Исследование высших грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides в качестве возможных продуцентов гидрофобинов

Система для проведения разделения методом ВЭЖХ состоит из нескольких блоков: насоса, дозатора, колонки, детектора и регистрирующего устройства.

Наиболее распространенным детектором в адсорбционной ВЭЖХ является спектрофотометрический. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны, соответствующей максимуму поглощения определяемых веществ. Такие детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой или видимой области спектра, причем первый вариант используется чаще.

Для анализа белков использовали 5-мкм колонку размерами 25 см х 4,6 мм. Неподвижная фаза -- силикагель с привитыми группами С4. Вводимый объем пробы составлял 20 мкл, а подвижная фаза состояла из 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и 50% (по объему) ацетонитрила с рН = 3,0. Скорость потока 0,8 мл / мин-1, и УФ поглощение элюента наблюдалось при 280 нм и при 254 нм. По полученным хроматограммам определяли наличие пиков, описанных в литературных источниках и соответствующих искомым поверхностно-активным белкам.

3.3.7 Определение молекулярной массы (электрофорез)

Электрофорез белков в полиакриламидном геле -- метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов).

Наиболее распространённым является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS PAGE).

3.3.7.1 Механизм разделения

Элетрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.

3.3.7.2 SDS-PAGE по Лэммли

При разделении полученных белковых экстрактов по молекулярной массе использовали электрофорез по Лэммли, так как гидрофобины имеют не большую молекулярную массу, а данный метод является наиболее широко используемым и применимым для белков с молекулярной массой 15-200 кДа.

Этот метод позволяет значительно улучшить разделение фракционируемых белков за счет введения дополнительного так называемого «формирующего» крупнопористого геля, в котором белки не фракционируются, а только концентрируются в виде очень узких полос перед переходом в разделяющий гель.

Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.

При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:

· белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;

· количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;

· собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы.

Для проведения денатуририрующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию -- это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous -- разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,5 и концентрацию полиакриламида около 4 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида 10-20 %. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,5 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.

В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.

3.3.7.3 Визуализация продуктов разделения

Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание гелей красителем Кумасси (Coomassie blue) или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.

3.3.7.4 Буферные системы

Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris.

гриб базидиомицет белок электрофорез

3.3.8 Оценка влияния полученного продукта на стабильность пены

Для удаления экстрагента проводилось выпаривание этанола на ротационной вакуум-выпарной установке при температуре 50?C.

Для определения поверхностной активности выделенных гидрофобинов нам было необходимо проверить воздействие полученных белков на стабильность пены. Известно, что гидрофобины вызывают высокую стабильность пены даже при крайне низких концентрациях.

Для сравнения пенообразования мы использовали один из самых распространенных стабилизаторов пены - казеинат натрия [21]. В качестве загустителя раствора использовали ксантан.

К 20 мл 0,5% раствора ксантана добавляли высушенный белковый препарат, полученный после удаления экстрагента (этилового спирта). В качестве контроля брали 20 мл 0,5% раствора ксантана, содержащего 0,01% казеината натрия. Исследуемый и контрольный образцы вспенивали в течение 20 секунд с помощью роторного вспенивателя. Далее измеряли объем образовавшейся пены непосредственно после вспенивания и каждый день в течение 7 суток.

3.3.9 Определение доверительного интервала

В статистической литературе пределы варьирования действительного значения произвольной величины при той или иной степени вероятности называется доверительным интервалом.

При малом числе наблюдений (так называемая малая выборка) для оценки достоверности результатов статического исследования прибегают к специальным таблицам, рассчитанным на эти малые числа. Например, таблица вероятности (р) по распределению Стьюдента (t), в которой при данном числе степеней свободы (k = n - 1) определяется для того или иного уровня вероятности (р95, р98, р99) значение величины t (поправочный коэффициент).

Вычисляется средняя величина:

xср = (x1 + x2 + … + xn)/n (2)

где n число опытов.

Затем сумма квадратов отклонений:

С = (x1 - x2)2 + (x2 - хср)2 + …+(хn -- хср)2 (3)

Средний квадрат отклонений:

у2= С/(n - 1) (4)

Среднее квадратичное отклонение:

у= (5)

Средняя ошибка разности:

mразн = (6)

Доверительный интервал:

Ip = mразн * t (7)

где t - коэффициент Стьюдента.

3.4 Результаты и обсуждение

3.4.1 Глубинное культивирование высших базидиомицетов

В данной работе было проведено исследование грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides как продуцентов поверхностно-активных белков -- гидрофобинов. Культура Pleurotus ostreatus относится к нетоксичным, съедобным видам. Coprinus lagopides описывается как несъедобный гриб.

Глубинное культивирование проводили на глюкозопептонной среде при 28-30°С в течение 7 суток.

3.4.2 Динамика роста грибов в глубинной культуре

Культуры грибов выращивали методом глубинного культивирования в течение 7 суток.

Мицелий отделяли от нативного раствора фильтрованием через бумажный фильтр под вакуумом и определяли прирост биомассы весовым методом, предварительно высушив ее в сушильном шкафу при температуре 50єС. Данные по динамике роста культур представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Динамика роста культур Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides

Динамика накопления биомассы Coprinus lagopides и Pleurotus ostreatus представлена в соответствии с рисунком 9.

Рисунок 9 - Динамика накопления биомассы Coprinus lagopides и Pleurotus ostreatus

Из таблицы и графиков видно, что исследуемые грибы постепенно накапливали биомассу в течение 7 суток. Наибольший прирост биомассы был отмечен у гриба Coprinus lagopides на седьмые сутки культивирования (около 8 г/л). При этом стоит отметить, что данная культура в целом показывала большие значения прироста биомассы, чем Pleurotus ostreatus, что делает этот гриб более предпочтительным в целях получения биомассы для экстракции. Также это может быть связано с составом питательной среды, которая использовалась для глубинного культивирования и по-видимому является более приемлемой для культуры Coprinus lagopides, чем Pleurotus ostreatus, так как условия культивирования обеих культур были одинаковыми и неизменными.

3.4.3 Определение влажности биомассы

Влажность расчитывали исходя из масс влажной и высушенной до постоянного значения биомассы. Данная величина характеризует количество влаги в веществе, а следовательно влага может несколько искажать полученные результаты, так как при добавлении определенных количеств экстрагента может происходить некоторое разбавление полученного раствора. Поэтому влажность биомассы учитывалась при расчете необходимого количества экстрагента при экстракции. Также влажность биомассы необходима при расчете количества белка, полученного экстракцией, на 1 г сухого вещества. Значения влажности полученной биомассы приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Влажность биомассы

Содержание влаги в биомассе обеих культур практически одинаково, в следствие чего при экстракции были использованы одинаковые количества экстрагента для грибов Coprinus lagopides и Pleurotus ostreatus.

3.4.4 Определение количества белка в экстрактах

Так как полученные экстракты были спиртовыми, то определение белка осуществляли по методу Бредфорда. Данный метод является не менее точным, чем широко используемый метод Лоури, но имеет меньше ограничений при использовании.

Вначале было проведено исследование гриба Pleurotus ostreatus как возможного продуцента гидрофобинов, для чего была проведена экстракция из полученной глубинным культивированием биомассы поверхностно-активных белков методом описаным ранее. После чего в экстракте определили содержание белка и пересчитали на 1 г сухой биомассы. Концентрация составила 0,033 мкг/г сухого вещества или 20 мг/л культуральной жидкости. Далее таким же образом провели экстракцию из плодовых тел Pleurotus ostreatus. Гидрофобины выделяли отдельно из шляпок и ножек и определяли содержание белка в экстарктах, что составило для шляпок 0,044 мкг/г сухого вещества, а для ножек 0,051 мкг/г сухой биомассы. Кроме того в литературных источниках есть данные о выделяемых грибом в среду гидрофобинах, поэтому было проведено исследование нативного раствора культуральной жидкости культуры Pleurotus ostreatus. Выделение гидрофобинов из нативного раствора производилось в соответствии с методом описанным ранее. Содержание белка в полученном спиртовом растворе составило 0,0032 мкг/г сухого вещества или 2 мг/л культуральной жидкости. Из полученных данных видно, что наибольшее количество белка было в экстракте из плодовых тел Pleurotus ostreatus, что подтверждают немногочисленные литературные данные. Также выяснилось, что наибольшее количество поверхностно-активных белков находится в ножках плодовых тел. Наименьшее количество белка оказалось в культуральной жидкости, что по-видимому говорит о том, что большая часть поверхностно-активных белков связано с клеткой, а не секретируется в среду. В связи с этим можно сказать, что наиболее предпочтительным материалом для экстракции служат плодовые тела и биомасса, полученная глубинным культивированием. Далее было проведено исследование на наличие гидрофобинов в биомассе гриба Coprinus lagopides, так как в настоящий момент не существует промышленного производства данного гриба, в отличие от Pleurotus ostreatus. Также этот гриб обнаруживал больший прирост биомассы, чем Pleurotus ostreatus. Экстракцию из биомассы Coprinus lagopides вели двумя способами: с промежуточной обработкой 96% спиртом и без нее (как это описано для экстракции из биомассы Pleurotus ostreatus). Данный метод обработки в литературных источниках приводится как метод удаления нековалентно связанных липидов. В первом случае концентрация белка в экстракте составила 0,053 мкг/г сухого вещества или 32,5 мг/л культуральной жидкости. Во втором (без обработки) -- 0,110 мкг/г сухого вещества или 70 мг/л культуральной жидкости, что в 2 раза больше. Возможно в первом случае произошла денатурация белков при добавлении 96% спирта, что дало такое малое значение концентрации белка в экстракте.

Концентрации белка всех полученных экстрактов на 1 г сухого вещества представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Белок в экстрактах

Значения, представленные в вышеуказанной таблице свидетельствуют о том, что наиболее предпочтительным сырьем для получения поверхностно-активных белков служит биомасса гриба Coprinus lagopides. Экстракцию стоит проводить так, как это описано для выделения гидрофобинов без промежуточной обработки 96% этиловым спиртом с целью удаления липидов.

3.4.5 Разделение с помощью ВЭЖХ

Часть полученных спиртовых экстрактов, содержащих поверхностно-активные белки разделяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. При использовании обращенно-фазовой ВЭЖХ соединения выходят из колонки в порядке убывания полярности.

Полученные хроматограммы совпадают по количеству пиков с описанными в литературе, присутствует лишь разница в значениях времени удерживания по сравнению с литературными данными из-за различий в алкильных прививках силикагеля. Разница составляет около 2 минут. Изменения оптической плотности при изменении концентрации фиксировались при помощи спектрофотометра при двух длинах волн -- 254 нм и 280 нм. На длине волны 254 нм определяются, главным образом, азотсодержащие вещества, пуриновые основания. На длине волны 280 нм определяются среднемолекулярные вещества, имеющие в своей структуре бензольные кольца.

Полученные хроматограммы представлены в соответствии с рисунками 10, 11, 12 и 13.

Рисунок 10 - хроматограмма экстракта, полученного из биомассы Pleurotus ostreatus

Рисунок 11 - хроматограмма экстракта, полученного из культуральной жидкости Pleurotus ostreatus

Рисунок 12 - хроматограмма экстракта, полученного из биомассы Coprinus lagopides (обработка этанолом)

Рисунок 13 - хроматограмма экстракта, полученного из биомассы Coprinus lagopides (без обработки этанолом)

На приведенных графиках отчетливо видны два пика. В соответствии с литературными данными второй пик, присутствующий на всех хроматограммах является белком -- гидрофобином. Время удерживания для этого пика, на используемой нами колонке, составляет около 5 мин.

3.4.6 Электрофорез

3.4.7 Оценка пенообразующей и пеностабилизирующей способностей полученных экстрактов

Известно, что гидрофобины вызывают высокую стабильность пены даже при крайне низких концентрациях благодаря своему амфифильному строению. Для оценки поверхностной активности выделенных белков проверялась их пенообразующая и пеностабилизирующая способности. Для чего проводилось выпаривание экстрагента (этанол) и готовились растворы полученных белков в 0,5% растворе ксантана, после чего вспенивались. Далее измерялся объем получившейся пены сразу после вспенивания и в течение Х суток, что представлено в таблице 5.

Таблица 5 - Объем образовавшейся пены

Видно, что полученный продукт вызывает пенообразование и увеличивает стабильность образовавшейся пены. Полученные результаты свидетельствуют, что пенообразующая способность экстрактов такая же как и у широко используемого в производстве казеината натрия, а в случае белков, проэкстрагированных из мицелия без промежуточной обработки этиловым спиртом, даже несколько выше. Также следует отметить пеностабилизирующие свойства полученных поверхностно-активных белков. Из таблицы видно, что наибольшая стабильность образовавшейся пены была у раствора белков, выделенных из мицелия культуры Coprinus lagopides без обработки этиловым спиртом. При этом стабильность пены раствора 0,01% казеината натрия оказалась практически наименьшей. В связи с полученными результатами стоит отметить, что дальнейшее исследование культуры гриба Coprinus lagopides в качестве продуцента гидрофобинов является весьма перспективным.

4 Заключение и выводы

· Подтверждено наличие поверхностно-активных белков в культурах грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides.

· Показано наличие высокой поверхностной активности выделенных белков.

Список использованных источников

1 Белозерская Т.А. Гидрофобины грибов: структура и функции / Т.А. Белозерская // Микология и фитопатология. - 2001. - Т. 35. - №.1. - С. 3-11.

2 De Vries O.M.H., Fekkes M.P., Wosten H.A.B., Wessels J.G.H. Insoluble hydrophobin complexes in the walls of Schizophyllum commune and other filamentous fungi // Arch Mirobiol. 1993. Vol. 5. P 330-335.

3 Bidochka M.J., Leger R.J.St., Joshi L. and Roberts D.W. The rodlet layer from aerial and submerged conidia of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana contains hydrophobin // Mycol. Res. 1995. Vol. 99. P. 403-406

4 Wosten H.A.B., de Vries O.M.H., and Wessels J.G.H. Interfacial Self-Assembly of a Fungal Hydrophobin into a Hydrophobin Rodlet Layer // Plant Cell. 1993. Vol. 5. N. 11. P 1567-1574.

5 Wosten H.A.B., Aigeirsdottir S.A. The fungal hydrophobin Sc3p self-assembles at the surface of aerial hyphae as a protein membrane constituting the hydrophobic rodlet layer // Eur. J. Cell Biol. 1994. Vol. 63. P. 122-129.

6 Wosten H.A.B., Schuren F.H.J. and Wessels J.G.H. Interfacial self-assembly of a hydrophobin into an amphipathic protein membrane mediates fungal attachment to hydrophobic surfaces // EMBO J. 1994. Vol. 13. N. 27. P. 5848-5854

7 Lee Y.H. and Dean R.A. Hydrophobicity of contact surface induces appressorium formation in Magnaporthe grisea // FEMS Microbiology. 1994. Lett. 115. P.71-75.

8 Talbot N.J., Kershaw M.J., Wakley G.E., de Vries O.M.H., Wessels J.G.H., Hamer J. MPG1 encodes a fungal hydrophobin involved in surface interactions during infection-related development // Plant Cell. 1996. Vol. 8. N. 6. P 985-999.

9 Tagu D., Nasse B., Martin F. Cloning and characterization of hydrophobins encoding cDNAs from the ectomycorrhizal basidiomycete Pisolithus tinctorius // Gene. 1996. Vol. 168. P. 93-97

10 D. N. Pegler. Useful fungi of the world: the Shii-take, Shimeji, Enoki-take, and Nameko mushrooms // Mycologist. Vol. 17. Part 1 February 2003. P. 3 - 5.

11 Nakari-Setala T., Aro N., Kalkkinen N., Alatalo E., Penttila M. Genetic and Biochemical characterization of the Trichoderma reesei hydrophobin HFB1 // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 235. N 1-2. P. 248-255.

12 Ian Sutherland. A sticky business. Microbial polysaccharides: current products and future tends // Microbiology today. Vol. 29. May 2002. P. 70 - 71.

13 Elaine & Neil Bruce. Defusing the environment // Microbiology today. Vol.29. May 2002. P. 72 - 74.

14 Лессо Т. Грибы, определитель/ пер. с англ. Л.В. Гарибовой, С.Н. Лекомцевой. - М.: Астрель, АСТ, 2003. - 114 с.

15 Askolin Sanna, Nakari-Setдlд Tiina, Tenkanen Maija Overproduction, Purificaton, fnd Characterization of the Trichoderma reesei Hydrophobin HFBI // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. Vol. 57. P 124-130.

16 Deutsche Zusammenfassung [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://dissertations.ub.rug.nl/FILES/faculties/science/2004/m.i.janssen/ deutsche_zusammenfassung.pdf свободный.

17 Шмелева В.Г. Определение белков и аминокислот в микробной биомассе: Метод. указания. - СПб., СПбГТИ(ТУ), 2003. - 22 с.

18 Инструкция по применению набора реагентов для определения количества плазминогена ХромоТехПлазминоген. Производитель ООО Фирма «Технология - Стандарт».

19 Яковлев В.И. Технология микробиологического синтеза. Учебное пособие для ПТУ. - Л.: Химия, 1987. - 272 с.

20 Кирюшкин А.А., Капитоненко З.В., Ивахнюк Г.К. Охрана труда и окружающей среды: Метод. Указания к дипломному проектированию. МПб., СПбГТИ(ТУ), 2005. - 27 с.

21 Вредные вещества в промышленности: В 3 т./ Под. Ред. Н.В. Лазарева. - М.: Химия, 1976. - 3 т. - 533 с.

22 ГН 2.2.5.686.-98. Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны

23 ГН 2.1.6.1339-03. ОБУВ загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест.

24 НБП 105.- 03. Определение категорий помещений, зданий и наружных установок по взрывопожарной и пожарной опасности.

25 ГОСТ 12.4.021-75 (1999). ССБТ. Системы вентиляционные. Общие требования.

26 СНиП 23-05-95. Естественное и искусственное освещение производственных помещений. Нормы проектирования. - М.: Стройиздат, 1980.

27 Сборник общих правил по технике безопасности при работе в химической лаборатории. Л.:Изд. ЛТИ им. Ленсовета, 1991. - 48 с.

Размещено на Allbest.ru