Исследование системы гомеостаза железа и развития окислительного стресса методами математического моделирования

В постгеномную эру основной задачей системной биологии является исследование принципов организации и функционирования сложных молекулярно-генетических сетей, обеспечивающих формирование фенотипических (молекулярных, биохимических, физиологических, морфологических, поведенческих и др.) характеристик организмов. Развитие высокоэффективных методов молекулярной биологии привело к накоплению огромного числа экспериментальных данных по структурно-функциональной организации генных сетей и их молекулярно-генетических компонент. Анализ этих экспериментальных данных принципиально невозможен без использования современных информационных технологий и эффективных математических методов анализа данных и моделирования биологических систем и процессов. Это необходимо для понимания принципов их организации, молекулярных механизмов функционирования, закономерностей эволюции, оценки влияния мутаций на функцию генных сетей. Таким образом, теоретическое исследование динамики генных сетей методами математического моделирования приобретает в настоящее время фундаментальное и первоочередное значение.

Целью данной работы было исследование системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса у млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание формального описания и математической модели системы клеточного гомеостаза железа.

2. Создание формального описания и математической модели системы, контролирующей гомеостаз железа организма в целом в норме и при развитии окислительного стресса.

3. Изучение с помощью численных методов динамики системы, контролирующей гомеостаз железа и развитие окислительного стресса.

4. Экспериментальное изучение динамики параметров, связанных с развитием окислительного стресса и метаболизмом железа, при развитии асцитной гепатомы Зайделя.

Математическая модель, созданная в ходе данной работы, будет полезна для исследования системы гомеостаза железа у млекопитающих в норме и при патологии, а также процесса доставки лекарств, в частности, в ходе химиотерапии.

1. Обзор литературы

1.1 Роль железа в развитии окислительного стресса

Уникальная способность железа изменять своё состояние окисления и окислительно-восстановительный потенциал в ответ на смену состава окружающих лигандов делает этот металл необходимым почти всем живым существам. Железо легко вступает в одноэлектронные окислительно-восстановительные реакции, переходя при этом между Fe²⁺ и Fe³⁺ состояниями. Железосодержащие белки являются ключевыми компонентами многих биологических процессов, таких как энергетический обмен, транспорт кислорода, репликация и репарация ДНК, нейтрализация активных форм кислорода и многих других, катализируемых ферментами оксигеназами, пероксигеназами и.т.п. Однако те же самые химические свойства железа делают его опасным для организма. Даже малое количество “свободного” железа может катализировать образование высокотоксичных радикалов посредством цикла реакций Фентон/Хабер-Вейса. В присутствии перекиси водорода железо катализирует образование гидроксил радикалов (уравнение 1) - реакция Фентона. Далее окисленный металл может быть восстановлен супероксид радикалом (уравнение 2). Суммарная реакция называется реакцией Хабер-Вейса (уравнение 3). Она может происходить и в отсутствии переходных металлов, но присутствие железа значительно увеличивает скорость реакции [1]. Взаимодействие гидроксил радикала с компонентами клетки может приводить к окислению белков, липидов, липопротеинов, нуклеиновых кислот, углеводов.

Fe²⁺ + H₂O₂ Fe³⁺+ ^-OH + ^*OH (уравнение 1),

Fe³⁺ + O₂^*- Fe²⁺ + O₂ (уравнение 2),

H₂O₂ + O₂^{*- -}OH + ^*OH + O₂ (уравнение 3).

Так как “свободное” железо опасно, но в тоже время жизненно необходимо для организма, существует система, контролирующая его уровень. В нормальном состоянии доля железа, доступного для продукции свободных радикалов, составляет 3-5% от общего количества железа клетки. Эта часть также называется хелатируемым железом (chelatable iron) или лабильным пулом железа(labile iron pool). Лабильный пул железа содержит обе ионные формы железа (Fe²⁺ и Fe³⁺), связанные с низкой аффинностью с лигандами разной природы: цитратом, фосфатом, углеводами и карбоксилатами, нуклеотидами, нуклеозидами, полипептидами и фосфолипидами [2,3].

1.2 Система гомеостаза железа

Клеточный гомеостаз железа опосредуется процессами транспорта железа в клетку, его запасания, внутриклеточного перераспределения и экспорта из клетки в интерстиций и циркуляторное русло. На Рис. 1 представлена схема поддержания клеточного гомеостаза железа.

Рисунок 1. Схема поддержания клеточного гомеостаза железа. Комплекс трансферрина с Fe³⁺ связывается с TfR1 и TfR2 на поверхности клеточной мембраны. Эти комплексы подвергаются эндоцитозу. Кислая среда эндосом приводит к диссоциации Fe³⁺ от трансферрина. Fe³⁺ восстанавливается редуктазой Steap3 перед тем как транспортироваться из эндосом посредством DMT1(divalent metal transporter 1). Рецепторы и их комплексы с трансферрином возвращаются на клеточную мембрану, где могут вступать в новый цикл эндоцитоза. DMT1 также находится на апикальной мембране энтероцитов, где транспортирует в клетку Fe²⁺, восстановленный редуктазой DCYTB. Железо, поступившее в клетку входит во внутриклеточный лабильный пул железа. Белки IRP реагируют на изменение количества железа в этом пуле и регулируют трансляцию мРНК, содержащих IRE в 5'-UTR (H- и L-ферритин, eALAS, m-aconitase, ferroportin), и стабильность мРНК, содержащих IRE в 3'-UTR (TfR1 и DMT1) (взято из [16]).

Потребление железа клетками

Клетки млекопитающих способны получать железо из плазмы крови, где, в нормальном состоянии, большая часть железа находится в комплексе с трансферрином. Большинство клеток способно получать железо из этого комплекса посредством рецептор-индуцируемого эндоцитоза (рецепторы TfR1 и TfR2). Однако, для некоторых типов клеток, таких как гепатоциты, клетки меланомы, характерен дополнительный, трансферрин-независимый путь потребления железа. Гепатоциты способны получать железо из комплекса с ферритином, гем-гемопексином, гемоглобин-гаптоглобином также посредством рецептор-индуцируемого эндоцитоза [4, 5]. Альтернативная система потребления железа, имеющая место в эпителиальных клетках, представлена белком липокалином и его рецептором [6].

Транспорт железа в клетку посредством трансферринового рецептора 1 (TfR1) изучен лучше, чем процессы, связанные с TfR2. Трансферрин - гликопротеид, содержащийся в большом количестве в плазме крови и с высокой аффиностью связывающий две молекулы Fe³⁺. При внеклеточном pH~7.4 холотрансферрин (трансферрин, связанный с двумя молекулами железа) способен быстро связываться с TfR1. Более высокое сродство холотрансферрина к TfR1 приводит к вытеснению апотрансферрина (не связанного с железом трансферрина) из комплекса с рецептором [7]. TfR1 рецептор-индуцируемый эндоцитоз происходит в окаймленных ямках - специальных структурных образованиях на плазматической мембране. Следует заметить, что TfR1 конститутивно концентрируется в окаймленных ямках и подвергается эндоцитозу даже в отсутствие лиганда [8]. Вследствие инвагинации окаймленной ямки внутрь клетки формируется окаймленный пузырек, который быстро теряет клатриновую оболочку и превращается в эндоцитозный пузырек. Он, в свою очередь, сливается с ранними эндосомами, где поддерживается низкий pH за счет работы протонных насосов [9]. Кислая среда вызывает конформационные изменения как в молекуле TfR1, так и в трансферрине, что приводит к диссоциации трехвалентного железа от комплекса. При этом трансферрин остается связанным c рецептором. Далее редуктаза Steap3 восстанавливает Fe³⁺ до Fe²⁺ [10], которое транспортируется из эндосомы в цитоплазму с помощью белка DMT-1. TfR1 в комплексе с апотрансферрином возвращается на плазматическую мембрану, где может вступать в новый цикл эндоцитоза.

Потребление клетками железа из комплекса с трансферрином может также осуществляться посредством рецептора второго типа - TfR2. В то время как известно, что TfR1-зависимый транспорт железа является основным путем доставки его в клетку, роль TfR2 до сих пор изучена слабо. Несмотря на большую гомологию этих рецепторов, TfR2 значительно отличается по своим свойствам и функциям от TfR1. В то время как TfR1 экспрессируется почти во всех тканях организма, экспрессия TfR2 тканеспецифична и происходит в основном в печени и в меньшей степени в селезенке, легких, мышцах и предстательной железе. В отличие от TfR1, рецептор второго типа локализуется на поверхности мембраны не в ямках, окаймленных клатрином, а в кавеолах, образуемых белком кавеолином. Что, по-видимому, и приводит к различиям во внутриклеточной локализации этих рецепторов [8]. TfR2 характеризуется меньшим сродством и меньшей специфичностью по отношению к различным формам трансферрина [11]. Также было показано, что этот путь транспорта не насышается трансферрином, по крайней мере, вплоть до концентрации трансферрина в 2 µM [12]. Недавно было обнаружено, что холотрансферрин стабилизирует TfR2, предотвращая его попадание в лизосомы, где он деградирует. Это привело к формированию гипотезы о том, что рецептор второго типа может играть роль сенсора железа в плазме крови [13, 14, 15]. Более подробно этот процесс будет рассмотрен в разделе 2.2. "Системный гомеостаз железа".

Хотя трансферрин-зависимое потребление железа превалирует в нормальном состоянии, при патологиях, сопровождающихся увеличением концентрации железа, не связанного с трансферрином, возможен другой, трансферрин-независимый путь. Как уже упоминалось выше, железо, не связанное с трансферрином, в плазме крови связано с низкой аффиностью с лигандами различной природы [2,3]. Некоторые клетки, к примеру, гепатоциты, способны получать железо из этих комплексов. Вне зависимости от формы железа, не связанного с трансферрином, на первом этапе происходит связывание с поверхностью клетки, где железо диссоциирует из комплекса с лигандом. Далее может происходить восстановление железа посредством неизвестной на данный момент гипотетической редуктазы. Считается, что доставка восстановленного железа в клетку осуществляется посредством транспортера, природа которого на данный момент не известна, но наиболее вероятными кандидатами являются белки DMT1, ZIP14 и кальциевые каналы [5].

Хранение железа в клетках

Основным местом запасания железа в организме являются клетки печени - гепатоциты. Макрофаги печени, селезенки и костного мозга также депонируют некоторую, но гораздо меньшую часть железа, полученного из фагоцитируемых ими эритроцитов. Большая часть железа печени находится в комплексе с белком ферритином или гемосидерином (примерно 80%), 5% ассоциировано с трансферрином, 2% - с гемом, а оставшаяся часть находится в лабильном пуле железа.

Железо, поступившее в клетку, попадает во внутриклеточный лабильный пул железа, откуда может образовывать комплекс с ферритином, гемом, другими железосодержащими белками или экспортироваться из клетки. железо стресс окислительный гомеостаз

Ферритин - гидрофильная молекула, состоящая из 24 субъединиц, формирующих полую сферу. Внутри этой сферы может разместиться до 4500 атомов железа. Субъединицы ферритина могут быть двух типов: тяжелые и легкие. Соотношение тяжелых и легких субъединиц варьируется в зависимости от типа клеток и физиологического статуса. Тяжелая субъединица ферритина обладает ферроредуктазной активностью. Синтез ферритина индуцируется при высоком уровне внутриклеточного железа и подавляется при нехватке железа. Эта регуляция опосредуется IRE-IRP системой, которая будет описана ниже. Также, синтез ферритина регулируется на уровне транскрипции цитокинами, такими как интерферон-г, интерлейкин 1 и интерлейкин 6. Деградация ферритина и, следовательно, высвобождение железа, помогает мобилизовать железо для нужд клетки. О деградации ферритина известно немного, но в этот процесс вовлечены как протеосомный, так и лизосомный аппарат клетки.

Гемосидерин - нерастворимая в воде молекула, присутствующая в лизосомах, и, по-видимому, являющаяся промежуточным продуктом деградации ферритина. Железо, хранящееся в комплексе с гемосидерином, гораздо менее доступно и менее эффективно в продукции свободных радикалов, чем в комплексе с ферритином.

Экспорт железа из клетки

Некоторые клетки млекопитающих, такие как энтероциты двенадцатиперстной кишки, макрофаги, гепатоциты и клетки центральной нервной системы обладают системой контроля экспорта железа. На данный момент в литературе известен только один экспортер железа - белок ферропортин. Этот транспортер переносит железо через клеточную мембрану в восстановленной форме. В плазме крови железо окисляется различными феррооксидазами прежде чем свяжется с трансферрином. Чаще всего в роли оксидазы выступает церулоплазмин, в случае энтероцитов - гефестин, а в случае астроцитов - гликозилфосфатидилинозитольная форма церулоплазмина, непосредственно взаимодействующая с ферропортином.

Регуляция клеточного гомеостаза железа

Система белков, участвующих в клеточном гомеостазе железа, регулируется на нескольких уровнях: транскрипции генов, стабильности мРНК, трансляции мРНК и посттрансляционной модификации белков.

Посттранскрипционный уровень регуляции наиболее хорошо изучен. Многие мРНК, кодирующие белки, вовлеченные в поддержание гомеостаза железа, содержат в нетранслируемой части последовательности IRE (iron-responsive element).

IRE - консервативные последовательности, образующие шпильки, с которыми взаимодействуют специальные регуляторные белки IRPs (iron regulatory proteins). IRE последовательности располагаются в 5'-нетранслируемых регионах (5'-UTR) мРНК таких белков как тяжелая и лёгкая субъединицы ферритина, ферропортин (FPN), ALAS-E (5-aminolevulinic acid synthase) и митохондриальная аконитаза. Образование IRE/IRP комплекса на 5'-UTR приводит к ингибированию ранних этапов трансляции. IRE также встречаются в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) мРНК таких белков как рецептор трансферрина первого типа (TfR1) и DMT1. Образование IRE/IRP комплекса на 3'-UTR приводит стабилизации мРНК [16, 17].

Всего на данный момент описаны два вида IRP белков: IRP1 и IRP2, которые являются ключевыми сенсорами цитоплазматического железа. При недостатке железа в клетке IRP связываются с IRE, ингибируя трансляцию с участием мРНК, содержащих IRE в 5'-UTR, и стабилизируя мРНК, содержащие IRE в 3'-UTR. Регуляция активности связывания IRP c IRE различна для IRP1 и IRP2. При недостатке железа в клетке IRP1 связывается с IRE с высокой аффиностью, а при повышении уровня железа в IRP1 собирается кластер 4Fe-4S, что приводит к утрате высокой аффинности и приобретению аконитазной активности. Повышение уровня активных форм кислорода приводит к разборке 4Fe-4S кластера, а, следовательно, к включению IRE-связывающей активности IRP1. Фосфорилирование IRP1 регулирует его активность, что является железо-независимым путем контроля [18, 16].

Несмотря на высокую гомологию IRP белков, IRP2 не проявляет аконитазной активности и не способен связывать 4Fe-4S кластер. Активность IRP2 регулируется на посттрансляционном уровне. В отличие от IRP1, IRP2 содержит определенную N-концевую последовательность, являющуюся сенсором железа. Три из пяти цистеинов этой последовательности координируют ион железа, а один из них способен окисляться, формируя дигидроцистеин, что приводит к убиквитинированию и последующей деградации с участием протеосом. N-концевая последовательность может связываться с гемом, индуцируя кислород-зависимое окисление и последующую деградацию IRP2 [19]. Активность IRP2 также регулируется фосфорилированием, что приводит к повышению аффинности связывания с IRE [18, 16].

Важной составляющей регуляции системы, поддерживающей гомеостаз железа, является контроль на уровне транскрипции. Экспрессия генов таких белков, как тяжелая субъединица ферритина, рецептор трансферрина первого типа (TfR1), гепсидин и ферропортин, регулируется цитокинами интерфероном-г, интерлейкином 1 и 6, а также фактором некроза опухоли б (TNFб). Гипоксия также является важным фактором, который способен вносить коррективы в реализацию информации генов TfR1, CP (церулоплазмин), FPN (ферропортин), DCYTB (дуоденальный цитохром В), HAMP (гепсидин), по-видимому, посредством активации индуцируемого гипоксией транскрипционного фактора HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) [17, 5].

Помимо этого, описано несколько посттрансляционных механизмов регуляции белков этой системы. Ферропортин посттрансляционно регулируется гепсидином, который способен индуцировать его вхождение в цитоплазму и деградацию [20]. Рецептор трансферрина второго типа регулируется степенью насыщения трансферрина железом: холотрансферрин ингибирует деградацию TfR2 и, таким образом, повышает стабильность белковой молекулы [21, 22]. Высокий уровень железа резко снижает представленность белка-транспортера железа DMT1 в апикальной мембране энтероцитов и индуцирует его вхождение в цитозольные везикулы [5]. Фосфорилирование рецептора трансферрина первого типа протеин киназой С уменьшает его количество на клеточной мембране [5].

1.2.2 Системный гомеостаз железа

В качестве объекта исследования была выбрана модель развития асцитной гепатомы Зайделя. В экспериментах in vivo использовали крыс-самцов линии Вистар весом 200-220 г. Клетки гепатомы Зайделя трансплантировали в брюшную полость животного путем введения 1 мл ресуспендированых в солевом буфере клеток в концентрации 1•10⁷ кл/мл. Продолжительность жизни животного с трансплантированной опухолью составляла 12-14 суток. При исследовании соотношения параметров про- и антиоксидантных систем плазмы крови и асцита ежесуточно производили декапитацию животных с целью забора образцов асцита и крови.

2.3 Выделение клеток