В настоящее время общее понятие о системе Gal4/UAS как об инструменте для изучения нарушенной экспрессии специфических генов быстро изменяется и список альтернативных использований этой системы разнообразен и длинен. Некоторые из наиболее стандартных направлений использования системы включают:

1) идентификацию генов, вовлеченных в интересующий процесс при помощи энхансерных или генетических ловушек;

2) анализ автономности работы гена с помощью направленной мозаичной экспрессии;

3) маркировка клеток для облегчения скрининга мутаций, воздействующих на интересующий процесс;

4) анализ фенотипа потери функции через направленную экспрессию иРНК и негативных доминантных конструкций;

5) идентификации генов, нарушенная экспрессия которых воздействует на интересующий процесс.

1.9 Управление системой

1.9.1 Зависимость активности белка GAL4 от температуры

Как в любой технологии, детальное понимание природы используемых процессов в системе Gal4/UAS помогает предотвратить неприятные неожиданности и способствует выявлению дополнительных свойств и выгодных характеристик. Одним таким открытием стала температурная зависимость работы GAL4 у дрозофилы. В мухах минимальная активность GAL4 наблюдается при 16°C, а при 29°C наступает баланс между максимальной работой GAL4 и минимальными эффектами высоких температур на фертильность и жизнеспособность организма. Поэтому, просто изменяя температуру, можно регулировать уровень экспрессии любого респондера, таким образом, увеличивая гибкость системы. Это особенно выгодно для изучения постэмбриональных стадий развития. Так как многие драйверы экспрессируются в течение всего времени развития, нежелательные летальные эффекты от направленной экспрессии на ранних стадиях могут препятствовать развитию до интересующей исследователя стадии. Однако, понижая температуру, можно снизить активность GAL4 - системы, чтобы избежать проблемные стадии, таким образом, обеспечивая простой путь изучения организма при более высоких температурах на интересующей стадии развития.

1.9.2 Выявление направленной экспрессии гена-респондера

Чтобы успешно применять GAL4-драйвер, сначала нужно определить его паттерн экспрессии. Это делается с помощью скрещивания GAL4 - драйвера с линией, где в качестве респондера выступает репортерный ген, т.е. ген, локализация продукта которого можно определить, либо по флуоресцентному свечению (UAS-Green Fluorescent Protein (GFP)), либо с помощью цветовой реакции (UAS-в-галактозидаза (UAS-LacZ)) (Duffy, 2002). На этом этапе работы создается система, в которой комбинируются драйвер GAL4, паттерн экспрессии которого определяют ген GAL4, и репортерный ген, находящийся под контролем UAS. Таким образом, ген - репортер выступает в роли маркера той ткани, к которой драйвер запускает экспрессию GAL4. Однако паттерны экспрессии репортера и респондера не всегда совпадают. Это связано с различиями в мРНК и стабильности белка, клеточной локализации у респондера и репортера. Поэтому для правильного понимания фенотипических проявлений направленной экспрессии респондера при комбинировании его с драйвером GAL4, нужно проводить дополнительный анализ экспрессии респондера. Для этого могут использоваться разнообразные подходы (гибридизация in situ или иммуногистохимия с использованием антител к белку респондера); включая расширяющееся использование различных флуоресцентных белков (FPs), пришитых к респондеру.

1.9.3 Выбор подходящего драйвера с репортером

Как упомянуто выше (Duffy, 2002), существует разнообразная группа респондеров для использования их в качестве клеточных репортеров. Часто используются такие удобные репортеры, которые специфически воздействуют на исследуемый процесс, не нарушая его в целом, что является важным условием удобного репортера. Сначала в качестве репортеров использовались множество респондеров, которые, как казалось, не имеют вредных эффектов. Однако появились данные, что некоторые из них приводят к фенотипическим нарушениям. Например, два ассоциированных с микротрубочками репортера, fusion-protein kinesin heavy chain-LacZ и флуоресцентный белок Green Fluorescent Protein (GFP), могут приводить к смертности в ответ на действие специфических драйверов (Phelps, Brand, 1998). Большинство драйверов GAL4 сами не вызывают фенотипических эффектов. Однако имеются сведения о драйверах GAL4, нарушающих какие - либо стороны развития. Например, влияние на развитие омматидиев глаз мухи наблюдалось при использовании драйвера p{GAL4-ninaE. GMR} (Freeman, 1996). Поэтому важны гарантии того, что ни присутствие драйвера GAL4, ни присутствие респондера, используемого в качестве клеточного репортера, не оказывает воздействия на изучаемый процесс.

1.9.4 Подбор рациональной системы экспрессии

С самого начала система GAL4/UAS претерпевает многочисленные видоизменения и модификации. Чтобы создать набор трансгенных линий с респондерами и драйверами, Брэнд и Перримон сконструировали ряд векторов (Brand, Perrimon, 1993). Вектор pUAST - это основанный на мобильном P-элементе вектор, который позволяет одновременно размещать исследуемый ген под контролем GAL4. Он содержит расположенный выше GAL4 элемент UAS, за ним следует основной промотор гена hit-shock protein 70 (hsp70), далее - сайты для клонирования (полилинкер), и малый t-интрон вируса SV40 и сигнал полиаденилирования. Были получены три отдельных конструкции, pGAWB, pGATB, и pGATN, обеспечивающих различный паттерн экспрессии GAL4. Как замечено выше, конструкция pGAWB создавалась для выявления тканеспецифических энхансеров (enhancer-trap - ловушка энхансеров). В этой конструкции GAL4 был вставлен ниже промотора транспозазы Р-элемента и выше от сайта терминации гена hsp70.

В отличие от pGAWB, pGATB и pGATN являются удобными векторами для размещения новых регулярных элементов выше GAL4. После того, как нужный регуляторный элемент помещается выше от GAL4 в этих векторах, весь фрагмент, содержащий регулярный элемент и ген Gal4, можно вырезать и клонировать в вектор для трансформации на основе Р-элемента. Таким образом были получены линии, в которых специфические регуляторные элементы размещались выше GAL4, что позволяло вызывать направленную тканеспецифическую экспрессию генов-мишеней. В результате этого, Шарма и другие описали основанный на P-элементе вектор для трансформации, pPTGAL, в котором регуляторные последовательности размещались непосредственно перед GAL4, таким образом, избегая дополнительного шага, необходимого при использовании pGATB или pGATN (Sharma et al., 2002). Также, Ромен и Девис описали подобный вектор для трансформации. В этом векторе для вставки регуляторных последовательностей непосредственно перед GAL4 используется гормон-индуцибельная сайт-специфическая рекомбинация по lox-сайтам, что также исключает лишний шаг в работе (Roman, Davis, 2002). В связи с разносторонним использованием системы GAL4/UAS последовали е? разнообразные модификации, среди которых: изменение структуры вектора, экспрессия респондера в клетках полового пути в оогенезе, улучшение способности индуцировать трансген в мухах и в клеточных культурах, направленная инактивация гена с помощью RNAi, усовершенствование клонального анализа и др.

1.10 Использование системы Gal4/UAS

1.10.1 Модификации вектора pGAWB

Модификации векторов с GAL4 также увеличили гибкость системы. Для увеличения частоты транспозиций Герлиц с соавторами сконструировали усовершенствованный вектор pGAWB, pGALW (Gerlitz et al., 2002). Они проанализировали приблизительно 40.000 независимо полученных инсерций pGALW для поиска тех из них, которые экспрессируются в крыловых имагинальных дисках. В качестве репортера применялся UAS-GFP. В итоге они отобрали 2000 драйверных инсерций, которые встроились в регуляторные районы генов, экспрессирующихся в крыловом имагинальном диске. Этот опыт показывает, что система UAS/GAL4 дает мощную возможность использования е? для идентификации регуляторных элементов генома - энхансеров, т.е. система может выступать в роли энхансерной ловушки. При этом можно легко идентифицировать и клонировать новые гены, экспрессирующиеся в интересующей ткани (например, крыло) и, одновременно, использовать эту линию в качестве драйвера для направленной экспрессии гена-респондера в конкретной ткани. В этом же исследовании Герлитс с сотрудниками отмечают, что, как pGAWB, так и pGALW драйверы вызывают экспрессию GAL4 в слюнных железах из-за того, что последовательность промотора hsp70, расположенного выше участка, кодирующего GAL4, имеет этот тканеспецифический энхансер. Устранение 5?-последовательности UTR приводили к прекращению экспрессии в слюнных железах; этот неудачный вариант ограничил полноценное использование pGALW в качестве вектора ловушки энхансеров (Gerlitz et al., 2002). Подобным образом был сконструирован другой GAL4 - содержащий вектор ловушки генов - pGT1 (Lukacsovich et al., 2001). Главное различие между энхансерными ловушками и ловушками генов заключается в том, что экспрессия вектора ловушки гена зависит от эндогенного покровителя, в отличие от энхансерных ловушек, экспрессия которых зависит от наличия промотора вблизи места встройки вектора энхансерной ловушки. Второе главное различие в том, что ловушки гена используют при наличии сайта акцептора (или донора), присутствующего в векторе для продукции гибридной мРНК. Такая молекула мРНК состоит из части последовательности экзона нарушенного гена (т.е. гена, в область которого встроился вектор) и последовательности, кодирующей GAL4.

1.10.2 Экспрессия в материнских клетках полового пути

Яйцевая камера дрозофилы состоит из двух главных видов клеток: герминальных клеток (включают яйцеклетку (ооцит) и группу клеток - кормилок (трофоцитов)) и клеток соматического эпителия. Одним из свойств конструкции pUAST было отсутствие экспрессии респондера в материнских клетках полового пути - герминальных клетках. Это было очень выгодно для тех, кто интересовался соматическим эпителием, поскольку получал возможность экспрессировать респондер только в этой ткани. Однако для тех, кто интересовался направленной экспрессией респондера в герминальной ткани на протяжении различных стадий оогенеза, отсутствие возможности экспрессировать там респондер было непредвиденной помехой. Чтобы преодолеть это, Рорт видоизменил вектор pUASP, в котором hsp70 - промотор и SV40-терминатор pUAST были заменены промотором и первым интроном транспозазы P-элемента и 3?-областью нетранслируемой зоны (3? UTR) гена fs (l) K10, таким образом, позволив эффективную экспрессию респондера в материнских герминальных клетках (Rorth, 1998). Вторая выгода, извлеченная из модернизации вектора рUASP, состоит в том, что он позволяет экспрессировать респондер на ранних эмбриональных стадиях, т.к. на этих стадиях активны только продукты генов материнского организма, привнес?нные ранее в ооцит. Важно отметить, что pUASP, как и pUAST, также эффективно регулируют экспрессию и в других тканях. Развитию pUASP сопутствовало и развитие ряда драйверов GAL4, более эффективно регулирующих экспрессию респондера в клетках полового пути. Например, драйвер GAL4, содержащий промотор гена nanos, белок GAL4 с пришитым к нему транскрипционным активатором VP16 (GAL4-VP16), и 3? UTR гена nanos, обеспечивает экспрессию респондеров вектора pUASP на всех стадиях оогенеза.

1.10.3 Направленное выключение или "нокдаун" генов

Система GAL4/UAS часто применяется при анализе фенотипа гиперфункции гена. Однако недавно е? стали использовать при индукции РНК-опосредованной интерференции (RNAi), что позволило увидеть в ней мощный инструмент также и для анализа фенотипа "потери функции" или

"нулевого фенотипа" (Reichhart et al., 2002). В настоящий момент успешно разрабатываются разнообразные подходы для направленной экспрессии конструкций, которые принимают форму двунитевой молекулы РНК (dsRNA). Такие двунитевые молекулы РНК (dsRNA) являются посредниками для геноспецифической RNAi и выключения гена ("нокдауна") (Giordano et al., 2002; Nagel et al., 2002). В одном из подходов, названном сплайсинг - активирование RNAi, образование шпильки молекулы РНК контролируется через сплайсинг. Включение интрона шпильки в конструкцию с UAS и респондером, возможно, помогает в образовании и транспорте молекулы dsRNA (Reichhart et al., 2002). В другом случае в векторе pUdsGFP респондер UAS-GFP был вставлен ниже от UAS-сплайс-активирующей шпильки. Экспрессия GFP затем обеспечивает идентификацию клеток, которые подвергаются RNAi-опосредованному нокдауну интересующего гена. Альтернативно, UAS-респондерный конструкт, который теряет интрон и вместо этого напрямую формирует шпильку; также можно использовать в качестве посредника геноспецифическую RNAi. Оба метода были эффективно использованы исследователями для результативного получения специфического нокдауна генов.

Глава II. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Объект исследования

Исследования проводились на плодовой мушке Drosophila melanogaster. Линии D. melanogaster культивировались на стандартной агаризованной среде, содержащей изюм, манную крупу, дрожжи.

2.1.2 Мутации D. melanogaster, используемые в работе

При проведении эксперимента мы использовали линии, содержащие различные маркерные мутации (таблица 1).

Таблица 1. Мутации D. melanogaster.

Символ	Ген	Фенотипическое проявление
y	yellow	желтое тело, коричневые щетинки
w	white	белые глаза
w+m	mini-white	окрашенные глаза
L	Lobe	редуцированные глаза
B	Bar	бобовидные глаза
KrIf-1	Kruppel	зернистые глаза
Cy	Curly	крыловые пластинки закручены вверх; доминантная мутация, локализованная во II хромосоме; гомозиготы летальны
D	Dichaete	крылья расставлены в стороны; доминантная мутация, локализованная в III хромосоме; гомозиготы летальны
Sb	Stubble	короткиегрубыещетинки; доминантная
		мутация, локализованная в III хромосоме; гомозиготы летальны
Tb	Tubby	короткое бочковидное тело, доминантная мутация, локализованная в III хромосоме; гомозиготы летальны

2.1.3 Линии D. melanogaster, используемые в работе

В работе использовались музейные линии, полученные из мировой коллекции (Блумингтон, США).

· Oregon R - лабораторная линия дикого типа;

· w; P{w+UAS-Ri}13 - трансгенная линия, содержащая генетическую конструкцию, маркированную геном miniwhite. Инактивирует экспрессию тех lawc-транскриптов, которые содержат последовательность открытой рамки считывания, в системе Gal4/UAS. получена в лаборатории регуляции морфогенеза ИБР РАН (Черезов и др., 2013); конструкт локализован в III хромосоме. Обозначена как UAS-Ri13.

· yw; P{y+UAS-TRIS} - трансгенная линия, содержащая генетическую конструкцию, маркированную геном w+ и инактивирующую экспрессию Trf2-транскриптов, которые содержат последовательность открытой рамки считывания (рис.2), в системе Gal4/UAS. Получена в лаборатории регуляции морфогенеза ИБР РАН, конструкт локализован во II хромосоме. Обозначена UAS-TRIS.

· w; P{w+UAS-RiC} - трансгенная линия, содержащая генетическую конструкцию, маркированную геном miniwhite. Экспрессирует РНК - шпильку, гомологичную 3'-зоне транскриптов гена lawc (Рис 2). Инактивирует экспрессию lawc-транскриптов в системе Gal4/UAS. Получена в лаборатории регуляции морфогенеза ИБР РАН. Обозначена как UAS-RiC.

· w; P{w+UAS-RiG} - трансгенная линия, содержащая генетическую конструкцию, маркированную геном miniwhite. Экспрессирует РНК - шпильку, гомологичную 3'-зоне геномной последовательности, включая интроны, гена lawc (Рис 2). Инактивирует экспрессию lawc-транскриптов, в системе Gal4/UAS. Получена в лаборатории регуляции морфогенеза ИБР РАН;. Обозначена как UAS-RiG.

· yw; P{w+UAS-GFP} - трансгенная линия, содержащая генетическую конструкцию, маркированную геном miniwhite. Экспрессирует белок GFP под контролем промотора UAS в системе Gal4/UAS. Получена от Г.П. Георгиева (ИБГ РАН); Конструкт локализован в аутосомах.

· y1w; P{w-tub-GAL4}/TM3, Tb - линия из мировой коллекции Блумингтона, содержащая генетическую конструкцию, обеспечивающую убиквитарную экспрессию GAL4. Сбалансирована множественной инверсией TM3.

· y1w; P{GawB}Dll/CyO - линия из мировой коллекции Блумингтона, содержащая генетическую конструкцию, нарабатывающей активатор GAL4 под контролем промотора гена Dll. Сбалансирована множественной инверсией CyO. Получена от Б.А. Кузина (ИБР РАН); Конструкт локализован во II хромосоме.

· y1w; P{w+m=GAL4-ninaE. GMR} - линия из мировой коллекции Блумингтона, содержащая трансгенный конструкт, созданный на основе мобильного Р - элемента, экспрессирующий ген Gal4 в глазоантенном имагинальном диске, позади морфогенетической борозды - в области глаза, и маркированный геном mini-white (усеч?нная копия гена white), локализован во II хромосоме. Обозначена GMR-GAL4.

· y1w; P{w+mC=Act5C-GAL4}25FO1/CyO - линия из мировой коллекции Блумингтона, содержащая трансгенный конструкт, созданный на основе мобильного Р-элемента, обеспечивающую убиквитарную экспрессию GAL4. Локализован во II хромосоме и сбалансирован множественной инверсией CyO;

· P{w+mC=UAS-Dcr-2. D}1, w [1118]; P{w+mC=GAL4-nos. NGT}40/CyO линия из мировой коллекции Блумингтона, содержащая трансгенный конструкт, созданный на основе мобильного Р-элемента, обеспечивающую экспрессию GAL4 в стволовых клетках полового пути, конструкт локализован во II хромосоме. Обозначена NOS-GAL4/CyO.

· P{otu-GAL4:: VP16. R}1,w*; P{GAL4-nos. NGT}40; P{GAL4:: VP16-nos. UTR}CG6325MVD1 - линия из мировой коллекции Блумингтона, содержащая трансгенные конструкты, созданный на основе мобильного Р - элемента, обеспечивающую экспрессию GAL4 в клетках полового пути. Обозначена otu-Gal4; Nos-Gal4; или MTD-Gal4.

· lawcp1 - гомозиготная линия, имеющая рецессивную сцепленную с полом не нарушающую жизнеспособность мутацию lawcp1, вызванную инсерцией двойной копии неполноразмерного Р-элемента.

· P {tj-GAL4. U} экспрессия белка в соматических тканях репродуктивной системы

· l (1) /In (1) FM4, y31dsc8B; TM3, Tb/Sb - линия, содержащие множественные инверсии, препятствующие кроссинговеру в I хромосоме (FM4, маркер Bar) и в III хромосоме (TM3, маркер Tb).

2.1.4 Методы содержания дрозофилы и манипулирования с ней 2.4.1 Отбор девственных самок

При постановке скрещиваний необходимо использовать девственных самок, в связи с тем, что жизнеспособная сперма может храниться в сперматеках самок в течение нескольких суток после спаривания. Девственных самок отбирают таким образом: из культур удаляют всех мух, затем через 6 часов, в течение которых выводятся новые мухи, отбирают самок. Так как первые подвижные сперматозоиды у самцов появляются только через 7+1 часов после выхода из куколки, то девственность самок, отобранных в этом интервале, не вызывает сомнений. Характерностью для девственных самок является светлое, полупрозрачное брюшко.

2.1.5 Температурные условия разведения

В лабораторных условиях дрозофил разводят при 22 - 24о С. При этой температуре развитие мушек происходит за 10 дней, а средняя продолжительность жизни D. melanogaster составляет 3-4 недели. При температуре выше 30о наступает полная или частичная стерильность. Низкие температуры оказывают замедляющее действие на развитие (20 дней), это используют для содержания фонда. Коллекцию обычно содержат при 18о - 19о, что позволяет реже пересаживать мух на свежую питательную среду.

2.1.6 Определение стерильности самок

Стерильность самок, характеризуется утратой к способности производить и откладывать яйца. В эксперименте при подавлении прямых и обратных транскриптов в репродуктивных тканях необходимо определить частоту стерильных самок, поэтому при скрещивании мух из драйверной линии с мухами с трансгенными конструкциями, мы отбирали в F1 зрелых самок и индивидуально скрещивали их с самцами дикого типа (Oregon R). В результате чего могли наблюдать стерильность, при которой в пробирке не было яиц, либо самка могла откладывать небольшое потомство в количестве до 20 особей, но потомство в свою очередь не было жизнеспособным. Частота стерильности определялась в процентах через отношение количества стерильных самок к общему количеству самок, взятых в анализ, умноженному на 100.

2.2 Генетические методы

2.2.1 Хромосомное картирование

Для работы были созданы линии с конструкциями, которые инактивировали работу комплекса генов lawc/Trf2. Проколотых эмбрионов помещали на питательную среду и в термостат с температурой 25?С. Вылетевших мух скрещивали с мухами из линии y'w'. Затем искали генетических трансформантов, меченных w+ (маркер - красные глаза). Этих трансформантов скрещивали в свою очередь с линией 18V, для выведения в гомозиготную линию и картирования. Для определения локализации исследуемых трансгенных конструкций проводились скрещивания с линией 18V по схеме 1:

Схема 1.

P: > yw; +/ (?); +/ (?) x +y+w; Cy/L; D/Sb

F1: >, + yw/ y+w; Cy/+; D/+ yw/ y+w; Cy/+; Sb/+

yw/ y+w; L/+; D/+ yw/ y+w; L/+; Sb/+

yw/ y+w; Cy/ (?); D/ (?)

yw/ y+w; Cy/ (?); Sb/ (?)

yw/ y+w; L/ (?); D/ (?)

yw/ y+w; L/ (?); Sb/ (?)

Мухи F1 c фенотипом окрашенных глаз (селекторный признак, маркирующий конструкт) и двумя доминантными маркерами вновь скрещивались с линией 18V по схеме 2:

Схема 2.

F1: > yw/ y+w; Cy/ (?); D/ (?) x + y+w; Cy/L; D/Sb

F2:

+гаметы >гаметы	Cy; D	Cy; Sb	L; D	L; Sb
Cy; D	x	x	x	Cy/L; D/Sb
Cy; (?)	x	x	Cy/L; D/ (?)	Cy/L; Sb/ (?)
D; (?)	x	Cy/ (?); D/Sb	x	L/ (?); Sb/D
(?); (?)	Cy/ (?); D/ (?)	Cy/ (?); Sb/ (?)	L/ (?); D/ (?)	L/ (?); Sb/ (?)

X-летальныекомбинации

Из потомства F2 необходимо анализировались особи, которые содержат 3 доминантных маркера (ячейки выделены цветом). Если фенотип красных глаз проявляется в классах Cy/ (?); D/Sb и L/ (?); Sb/D, то можно сделать вывод, что конструкт локализован во II хромосоме. Если в классах Cy/L; D/ (?) и Cy/L; Sb/ (?), то делается вывод о локализации конструкта в III хромосоме. Если особи не разбиваются на эти два класса, то проводится анализ на локализацию конструкта в X-хромосоме.

2.2.2 Выведение линии, гомозиготной по трансгенной конструкции

После определения локализации трансгенных конструкций становится возможным выведение линии, содержащей этот конструкт в гомозиготном состоянии. Для этого из поколения F2 от скрещивания по схеме 1 отбираются самцы и самки с окрашенными глазами, и двумя маркерами и скрещиваются по схеме 3 (если конструкт локализован во 2 хромосоме):

Схема 3.

F2: > Cy/ [w+m, конструкт]; D/+ x + Cy/ [w+m, конструкт]; D/+

F3: >, + Cy/ [w+m, конструкт]; D/+

Cy/ [w+m, конструкт]; +/+

[w+m, конструкт] / [w+m, конструкт]; D/+

[w+m, конструкт] / [w+m, конструкт]; +/+

Из поколения F3 отбирались самки и самцы без маркерных признаков и скрещивались между собой.

2.2.3 Тотальное подавление экспрессии прямых и обратных транскриптов

Для тотального подавления экспрессии прямых и обратных транскриптов с помощью системы GAL4/UAS проводили скрещивание по схеме 4 и 5 (рис.7) при температуре развития 25оС и 28оС. При этом использовали линии y1w; P{w-tub-GAL4}/TM3, Tb и y1w; P{w+mC=Act5C - GAL4}25FO1/CyO.

Частота выживаемости рассчитывалась как отношение особей подопытного класса (не менее 250 особей) к количеству особей альтернативного контрольного класса с балансерной хромосомой. По формуле:

(Опыт/Контроль) х 100%, где

Опыт - количество особей подопытного класса

Контроль - количество особей альтернативного контрольного класса.

Схема 4:

P: >P{tub-GAL4}/TM3,Tbх+UAS-конструкт

F1: +>P{tub-GAL4}/UAS - конструкт - мухи без маркерных мутаций (опыт)

+>UAS - конструкт /TM3,Tb - мухи с коротким телом (контроль)

Схема 5:

P: >y1w; P{w+mC=Act5C-GAL4}/SM,CyO; +/+х++/+; UAS-конструкт

F1: +> P{Act-GAL4}/+; +/UAS-конструкт - мухи без маркерных мутаций (опыт)

+>SM,CyО/+; +/UAS-конструкт-мухисзакрученнымикрыльями (контроль)

Рисунок7. Схема активации конструкциис использованием системы UAS/GAL4.

2.2.4 Тканеспецифическое подавление экспрессии прямых и обратных транскриптов

Для тканеспецифического подавления в тканях глаза был использован драйвер P{w+m=GAL4-ninaE. GMR}. Скрещивание проводили по схеме 6 (А - подавление прямых и обратных транскриптов, Б - контроль) при температуре развития 25 и 28оС. Частота встречаемости особей с нарушением развития глазных структур рассчитывалась по отношению к общей сумме, просмотренных в потомстве F1 особей. Схема 6:

А) P: > GMR-GAL4 х+UAS-конструкт

F1: +> GMR-GAL4/UAS-конструктмухи с "грубыми глазами"

+> UAS-конструкт / GMR-GAL4 (опыт)

Б) P: >+/Y; GMR-GAL4}х+ y'w'; +/+

F1: + y'w'/+; GMR-GAL4/+ > y'w'/Y; GMR-GAL4/+ (контроль) мухи с нормальными глазами

Для тканеспецифического подавления в глазо-антенных дисках в зоне антенны был использован драйвер y1w; P{GawB}Dll/CyO. Скрещивание проводили по схеме 7 при температуре развития 28оС.

Схема 7.

P: >y1w; GAL4-Dll/CyO; +/+х++/+; UAS-конструкт

F1: +> +/ GAL4-Dll; +/ UAS-конструкт - мухи без маркерных мутаций (опыт)

+> +/ CyO; +/ UAS-конструкт - мухи с закрученными крыльями (контроль)

Для сравнения эффекта, подавления прямых и обратных транскриптов комплекса lawc/Trf2 в клетках половой системы D. melanogaster мы поставили скрещивания мух из трансгенных линий UAS-TRIS, UAS-Ri13, UAS-RiC и UAS-RiG с мухами драйверной линиии P{w+mC=UAS-Dcr - 2. D}1,w [1118]; P{w+mC=GAL4-nos. NGT}40/CyO (схема 8) При температурах развития 25 и 28. Затем гибридных самок от каждого скрещивания

индивидуально скрещивали с самцами дикого типа (Oregon R) для проверки самок на стерильность.

Схема 8:

P: > NOS-GAL4/CyOх+ UAS-конструкт

F1:

1. +NOS-GAL4/CyO; UAS-конструктх>Oregon (Проверкана стерильность).

Для сравнения эффекта, подавления прямых и обратных транскриптов комплекса lawc/Trf2 в герминативных клетках половой системы D. melanogaster мы поставили скрещивания мух из трансгенных линий UAS - TRIS, UAS-Ri13, UAS-RiC и UAS-RiG с мухами драйверной линии MTD-Gal4. При температурах развития 25 и 28oC. Затем гибридных самок от каждого скрещивания индивидуально скрещивали с самцами дикого типа (Oregon R) для проверки самок на стерильность.

Схема 9:

P: > MTD-Gal4 х+ UAS-конструкт

F1:

1. + MTD-Gal4; UAS - конструкт х >Oregon (Проверка на стерильность).

Для сравнения эффекта, подавления прямых и обратных транскриптов комплекса lawc/Trf2 в соматических клетках половой системы D. melanogaster мы поставили скрещивания мух из трансгенных линий UAS - TRIS, UAS-Ri13, UAS-RiC и UAS-RiG с мухами драйверной линии tj-Gal4 (по схеме10).

При температурах развития 25 и 28oC. Затем гибридных самок от каждого

скрещивания индивидуально скрещивали с самцами дикого типа (Oregon R) для проверки самок на стерильность.

Схема 10:

P: > tj-Gal4 х+ UAS - конструкт

F1:

1. + tj-Gal4; UAS - конструкт х >Oregon (Проверка на стерильность).

2.2.5 Метод микроскопирования

Для оценки работы драйверных линий мы использовали мух из линии с конструкцией UAS-GFP, в которой белок GFP (green fluorescent protein) при длине волны 485 нм под флуоресцентным микроскопом да?т яркое зел?ное свечение. Для того, чтобы увидеть локализацию белка GFP мы ставили скрещивание по схеме (рис.6), затем в полученном потомстве препарировали личинок и взрослых самок дрозофил на предметном стекле в капле дистиллированной воды, органы покрывали покровным стеклом и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioscope 40.

Снимки глаз и антенн D. melanogaster были произведены с помощью микроскопа Keyence vhx 1000e в Институте Молекулярной Биологии РАН. Keyence vhx 1000e - цифровой микроскоп, комплектуется измерительным штативом, либо штативом, позволяющим производить наблюдение и съ?мку под любым углом, быстро и точно в автоматическом режиме снимать 3D образ тр?хмерного объекта, производить измерения с точностью до 0,1 микрона в том числе и в 3D.

Съемка яичников D. melanogaster, окрашенных флуоресцентными красителями (Sytox Green и Phalloidin), производилась на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5, а окрашенных Dapi - на автоматизированным инвертированном флуоресцентным микроскопе Leica DMI6000 в ЦКП ИБР РАН.

2.2.6 Иммунофлуоресцентое окрашивание яичников дрозофил

Яичники выделяли из взрослой мухи в растворе WASH (10 мл PBS, 200 µl 10% Triton X-100) и фиксировали в свежем 4% параформальдегиде 20 минут. Затем материал промывали от параформальдегида 10 минут WASH и 2 раза по 10 минут в фосфатном буфере PBS (130 мМNaCl, 7 мМNa2HPO4.2H2Oи 3 мМNaH2PO4.2H2O, pH7,0). Далее окрашивали CF594 - конъюгированным фаллоидином (CF594-Phalloidin) в течение 1 часа для визуализации клеточных стенок и распределения актина, в разведении 1: 40 в буфере РВS. Потом трижды отмывали в фосфатном буфере PBS и обрабатывали в растворе RNAza A (250 мкг/мл) 15 минут при 37 єC, чтобы удалить из клеток РНК. После производили окрашивание ДНК-специфичным красителем Sytox Green (3 µl/мл) 10 минут и промывали раствором PBS 3 раза по 5 минут. Окрашенные яичники переносили в раствор PBS на предметное стекло, где их расправляли и убирали лишний раствор, далее добавлялся глицерин или Vectashield (mounting medium H-1000, Vector Laboratories). Препарат накрывали покровным стеклом и хранили в холодильнике при температуре 4°С горизонтально, в темной коробке или фольге. В некоторых случаях окраску яичников проводили ДНК - специфичным красителем DAPI (4',6-диамидион-2-фенилиндол).

Глава III. Результаты и обсуждение

3.1 Получение трангенных линий с инактивирующими конскрукциями

Для исследования работы разнонаправленных транскриптов генного комплекса lawc/Trf2 мы использовали трансгенные линии, в которых при определ?нных условиях (система Gal4/UAS) можно вызвать направленный нокдаун гена через инактивацию его транскриптов как прямых (Trf2), так и обратных (lawc).

Для этого сотрудниками лаборатории были созданы конструкции:

- TRIS, инактивирующие белок-кодирующую зону прямых транскриптов

- Trf2,RiC, RiG, инактивирующие обратные транскрипты lawc в 3'-некодирующем районе.

- Ri13, инактивирующая белок-кодирующую зону обратных транскриптов. Трансгенная линия с этой конструкцией была получена ранее.

Все эти конструкции были проколоты сотрудником лаборатории в эмбрионы линии y1w1 для получения трангенных особей. Нашей первой задачей было вывести линии в гомозиготное состояние и определить хромосому, в которой произошло встраивание конструкции (материалы и методы, схемы 1-3)

В результате были получены по 8 трансгенных линий для каждой конструкции и определены хромосомы локализации трансгена (таблица 2).

Таблица 2. Трансгенные линии, полученные в ходе работы

TRIS Номер линии и хромосома	RiC Номер линии и хромосома	RiG Номер линии и хромосома
№ 1-2 I хр	№ 1-3 III хр	№ 2-1 II хр
№ 2-1 II хр	№ 1-2 III хр	№ 3-5 III хр
№ 3 III хр	№ 2-1 II хр	№ 4-2 II хр
№ 4 III хр	№ 3-1 I хр	№ 5-3 III хр
№ 5-2 II хр	№ 4-2 II хр	№ 6-1 II хр
№ 8-2 I хр	№ 5-2 III хр	№ 7-1 II хр
№ 9 I хр	№ 6-7 II хр	№ 8-1 II хр
№ 10 II хр	№ 7-2 III хр	№ 9-1 II хр

3.2 Подавление прямых и обратных транскриптов lawc/Trf2 во всех органах и тканях

Для тотального подавления прямых и обратных транскриптов мы использовали две линии убиквитарных драйверов дрозофил, таких как y1w; P{w-tub-GAL4}/TM3, Sb1 Ser и P{w+mC=Act5C-GAL4}25FO1/CyO, в которых белок GAL4 экспрессируется под промотором гена тубулина и актина соответственно.

Так как трансгенные конструкции обладают способностью спонтанно вырезаться из генома, то сначала мы проверили работу драйверных конструкций этих линий с помощью репортерной линии UAS-GFP. Для этого мы провели скрещивания мух из драйверных линий и репортерной линии (Рис.7). Затем препарировали личинок полученных в потомстве от этого скрещивания. Препараты немедленно просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа "в живую" (рис.8).

Рисунок 8. Экспрессия GFP, активированная драйвером tub-GAL4.

Активация экспрессии GFP в личинках P{tub-GAL4}/UAS-GFP привела к яркому свечению в слюнных железах, имагинальных дисках, кишке, мальпигиевах сосудах, гонадах, а также в жировом теле (рис.8). Это говорит о широкомасштабном паттерне экспрессии белка GAL4 в этой линии драйвере, который можно использовать в качестве убиквитарного активатора в наших экспериментах. В случае личинок P{w [+mC] =Act5C-GAL4}25FO1/CyO свечение наблюдалось в имагинальных дисках, слюнных железах, кишке, гонадах и мозге (рис.9), что также подтвердило над?жность использования этой линии в качестве убиквитарного драйвера системы UAS/GAL4.

Рисунок 9. Экспрессия GFP, активированная драйвером Act-GAL4.

Слева личинка без активации UAS-GFP. Справа личинка с активированным UAS-GFP. Сверху те же препараты на просвет.

Таким образом, оба убиквитарных драйвера активны, и их можно использовать в двухкомпонентной системе Gal4/UAS. Поэтому, далее мы использовании эти линии для тотального подавления прямых и обратных транскриптов lawc/Trf2.

Эксперимент проводили при 25о C и 28о C. Скрещивания ставили по схемам (Мат. и методы, схемы 4 и 5). Эффект подавления прямых и обратных транскриптов оценивали по выживаемости самцов и самок D. melanogaster. (Табл.3).

Таблица 3. Выживаемость особей (%) при тотальном подавлении либо прямых, либо обратных транскриптов при температуре 25о C и 28о C.

Температура развития	25о C	28о C
Особи	+	>	+	>
tub>TRIS	0	10,2	9	31
tub>Ri13	96,1	89,5	4,7	23
tub>RiC	79,8	75,6	72	61
tub>RiG	18,03	69,8	60,8	60,7
Act>TRIS	55,9	3,2	0	0
Act>Ri13	49,5	33,6	0	0

В результате эксперимента мы выявили снижение выживаемости дрозофил, при подавлении как прямых, так и обратных транскриптов перекрывающихся генов lawc-Trf2. Частота выживаемости была ниже при 28оC, чем при 25о C, т.к. активность драйверной конструкции зависит от температурных условий развития. Чем выше температура развития, тем активнее работает драйверная конструкция и, следовательно, увеличивается частота гибели потомков в наших экспериментах.

3.3 Подавление прямых и обратных транскриптов lawc/Trf2 в глазо - антенных имагинальных дисках

При тканеспецифическом подавлении прямых и обратных транскриптов в тканях глаза, мы использовали драйверную линию P{w+m=GAL4 - ninaE. GMR}, в которой белок Gal4 накапливается в глазо-антенных имагинальных дисках, в области глаза, позади морфогенетической борозды.

Сначала мы проверили работу драйверной конструкции P{w+m=GAL4-ninaE. GMR} с помощью репортерной линии UAS-GFP. Для этого мы провели скрещивания мух из драйверной линии и репортерной линии (схема.6 в Мат. и методы). Затем препарировали личинок полученных в потомстве от этого скрещивания. Препараты просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа (рис.10).

Мы наблюдали яркое свечение в глазо-антенном имагинальном диске позади морфогенетической борозды, в области глаза.

Рисунок 10. Экспрессия GFP в глазо-антенном имагинальном диске, в личинках GMR-Gal4>UAS-GFP.

Таким образом, драйвер P{w+m=GAL4-ninaE. GMR} активен, поэтому мы использовали эту линию для двухкомпонентном системы Gal4/UAS, для подавления прямых и обратных транскриптов в глазо-антенном имагинальном диске.

Эксперимент проводили при 25о C и 28о C. Скрещивания ставили по схеме 6. Эффект подавления прямых и обратных транскриптов оценивали по степени нарушения морфологии глазных структур (табл.4).

Слабый фенотип характеризовался небольшим нарушением рядности омматидиев, средний - сильным нарушением рядности (по всему глазному полю), сильный фенотип - нарушение рядности, сопровождающееся гибелью одних клеток и слиянием других.

Таблица 4. Частота нарушений глазных структур при подавлении прямых и обратных структур при температурах развития 25оСи28оС).

Линия	Сильный фенотип Частота (%)	Средний фенотип Частота (%)	Слабый Фенотип Частота (%)	Общее число мух
Температура	25о C	28о C	25о C	28о C	25о C	28о C	25о C	28о C
GMR-Gal4/+ (Контроль)	0	0	0	0	0	0	527	343
GMR>TRIS	0	32,9%	0	67,08%	100%	0	162	79
GMR>Ri13	27%	13,5%	0	33%	72,9%	53,5%	858	200

Глаз плодовой мушки Drosophila melanogaster представляет сложную структуру, образованную особыми структурными единицами - омматидиями, роговичная линза которых имеет вид выпуклого шестигранника - фасетки. В состав такого фасеточного глаза у плодовой мушки входит от 700 до 800 омматидиев с поперечным размером около 15 мкм; размер всего сложного глаза составляет 400 мкм. (Wolff, T., and Ready, D. F., 1993) Омматидии имеют собственный светопреломляющий (диоптрический), светоизолирующий (экранирующий) и светочувствительный (фоторецепторный) аппараты. Кроме зрительной функции, глаз дрозофилы обладает также и осязательной способностью, благодаря наличию механочувствительных щетинок, находящихся по чередующимся вершинам шестиугольников омматидиев и выдающихся на 15-20 мкм над поверхностью глаза (рис.11).

Рисунок 11. Глаз мухи дикого типа. Видны упорядоченные ряды фасеток глаза.

Подавление как прямых, так и обратных транскриптов привело к одинаковому результату. Вследствие чего наблюдался фенотип "грубые глаза" (рис.12), который проявляется нарушением рядности фасеток глаза, а также гибелью, слиянием части фасеток и пигментных клеток глаза. Это свидетельствует о нарушении клеточных делений и поляризации клеток, формирующих глазные структуры.

Рисунок 12. Эффект специфического подавление транскриптов lawc/Trf2 втканяхглаза (нарушениеразвитияглазныхструктур). Слева-глазмухиGMR-Gal4>UAS-TRIS (сильныйфенотип). Справа - глаз мухи GMR-Gal4>UAS-Ri13 (сильный фенотип).

При тканеспецифическом подавлении прямых и обратных транскриптов в тканях антенны, мы использовали драйверную линию y1w; P{GawB}Dll/CyO, в которой белок Gal4 накапливается в глазо-антенных имагинальных дисках, в области антенны.

Для того, чтобы убедиться в том, что драйвер активен и экспрессирует белок GAL4 в нужных тканях, мы сначала проверили работу драйверной конструкции P{GawB}Dll/CyO с помощью репортерной линии UAS-GFP. Для этого мы провели скрещивания мух из драйверной линии и репортерной линии (Схема 7). Затем препарировали личинок полученных в потомстве от этого скрещивания. Препараты просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа. Экспрессия GFP наблюдалась в глазо-антенных дисках в области антенны (Рис.13).



Рисунок 13. Экспрессия GFP в глазо-антенном имагинальном диске, в районе антенны в личинках Dll-Gal4>UAS-GFP.

Таким образом, драйвер P{GawB}Dll/CyO активен, поэтому мы использовали эту линию с двухкомпонентной системой Gal4/UAS, для подавления прямых и обратных транскриптов в глазо-антенном имагинальном диске. Эксперимент проводили при 28о C в условиях наибольшей активности белка Gal4. Скрещивания ставили по схеме 7. Эффект подавления прямых и обратных транскриптов оценивали по морфологии антенны (рис.14).