экстремальные физиологические и патологические состояния, в частности, связанные со значительной активацией процессов потребления энергии, а также развивающиеся при нарушении функций митохондрий, недостаточном снабжении тканей кислородом, избыточном окислении липидов при сахарном диабете или голодании. К примеру, даже короткий период остановки сердца, вызванный фибрилляцией, характеризуется глубоким ацидозом миокарда. Особое значение приобретает метаболический ацидоз в условиях интенсивной мышечной работы (Рямова, Розенфельд, 2014).

При этом в большинстве случаев снижения рН основной причиной этого изменения гомеостатических показателей является переход к метаболизму с преобладанием гликолиза (Pekun et al., 2014), то есть митохондрии напрямую вовлечены в эти процессы.

В связи с этим целью настоящей работы являлся анализ имеющихся в литературе данных об особенностях синтеза АТФ митохондриями при изменении pH.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- изложить современные представления о структурной организации митохондрий и их основных функциях;

- описать молекулярные механизмы окислительного фосфорилирования;

- охарактеризовать особенности функциональной активности митохондрий при снижении и повышении рН;

- оценить современное состояние проблемы синтеза АТФ митохондриями при изменении рН.

Глава 1. Современные представления о структурно-функциональной организации митохондрий

Кристы в ортодоксальном состоянии (когда объем матрикса увеличен) представляют трубочки или короткие уплощенные ламеллы, с одним или двумя контактами в периферическом регионе внутренней мембраны. Конденсированные митохондрии (с компактным матриксом) имеют увеличенные внутренние компартменты со множественными трубчатыми соединениями с периферической областью и друг с другом. Переход от одного состояния к другому осуществляется за счет процессов слияния и разделения (fusion and fission) внутренней мембраны, причем в регуляции этих процессов участвует большое число белков. Полагают, что топология внутренней мембраны митохондрий непосредственно влияет на определенные функции этого органоида и может представлять собой новую форму регуляции метаболизма. В частности, форма и размер соединений крист может участвовать в регуляции скорости продукции АТФ посредством ограничения поступления АДФ (Mannella, 2006).

Молекулярные механизмы перестроек внутренней структуры митохондрий окончательно не расшифрованы, однако уже выявлено несколько белков, которые, по-видимому, играют ведущую роль в этих процессах. В частности, показано, что белок tBID, вовлеченный в механизмы апоптоза, вызывает уменьшение степени искривления мембран, содержащих кардиолипин, в том числе мембран крист митохондрий. В этих процессах также участвует транслокатор аденин-нуклеотида (adenine nucleotide translocator, ANT), белок, входящий в состав внутренней мембраны и связанный с кардиолипином. На митохондриях клеток дрожжей показано, что tBID ингибирует активность ANT (Mannella, 2006).

Митохондриальный F1F0-ATФ-синтазный комплекс также вовлечен в регуляцию топологии внутренней мембраны. Показано, что мутации субъединицы е АТФ-синтазы (также известной как Atp21p и Tim11p) ингибирует формирование димеров АТФ-синтазы и в результате образуются концентрические кристы, напоминающие луковицы (Paumard et al., 2002).

Не исключено, что в процессах регуляции морфологии крист принимает участие митофилин, белок внутренней мембраны, имеющий молекулярную массу 90 кДа. Функции этого белка на настоящий момент остаются не выясненными, однако при снижении его уровня путем использования соответствующей siРНК, внутренняя мембрана формирует концентрические структуры (John et al., 2005).

Внутренняя ограничивающая мембрана и мембрана крист различаются по своему молекулярному составу. В ограничивающей мембране преимущественно локализованы белки, вовлеченные в процессы митохондриального слияния (Mgm1p) или транслокации белков (Mia40p, TIM23 complex). Мембрана крист обогащена белками, принимающими участие в процессах окислительного фосфорилирования (ANC, Complex III, Complex IV, F1FO-ATP-synthase) и в окислительно-восстановительный метаболизм железа и серы (Fe/S cluster). При этом белки очень динамично перераспределяются между доменами, в зависимости от функционального статуса клетки (Zick et al., 2009).

Ограниченный внутренней мембраной матрикс митохондрий представляет собой относительно гомогенную структуру с умеренной электронной плотностью. Содержимое матрикса - это субстраты и ферменты цикла Кребса и некоторых других этапов энергетического метаболизма (цитратсинтетаза, изоцитратдегидрогеназа, фумараза, малатдегидрогеназа, аконитаза и др.), (от 2 до 10) копий митохондриальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (мтДНК), митохондриальные рибосомы, рибонуклеиновая кислота (РНК) и ферменты, участвующие в экспрессии митохондриального генома (Ченцов, 2004).

Характерной особенностью митохондрий является наличие собственного генома двухцепочечной ковалентно замкнутой митохондриальной ДНК (мтДНК), размером 16569 п.н., которая присутствует в каждой митохондрии в виде нескольких идентичных копий. Геном митохондрий животных клеток содержит 37 генов: два гена рРНК, 13 структурных генов, кодирующих первичную последовательность белков, и 22 гена тРНК. Большинство регуляторных участков находятся в некодирующем, так называемом контрольном, районе протяженностью 1122 п.н. (Boore, 1999; Мазунин и др., 2010).

Несмотря на некоторое сходство в строении мтДНК человека и ДНК прокариот, заключающееся, в частности, в отсутствии интронов и перекрывании генов, структурная организация генома митохондрий значительно сложнее. Установлено, что молекулы мтДНК (пять-семь молекул) соматических клеток организованы в нуклеоиды, в состав которых входят гистоноподобные белки и белки, участвующие в регуляции транскрипции и репликации мтДНК, основные из которых - mtSSB, POLG, TFAM и Twinkle (Мазунин и др., 2010). Генетический код мтДНК имеет ряд характерных особенностей. Все белки, синтезируемые митохондриальной трансляционной системой, локализованы на внутренней мембране митохондрий (Литвинова и др., 2014).

Собственный трансляционный аппарат митохондрий включает рибосомы, которые имеют типичное строение и состоят из двух субъединиц (малой и большой). Каждая субъединица содержит, по меньшей мере, одну молекулы рРНК и несколько молекул рибосомных белков (Agrawal, Sharma, 2012). Рибосомы митохондрий, которые также известны под названием миторибосомы, локализуются в митохондриальном матриксе. Как показали работы, проведенные на гепатоцитах крыс, каждая митохондрия содержит до 100 рибосом. При этом по своим структурным особенностям миторибосомы существенно отличаются от цитоплазматических рибосом, а также рибосом бактерий. В частности, рибосомы митохондрий характеризуются очень низким содержанием РНК и, как следствие, более низким коэффициентом седиментации (~55S). Коэффициенты седиментации большой и малой субчастиц митохондриальных рибосом, содержащих 16S и 12S рРНК, равны

~39S и ~28S, соответственно. В миторибосомах отсутствует небольшая 5S рРНК, характерная для обычных рибосом (Патрушев, 2000).

Межмембранное пространство имеет ширину 10-20 нм. По составу малых молекул его содержимое близко содержимому гиалоплазмы. Здесь находятся несколько ферментов, использующих выходящей из матрикса АТФ для фосфорилирования других нуклеотидов (Ченцов, 2004).

В целом первоначальное представление о митохондриях как о небольших изолированных друг от друга внутриклеточных органеллах сейчас меняется на картину сложной разветвленной митохондриальной сети, плотность которой зависит от типа ткани и связана с потребностью ткани в окислительном фосфорилировании и производстве энергии. Митохондрии путем слияния и разделения могут образовывать динамичные сети, в регуляции и организации которых участвуют белки цитоскелета (Бунеева, Медведев, 2011).

1.2 Митохондрии как мультифункциональные органеллы

Первоначально, исследователи митохондрий концентрировали свое внимание на их фундаментальных метаболических и биоэнергетических функциях, таких как окислительное фосфорилирование, цикл Кребса, биосинтез гема, бета-окисление жирных кислот и метаболизм аминокислот (Ernster, Schatz, 1981). В настоящее время представления о функциональной значимости митохондрий существенно расширены.

1.3 Энергетические функции митохондрий

Первичной функцией митохондрий является выработка энергии в форме АТФ. В клетках человека АТФ производится в ходе двух различных процессов: в ходе разложения глюкозы и других сахаров в отсутствие кислорода в цитоплазме (гликолиз) и в ходе метаболических превращений жиров, сахаров и белков в митохондриях в присутствии кислорода. Второй вариант имеет гораздо более высокую эффективность, почти в 20 раз превышающую энергетическую эффективность гликолиза. 95% АТФ в клетках аэробных организмов производится именно с участием кислорода. В митохондриях реализуется три основных энзиматических пути генерации АТФ: цикл трикарбоновых кислот, бета-окисление жирных кислот и окислительное фосфорилирование (Nsiah-Sefaa, McKenzie, 2016).

Процессы образования энергии в митохондриях можно разделить на четыре основных стадии, две первые протекают в матриксе, а две последние - на кристах митохондрий (рис. 5):

– превращение поступивших из цитоплазмы в митохондрии пирувата и жирных кислот в форме ацил-КоА в активированную, неполярную форму вначале ацил-КоА и далее ацетил-КоА;

– окисление ацетил-КоА в цикле Кребса с образованием НАДН;

– перенос электронов с НАДН на O2 по белковым комплексам дыхательной цепи;

– синтез АТФ как результат функционирования мембранной АТФ- синтетазы (Титов, 2012).

Последний этап энергетических процессов, реализуемых в митохондриях, будет подробнее рассмотрен в разделе 2.1.

Рисунок 5. Функциональная энергетическая архитектоника митохондрий (из Зеркаленкова, 2015)

1.4 Роль митохондрий в поддержании окислительно-восстановительного баланса клетки

Установлено, что в формировании активных форм азота принимает участие комплекс IV.

Хроническое воздействие АФК на клетку приводит к окислительному повреждению белков, липидов и нуклеиновых кислот, а острое воздействие - к инактивации Fe?S-центров ферментативных комплексов окислительного фосфорилирования и фермента цикла трикарбоновых кислот- аконитазы, что приводит к снижению продукции АТФ. Высокоактивный ONOO- нитрирует остатки тирозина окружающих белков, в результате чего повреждаются комплекс I и митохондриальная супероксиддисмутаза. Кроме того, в комплексе I сульфгидрильные группы могут подвергаться нитрозилированию, что приводит к подавлению активности комплекса. Воздействие АФК на мтДНК приводит к накоплению множественных мутаций. Все эти изменения, в итоге, нарушают функционирование клетки, вызывают программируемую клеточную смерть - апоптоз (Мазунин и др., 2010).

Однако в умеренных концентрациях АФК являются важными регуляторными компонентами различных сторон клеточного метаболизма. К настоящему времени убедительно доказано, что АФК, образуемые митохондриями, задействованы в передаче внутриклеточных сигналов от рецепторов эндотелина, TGFв1, PDGF, АТII, FGF2 и др. АФК в живой клетке кроме того являются эффективными регуляторами активности ряда транскрипционных факторов, в том числе NFкВ, AP1, а также проапоптотического белка p66Shc. Усиление продукции АФК, воздействующих на отмеченные выше внутриклеточные сигнальные механизмы, может активизировать воспалительный процесс, а также способствовать развитию фиброзных и гипертрофических изменений в тканях. Повышение уровня АФК также может способствовать снижению кальциевой чувствительности миофиламентов кардиомиоцитов и их сократительной активности (Giordano, 2005). В последнее время также появляется все больше данных о значимости АФК в процессах защиты организма от инфекционных агентов, а также в регуляции процессов автофагии (Dan Dunn et al., 2015).

1.5 Регуляция апоптоза

Сегодня не подлежит сомнению центральная роль митохондрий в реализации программированной гибели клетки. В межмембранном пространстве митохондрий находится ряд функционально важных белков, которые после их освобождения и выхода в цитоплазму, принимают непосредственное участие в процессах апоптоза. В числе таких белков можно назвать ингибиторы белков, блокирующих апоптоз (Smac/DIABLO, Omni/HtrA2), неактивные предшественники каспаз (прокаспаза-2, -3, -9), а также непосредственные индукторы программы апоптоза, например, активирующий каспазы цитохром С, эндонуклеазу G и AIF, которые инициируют клеточную гибель по механизму, независящему от каспаз (Mayer, Oberbauer, 2003).

Основной механизм освобождения проапоптотических белков из митохондрий реализуется благодаря формированию митохондриальных апоптотических пор, а также пор повышенной проницаемости (РТP - permeability transition pores) (Guimaraes, Linden, 2004). Выход проапоптотических факторов из митохондрий жестко контролируется внутриклеточными сигнальными системами. При этом ключевую роль в регуляции формирования митохондриальных пор играют белки из семейства Bcl2, среди которых есть как проапоптотические (Bax, Bak, Bok, Boo, BclG, BclB, Bclrambo, Bad, Bim, Bmf, Bid, Noxa, Puma, BNip3), так и антиапоптотические белки (Bcl2, BclxL, Bclw, Mcl1, BclB). В регуляции проницаемости митохондриальных мембран также задействованы свободные радикалы и цитоплазматические ионы Ca2+ (Mayer, Oberbauer, 2003).

Для выбора клеткой пути реализации программированной гибели большое значение имеет количество открытых митохондриальных пор. Если формирование пор повышенной проницаемости происходит только в отдельных митохондриях, то в клетке активируются процессы аутофагии. В случае, когда открытие таких пор захватывает большее число митохондрий, в клетке происходит инициация апоптоза, что, вероятно, связано с повышением содержания цитохрома С и AIF в цитоплазме. Если же поры повышенной проницаемости открываются практически во всех митохондриях, процессы окисления и фосфорилирования разобщаются, начинается интенсивный гидролиз АТФ митохондриальной АТФазой и активизация механизмов клеточной гибели по типу некроза (Guimaraes, Linden, 2004).

Определенную роль в «выборе» между реализацией апоптоза и некрозоподобной клеточной гибели играет уровень продукции АТФ в митохондриях (Судаков и др., 2006). При низком уровне АТФ в клетке процесс гибели клетки протекает по механизму некроза, в случае достаточного энергообеспечения клетки реализуются механизмы апоптоза (Daugas et al., 2000). Еще одним существенным фактором выбора механизма клеточной гибели является концентрация ионов кальция в цитоплазме. Небольшое увеличение уровня ионов кальция в цитоплазме приводит к развитию апоптоза, а при существенном возрастании их концентрации индуцируется некроз. Предполагается, что основой данной закономерности является возможная зависимость числа формируемых митохондриальных пор от концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме, а также активация Ca2+-зависимых протеаз, фосфолипаз и нуклеаз, приводящих к разрушению внутриклеточных структур и реализации некроза. Дополнительным механизмом может быть активация Ca2+- зависимой АТФазы митохондрий, способствующей истощению запасов АТФ в клетке (Skulachev, 2002).

1.6 Участие в обмене ионов Ca2+

Помимо энергетической функции, митохондрии способны также накапливать ионы кальция, что впервые было показано еще в 1960-х годах (Vasington et al., 1962). В настоящее время известно, что ионы кальция являются важнейшими вторичными посредниками в клетках. При этом концентрация Са2+ в цитоплазме поддерживается на относительно низком уровне (10-7 М), при этом он запасается в основном в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях. Кальциевый сигналинг имеет вид «волн» повышения и понижения концентрации цитоплазматического Са2+, причем митохондрии принимают важнейшее участие как в формировании этих «волн», так и их модулировании (Berridge et al., 2000; Rizzuto et al., 2000).

Митохондрии непосредственно задействованы в процессах регуляции концентрации свободного клеточного Ca2+, так как они выполняют роль внутриклеточного кальциевого депо с низким сродством к этим ионам. По своей емкости митохондриальное депо кальция существенно превышает емкости эндо- и/или саркоплазматического ретикулумов.

В норме, в клетке, находящейся в состоянии покоя, митохондрии окружены цитоплазмой с низкой концентрацией ионов Ca2+. При этом концентрация свободного Ca2+ существенно ниже сродства митохондриальной Ca2+-транспортирующей системы митохондрий, поэтому митохондрии находятся в стационарном состоянии умеренного покоя. При значительном возрастании концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме происходит их накопление в матриксе митохондрий. В этих условиях количество и концентрация ионов Ca2+ в матриксе митохондрий оказываются достаточными для индукции изменений состояния митохондрий, включая увеличение синтеза АТФ, усиление генерации кислородных радикалов, активацию неспецифических пор в мембране митохондрий, набухание и разрыв внешней мембраны митохондрий. Таким образом, митохондриальный транспорт Ca2+определяет судьбу клеток от нормального функционирования до программируемой клеточной гибели (Холмухамедов, 2008).

За проницаемость внешней митохондриальной мембраны для ионов кальция, как и для других ионов и небольших молекул отвечает белок VDAC. Последние данные показали, что VDAC более проницаем для ионов кальция в закрытом состоянии, хотя размер поры при этом существенно меньше (1,8 нм в закрытом состоянии против 2,5 нм в открытом состоянии) (Tan et al., 2007).

Перенос кальция через внутреннюю митохондриальную мембрану в матрикс происходит с помощью ряда переносчиков - кальциевого унипортера, митохондриального рианодинового рецептора и, по крайней мере, одного кальциевого канала (митохондриального кальциевого канала типа 2). Кроме того, на внутренней митохондриальной мембране были обнаружены молекулы, по своим функциональным особенностям сходные с рианодиновыми рецепторами скелетных мышц. По всей видимости, они ответственны за быстрое поглощение кальция митохондриями при сравнительно низких концентрациях этих ионов (Altschafl et al., 2007). Третьим способом поступления Са2+ в митохондрию является митохондриальный кальциевый канал типа 2 (Michels et al., 2009).

Выход кальция из митохондрий через внутреннюю мембрану осуществляется также несколькими способами, в том числе с помощью Na+/Ca2+-обменника и натрий-независимого выброса кальция. Na+/Ca2+- обменник считается основным путем выхода кальция из митохондрий в цитоплазму в клетках нервной ткани и сердечной мышцы. Натрий-независимый выброс кальция из митохондрий является основным механизмом выхода кальция в клетках печени и почки (Hoppe, 2010).

Накопление митохондриями кальция Са2+ играет одну из центральных ролей в физиологии и патофизиологии клетки. В частности, поступление Са2+ из цитоплазмы в митохондрии регулирует скорость митохондриального синтеза АТФ, а ионы кальция, находящиеся в матриксе митохондрии, активируют дегидрогеназы цикла Кребса (Jouaville et al., 1999). (Jouaville et al., 1999). Другие звенья митохондриального метаболизма, такие как работа транспортной цепи электронов, АТФ-синтетазы и ANT, также регулируются ионами Са2+ (Territo et al., 2000). Кроме того, поглощение кальция митохондриями модулирует временное и пространственное внутриклеточное распределение этих ионов, что чрезвычайно важно для работы всех сигнальных путей, связанных с этим катионом.

Таким образом, в настоящее время совокупность митохондрий клетки (хондриом) рассматривают как динамичную систему, быстро реагирующую на изменение ключевых параметров внутриклеточной среды и внутренней среды многоклеточного организма выраженными структурно-функциональными перестройками. Эти перестройки приводят не только к изменению функционирования энергетических систем митохондрий, но также способствуют активации ряда важнейших внутриклеточных сигнальных путей. В связи с этим митохондрии сегодня рассматривают не только как «энергетические фабрики», но и как важнейший компонент поддержания внутриклеточного и внеклеточного гомеостаза.

Глава 2. Влияние рН среды на синтез АТФ митохондриями