Молекулярная структура и наследование аллельных вариантов микросателлитных локусов у партеногенетического вида ящериц Darevskia Unisexualis

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА И НАСЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ У ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ВИДА ЯЩЕРИЦ DAREVSKIA UNISEXUALIS



СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ



ВВЕДЕНИЕ

Размножение облигатно-партеногенетических рептилий исключает рекомбинацию с мужским геномом и активацию яйцеклетки сперматозоидом являются уникальной моделью для изучения генотипической изменчивости в локусах с повышенной мутационной активностью [1], а также факторов, определяющих вариабельность микросателлитных повторов. Проблема нестабильности участков, в частности микросателлитов, очень важна, так как, целый ряд заболеваний человека связан с изменением числа мономерных звеньев в локусах, содержащих такие повторы [2]. Мутации в микросателлитах разнородны и зависят от вида организма, типа повторов, локусов, аллелей, равно как и от возраста и пола [3].

Тема сущности генетической нестабильности, аллельной структуры и мутаций гипервариабельных тандемно организованных последовательностей, активно исследуемая на человеке, а также на двуполых видах, почти не изучена на видах с клональным типом размножения. Открытие однополых видов ящериц [4] поставило ряд общебиологических вопросов по происхождению и эволюции этих видов. Одно из главных достижений работ по однополым таксонам - это доказательство их гибридного происхождения, а также подтверждение теории сетчатого видообразования однополых позвоночных. Для этого использовали методы аллозимного анализа и митохондриальной ДНК. В частности, этими методами установлены родительские двуполые виды для всех партеногенетических видов рода Darevskia. Было установлено, что семь партеногенетических вида рода Darevskia образованы в результате различных комбинаций межвидовых гибридизаций 4 двуполых видов. С помощью анализа полиморфизма белков и митохондриальной ДНК было также показано, что большинство партеновидов характеризуются небольшим внутривидовым генетическим и клональным разнообразием. Использование методов геномного фингерпринтинга выявило необычно высокий уровень популяционного и видового полиморфизма у этих ящериц по некоторым микросателлитам, которые содержат нуклеотидные последовательности (ТСС/ТСТ)n[5], (GACA)n [6] и (GATA)n [7]. Предполагается, что полиморфические фрагменты образуются в результате мутаций и являются новыми аллельными вариантами. Показано, что партеногенетические виды ящериц рода Darevskia сформировались на Кавказе в постледниковую эпоху и представляют собой молодые виды, в теории, обладающие одинаковыми возможностями для возникновения новых клонов [8]. Микросателлитный анализ оказался наиболее эффективным для изучения вопросов генетического и клонального разнообразия партеновидов. Предполагается, что генетическое разнообразие определяется дивергенцией двуполых родительских видов и конкретных популяций, участвующих в межвидовой гибридизации, множественными актами межвидовой гибридизации, мутациями и возможной рекомбинацией генетического материала.

Актуальность проблемы

Уникальные биологические свойства ящериц рода Darevskia дают возможность описать механизмы молекулярной эволюции геномов при переходе от двуполого типа размножения к партеногенетическому; выяснить механизмы, роль и значение микросателлитной нестабильности в общей изменчивости геномов; изучить влияние экологических, популяционных и абиотических факторов на молекулярные механизмы изменения геномов; показать и охарактеризовать взаимовлияние популяционных и внутригеномных процессов на динамику генофондов. Всё это требует наиболее полной характеристики популяций и особей, их составляющих - как для однополых, так и для двуполых видов.

Результаты, полученные при изучении геномной вариабельности микросателлитных локусов у рептилий рода Darevskia, могут быть использованы при создании молекулярных тест-систем для широкого круга фундаментальных биологических исследований, в таких областях, как генетика, селекция, экология, охрана окружающей среды и эффективное природопользование. Это откроет новые направления исследований в популяционной, эволюционной и экологической генетике партеногенетических видов рептилий. В дальнейшем, создание единой математической модели генетико-популяционной структуры партеновидов, из которой на основании данных генетического маркирования части особей популяций будет возможно получить аналитическую модель генетико- популяционной структуры партеновидов, позволяющей количественно оценить генетический вклад популяций в генофонд вида.

Выделение и исследование индивидуальных микросателлитсодержащих локусов требуется для понимания природы мутационных изменений, идущих в геномах партеногенетических видов. В этой связи представляется важным изучение дочерних партеновидов и их популяций, выявление и сравнительный анализ их генотипов с таковыми у родительских двуполых видов. Степень дивергенции видов в дальнейшем можно оценить на основании полученных данных.

Целью настоящей работы является исследование молекулярной структуры и наследования аллельных вариантов микросателлитных локусов у партеногенетического вида ящериц Darevskia unisexualis.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие

задачи:

1. Изучить внутривидовой полиморфизм четырех микросателлитных локусов (Du215, Du281, Du323 и Du47G) в популяциях партеновида

D. unisexualis и двуполых родительских видов D. raddei и D. valentini.

2. Определить наследование аллельных вариантов исследованных локусов партеновидом D. unisexualis от двуполых родительских видов D. raddei и

D. valentini.



1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Партеногенетические виды позвоночных и особенности их размножения

Среди живых организмов группы клонально размножающихся позвоночных выделяются виды с партеногенетическим типом полового размножения. Более 80 таксонов рыб, амфибий и рептилий воспроизводятся путем партеногенеза или его вариантов, и представляют собой полностью женские линии [9].

Партеногенез - тип полового размножения, при котором развитие новой особи происходит из неоплодотворенной мужской гаметой яйцеклетки. Половые клетки формируются посредством нарушенных премейотических или мейотических механизмов, предотвращающих генетическую рекомбинацию и приводящих к возникновению генетически сходных потомков, также в популяциях возможно появление полиплоидов [10]. Поколения, возникшие с помощью партеногенетического размножения, представлены в большинстве случаев самками. Размножение с помощью партеногенеза позволяет избежать энергетических затрат на развитие самцов, которых требует двуполое половое размножение, что позволяет каждой женской особи независимо получать потомство [9]. Партеногенетические виды позвоночных лучше адаптируются к внешним условиям, чем двуполые виды. Благодаря тому, что все половозрелые члены популяции способны к откладке яиц, повышается скорость размножения в благоприятных условиях среды, что способствует быстрому росту численности популяции [11]. В результате, каждая особь теоретически способна к образованию популяции в новом месте обитания [9]. Малое число особей, попавших в благоприятные условия обитания, образовали новую популяцию, это было показано для ряда островных видов [8].

Партеновиды часто называют «эволюционными тупиками», потому что в клонально размножающихся родах возможность к рекомбинирации, а также генерации новых комбинаций признаков отсутствует [13]. Следовательно, партеногенетические виды более подвержены паразитам, болезням, а также хищникам из-за их слабой способности к адаптациям в условиях изменяющейся окружающей среды [14]. Однако, тот факт, что некоторые бесполые таксоны развиваются в течение длительного периода времени [15], ставит под сомнение общность данного [16] предположения. С помощью методов молекулярной биологии и геномики, исследователи начали раскрывать основные молекулярные механизмы партеногенеза [17] и показали, какое поразительное генетическое разнообразие формируется в партеногенетических популяциях саламандры [18].

Партеногенетический способ размножения встречается как в царстве растений, так и животных, особенно характерен для насекомых. Для теплокровных животных, в частности птиц, обнаружен зачаточный естественный партеногенез, в результате которого развитие зародыша прекращается на начальных этапах эмбриогенеза [19]. В тоже время, известны случаи получения взрослых партеногенетических особей индеек [20].

Партеногенез бывает облигатным, то есть постоянным, и циклическим или факультативным. Партеногенетические поколения чередуются с половыми у таких живых организмов, как дафний, тли, коловратки [21], приводя к генетическому разнообразию популяции в результате рекомбинации [11].

Среди позвоночных, облигатный партеногенез встречается у многих видов чешуйчатых рептилий [9]. Гекконы рода Hemidactylus (Даревский, 1993), американские тейидные ящерицы рода Cnemidophorus, ящерицы рода Leiolepis [22] и рода Darevskia [12] являются партеногенетическими видами в классе рептилии.

Ящерицы рода Darevskia, как партеногенетические виды позвоночных, - удобный модельный объект для исследований, вследствие того, что их клоны с точки зрения сочетания генов постоянны из поколения в поколение, что исключено среди животных, размножающихся путем слияния половых клеток. Клональные виды, а также их разведение в лабораториях даст возможность не проводить скрещивания, для получения линий животных, например, мышей, хомяков, с установленным и неизменным генотипом [23]. Партеногенез как явление интересен в качестве модели для анализа проблем биологии развития, изменчивости и образования новых видов [24].

Партеногенетические виды Кавказских скальных ящериц рода Darevskia (семейство Lacertidae)

На сегодняшний день известно порядка 40 видов однополых ящериц родов Darevskia, Cnemidophorus, Hemidactylus, для которых характерен облигатный партеногенез [12].

Особенно интересны партеновиды Кавказские скальные ящерицы рода Darevskia, которые входят в saxicola-комплекс, которые ранее принадлежали к Lacerta [25]. В Закавказье и близлежащих районах Турции клонально размножающиеся ящерицы представлены бисексуальными и партеногенетическими видами. Их характеристика была дана на основе исследования электрофореза полиморфизма белков, а также исследования митохондриальной ДНК [26].

Род Darevskia представлен 17 двуполыми и 7 однополыми видами ящериц [25]. Партеногенетические ящерицы были открыты на территории Армении И. С. Даревским. Было установлено, что популяции Darevskia armeniaca состоят только из самок, которые откладывают жизнеспособные неоплодотворенные яйца [4]. Особи в популяциях партеновидов генетически идентичны между собой, так как происходят от единого предка. При размножении партеногенезом отсутствует комбинаторная изменчивость, следовательно, все изменения случайны и показывают процессы мутаций или рекомбинаций, идущие в геномах партеногенетических особей [24].

Изредка (приблизительно 1: 1000) среди потомков партеногенетических ящериц встречаются мужские особи, их большая часть погибает на различных стадиях эмбриогенеза. Единицы из этих самцов доживают до половозрелого состояния, но в тоже время их фертильность сильно понижена. Цитологические механизмы, отвечающие за появление в популяциях партеногенетических ящериц мужских особей, неустановленны [12]. Самки партеновидов рода Darevskia могут скрещиваться с самцами

«отцовского» вида, с образованием стерильных триплоидных гибридов. В тоже время, триплоидные самки рода Cnemidophorus оставляют плодовитое потомство, обуславливая появление триплоидных клонов [27].

Происхождение партеногенетических Кавказских скальных ящериц рода Darevskia

Во всех известных случаях у костистых рыб однополые виды возникли вследствие межвидовой гибридизации [28]. Точно также и у саламандр и лягушек однополые виды возникали путем гибридизации двуполых разновидностей, одно из возможных исключений, гибридизация между двуполыми видами, которая дала начало всем партеногенетическим видам ящериц [29]. Из-за их гибридного происхождения, каждый из однополых видов позвоночных сочетает большую часть генетического разнообразия двух различных двуполых видов. Многие локусы у особей родительских двуполых видов являются гомозиготными по конкретному аллелю. В тех случаях, когда два родительских двуполых вида имеют различные аллели, оба аллеля обнаружены у особей партеногенетических видов. Высокий уровень гетерозиготности у большинства видов партеногенетических позвоночных считается существенным фактором, благодаря которому они способны сохраняться в природе в течение тысяч поколений [9].

В настоящее время доказано, что все партеногенетические диплоидные виды Кавказских скальных ящериц (2n = 38) образовались вследствие сетчатой эволюции, гибридизацией четырех предковых бисексуальными форм, различные сочетания родительских видов давали начало появлению различных партеногенетических гибридных видов [12]. Повторные акты гибридизации не нужны для поддержания устойчивости партеногенетических видов [30]. Подтверждением является жизнь в течение десятков сотен поколений островных популяций партеногенетических видов, например, интродуцированная в Украине в 1964 года популяция вида D. armeniaca, основной ареал которого находится в Северной Армении [31].

Возникновение партеногенетических видов ящериц рода Darevskia можно описать с помощью теории «сетчатого видообразования» [12] (рис. 1). Один из двуполых видов - «материнский», другой является «отцовским», то есть гибридизовались самки одного вида и самцы другого вида.

«Материнский» вид для каждого партеногенетического вида определяли путем сравнительного анализа митохондриальной ДНК партеногенетических видов и возможного бисексуального родительского вида, потому что митохондриальный геном наследуется по материнской линии. «Отцовские» виды определяли с помощью аллозимного анализа. Сравнение вариабельность сайтов рестрикции митохондриальной ДНК у двуполых и партеногенетических видов, анализ аллозимов и исследования кариотипа дает возможность сделать вывод о гибридном происхождении партеногенетических видов рода Darevskia. Дивергенция митохондриального генома «материнского» и соответствующего партеногенетического вида у ящериц рода Darevskia составляет 0% - 0.6%, что говорит о недавнем появлении размножения по типу партеногенеза в роде Darevskia, после ледникового периода, примерно 10000 лет назад [32].

Партеногенетические виды ящериц рода Darevskia на основной части ареала аллопатричны с родительскими видами, но в зонах симпатрии обычно образуются стерильные триплоидные гибриды обоих полов, несущие два «материнских» генома и один «отцовский» геном [12].

Характеристика вида Darevskia unisexualis



Рисунок 1 - Схема гибридного происхождения партеногенетических видов рода Darevskia. Красным цветом показаны партеногенетические виды, черным - двуполые родительские виды

Вид Кавказских скальных ящериц Darevskia unisexualis (рис. 2) является одним из семи облигатно-партеногенетических видов рода Darevskia. Партеновид D. unisexualis возник в результате межвидовой гибридизации бисексуальных видов. Его родоначальными видами являются

D. raddei («материнский вид») и D. valentini («отцовский вид») [10].

Хромосомы у вида D. unisexualis акроцентрические, их число равно 38 в диплоидном наборе, в том числе пара микрохромосом. D. unisexualis также имеет редуцированную половую W хромосому продвинутого типа [33].

Популяции партеногенетического вида D. unisexualis находятся в центральной части Армении и прилегающих областях северо-восточной Турции: центральные популяции (Такярлу, Лчап); западная (Кучак); восточная (Норадуз); юго-восточная (Загалу) (рис. 3).



Рисунок 2 - Внешний вид Darevskia unisexualis

Вид D. unisexualis расселен в горных районах на высоте 1700 - 2100 метров. Изолированные популяции обнаружены в северной Армении и на побережье озера Севан. D. unisexualis обитает на коренной подстилающей породе, чаще вулканического происхождения, каменистых обвалах, кучах камней, а также на больших фрагментах лавы в степях вокруг гор и камнях по берегам горных прудов [34].

Рисунок 3 - Популяции Darevskia unisexualis: Кучак, Такярлу, Лчап, Норадуз,

Внешний вид Кавказских скальных ящериц вида D. unisexualis отличается заостренной, значительно приплюснутой головой, что позволяет пробираться в трещины и щели горных пород. Верхняя сторона тела бурого цвета, с рисунком из темных боковых лент, также окраска характеризуется явственной полосой по хребту. Нижняя сторона тела D. unisexualis окрашена в желтовато-белые цвета. По бокам в ряд вдоль всего тела располагаются синие или голубые пятнышки [35].

Анализ сайтов рестрикции митохондриальной ДНК выявил низкую степень нуклеотидной изменчивости и у партеновида, и у возможного «материнского» вида [32]. На основании разности генома митохондрий между «материнскоим» двуполым видом и однополым видом, возможно выяснить возраст партеногенетического вида, в частности, возраст партеновида D. unisexualis примерно 5000 лет.

У партеногенетического вида D. unisexualis, с помощью аллозимного анализа 35 локусов было показано, что партеногенетический вид представлен одним широко расселенным клоном, но также выявлены единичные редкие клоны [30]. У вида D. unisexualis обнаружено 3 клона [36], различающиеся аллельными вариантами не менее, чем в двух локусах, при этом соответствующие варианты обнаружены у родительских видов. Но встречались редкие аллели, не обнаруженные ни у одного из родительских видов. Доказано, что партеногенетическим видам рода Darevskia свойственна генетическая изменчивость [33].

Структура и особенности микросателлитных повторов эукариотических геномов

Геном эукариот содержит уникальные и повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Доля содержания уникальных последовательностей в геномах видоизменяется у разных организмов и варьирует от 15 до 98% от всей ДНК. Уникальные последовательности по большей части являются некодирующими, то есть не несут генетической информации о функционально значимых полипептидных цепях или РНК, тогда как содержит значительное количество структурных генов.

Большое число множественных копий некодирующих повторяющихся последовательностей в гаплоидных геномах эукариот является загадочным с точки зрения эволюции. В настоящий момент выделяют часто повторяющиеся последовательности, число которых в гаплоидном геноме превосходит 105, и умеренно повторяющиеся, для которых характерно, как правило, 10-104 копий. Сателлитная ДНК относится к часто повторяющимся повторам и представляет собой длинные блоки, складывающиеся из коротких тандемных повторов длиной 1?20 п.о. Сателлитная ДНК составляют от 5 до 50% от общего количества ДНК в геномах эукариот [37].

А. Вайман и Р. Уайт в 1980 году, исследуя геном человека, в первый раз показали существование гипервариабельных локусов [38]. Для локусов, состоящих из тандемно повторяющихся олигонуклеотидных звеньев, характерна заметная асимметрия в составе пуринов и пиримидинов в различных звеньях, что подобно сателлитной ДНК. Вследствие особого нуклеотидного состава эти локусы, в большинстве случаев не несут сайтов узнавания большинства эндонуклеаз рестрикции. Данные локусы имеют различную геномную локализацию, в отличие от сателлитной ДНК, которая располагается в районе центромер. По причине схожести с сателлитной ДНК такие последовательности были названы «мини-» и «микросателлитами» [39].

Структурная организация мини- и микросателлитов

Размер повторяющегося мономерного звена у минисателлитов колеблется в промежутке от 6 до 100 п.н., а длина кластера равна 0,2-20 т.п.н. Большая часть минисателлитов принадлежит к GC-типу, но встречаются и АТ-типы. В геноме содержится от нескольких сотен до нескольких тысяч копий минисателлитов. Часть из них кластеризована в прителомерных областях хромосом, другие же равномерно распределены по геному [40].

Микросателлиты (SSR или STR) являются рассеянными по геному, тандемно организованными гипервариабельными последовательностями ДНК [41]. Аллели микросателлитов отличаются по длине из-за разного числа повторов звеньев. На основании повторяющегося мономерного звена и классифицируют микросателлитные повторы, с выделением мононуклеотидных (А)n, динуклеотидных (CT)n, (AC)n, тринуклеотидных (CAC)n, (TCC)n, (CTG)n, (TCT)n, тетрануклеотидных (GATA)n, (GACA)n и далее [42]. Размер повторяющегося звена микросателлитов - 1-6 п.о., кластера - 20-60 п.о. [40]. Исключение - экспансии, то есть резкое увеличение длины тринуклеотидного повтора, при котором размер кластера может превосходить 1 000 п.о., которые приводят к тяжелым наследственным болезням [43].

По строению ДНК выделяют простые микросателлиты, состоящие только из одного повторяющегося мотива, так называемые совершенные повторы, а также сложные микросателлиты, несущие разные по составу нуклеотидов повторов, названные несовершенными повторами [44]. В сложном микросателлитном локусе могут содержаться аллели разной структуры [45]. По данной номенклатуре, выделяют аллели, которые согласованны с вариабельным числом одинаковых повторяющихся звеньев, интераллели, несущие в определенной точке делецию или инсерцию нуклеотида другого размера, в отличие от основного повтора, а также экстраординарные аллели, очень сложные по структуре и редко встречающиеся в популяциях.

Полиморфизм микросателлитов определяется вариантами числа повторов звеньев в аллелях [46]. Микросателлиты составляют примерно 3% генома человека, около 0,5% приходится на чаще всего встречающиеся динуклеотидные повторы, редко встречаются тринуклеотидные. У человека один микросателлит наблюдается приблизительно на каждые 2 000 п.о. В тоже время, у растений тринуклеотидные повторы наиболее распространенный тип микросателлитов [47]. У животных частота встречаемости микросателлитов положительно взаимосвязана с размером генома [48], наибольшая обнаружена у млекопитающих. Впрочем, у растений концентрация микросателлитов отрицательно коррелирует с размером генома в связи с тем, что микросателлитные локусы редко встречаются в повторяющихся частях геномов растений, вовлеченных в экспансию, к примеру, в ретротранспозонах в длинных повторах на концах [49].

Распространение и возможные функции микросателлитов

По геному микросателлиты распространены равномерно [50], с равной вероятностью они распределены и межгенных пространствах и в интронах [51]. В пределах хромосомы микросателлиты реже располагаются в субтеломерных районах [52]. У ряда видов концентрация микросателлитов и их распространение по длине у Х-хромосомы не совпадает с распределением на аутосомах [53].

Концентрация микросателлитных локусов в геномах мыши и человека в два раза выше на концах плеч хромосом [49]. Распределение совершенных микросателлитов по хромосомам человека проанализировали и выявили, что плотность микросателлитов в отдельных хромосомах варьирует слабо, исключение составляет 19-я хромосома [54]. В экзонах часто встречаются тринуклеотидные и гексануклеотидные повторы, остальные повторы - в интронах. Микросателлиты также найдены в малом количестве и у прокариот. Как правило, это длинные повторы, иногда связаные с факторами вирулентности, то есть микросателлиты выступают в качестве «переключателей» транскрипции и трансляции [55].

Большое количество проведенных исследований показывают, что расположение микросателлитов в геномах является не случайным. Часто микросателлиты локализованы в составе крупной фракции некодирующей ДНК и в тоже время достаточно редко встречаются в кодирующих областях геномов. Микросателлиты часто встречаются рядом с SINE и LINE элементами.

Самые разнообразные типы микросателлитных повторов были найдены в некодирующих частях генома эукариот таких классов как: Saccharomyces cerevisiae (Сахаромицеты), Shizosaccharomyces pombe, Caenorabditis elegans (Нематоды), Drosophila [56]. Однако, триплетные повторы, которые связаны с различными заболеваниями, обнаружены в геноме челловека в кодирующих областях [57]. Установлено, что микросателлиты широко распространены и протяженны у позвоночных, в сравнении с беспозвоночными, а также наиболее протяженные микросателлитные последовательности обнаружены у холоднокровных видов [58].

Предполагалось, что высокоповторяющиеся ДНК не выполняют никаких функции и абсолютно нейтральны. Длительное время сохранялось представление о повторах как о «мусорной» ДНК [59].

Широкая распространенность микросателлитов в геномах основана на их возможном участии в образовании хромосом-специфичных структур. Механизм формирования и поддержания видоспецифичных хромосомных структур высоко консервативнен для большей части геномов различных видов [60]. Предполагается, что повторы, чаще всего располагающиеся в центромерных областях, выполняют функции удержания сестринских хроматид, а также косвенного участия в организации и деятельности кинетохор [61].

По появившимся данным микросателлитные последовательности нуклеотидов геномов участвуют в регуляции транскрипции генов [62], рекомбинационных событий [63], а также генерации позиционных сигналов нуклеосом [64]. Простые тандемные повторы могут являться важнейшим фактором в регуляции экспрессии определенных генов, которые могут транскрибироваться только при наличии особых тандемных повторов, к примеру, (GAA)17 в промоторе гена LacZ E.coli [65]. Другие тандемные повторы, располагающиеся перед активаторной последовательностью, являются сайтом связывания различных белков-регуляторов [37]. Некоторые нейродегенеративные заболевания человека связаны с экспансией тринуклеотидных повторов, так в основе синдрома ломкой Х-хромосомы, а также миотононической дистрофии лежит понижение или остановка транскрипции соответствующих или близко расположенных генов [66].

Число повторов находится в обратной зависимости от транскрипционной активности генов, которые несут тринуклеотидные повторы [67].

Микросателлитные ДНК - «горячие» точки рекомбинации [68], что подтверждено значительным количеством исследований, проведенных на вирусах [69], дрожжах [70], а также человеке [68]. Динуклеотидные повторы являются основными сайтами рекомбинации благодаря их сходству с ферментами рекомбинации. Некоторые микросателлитные повторы могут индуцировать рекомбинацию, напрямую изменяя структуру ДНК. Белки, которых связываются с (GT)n-, (CA)n-, (CT)n-, (GA)n-, (GC)n- или (AT)n- повторами, вызывают Z-конформацию и другие альтернативные вторичные структуры ДНК [71].

Микросателлитные повторы могут оказывать влияние на репликацию ДНК [72] и на клеточный цикл. Известно, что в гене человека CHK1, отвечающем клеточный цикл, в кодирующей области есть (А)9-кластер [73], являющийся вероятным сайтом мутаций, вызывающих появление опухолевых клеток [74].

Микросателлиты также способны к поддержанию пространственной структуры хроматина, способствуя присоединению хромосомной ДНК к матриксу ядра с помощью специальных белков, присоединяющихся к определенным простым последовательностям нуклеотидов, например, к А- обогащенным повторам [57]. Впрочем, проаналированные данные строения 592 микросателлитных локусов 98 видов, относящихся к классам рыб, птиц, амфибий, рептилий и млекопитающих показали то, что размер генома не коррелирует с числом микросателлитных повторов, и не подтвердили предположение, первичной функцией микросателлитов является упаковка ДНК в хромосомы.

Итак, последующее исследование взаимосвязи вариабельности и мутаций микросателлитов с различными процессами, идущими внутри клетки и фенотипическими эффектами, имеет значение выяснения их функций.

Использование микросателлитных ДНК в качестве геномных маркеров

В геномах организмов даже одного вида для мини- и микросателлитов характерна высокая вариабельность по количеству копий отличаются как в норме, так и при патологиях организма. Вследствие этого свойства, мини- и микросателлиты носят название тандемных повторов с изменяющимся числом копий ? VNTR [37].

Гипервариабельные локусы характеризуются высоким полиморфизмом, благодаря этому их информативность как генетических маркеров заметно выше, чем у значительного большинства биохимических маркеров, таких как изозимы ферментов или группы крови, в популяциях частота гетерозиготности микросателлитов близка к 100% [40].

Системы маркеров на основе мини- и микросателлитных последовательностей в геноме живых организмов позволяют использовать зонды для разрешения различных генетических задач. Микросателлитные ДНК используются сегодня в качестве геномных маркеров в медицинских исследованиях, а также при исследовании организации, структуры и нестабильности генома, а также таких фундаментальных проблем биологии, как видообразование, эволюция и систематика. Широко используются микросателлиты в свиноводстве. Микросателлитные профили свиней используют в популяционно-генетических и генеалогических исследованиях, в генетической экспертизе происхождения, а также в качестве критериев породной принадлежности животных [75]. Также по уровню гетерозиготности локусов микросателлитной ДНК в различных популяциях свиней можно определить степень антропогенного воздействия, в особенности последствиями аварии на Чернобыльской АЭС [76].

Картирование генов, сцепленных с гипервариабельными маркерами, создает условия для выделения и клонирования нуклеотидной последовательности генов и определения структуры генов, которые кодируют белки. Это способствует возможности изучения молекулярных механизмов генных болезней.

Монолокусных анализ микросателлитсодержащих локусов (локус-специфическая ПЦР)

Анализ микросателлитных локусов проводят при помощи ПЦР реакции. В 1989 году этот способ был предложен J. L. Weber с соавторами. Было показано, что длина блоков (dC-dA)n*(dG-dT)n различается в семи случаях из восьми у разных организмов, что дает возможность использовать их как генетические маркеры. Однако, самое важное, J. L. Weber с соавторами ввели чрезвычайно эффективный метод анализа данных маркеров, который предполагал амплификацию при помощи ПЦР и последующее разделение продуктов реакции на полиакриламидном геле. В сравнении с используемыми ранее методами гибридизации геномных блотов, анализ микросателлитносодержащих локусов с помощью ПЦР дал возможность резко увеличить чувствительность и скорость.

Метод ПЦР применяют для генотипирования и обеспечения высокой воспроизводимости результатов, вследствие небольших размеров микросателлитных локусов [77]. Даже из сильно деградировавшего материала можно выделить количество ДНК, необходимое для генотипирования микросателлитных последовательностей. Высокий полиморфизм микросателлитов и быстрые темпы возникновения мутаций в микросателлитах являются причиной накопления специфических для популяции мутаций, на основе которых проводится подробный анализ структуры популяции различных видов животных. В целом, микросателлиты более селективно нейтральны, то есть меньше влияют на приспособленность особей, по сравнению с белковыми маркерами, ввиду того, что исследуются, как правило, микросателлитные локусы, располагающиеся в участках генома, не несущих генетическую информацию о последовательности аминокислот белка [78].

При локус-специфическом ПЦР анализе микросателлитносодержащих локусов наследование маркеров ядра происходит кодоминантно, следовательно, можно определить, гетерозиготна или гомозиготна исследуемая особь по каждому локусу. Подбор праймеров осуществляется на прилегающие к микросателлиту участки, т.о. проводится амплификация и анализ непосредственно самого микросателлита. Фланкирующие последовательности различны у разных локусов, поэтому каждая пара праймеров определяет только один локус. Важным фактором для анализа структуры популяции является скорость мутаций в микросателлитах, в отличие от аллозимов, в которых скорость мутирования ниже на 1?2 порядка. Высокая мутабильность и изменение числа повторов способны обуславливать явление гомоплазии, при которой образование одинаковых аллелей происходит в ходе разных мутаций, что приводит к переоценке генетической дивергенции популяций [79]. Недостатком является то, что только для исследований внутри вида хорошо подходит монолокусный анализ микросателлитсодержащих локусов. Также без секвенирования нуклеотидных последовательностей невозможно различить равные по длине аллели, которые отличаются одной или нескольким нуклеотидными заменами. К формированию в популяции разных аллельных вариантов приводит высокая частота замен при однонуклеотидном полиморфизме (SNPs) [80]. Неоспоримым достоинством использования метода локус- специфической ПЦР является возможность амплификации и анализа любого конкретного участка генома.

В дальнейшем Ziegle с соавторами разработали эффективный автоматизированный метод анализа микросателлитов с импользованием стандартизированного автоматического секвенатора ДНК [81]. Было предложено мечение праймеров тремя разными флуоресцентными красителями для того, чтобы проводить анализ одновременно трех образцов на одной дорожке, при этом четвертый краситель вносится в ту же дорожку, это используется для маркирования стандартизированного молекулярного веса. Это позволило повысить производительность данного метода, а также поднять точность установления длины каждого фрагмента.

Данный тип маркеров активно используется в разных проектах картирования, благодаря эффективным методам анализа. К примеру, применение микросателлитных повторов дало возможность выявить локусы, отвечающие некоторые многофакторные заболевания. У мышей были обнаружены локусы, связанные с регуляцией кровяного давления [82], а также с аутосомным диабетом и эпилепсией [83].

На современном этапе развития биологии исследования по моделированию динамики генофондов на молекулярном и популяционном уровнях являются чрезвычайно актуальными и занимают центральное место при решении многих фундаментальных и прикладных проблем охраны окружающей среды и сохранения биоразнообразия. Подобные исследования объединяют в себе наиболее передовые достижения геномики, популяционной биологии, математической биологии и биоинформационных технологий, служат основой комплексного понимания взаимовлияния процессов изменчивости геномов индивидуальных организмов на изменение генетического разнообразия популяций. Исследование изменчивости мини- и микросателлитов в геномах однополых видах как модельных систем, может внести важный вклад в изучение механизмов нестабильности, также эволюции гипервариабельных повторов ДНК.

В 2004 году была получена клонотека геномной ДНК партеногенетического вида ящериц D. unisexualis, а также выделены клоны, которые содержат разные типы микросателлитных повторов [7].

Исследования с использованием монолокусной ПЦР ортологичных локусов у особей однополых и двуполых видов ящериц рода Darevskia даст возможность определить аллельные варианты локусов и их молекулярную структуру, и в тоже время провести анализ эволюционных отношений среди видов рода Darevskia. Полученная информация о структуре аллелей ортологичных локусов дают возможность изучать филогенетические связи между партеновидами, их родительскими видами, а также другими представителями рода Darevskia.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологический материал

Модельный объект исследования - однополые Кавказские скальные ящерицы Darevskia unisexualis и двуполые Darevskia raddei и Darevskia valentini (семейство Lacertidae).

Коллекция исследованных популяционных образцов партеногенетических D. unisexualis и двуполых (D. raddei и D. valentini) видов ящериц рода Darevskia, представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Коллекция исследованных партеногенетических и двуполых видов рода Darevskia из разных популяций

Вид	Популяция	Кол-во особей	Общее число исследуемых особей
D. unisexualis	Лчап?	11	68
	Кучак	10
	Загалу	10
	Норадуз	17
	Такярлу	20
D. raddei D. nairensis	Егегнадзор	8	64
	Гегард	3
	Гош	1
	Кельбаджар	1
	Татев	3
	Дорога	1
	Горис	2
	Пьюник	17
	Лчап	5
	Лчашен	14
	Ереван	6
	Бжни	1
	Айриванк	2
D. valentini	Лчашен	4	19
	Кучак	2
	Тэж	6
	Адис	7

Примечание. Названия популяций совпадают с названиями населенных пунктов, вблизи которых проводился сбор материала.

При создании коллекции кровь взрослых самок, консервировали в 0,05 М ЭДТА (рН 8,0). Выделенные образцы ДНК ящериц рода Darevskia использовали в различных экспериментах.

Выделение геномной ДНК

Свежую кровь ящериц, в частности ядерные эритроциты, консервировали в 0,05 М растворе ЭДТА (pH 8,0) и хранили при температуре 4 0С. По методу Мэтью выделяли геномную ДНК, используя протеиназу К [Mathew, 1984].

Лизис клеток и выделение ДНК

Образец крови, примерно 50 мкл, смешивали в соотношении 1 к 10 с лизирующим буфером № 1, который состоит из 0,32 М сахарозы, 0,005 М MgCl2, 0,01 M трис-HCl, 1% тритона X-100). Инкубацию смеси проводили в ледяной бане на протяжении 30 минут. Центрифугирование проводили для осаждения ядер при 4 000 об/мин протяжении 20 минут. После удаления супернатанта, осадок ядер суспендировали в 2-4 мл буфера № 2, который состоит из 75 mM NaCl, 25 mM ЭДТА, 25mM трис-HCl, (pH 8,0). Вскрытие ядер проводили, добавляя SDS до концентрации 1%, затем протеиназу К («Sigma») до концентрации 50-100 мкг/мл.

Инкубацию смеси проводили на протяжении ночи в термостате при температуре 37 0С. После чего в смесь добавляли 4 М раствор ацетата натрия до концентрации 0,2 М, аккуратно смешивали, затем добавляя фенол (насыщенный 1 М трис-HCl, pH 8,0) в соотношении объемов 1 к 1. На протяжении 15 минут осуществляли депротеинизацию фенолом.

Фазы разделяли с помощью центрифугирования на протяжении 20 минут при 4 000 об/мин. В результате получали три фазы: верхнюю - раствор ДНК, среднюю - белки, а также нижнюю - фенол. В отобранный раствор ДНК добавляли фенол-хлороформную смесь, в соотношении компонентов в 1 к 1. Затем осуществляли депротеинизацию хлороформом, в соотношении компонентов смеси 1 к 1.

Осаждение ДНК проводили 1 объемом этанола, 2,5 объема спирта к 1 объему раствора ДНК, перемешивая раствор до полного осаждения ДНК. Осажденную ДНК два раза промывали 75% раствором этанола, растворяя затем в ТЕ-буфере, который содержит в составе 10 mM трис-HCl, 1 mM ЭДТА, pH 8,0. Проверку концентрации ДНК проводили спектрофотометрически на приборе «Genesys 10UV» при длине волны 260 нм. Хранение раствор ДНК осуществляли в холодильнике при температуре,

Выделенную ДНК проверяли на нативность при помощи электрофореза в 0,8% агарозном геле «Sigma», добавляя бромистый этидий в 1??трис-боратном буфере (TBE), состав которого 89 mM трис-борат, 89 mM борная кислота, 2 mM ЭДТА (pH 8,0). Проверку агарозного геля осуществляли в проходящем ультрафиолетовом свете.

Постановка локус-специфической полимеразной цепной реакции

Подбор праймеров

Популяционные образцы ДНК партеногенетических ящериц unisexualis и двуполых видов D. raddei и D. valentini анализировали, осуществляя подбор праймеров при помощи компьютерной программы

«Primer Select©» из пакета LaserGene (1993-2000 DNASTAR Inc.). При анализе не использовались последовательности праймеров, которые образовывали шпильки, а также пары праймеров, частично комплиментарные друг другу [7]. Условия для ПЦР подбирались с помощью постановки ПЦР- анализа с различными температурами отжига, после чего в 1,5% агарозном геле осуществлялся анализ амплифицированных фрагментов ДНК.

Проанализировав несколько пар праймеров и подобрав условия амплификации были выбраны следующие пары праймеров (табл. 2).

Таблица 2 - Характеристика праймеров, подобранных к локусам Du215, Du281, Du323 и Du47G

Локус	Gene Bank, Ac. No	П р а й м е р ы	Нуклеотидная последовательность	Кол-во нуклеотидов	Tо отжига, єC
Du215	AY574978	F	5'CAACTAGCAGTAGCTCTCCAGA 3'	22	58єC
		R	5' CCAGACAGGCCCCAACTT 3'	18
Du281	AY442143	F	5' TTGCTAATCTGAATAACTG 3'	19	50єC
		R	5' TCCTGCTGAGAAAGACCA 3'	18
Du323	AY574977	F	5'AAGCAGACTGTACAAAATCCCTA 3'	23	48°С
		R	5'ACTGATCTAAAGACAAGGTAAAAT3'	24
Du47G	DQ157450	F	5'ATACAACCGCAATACACAATA 3'	21	50єC
		R	5'TGAACTGAGCAGAGCACTAAATA 3'	23
F ? прямой праймер; R ? обратный праймер

Полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию осуществляли в объёме 20 мкл на 50 нг ДНК матрицы, используя набор для ПЦР GenePak® PCR Core (Isogene Lab. ltd, Россия). Использовали по 0,5 мкл праймера для каждой амплификации. Амплификация проводилась с использованием четырёхканального ДНК- амплификатора «Терцик ТП4-ПЦР-01» (ДНК-технология, Россия) при температуре, определённой для каждой стадии: денатурация при 94 єС ? 3 мин., амплификация на протяжении 30 циклов, каждый из которых включает денатурацию: 94 єС - 1 мин., отжиг: температура tє отжига зависит от используемых пар праймеров: 48?58 єС в течение 40 сек., элонгация: 72 єС - 40 сек., последний цикл идет 5 мин. при 72 єС. Фракционирование продуктов амплификации проводили в 8% нативном полиакриламидном геле (ПААГ). Выделение и очистка продуктов амплификации из агарозного геля осуществлялась при помощи набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) на основе методики производителя. Клонирование проводили, используя плазмидный вектор pGEM®-T Easy Vector System I (Promega, США) по методике производителя. Выделение плазмидной ДНК осуществляли набором ДНК GeneJet™ Plasmid Miniprep Kit по методике производителя.

Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ)

Приготовление 8% ПААГ

Для получения 50 мл 8% ПААГ был использован 40% стоковый раствор акриламида с бис-акриламидом, в соотношении акриламида и бис- акриламида 29 к 1. Стоковый раствор в объеме 10 мл смешивали с 5 мл 10х ТВЕ и 35 мл H2O, затем раствор был отфильтрован. Перед самой заливкой в раствор вносили 300 мкл 10% персульфата аммония (NH4)2S2O8 и 40 мкл ТЕМЕD.

Подготовка стекол

Обычно использовали два стекла, с размерами 20 x 20 см. Перед заливкой геля осуществляли силиконирование стекла с вырезом, натирая его 5 мл 4% раствором диметилдихлорсилана в четыреххлористом углероде («Repel-Silane»), затем давали стеклу высохнуть и осуществляли повтор процедуры. Стекло без выреза обрабатывали раствором, в состав которого входили 20 мкл «Bind-Silane», 20 мкл ледяной уксусной кислоты и 5 мл 96% этилового спирта.

Вертикальный электрофорез

После заливки ПААГ стекла устанавливали в камеру для вертикального электрофореза, заполняя 1?ТБЕ-буфером нижнюю и верхнюю камеры, а затем наносили по 5-10 мкл образцов ПЦР-продуктов. Стандартный маркер с разрешением 50 п.н. (50 bp DNA Ladder «Fermentas») и 100 п.н. (100 bp+ DNA Ladder «Fermentas») применяли как маркер молекулярного веса. Электрофорез проводили при напряжении 95 V в течение 16 часов. После чего гель окрашивали раствором бромистого этидия. Результаты ПААГ-электрофореза визуализализировали на трансиллюминаторе («Sigma») при помощи системы автоматической регистрации изображения «BioDocAnalyze», после чего пленку обрабатывали по стандартной методике. Фотоплёнку сканировали на HP Scanjet 4570c, обрабатывая ее на компьютере.

Элюция ДНК из геля и секвенирование ДНК

Элюция ДНК из агарозного геля

Элюцию фрагментов ДНК из агарозного геля проводили с использованием набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) по методике производителя.

Элюция ДНК из полиакриламидного геля

Участок геля с фрагментом вырезали и переносили в 1,5 мл пробирку, добавляя 300 мкл 1 М NaCl, и оставляли в термостате на ночь при температурё 65 0С. Центрифугировали на 14 000 об/мин 20?25 минут, охлаждая от 0 0С до минус 4 0С, после чего жидкость помещали в новые пробирки, добавляя 2,5 объема (750 мкл) 96% этанола, перемешивали, оставляли при минус 20 0С на ночь. Центрифугирование проводили при 14 000 об/мин в течение 20-25 минут, охлаждая от 0 0С до минус 4 0С, затем выливали спирт, добавляли 100 мкл 75% этанола и оставляли на 30 минут при 4 0С. Центрифугировали при 14 000 об/мин 20-25 минут, охлаждая от 0 0С до минус 4 0С, затем выливали спирт, высушивали и растворяли в 4 мкл воды MQ. позвоночный микросателлитный геном локус

Секвенирование ПЦР-продуктов

Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера с использованием набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator V.3.1, затем осуществляли анализ продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Секвенирование определенной последовательности проводили в двух направлениях, прямой и обратной, которые сравнивали между собой, исключая тем самым возможные ошибки при секвенировании. Последовательности одного образца полностью совпадали.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Полученные результаты обрабатывали с использованием компьютерных программ пакета DNASTAR Inc. С помощью алгоритма Clustal W программы MEGA 7.0 выравнивали последовательности ДНК разных особей.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение структурной организации и полиморфизма микросателлитсодержащих локусов у D. unisexualis и двуполых родительских видов D. raddei и D. valentini

При помощи локус-специфического ПЦР-анализа, с использованием пар праймеров, подобранных для локусов Du215, Du218, Du323 и Du47G D. unisexualis, которые содержат помимо (GATA)n-микросателлита и другие микросателлитные звенья, проводили изучение аллельного полиморфизма D. unisexualis из 5 изолированных популяций Армении и ортологичных локусов в популяциях двуполых родительских видов D. raddei и D. valentini. В популяциях исследуемых видов определены аллельные варианты ортологичных локусов, выявлены их отличия строения первичной структуры ДНК и прослежено наследование от двуполых родительских видов.

Определение структурной организации и полиморфизма микросателлитсодержащих локусов у D. unisexualis

Для исследования молекулярной природы аллельного полиморфизма Du215(uni), Du281(uni), Du323(uni) и Du47G(uni) в популяциях D. unisexualis секвенировали ПЦР-продукты соответствующих аллельных вариантов. Во всех четырех микросателлитных локусах аллельные варианты различаются между собой точковыми мутациями по типу транзиций и трансверсий, располагающимися на фиксированных расстояниях от микросателлита. Гаплотипы - это различные сочетания точковых мутаций, характеризующие определенные аллели. На основе сочетания структуры микросателлита с точковыми заменами, все аллельные варианты разделяются на несколько групп (табл. 3).

Таблица 3 - Структурные различия аллельных вариантов микросателлитных локусов Du215, Du281, Du323 и Du47G партеногенетического вида D. unisexualis

Аллельный вариант	Длина (п.о.)	Последовательность микросателлитного кластера	Гаплотип
Du215(uni)1	163	5' (GATA)4(GAT)(GATA)7(GCAA)2 3'	A-А
Du215(uni)2	156	5' (GATA)10(GCAA)2 3'	T-G
Du215(uni)3	152	5' (GATA)9(GCAA)2 3'	T-G
Du281(uni)1	212	5' (GATA)12(GAT)GATA(TA)GATA 3'	Т-A-Т
Du281(uni)2	208	5' (GATA)11(GAT)GATA(TA)GATA 3'	Т-A-Т
Du281(uni)3	204	5' (GATA)10(GAT)GATA(TA)GATA 3'	Т-A-Т
Du281(uni)4	201	5' (GATA)10GATA(TA)GATA 3'	С-G-C
Du281(uni)5	200	5' (GATA)9(GAT)GATA(TA)GATA 3'	Т-A-Т
Du281(uni)6	197	5' (GATA)9GATA(TA)GATA 3'	С-G-C
Du323(uni)1	199	5' (AC)6...(GATA)7(GAT)(GATA)2 (GA)4 3'	C-C-C-C-T
Du323(uni)2	180	5'(AC)4GC...GATA(GGT)(GATA)2(GAT)GATA(GA)4 3'	G-G-A-C-T
Du47G(uni)1	142	5' (GATA)5(GACA)4GATA(GAT)(GATA)2 3'	T-C-T-C
Du47G(uni)2	130	5' (GATA)2(GACA)(GATA)4(GAT)(GATA)2 3'	A-T-A-G
Du47G(uni)3	126	5' (GATA)2(GACA)(GATA)3(GAT)(GATA)2 3'	A-T-A-G

Локус Du215(uni) представлен тремя аллельными вариантами (рис. 4). Микросателлитный кластер аллеля Du215(uni)1 сложный и содержит совершенные тетрануклеотидные (GATA)n и (GCAA)n повторы, а также несовершенный GAT-повтор. Два других аллеля (Du215(uni)2 и Du215(uni)3) включают простой микросателлит с двумя типами повторов.