Изучение геномов гибридогенных позвоночных

1.1 Гибридогенное видообразование

Гибридогенное образование является одним из способов появления новых видов, происходящих до сих пор. К нему относятся примеры образований новых видов в результате взаимодействия генофондов других. От прочих оно отличается достаточно быстрой скоростью появления вида и повышенной долей уникальных особенностей в размножении новообразованной группы животных.

Достаточно важно разобраться в современной терминологии гибридогенного видообразования, это связано с изменением подходов и значений одних и тех же терминов в процессе развития цитологических, молекулярных и других методов анализа. Все термины восходят к классификации Э. Майра 1942 года (Майр, 1947), в которой он выделил симпатрическую и аллопатрическую категории гибридизации. Аллопатрическая гибридизация происходит в результате преждевременного, для генетической изолированности двух родственных видов, исчезновения фактора, осуществлявшего функции барьера, предотвращающего свободное смешивание генофондов этих популяций. А симпатрическая гибридизация является следствием исчезновения преград, ограничивающих свободное спаривание этих видов, т.е. за счёт генетических механизмов. Разделение на эти категории вызвало недоумения у многих учёных, к тому же примеры самого Майра оказались неудачными, в связи с чем он впоследствии уточнил классификацию, но уже с точки зрения популяционной биологии. Здесь он выделил уже пять её типов (Gardner, 1997: 5).

1. Гибридогенез симпатрических видов с появлением стерильных/нежизнеспособных гибридов, произошедший случайно.

2. Появление гибридов, способных к последующему размножению, а также к возвратному скрещиванию с родительскими симпатрическими видами.

3. Появление вторичной зоны частичного перекрывания или их контактов для видов изначально не сформировавших генетический барьер и разделённых только пространственно.

4. Область с высокой концентрацией гибридных форм (скопление гибридов) в результате локального нарушения репродуктивного барьера между симпатрическими видами.

5. Возникновение в результате гибридизации и последующего удвоения числа хромосом (аллополиплоидия, распространенная главным образом у растений) нового видового единств? (Майр 1971: 223)

Ещё одно явление, которое нельзя не упомянуть, говоря о гибридизации, это интрогрессия. Под этим термином понимается заимствование элементарных функциональных частиц генофонда одного вида в другой, и в природе механизмом этого переноса часто служит возвратное скрещивание гибрида с представителем родительского вида.

Кроме типов гибридизации также часто необходимо охарактеризовать её масштабы, для этого можно воспользоваться классификацией, предложенным Л.Я. Боркиным и И.С. Даревским в 1980 г. В ней все примеры данного явления можно разделить на три ранга, и к первому рангу относят единичные гибридные особи, по сути, они являются результатом случайной гибридизации, ко второму рангу причисляются следствия значительных межвидовых взаимодействий - гибридные зоны или популяции, а третий ранг формируется стабилизированными двуполыми или клональными популяциями, развивающиеся самостоятельно от прочих и объединённые в общий таксон, иначе говоря гибридогенные виды.

Наиболее поздним из мной рассмотренных является деление на группы Аллендорфа (Allendorf et al. 2001: 616). Эта классификация достаточно подробна и также выполнена по естественности - из 6 групп, первые три - появляются в природе самостоятельно, а последние три - в результате влияния человека, однако в работе «Гибридизация, видообразование и систематика животных» (Боркин, Литвинчук 2013: 96), авторы отмечают, что и последние три типа могут реализоваться естественным путём в природе. К первому типу здесь относятся таксоны, произошедшие гибридогенно, ко второму относятся результаты случайной гибридизации между симпатрическими видами и проникновением генетического материала из одного в другой, то есть это ограниченная интрогрессия. Третий тип проявляет себя, как узкая гибридная зона, а четвертый - межвидовая гибридизация без интрогрессии. Последние - самые масштабные, к пятому относят гибридизацию с обширной интрогрессией, а к шестому - полное смешивание или поглощение одного вида другим.

Окончив кратко освещать типы гибридизации, следует сказать несколько слов о её способах. Существует два способа гибридного видообразования: гомоплоидия и аллоплоидия (Mallet, 2007). Гомоплоидное гибридообразование (ГГВ) - Это образование межвидового, изолированного тем или иным способом, гибрида без изменения уровня плоидности, а аллоплоидное видообразование (АГВ) отличается увеличением плоидности организма. В природе чаще встречается аллоплоидное образование гибридных особей, и это связано с тем, что оно хорошо распространено у растений, так как у них полиплоидия реже приводит к снижению жизнеспособности потомства, в результате чего, порядка 10% всех видов растений так или иначе участвовали в образовании гибридов (Rieseberg, 2014), у животных же соотношение гомоплоидии и аллолплоидии, иное, в частности, чаще всего гомоплоидных гибридов встречают среди представителей таких классов, как рыбы и насекомые (Mavarez, Linares, 2008).

АГВ у животных на первый взгляд оказывается более естественным способом, так как в результате полиплоидии потомства сразу возникает барьер, предполагающий репродуктивную изоляцию потомства от представителей родительских видов. А у ГГВ изоляция должна происходить в течении или после гибридизации, что значительно усложняет процесс, однако согласно некоторым моделированиям процесс ГГВ оказывается даже более вероятным, чем АГВ (Лавренченко, 2013). Конечно, в связи с нехваткой эмпирических данных всё это остаётся на уровне моделей, тогда как по АГВ собраны более обширные данные.

1.2 Общая характеристика гибридогенных позвоночных

Межрасовые, межвидовые и межродовые гибриды - явление, распространённое не только в царстве растений, но и у животных, однако частота встречаемости видов подобных организмов у животных не сравнимы с таковой у растений. В первую очередь это связывают с тем фактом, что наиболее простым способом появления гибрида является наружное оплодотворение, ведь в таком случае исчезает одно из препятствий - поведенческий барьер, брачные танцы, например. Это было отмечено ещё Грантом в 1984 году (Боркин, Литвинчук, 2013) Однако, как ни странно разнообразие гибридогенных позвоночных, не ограничивается только представителями животных с наружным оплодотворением, к примеру, Слынько Ю.В. в своей работе «Система размножения межвидовых гибридов плотвы, леща и синца» отмечает, что большинство однополых видов тетрапод и рыб всё-таки приходится на долю видов с внутренним оплодотворением. Гибридизация - непростой процесс, для её прохождения необходимо преодолеть межвидовые барьеры не только на экологическом, но и на генетическом уровнях, в связи с этим, важную группу гибридогенных существ составляют виды с нетипичными формами размножения - это и является следствием решений проблем с цитогенетическими и молекулярными барьерами, препятствующими обмену генетической информацией между разными группами организмов. Кроме того, виды, обладающие нехарактерными способами размножения имеют очевидное препятствие для обратного скрещивания и поэтому без споров получают статус гибридогенных, поэтому в данной работе они будут разобраны достаточно подробно.

Именно гибридогенные виды, обошедшие барьер, поддерживающий обособленность вида, например, когда препятствия для последующего скрещивания недостаточно эффективны или их развитие не поддерживается отбором (Servedio, Noor 2003, Gourbiere, Mallet, 2010), а также в тех случаях, когда подобные разделяющих механизмы ещё не создан (Price, Bouvier, 2002), могут помочь понять структуру этих барьеров.

Гибридогенные организмы зачастую имею повышенную выживаемость и приспособляемость (в первом поколении - гетерозис), к примеру южноамериканский вид красной вискашевой крысы (Tympanoctomys barrerae) обладает удивительной адаптацией для питания галофитами, в совершенно нехарактерной степени для млекопитающих (Лавренченко, 2013: 256).

Наземные гибридогенные виды имеют небольщие ареалы обитания и не очень высокую численность.

Гибридогенные виды чаще встречаюся в тех местах, где экологическая обстановка имеет более контрастные изменения (Боркин, Литвинчук 2013: 93), например, четвертичное оледенение «более ярко» проявило себя в умеренных широтах, чем в тропиках.

Кроме того, поскольку отличия видов с точки зрения популяционного, «природного» или Вавиловского подхода - это скорее обособленность популяционных систем друг от друга, а не различия в морфологических признаках их представителей (Майр, 1968, 1974, Расницын, 1975, Колчинский, 2006) То гибридизацию можно рассматривать как механизмы обхода этих обособленностей. Но на этом пути важно понимать, что эта обособленность достигается не только как «нескрещиваемость, стерильность и/или селективная неполноценность гибридов» (Фридман, 2012).

1.3 Разнообразие гибридогенных позвоночных

Различные группы животных имеют различную долю гибридогенных видов, конечно, полностью достоверных данных, пока ещё не собрано, так, что все оценки, приведённые далее, могут рассматриваться как предварительные. Однако значительным прорывом можно рассматривать формирующееся мнение о том, что гибридизация среди позвоночных животных является обычным явлением (Боркин, Литвинчук, 2013: 92) Разные исследователи давали различные оценки частоты встречаемости гибридогенных видов у позвоночных, так согласно положениям Станислава Семёновича Шварца, сформулированным им в своей книге о путях эволюционного преобразования популяций (Шварц, 1980), среди млекопитающих встречается свыше 400 гибридогенных видов и порядка 1000 среди птиц, в то время как среди ящериц таковых отмечается более полусотни видов.

В более современных источниках предполагается, что количество гибридизирующих видов птиц колеблется в пределах 10-19% от мирового разнообразия (Grant and Grant 1992: 194; Aliabadian and Nijman 2007: 60), вот только сразу возникает вопрос, что понимается под гибридогенностью. К примеру очень тяжелая ситуация складывается с определением таксономического положения так называемого «итальянского воробья» Passer italiae (Vieillot, 1817). Не смотря на то, что этот вид был описан почти два века назад, в свете современных методов исследований, его «статус» пошатнулся. Сейчас он рассматривается как результат гибридизации в виде широкой устойчивой зоны или устойчивого гибрида. На этом примере видно, что в связи с появлением современных методов генетического анализа, происходит изменение критерия вида, и формально гибридная популяция или зона получают неопределённый статус.

Аналогичная ситуация происходит и с млекопитающими. Сейчас как гибридогенные виды рассматриваются два случая полиплоидии (АГВ) - красной вискашевой крысы (Tympanoctomys barrerae; 2n = 102) и золотой вискашевой крысы (Pipanacoctomys aureus; 2n = 96), в то время как золотистый хомячок (Mesocricetus auratus), исторически бывшим первым претендентом на статус гибридогенного вида из млекопитающих не подтвердил свой статус (Romanenko, 2006). К организмам с ГГВ относят медвежьего макака (Macaca arctoides) (Tosi et. al., 2000). Предполагается, что подобное происхождение из приматов может также быть у мармозетки Куля (Callithrix kuhlii), горного мангабея кипунджи (Rungwecebus kipunji), надвидовом комплексе лангуров Trachypithecus pileatus s.l. (T. pileatus, T. geei), и ещё индокитайского серого лангура (Trachypithecus crepusculus) (Лавренченко, 2015: 259). У грызунов же традиционно к гибридогенным относят подвид домовой мыши (Mus musculus molossinus), представителей комплекса крапчатых жестковолосых мышей (Lophuromys ? avopunctatus s.l.). У такой интересной группы, как рукокрылые к ГГВ видам относят листоноса (Artibeus schwartzi) (Larsen et al., 2010). Среди хищных - рыжий и восточный волки (Canis rufus и C. Lycaon соответственно) (Holdt et al., 2011)

Среди амфибий хорошо известен комплекс триплоидов Ambystoma laterale-jeffersonianum, где в качестве гибрида выступает серебристая амбистома (A. platineum), предположительно АГВ-происхождение предписывается полиплоидным представителям рода Ceratophrys (Bogart, 1967) и комплекса европейской зелёной лягушки (Rana esculenta) (Замалетдинов, 2005). Также считается, что представители рода Bufus легко образуют гибриды, как в природе, так и в лабораториях, к ним же относятся представители надвидового комплекса пуштунских жаб (Bufo pseudoradde) (Stock et. al., 2011) или аналогичного комплекса зелёных жаб (Bufo viridis)

У рыб в качестве ГГВ видов выступает комплекс рода Моллиенезий (Poeciliopsis), а также североамериканский комплекс гольяна Phoxinus eos- neogaeus и Пиренейского вирезуба (Tropidophoxinelus (=Rutilus) albumoides) (Слынько, 2000). Кроме того, существую устойчивые популяции межвидовых и межродовых гибридов сем. Карповых (Cyprinidae).

Классическим примеров гибридогеза у рептилий стали Кавказские ящерицы рода Lacerta (в прошлом saxiocola), открытые нашим соотечественником, И.С. Даревским, кроме них ярким представителем является гибридогенный комплекс рода кнемидофоров или кнутохвостых (Cnemidophorus). Впоследствии были обнаружены непростые случаи у представителей шипохвостов, варанов, хамелеонов, игуановых, удавовых, слепозмеек и ужовых. (Семёнов, 2007)

1.4 Генетические механизмы гибридной несовместимости

При обсуждения этой темы, вопрос критерия вида достаточно важен, т.к. в зависимости от его определения, можно выделять различные причины, ограничивающие возможность гибридогенеза или его исключающие. Также При этом вопрос о поддерживаемости гибридизации с точки зрения отбора остаётся открытым, и есть сторонники обоих точек зрения (Фридман, 2012:158). Исторически рассматривалось, что гибридизация не поддерживается отбором, однако этому противостоит факт, что в зонах давней гибридизации, даже с долей, доходящей до ста процентов, зона распространения гибридов остаётся узкой и относительно постоянной, даже не смотря на то, что в каждой форме доля «стороннего» генотипа является достаточной для реализации в генотипе всей популяции, но смещения интенсивности гибридизации не всегда происходит. (Randler, 2002; Price, 2008; Rheindt, Edwards, 2001). К примеру, по Фридману (2012) можно выделить следующие ряд факторов, предупреждающих гибридизацию.

Модель Добжанского-Меллера. Она подразумевает возникновение несовместимостей геномов видов - родителей, разнообразно проявляющихся, но ведущих к понижению жизненных показателей гибридных особей, а значит снижающих их конкурентоспособность относительно представителей родительских видов. Что ведёт к невозможности закрепления появившихся генотипов или появления видов в результате скрещивания. Механизмом для этой модели послужила идея о накоплении случайных мутаций в генотипах популяций, чьё сочетание («антагонистический эпистаз») в потомстве и будет негативно сказываться на его жизнеспособности. Понятно также, что с течение времени количество таких генов будет расти, а также то, что одновременно такие несоответствия будут находиться во множестве локусов. Несмотря на то, что модель была сформулирована Ф. Г. Добжановским и Г. Д. Мёллером в 1936 году, в связи с трудностями технического характера достоверно её доказать смогли только в 2010 году, зато сразу на двух объектах: дрозофилах (Drosophila) (Matute, 2010) и паслёнах (Solanum) (Moyle,2010). При этом не смотря на отсутствие фактических доказательств, её использовали с 40-х годов прошлого века, причём на удивление плодотворно c выделением отдельных генов, мешающих скрещиванию. (Brideau, 2006). Однако к настоящему моменту накоплено значительное количество данных, показывающих если не состоятельность, то необходимость в уточнении этой идеи.

Разнообразные перестройки структур хромосом

Функциональное смещение отдельных генов при их дупликации и последующим нарушения работоспособности отдельных копий (т.е. создаётся ситуация, когда ген есть у обоих форм, но находится в разных локусах).

Гены гибридной стерильности. Генами гибридной стерильности или «генами видообразования» называются определённые гены, неудачное сочетание аллелей, которых, приводит к бесплодию. И на данный момент у позвоночных был достоверно обнаружен только один такой ген, найденный только у млекопитающих - PDRM9. (Brick et al., 2012) Из других групп организмов, они были найдены у дрозофил (Orr et al., 2004) и у растений (Rieseberg & Blackman, 2010). Этот ген необходим для рекомбинации перед мейотическим делением, именно он определяет первичные точки разрыва цепей ДНК и при несоответствии его локализации на различных цепях разрывы происходят случайно, резко повышая риск повреждения функциональных генов.

Нарушение расхождения гомологичных хромосом. Это частое нарушение при гибридогенезе происходит во время редукционного деления в гаметогенезе, причины не определены до конца. Именно эта причина приводит или к полиплоидии или нехарактерным формам размножения.

Нарушения, связанные с мобильными элементами генома, такими как транспозоны и т.п. В частности, синдром гибридного дисгенеза - возможно, уникального явления, обнаруженного в некоторых линиях Drosophila melanogaster (de Almeida, Carareto, 2002). Этот феномен проявляется в атрофии гонад у потомства, родители которого имели несоответствующее сочетание типов МГЭ или их количество.

Несоответствие соотношений генов и их крайняя степень - разная степень плоидностей.

1.5 Геном и генотип

Наследственность организма формируется за счёт деятельности нескольких подсистем - цитотипа - совокупности цитоплазматических наследственных факторов и нуклеотипа - совокупности всех ядерных факторов, формирующих феномен наследственности (Лобашев, 1967) и под генотипом зачастую понимают не только совокупность всех генов человека, его генетическую формулу, с учётом аллелей, но и всю наследственную систему организма.

Однако со временем эту классификацию функционально усложнили, разделив на облигатный и факультативный (Хесин, 1980, 1984). Оба компонента присутствуют, как в цитоплазме, так и в ядре. Облигатный компонент, это как раз и есть совокупность всех генов, локализованных в хромосомах, которые есть у всех представителей вида. Облигатный компонент цитотипа - это гены пластид и митохондрий. Факультативные же элементы - это вариативные фрагменты ДНК и РНК, причём, в некоторых случаях их можно даже не обнаружить у конкретного представителя. В таблице 1 представлена более развёрнутая версия этой классификации. (из кн. Молекулярные механизмы генетических процессов. Молекулярная генетика, эволюция и молекулярно-генетические основы селекции)

Таблица 1

Наследственная система клетки

Как видно из таблицы 1, факультативные элементы, находящиеся в ядре представляют собой:

Высокоповторяющиеся блоки ДНК, часто даже не реализующейся информации - сателлитную ДНК, которая будет разобрана подробнее позже.

2) Умеренно повторяющиеся - к ним относятся гены, кодирующие разнообразные РНК, гистоны, рибосомные белки.

3) отдельные псевдоны и тандемные орфоны - безинтроновые и неработающие последовательности реально существующих генов.

4) Дополнительные (добавочные) хромосомы, чьё количество или наличие не приводит к смерти носителя.

5) Вирусные последовательности, часто уже влившиеся в геном носителя

6) генетические аппараты бактерий - внутриклеточных симбионтов или паразитов. К примеру, к ним относят риккетсии и реккетсиоподобные организмы (порядок Rickettsiales).

В то время как факультативный компонент цитотипа состоит из:

1) Опять же из проявлений, многократно повторённых ДНК.

2) Плазмиды различного происхождения.

3) ФрагментычужероднойДНК,способнойкодновременной дупликацией с ДНК носителя.

4) Опять же цитобионты

5) Вирусы.

И при всём этом как облигатные компоненты наследственной системы, так и факультативные находятся в регулярном взаимодействии, формирует именно то самое, широкое понимание термина генотип.

1.6 Микро- и минисателлиты

Мини- и микросателлиты - это фрагменты ДНК, которые относятся к группам высокоповторяющихся тандемных последовательностей. (Например, у кенгуровой крысы (Dipodomys ordii) более 50% всего генома состоит из трех повторенных последовательностей: AAG (2.4 млрд. копий), TTAGGG (2.2 млрд. копий) и ACAAGCGGG (1.2 млрд. копий) (Widegren B., Arnason U., Akusjarvi G., 1985) К удобству их рассмотения также относится тот факт, что они встречаются в значительных количествах в геномах всех эукариотических организмов (Kashi et al., 1990). Распространение таких последовательностей по набору хромосом зависит от конкретного вида и иногда принимает довольно интересные формы, причём в некоторых случаях она даже локализована целиком в одной хромосоме, к примеру, так у Drosophila nasutoides, чей геном на 60% сформирован сателлитной ДНК, (Miklos G.L.G., 1985) Темпы мутаций в подобных тандемах крайне высоки, и достигают максимальных значений среди генетических локусов. Именно этот факт позволяет использовать их для детального анализа геномов близкородственных популяций, т.к. высокая скорость модификаций микро- и минисателлитных последовательностей приводит к накоплению мутаций популяций, обмен генетической информации которых происходил даже относительно недавно (Bowcock et al.,1994; Jorde et al.,2000; Rosenberg et al.,2002; Zhivotovsky et al., 2003). В тех случаях, когда они в достаточной степени распределены по геному исследуемого организма, они могут быть использованы для составления генных карт и работы с отдельными генными ассоциациями, сцеплениями (Holmans, 2001; Ott, 1999; Kong et al., 2002).

Кроме того, микросателлиты могут использоваться для решения одной из важнейших групп вопросов биологии современности - это вопрос молекулярных механизмов эволюции. В подобных вопросах существует ряд сложностей, среди которых находятся подходящая скорость изменений фрагментов генома исследуемых объектов и удобства работы с ними.

Таким вопросам удовлетворяет мини- и микросателлитный анализ эукариотической ДНК. Чаще всего он используется в популяционной и эволюционной биологии, картировании эукариотической ДНК и смежных областях исследований. Надёжность этого метода не вызывает сомнений, так что его используют и и в медицинских исследованиях генома человека [Jeffreys et al., 1995; Ashley, Warren, 1995; Рысков, 1999] Этот тип исследований относится к молекуолярно-генетическому методу, о котором более подробно рассказано далеее.

гибридогенный клональный позвоночный геном

Он подразумевает под собой изучение генетических закономерностях на близнецах, как монозиготных, так и гетерозиготных. Особенностью этого метода является то, что используя его удобно изучать влияние как наследственности, так и среды на проявление какого-либо гена. При этом без использования более современных методик исследования геномов, он обладает теми же недостатками, что и генеалогический.

3.3 Популяционно-статистические методы

Эти методы представляют собой комплексную статистическую обработку данных, к примеру, влияния экспрессии определённого гена на генофонд популяции в целом или его изменения со временем. Используя этот метод с определённой долей вероятности возможно узнать частоту встречаемости определённой аллели какого- либо гена или влияние определённых факторов в эволюционных процессах. Основой этого метода является закон Харди-Вайнберга, на основании которого и можно получить данные о частоте встречаемости определённого фено- или генотипа. Этот способ применим для популяционных задач и практически ничего не говорит, как это реализуется на клеточном уровне.

3.4 Цитогенетический метод

Это - микроскопический метод анализа достаточно крупных внутриклеточных образований, таких как хромосомы (их количество, окрашиваемость, особенности формирования и расхождения), ядра клеток, и другие органеллы или клеточные включения. К примеру, особенности размножения, гибридогенных комплексов Poecilia formosa и Poeciliopsis monacha (Hubbs, Hubbs, 1946; Monaco et al., 1984; Schultz, 1961, 1969, 1977; Vrijenhoek, 1984; Moore, 1984) в том числе проводились на основе цитометрических анализов гамет (Слынько, 2000) В последствии цитогенетический метод в связи с своей относительной не дороговизной и эффективности стал одним из важнейших разделов медицины. В частности, одно из самых простых его применений - использование его для определения хромосомных заболеваний, например, синдрома Дауна.

3.5 Методы генетики соматических клеток

Они базируются на том факте, что все клетки нашего организма несут одинаковый набор генетической информации, что позволяет аппроксимировать результаты исследований отдельных соматических клеток на весь организм. Для этого с клетками организма, культивированными в питательной среде проводят гибридизацию и последующую селекцию.

3.6 Биохимические методы

Это большая группа методов исследований также являются опосредованным способом изучения генов и генома. Но в отличии от выше обозначенных методов в данном исследуется первичные продукты работы генов, нарушения или особенности работы ферментов (энзимопатии), накопление характерных метаболитов в клетках или даже тканях. В качестве диагностики может использоваться огромный диапазон химических реакций, а также отдельные специфические методы, такие как электрофорез, хроматография, спектроскопия. Стоит также отметить, что эти методы могут использоваться не только в биохимических исследованиях, но и в молекулярно-генетических. А в качестве объектов анализа могут выступать, как клетки (или их остатки) или их культуры, так и телесные жидкости (пот, плазма крови, моча). Соответственно, это самый применяемый метод в современной прикладной медицине.

3.6.1 Электрофорез

Электрофорез представляет собой биохимический анализ на основе скорости проникновения заряженных частиц в жидкой или газообразной среде под влиянием созданного исследователем электрического поля. Среда подбирается таким образом, чтобы наиболее комфортно выделять или разделять образец. Заряженные частицы могут перемещаться к катоду (катафорез) или аноду (анафорез) в зависимости от собственного заряда, и так как существенная часть белков имеет отрицательный заряд, то при работе с биологическими материалами превалирует катафорез. К примеру, аллозимный, анализ, то есть анализ аллельных форм одного фермента относится к электрофоретическим методам исследований.

3.6.2 Хроматография