Исследование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов из недревесного растительного сырья

Стакан с полученным раствором помещают в водяную баню с температурой (47 + 1) и постепенно небольшими порциями добавляют 300 г виннокислого калия-натрия. Перемешивание продолжают при той же температуре до полного растворения реактива.

Раствор охлаждают холодной водой до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят объем до метки дистиллированной водой, при необходимости фильтруют через воронку со стеклянным фильтром.

Приготовленный реактив должен иметь ярко-желтое окрашивание (без красного оттенка).

Срок хранения раствора в темной бутыли при комнатной температуре - не более 6 месяцев.

При необходимости (в случае образования осадка) раствор фильтруют через воронку со стеклянным фильтром [35].

2.3.4 Приготовление 17,5 %-го раствора гидроксида натрия

Навеску гидроокиси натрия 17,5 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, растворяют в фарфоровом стакане в 82,5 см3 свежепрокипячённой дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в бутыль и отстаивают в течение 10…20 суток до полного осаждения карбонатов. Прозрачный раствор по окончании времени отстаивания сливают в другую бутыль, при помощи сифона, не взбалтывая [36].

2.3.5 Приготовление 9,5 %-го раствора гидроксида натрия

Навеску гидроокиси натрия 9,5 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, растворяют в фарфоровом стакане в 90,5 см3 дистиллированной воды. Раствор хранят в полиэтиленовых или стеклянных бутылях [36].

2.4 Методики анализов

2.4.1 Методика определения концентрации редуцирующих веществ в пересчете на глюкозу на спектрофотометре Unico UV-2804

Метод основан на восстановлении редуцирующим сахаром 3,5-динитросалициловой кислоты (желтый цвет) в 3-амино-5-нитросалициловую (желто-оранжевый цвет). Образовавшуюся 3-амино-5-нитросалициловую кислоту определяют спектрофотометрически при длине волны 530 нм.

Все моносахариды (глюкоза, фруктоза, ксилоза, арабиноза, галактоза и др.) и некоторые дисахариды, в том числе целлобиоза, относятся к группе редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, то есть соединений, способных вступать в реакцию восстановления.

Расчет концентрации редуцирующих веществ осуществляется по калибровочному графику.

В случае определения концентрации редуцирующих веществ в пересчете на другой восстанавливающий сахар по нему строится калибровочный график и по этому графику ведется определение концентрации.

Для спектрофотометрического анализа с учетом чувствительности методики определения концентрация восстанавливающих сахаров в растворе должна находится в интервале от 0,2 до 2 г/л. В мерные колбы на 25 см3 пипеткой вносят по 1 см3 испытуемого раствора, при необходимости профильтрованного, и 2 см3 реактива ДНС и быстро перемешивают. Одновременно готовят контрольную пробу. Для этого к 1 см3 дистиллированной воды добавляют 2 см3 реактива ДНС.

Колбы помещают в кипящую водяную баню и кипятят в течение 5 мин с точностью, измеряемой по секундомеру или песочным часам. Колбы охлаждают в холодной воде до комнатной температуры, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность растворов на двухлучевом спектрофотометре UNICO UV - 2804 при длине волны 530 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Рабочая зона калибровочного графика лежит в пределах оптической плотности от 0,15 до 1,5. В случае если оптическая плотность исследуемого раствора меньше 0,15, то берут большее количество раствора, если больше 1,5, то раствор дополнительно разводят. Это учитывают при расчете истинной концентрации исследуемого раствора.

Абсолютная погрешность данного метода составляет 0,01725 г/л. Относительная погрешность 3,45 %.

Сходимость измерений, то есть степень близости друг к другу результатов, полученных при исследовании одного и того же образца в одной и той же лаборатории, в небольшой промежуток времени, на одном и том же аппарате, одним и тем же оператором, с химическими реагентами из одной и той же партии составляет 0,0019 г/л.

2.4.2 Методика определения массовой доли пентозанов

Навеску целлюлозы помещают в круглодонную колбу. Туда же насыпают 20 г хлористого натрия и с помощью мерного цилиндра наливают 100 см3 раствора с массовой долей соляной кислоты 13 %.

Круглодонную колбу помещают в баню с глицерином и присоединяют к установке. При этом уровень глицерина следует поддерживать на 1,5…2,0 см выше уровня жидкости в колбе. В глицериновой бане укрепляют термометр. Установку помещают в вытяжной шкаф.

Сбор дистиллята следует производить в мерный стакан или цилиндр, помещенный для охлаждения в кристаллизаторе с холодной водой.



Рисунок 2 - Установка для определения массовой доли пентозанов

Нагревание глицериновой бани регулируется. Температуру глицерина необходимо поддерживать 164…166 . При этом отгонка дистиллята должна происходить со скоростью 30 см3 в течение 10 мин. После отгонки каждых 30 см3 из капельной воронки в круглодонную колбу приливают по 30 см3 раствора с массовой долей соляной кислоты 13 %.

Отгоняют 225 см3 дистиллята.

После окончания отгонки дистиллят из мерного стакана переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, стакан ополаскивают небольшим количеством раствора с массовой долей соляной кислоты 13 % и объем в колбе доводят до метки раствором той же кислоты.

Колбу закрывают пробкой и содержимое в колбе тщательно перемешивают.

После перемешивания отбирают пипеткой 5 см3 раствора и переносят в колбу вместимостью 100 см3. Туда же пипеткой с помощью резиновой груши вносят 25 см3 раствора орсина, затем колбу закрывают пробкой и содержимое колбы перемешивают и выдерживают в течение 50 мин при (20±0,5) .

Через 50 мин к содержимому в колбе приливают пипеткой 20 см3 этилового спирта. После перемешивания содержимое колбы слегка охлаждают и выдерживают при (20±0,5) в течение 10…15 мин.

Одновременно таким же способом готовят контрольную пробу, в которой анализируемый раствор заменяют 5 см3 раствора с массовой долей соляной кислоты 13 %. Выдерживают контрольную пробу вместе с испытуемыми пробами.

Через 10…15 мин после приготовления растворов определяют их оптическую плотность относительно контрольной пробы на фотоэлектроколориметре с длиной волны 630 нм (красный фильтр).

Предварительный выбор кювет производят в зависимости от величины оптической плотности испытуемой пробы. Номинальная величина оптической плотности должна быть в пределах 0,3…0,5.

Применяют кюветы с толщиной поглощающего света слоя 10, 20 и 50 мм.

По полученной величине оптической плотности, пользуются соответствующим градуировочным графиком, находят массу пентозанов в пробе.

Массовую долю пентозанов в процентах к абсолютно сухой целлюлозе вычисляют по формуле:

(3)

где g - масса пентозанов в пробе, мг;

m - масса навески воздушно-сухой целлюлозы, г;

W - влажность целлюлозы, %

За результат анализа следует принимать среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, округленное до десятых долей процента. Расхождение между параллельными определениями при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 0,2 % при массовой доле пентозанов до 3 % и 0,4 % при массовой доле пентозанов свыше 3 % [33].

2.4.3 Методика определения влажности

Навески сырья не более 3 г помещают в предварительно вымытые, высушенные и взвешенные стеклянные бюксы. Взвешивание навесок в бюксах производят вместе с крышками.

Взвешенные бюксы с навесками открывают и помещают вместе с крышками в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 105…110 , и сушат при этой температуре в течение 2 ч. Вынутые из шкафа бюксы закрывают крышками, ставят на керамическую плитку или металлический лист и охлаждают не менее 5 мин, а затем в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Все взвешивания производят с погрешностью не более 0,0002 г.

Влажность w определяют по формуле:

,(4)

где mвл - масса влаги, г;

mнав - масса навески до высушивания, г;

m - масса навески после высушивания, г.

Масса навески до высушивания определяется по формуле:

,(5)

где mо - масса тигля с навеской, г;

mт - масса тигля, г.

Влажность определяют параллельно в трех навесках. За окончательный результат принимают среднее арифметическое трех параллельных определений в пределах допускаемых расхождений по влажности, которые не должны превышать 0,5 %. Вычисление результатов анализа производят до второго десятичного знака. Окончательные результаты округляют до первого десятичного знака.

Допускается использовать металлические стаканчики с крышкой диаметром 50…60 мм и высотой 30…40 мм, навеску целлюлозы сушить при температуре 130…140 в течение 30 минут, проводить охлаждение в эксикаторе без термометра [36].

В ИПХЭТ СО РАН влажность можно определять с помощью анализатора влажности «МВ 23».

2.4.4 Определение содержания альфа-целлюлозы весовым методом

Из объединенной пробы воздушно-сухой целлюлозы, разрезанной на кусочки размером 10Ч10 мм, берут навеску массой около 3 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в фарфоровый стакан вместимостью 150 см3 и заливают 45 см3 17,5 %-ного раствора NaOH, температура которого (20±0,2) . В отдельной пробе определяют влажность целлюлозы. Раствор гидроксида натрия заливают порциями: вначале приливают 15 см3 и осторожно в течение 2...3 минут размешивают целлюлозу стеклянной палочкой с плоским концом. Затем добавляют остальную часть раствора (30 см3) и еще равномерно и осторожно размешивают в течение 1 мин. Стакан со смесью покрывают часовым стеклом и помещают в термостат с температурой (20±0,2) на 45 мин, считая с начала обработки целлюлозы щелочью.

По истечении этого времени к массе приливают 45 см3 дистиллированной воды (20±0,2) , осторожно перемешивают в течение 1,5 мин и переносят массу на стеклянный фильтр. Целлюлозную массу равномерно распределяют на фильтре и отсасывают фильтрат в приёмную колбу. При фильтровании во избежание потерь волокна фильтрат пропускают дважды через слой волокна. Остаток на фильтре при слабом вакууме промывают в три приема по 25 см3 9,5 %-ным раствором NaOH с температурой (20±0,2) . Каждую новую порцию промывной щелочи прибавляют лишь после полного отсоса предыдущей порции. Общая продолжительность промывки щелочью должна быть 2...3 мин. После отсоса щелочи волокно промывают отдельными порциями дистиллированной воды при температуре 18...20 с промежуточным отсосом. Промывку ведут до нейтральной реакции по фенолфталеину. По окончании промывки отсасывание продолжают до исчезновения капель на кончике воронки при уплотнении палочкой. Промытый остаток (альфа-целлюлозу) пинцетом переносят в предварительно высушенный до постоянной массы бюкс и высушивают в сушильном шкафу при температуре (103±2) в течение 6...7 ч до постоянной массы. По окончании сушки бюкс помещают в эксикатор, охлаждают и взвешивают.

Массовую долю альфа-целлюлозы, % к абсолютно сухой целлюлозе, вычисляют по формуле:

(6)

где m -- масса пустого бюкса, г;

m1 -- масса бюкса с высушенной альфа-целлюлозой, г;

g -- абсолютно сухая навеска целлюлозы, г.

За результат испытания принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, округлённое до 0,1 %. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 0,3 % [37].



2.5 Характеристика ферментных препаратов

В качестве катализаторов были использованы препараты «Брюзайм BGX», «Рапидаза CR» (производитель «Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США) и «ЦеллоЛюкс-А» (производитель ООО ПО «Сиббиофарм», Россия, г. Бердск). Ферментативные активности препарата грибного происхождения «ЦеллоЛюкс-А», препарата «Брюзайм BGX» (продуцент Trichoderma longibrachiatum) и препарата «Рапидаза CR» приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристики ферментных препаратов

Наименование препарата	Параметры обработки	Активность
	температура,	рН
Целлолюкс-А	30-70	3-7	Целлюлазная: 2000±200 ед/г; Ксиланазная: 8000 КС; в-Глюканазная: 1500 в-ГлС;
Брюзайм BGX (грибная гемицеллюлаза)	30-50	3,5-5,5	Ксиланазная: 6500+5 % ед КС/см3; в-Глюканазная: 1450+5 % ед в-ГкС/см3; Целлюлазная: 1500 ед.+5 % ед КМЦ/см3;
Рапидаза ЦР	10-50	3,5-5,8	Высокоэффективный комплекс гемицеллюлазных и пектолитических ферментов

Препарат «Целлолюкс-А» позиционируется на рынке как целлюлаза для расщепления некрахмалистых полисахаридов, «Брюзайм BGX» как гемицеллюлаза, «Рапидаза ЦР» - это пектолитический препарат.



3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Данная работа выполнена в рамках партнерского проекта фундаментальных исследований № 11, выполняемому ИПХЭТ СО РАН совместно с организациями УрО РАН «Химическая, механохимическая и ферментативная деструкция целлюлозосодержащего сырья для получения ценных продуктов».

3.1 Ферментативный гидролиз ЛЦМ в ацетатном буфере и в водной среде

В ИПХЭТ СО РАН ранее проводились работы по изучению ФГ технических целлюлоз в ацетатном буфере и в водной среде с последующим сбраживанием полученных гидролизатов в этанол [38, 39, 40]. Эти исследования носили фундаментальный характер, так как получение технической целлюлозы достаточно дорого.

Для проведения данного опыта гидролизу подвергались следующие образцы: ЛЦМ ПОО № 516, ЛЦМ Мискантуса № 592; ЛЦМ ПОО № 593. Их характеристики представлены в таблице 1. При этом гидролиз каждого образца проводился в ацетатном буфере (рН 4,7) и в водной среде (активная кислотность регулировалась с помощью ортофосфорной кислоты и была в пределах 4,7…4,8 ед. рН). Концентрация субстрата во всех опытах составила 33,3 г/л. В качестве катализаторов использовалась композиция ферментных препаратов «Целлолюкс - А» и «Брюзайм BGX», внесённых в количестве 0,02 г фермента на 1 г субстрата в начале ферментации и через 60 часов. Концентрация редуцирующих веществ определялась спектрофотометрическим способом в пересчёте на глюкозу. Ферментация продолжалась 72 часа при температуре 50 , в инкубаторе «UNIMAX 1010» с частотой перемешивания 170 мин-1.

Зависимости концентрации редуцирующих веществ (РВ) от продолжительности ферментативного гидролиза в ацетатном буфере и в водной среде приведены на рисунке 2, концентрации редуцирующих веществ в зависимости от продолжительности гидролиза, а так же их выход по окончании ферментации - в таблице 3.

Таблица 3 - Концентрация РВ в зависимости от продолжительности гидролиза, а так же их выход по окончании ферментации

Время гидролиза, ч	Концентрация РВ в образцах
	516	592	593
	Водная среда	Ацетатный буфер	Водная среда	Ацетатный буфер	Водная среда	Ацетатный буфер
1	2	3	4	5	6	7
3	2,1	3,1	2,1	2,2	2,8	3,3
12	3,6	6,5	2,8	4,4	4,8	6,4
20	4,2	9,9	2,9	5,6	6,3	9,1
28	4,7	10,9	5,2	6,8	6,6	9,4
36	4,7	11,0	5,5	7,4	6,7	10,9
44	4,9	11,3	5,5	7,6	7,0	12,2
52	5,0	12,8	5,1	7,3	6,2	12,0
60	5,1	13,8	5,0	7,2	7,6	12,5
64	13,8	19,3	9,0	13,3	19,5	19,5
72	18,8	24,2	11,4	19,2	25,1	25,4
Выход РВ, % от массы субстрата	56,5	72,7	34,2	57,7	75,4	76,3



А

Б

Рисунок 2 - Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментативного гидролиза: А - в ацетатном буфере, Б - в водной среде

Таким образом, во всех образцах гидролиз быстрее шёл в ацетатном буфере, несмотря на близкие значения активной кислотности. До вторичного внесения ферментных препаратов, в процессе гидролиза концентрация РВ в ацетатном буфере всех образцов была примерно в два раза выше, чем в водной среде. Однако только в образце № 593 после вторичного добавления ферментных препаратов в водной среде получен выход РВ, аналогичный выходу в ацетатном буфере - 75, 4 и 76,3 % соответственно.

Следовательно, ФГ ЛЦМ возможно проводить в водной среде и получать выход, соответствующий выходу РВ в ацетатном буфере. Использование водной среды позволит получать доброкачественные гидролизаты для дальнейшего сбраживания [41].

3.2 Зависимость ФГ от концентрации субстрата

Целью данной работы является исследование влияние концентрации субстрата на ФГ лигноцеллюлозного материала в водной среде.

Характеристики использованных ЛЦМ М № 592 и ЛЦМ ПОО № 593 представлены в таблице 1. ЛЦМ ПОО характеризуется меньшей массовой долей (МД) целлюлозы и большей МД пентозанов, являющихся более легко гидролизующимся субстратом. МД золы в ЛЦМ ПОО в два раза выше, чем в ЛЦМ М.

Гидролиз проводился в водной среде при активной кислотности 4,6…4,8 ед. рН, которая регулировалась с помощью ортофосфорной кислоты. Опыты проводились при концентрации субстратов 90,0 и 33,3 г/л. В качестве катализаторов использовалась композиция ферментных препаратов «Целлолюкс А» и «Брюзайм BGX», внесённых в количестве 0,02 г / 1 г субстрата в начале ферментации и через 60 ч. Ферментация продолжалась 72 ч при перемешивании на платформе «ПЭ - 6410 М» с частотой 150 мин-1. Температура гидролиза 50 . Концентрация РВ определялась спектрофотометрическим способом в пересчёте на глюкозу.

Концентрации РВ в зависимости от продолжительности ФГ, так же их выход по окончании ферментации представлены в таблице 4. Зависимости концентрации РВ от продолжительности ФГ в водной среде приведены на рисунке 3.

ферментативный гидролиз целлюлоза сырьё



Таблица 4 - Концентрации РВ в зависимости от продолжительности ФГ, так же их выход по окончании ферментации

Продолжительность гидролиза, ч	Концентрация РВ в образцах
	ЛЦМ М № 592	ЛЦМ ПОО № 593
	90 г/л	33,3 г/л	90 г/л	33,3 г/л
3	4,3	2,12	7,69	2,85
12	8,1	2,75	16,7	4,89
20	8,66	2,97	19,8	6,33
28	15,6	5,20	20,9	6,61
36	17,3	5,46	21,3	6,72
44	19,7	5,51	25,8	7,04
52	20,4	5,05	26,5	6,23
60	21	5,02	27,9	7,66
64	21,2	9,04	28,08	19,5
72	27,5	11,4	60,2	25,1
Выход РВ, % от массы субстрата	30,5	34,2	66,9	75,4



А

Б

Рисунок 3 - Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментативного гидролиза ЛЦМ М и ЛЦМ ПОО в водной среде: А - 90 г/л, Б - 33,3 г/л

Из полученных данных следует, что выход для ЛЦМ ПОО с концентраций субстрата 33,3 г/л в 1,12 раз больше, чем у ЛЦМ ПОО с концентрацией субстрата 90 г/л. То есть, повышение концентрации субстрата снижает эффективность процесса гидролиза. Для ЛЦМ М такой закономерности нет, выходы находятся примерно на одном уровне.

Сравнение ферментативного гидролиза ЛЦМ М и ЛЦМ ПОО показывает, что ПОО гидролизуется полнее. Это можно объяснить природой субстрата и физико-химическими характеристиками исходных ЛЦМ. ЛЦМ ПОО представляет собой рыхлую массу, в то время как ЛЦМ М состоит из довольно плотных конгломератов размером до 1 см. Для получения более высокого выхода РВ при работе с ЛЦМ М необходимо отработать способы предварительного измельчения субстратов.

Гидролиз ЛЦМ в водной среде был проведён впервые. Для ЛЦМ ПОО получен неплохой выход РВ. Необходимо продолжить изучение ФГ с целью повышения выхода РВ и получения концентрированных гидролизатов, пригодных для спиртового брожения [42].

3.3 Зависимость эффективности ФГ от условий перемешивания

Целью данной работы являлось исследование влияния перемешивания в ходе ферментативного гидролиза на его эффективность. В качестве сырья для проведения работы использовались ЛЦМ М № 592 и ЛЦМ ПОО № 560. Характеристики данных ЛЦМ представлены в таблице 1.

Гидролиз каждого образца проводился в водной среде при рН 4,6…4,8 ед. рН, это естественный уровень активной кислотности для суспензии данного субстрата. Концентрация субстрата во всех опытах составила 90 г/л. В качестве катализаторов использовалась композиция ферментных препаратов «Целлолюкс - А» и «Брюзайм BGX», внесённых в количестве 0,02 г / 1 г субстрата. Ферментация проводилась при температуре 50  в течение 60 ч. Были исследованы следующие режимы перемешивания:

А) контроль, в статических условиях;

Б) на перемешивающей платформе «ПЭ - 6410 М» с частотой перемешивания 150 мин-1;

В) на инкубаторе «UNIMAX 1010» с частотой перемешивания 170 мин-1.

Концентрация редуцирующих веществ (РВ) определялась спектрофотометрическим способом в пересчёте на глюкозу.

Концентрации РВ в зависимости от продолжительности ФГ, так же их выход по окончании ферментации представлены в таблице 5. Зависимости концентрации РВ от продолжительности ФГ в статических условиях и при перемешивании приведены на рисунке 4.

Таблица 5 - Результаты проведения ферментации

Время гидролиза, ч	Образцы и способы ферментации
	№ 592	№ 593
	А	Перемешка	Инкубатор	А	Перемешка	Инкубатор
3	20,6	4,3	5,4	15,0	7,7	4,7
8	24,5	7,6	7,0	32,9	17,5	7,7
12	24,6	8,1	7,5	35,2	24,8	15,7
20	25,0	12,5	11,1	36,1	26,3	18,4
28	25,0	21,3	13,7	35,9	30,2	23,7
36	25,1	25,3	15,9	35,3	36,3	24,1
44	24,9	26,1	17,5	35,3	40,4	25,0
52	24,8	26,8	19,1	35,3	40,5	25,3
60	24,5	27,8	19,7	36,6	42,1	25,9
Выход РВ, % от массы субстрата	27,2	30,8	21,8	40,6	46,7	28,7



а)

б)

А - контроль, статические условия; Б - частота перемешивания 150 мин-1; В - частота перемешивания 170 мин-1

Рисунок 4 - Зависимости концентрации РВ от продолжительности ферментативного гидролиза в зависимости от частоты перемешивания: а) ЛЦМ М; б) ЛЦМ ПОО

Для обоих видов сырья ферментация в статических условиях обеспечивает более быстрое накопление РВ - уже через 8 часов графики выходят на плато. При этом концентрация РВ в гидролизатах выше, чем при ферментации в условиях перемешивания. Однако это не обеспечивает максимального выхода сахаров. При перемешивании с частотой 150 мин-1 (вариант Б) реакция гидролиза проходит глубже: через 60 ч для ЛЦМ М выход РВ на 3 г/л выше, чем при ферментации в статических условиях, для ЛЦМ ПОО - на 6 г/л. Частота перемешивания 170 мин-1 оказывается избыточной для обоих видов субстрата. При таких условиях концентрация РВ минимальна. Это можно объяснить тем, что лимитирующей стадией ферментативного гидролиза целлюлозы является присоединение фермента к субстрату [1].

Сравнение ферментативного гидролиза ЛЦМ М и ЛЦМ ПОО показывает, что ПОО гидролизуется полнее. Это можно объяснить природой субстрата и физико-химическими характеристиками исходных ЛЦМ. ЛЦМ ПОО характеризуется меньшей МД целлюлозы и большей МД пентозанов, являющихся более легко гидролизующимся субстратом.

В результате проведенной работы можно сделать вывод о целесообразности первые 8 ч проводить ферментацию без перемешивания, а далее с перемешиванием с частотой не более 150 мин-1 [43].

3.4 Зависимость ФГ от сырья для получения ЛЦМ

В данной работе в качестве сырья использованы ЛЦМ М № 592 и ЛЦМ ПОО № 593, полученные в одну стадию методом азотнокислой варки в 4 %-ной азотной кислоте. Характеристика материалов представлена в таблице 1.

Гидролиз проводился в водной среде при активной кислотности 4,6…4,8 ед. рН, которая регулировалась с помощью ортофосфорной кислоты. Концентрация субстратов составила 90 г/л. В качестве катализаторов использовалась композиция ферментных препаратов «Целлолюкс А» и «Брюзайм BGX», внесённых в количестве 0,02 г фермента на 1 г субстрата в начале ферментации и через 60 ч. Ферментация продолжалась 72 ч при перемешивании на платформе «ПЭ - 6410 М» с частотой 150 мин-1. Температура гидролиза 50 . Концентрация РВ определялась спектрофотометрическим способом в пересчёте на глюкозу.

Концентрации РВ в зависимости от продолжительности ФГ, так же их выход по окончании ферментации представлены в таблице 6. Зависимости концентрации РВ от продолжительности ФГ в статических условиях и при перемешивании приведены на рисунке 5.

Таблица 6 - Результаты проведения ферментации

Время гидролиза, ч	Образцы и способы ферментации
	№ 592	№ 593
3	4,3	7,7
8	7,6	17,5
12	8,1	24,8
20	12,5	26,3
28	21,3	30,2
36	25,3	36,3
44	26,1	40,4
52	26,8	40,5
60	27,1	42,1
72	27,8	60,2
Выход РВ, % от массы субстрата	30,6	66,9

Рисунок 5 - Зависимости концентрации РВ от продолжительности ферментативного гидролиза в зависимости от сырья для получения ЛЦМ.

Выход РВ при ферментации ЛЦМ ПОО № 593 (66,9 %) в 2,2 раза больше, чем у ЛЦМ М № 592 (30,6 %). При равных условиях получения субстрата и проведения ферментации это может быть связано, в первую очередь, с природой субстрата, с большей стойкостью к гидролизу целлюлозы мискантуса. Также различия могут быть вызваны физико-химическими характеристиками исходных ЛЦМ: большей МД пентозанов и меньшей МД целлюлозы в ЛЦМ ПОО.

Низкая степень конверсии ЛЦМ в РВ может быть объяснена высокой концентрацией субстратов, что, как известно, может ингибировать процесс осахаривания, а также возможной адсорбцией ферментных препаратов на субстрате в процессе гидролиза и тем самым вывода их из системы [44]. Эта версия подтверждается увеличением скорости осахаривания после вторичного внесения ферментных препаратов через 60 ч гидролиза [45].

3.5 Реакционная способность к ферментации ЛЦМ плодовых оболочек овса разными ферментными препаратами

В данной работе в качестве субстрата использован ЛЦМ ПОО № 593. Характеристика субстрата представлена в таблице 1.

Для гидролиза сложных субстратов необходимо проводить подбор мультиэнзимной композиции, так как именно при совместном использовании ферментные препараты дают наилучший результат.

Целью работы было проведение гидролиза ЛЦМ ПОО различными ферментными препаратами и обоснование выбора рациональной мультиэнзимной композиции. Характеристика ферментных препаратов представлена в таблице 2.

Гидролиз проводился в ацетатном буфере при активной кислотности 4,6…4,8 ед. рН. Концентрация субстрата составила 33,3 г/л. Ферментация проводилась при температуре 50  в течение 72 ч. В качестве катализаторов использовались следующие композиции ферментных препаратов:

А) Целлолюкс - А (0,02 г/1 г субстрата);

Б) Целлолюкс - А и Брюзайм BGX (по 0,02 г/1 г субстрата);

В) Целлолюкс - А, Брюзайм BGX и Рапидаза ЦР (по 0,02 г/1 г субстрата);

Г) Целлолюкс - А (0,02 г/1 г субстрата) и Брюзайм BGX (0,2 г/1 г субстрата).

Повторно ферменты внесены через 62 часа гидролиза в тех же пропорциях.

Концентрация РВ определялась спектрофотометрическим способом в пересчёте на глюкозу.

Концентрации РВ в зависимости от продолжительности ФГ, так же их выход по окончании ферментации представлены в таблице 7. Зависимости концентрации РВ от продолжительности ФГ в статических условиях и при перемешивании приведены на рисунке 6.

Таблица 7 - Результаты проведения ферментации

Продолжительность гидролиза, ч	Обозначение опыта
	А	Б	В	Г
16	5,4	9,3	9,6	11,7
24	2,9	5,9	6,6	9,5
32	3,9	8,2	9,0	12,3
40	10,9	12,8	13,9	18,9
52	10,7	12,7	13,6	19,5
62	14,7	8,9	12,0	16,4
72	12,1	14,0	16,6	25,4
Выход РВ, % от массы субстрата	36,3	42,0	49,8	76,3



Рисунок 6 - Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментативного гидролиза

Наименьшую скорость гидролиза обеспечивает ферментный препарат «Целлолюкс-А» и обеспечивает выход РВ 36,3 %. При совместном использовании препаратов «Целлолюкс-А» и ««Брюзайм BGX» выход РВ повышается на 6 %, а при введении в систему препарата «Рапидаза CR» - ещё на 8 %. Повышение эффективности гидролиза объясняется согласованным действием полиферментной системы препаратов, обеспечивающей увеличение скорости и глубины гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы при совместном действии ферментов, а также эффектом синергизма работы препаратов.

Интересно отметить, что наибольший выход РВ (76,3 %) обеспечивает вариант Г, в котором использовано два ферментных препарата, но при этом концентрация препарата «Брюзайм BGX» повышена в 10 раз по сравнению с вариантом Б. Такая концентрация обеспечивает выход РВ почти в два раза больший, чем в остальных вариантах. Возможно, в процессе гидролиза происходит необратимая адсорбция ферментных препаратов на ЛЦМ ПОО и тем самым вывод их из системы. Эта версия подтверждается увеличением скорости гидролиза для всех вариантов после вторичного внесения ферментных препаратов через 60 ч гидролиза [46].

3.6 Зависимость эффективности ФГ от способа подготовки ЛЦМ

В ходе проведения экспериментальной работы, выход РВ после ферментативного гидролиза был достаточно низок, это может обуславливаться наличием нитросоединений в ЛЦМ, полученном на опытном производстве: растворы окрашивались в интенсивный жёлто-коричневый цвет, а фермент адсорбировался на субстрате.

Для проведения данного опыта использовались ЛЦМ ПОО № 593 и ЛЦМ М № 592, ЛЦМ ПОО № 621, ЛЦМ М № 632. Характеристики данных материалов представлены в таблице 1.

Для начала, два образца (№ 592 и № 593) промыли на магнитной мешалке несколько раз, пока не пропадет желто-коричневая окраска удаляемой воды. Температура нагрева составила 60 . Активная кислотность после промывания составила для № 592 - 4,83 ед. рН, для № 593 - 4,67 ед. рН.

Образцы № 621 и № 632 получены Золотухиным В.Н. в лабораторных условиях, тщательно отмыты им от остатков азотной кислоты и сразу переданы на ферментацию.

Отработаны следующие варианты ферментативного гидролиза:

1) ЛЦМ ПОО № 593 получен на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН;

2) ЛЦМ ПОО № 593 промыт водой до полного удаления окраски;

3) ЛЦМ ПОО № 621, получен в лабораторных условиях;

4) ЛЦМ мискантуса № 592, получен на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН;

5) ЛЦМ мискантуса № 592, промыт водой до полного удаления окраски;

6) ЛЦМ мискантуса № 632, получен в лабораторных условиях.

Химический анализ не отличается между субстратами ЛЦМ мискантуса и ЛЦМ ПОО до и после промывки (№592, №593).

Проводим ферментативный гидролиз в ацетатном буфере. Концентрация субстрата 33,3 г/л. Температура гидролиза 46 . Ферментация проводилась на перемешивающей платформе «ПЭ - 6410 М» с частотой перемешивания 150 мин-1. Ферменты вносили следующим образом: «Целлолюкс - А» - 0,04 г фермента на 1 г субстрата, «Брюзайм» - 0,2 г фермента на 1 г субстрата. Ферменты вносили только в начале гидролиза.

Концентрация РВ определялась спектрофотометрическим способом в пересчёте на глюкозу. Выход РВ (отношение массы РВ к массе субстрата) рассчитан с учетом коэффициента, связанного с присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.

Концентрации РВ в зависимости от продолжительности ФГ, так же их выход по окончании ферментации представлены в таблице 8. Зависимости концентрации РВ от продолжительности ФГ ЛЦМ ПОО и М приведены на рисунке 7.

Таблица 8 - Значение концентрации РВ в процессе гидролиза

Продолжительность гидролиза, ч	ЛЦМ ПОО	ЛЦМ мискантуса
	593	593 после промывки	621	592	592 после промывки	632
8	9,5	9,6	13,8	5,6	11,4	17,1
22	11,7	17,2	22,9	6,9	16,6	22,3
32	12,3	16,9	24,7	7,4	19,0	22,3
48	18,9	19,5	25,9	9,6	19,3	22,6
56	19,5	22,2	26,6	12,5	25,0	28,4
72	19,5	24,8	26,8	13,3	25,2	29,5
Эффективность ферментативного гидролиза
Выход РВ*, % от массы субстрата	52,7	67,0	72,4	35,9	68,1	79,7

*Примечание: Надо учитывать коэффициент 0,9 (162 г целлюлозы ферментируется в 180 г глюкозы). Тогда теоретически, из 33,3 г/л субстрата может образоваться 37 г/л РВ - это 100%

а)

б)

а) лигноцеллюлозный материал ПОО; б) лигноцеллюлозный материал Мискантуса

Рисунок 6 - Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментативного гидролиза

Промывка ЛЦМ от нитросоединений существенно увеличивает эффективность ферментативного гидролиза. У мискантуса выход РВ увеличивается в 1,9 раза, а у ПОО в 1,3 раза. До промывки ЛЦМ М ферментируется хуже, чем ПОО. После промывки - одинаково. Кроме того, лабораторные образцы ЛЦМ М и ЛЦМ ПОО демонстрируют достаточно высокие выходы РВ - 79,7 и 72,4 % соответственно.

Предполагается, что в процессе хранения непромытого ЛЦМ медленно протекают реакции окисления с образованием нитросоединений из нитрозососоединений. Использование свежеподготовленных образцов ЛЦМ даёт высокую эффективность ферментативного гидролиза. Поэтому после химической подготовки сырья к ферментативному гидролизу важно немедленно передавать субстрат на ферментацию.

Ферментация данных материалов будет продолжена с целью дальнейшего сбраживания ЛЦМ для получения биоэтанола.



4. БЕЗОПАСНОСТЬ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ

4.1 Требования охраны труда

При выполнении данной работы использовалось следующее оборудование: электрическая плитка, весы лабораторные, холодильник бытовой, а также стеклянная и фарфоровая посуда. Все оборудование является стандартным, поэтому выполняются общие правила при работе с ним. Все необходимые для работы реактивы использовались в небольших количествах. Кроме того, соблюдались правила при работе с кислотами и щелочами. Сбросы сточных вод проводились в хозяйственно-бытовую канализацию.

Операции с кислотами, щелочами, растворителями, пожаро- и взрывоопасными продуктами, высокими температурами, вакуумом принадлежат к числу опасных и требуют строгого соблюдения правил проведения работ и правил техники безопасности. Нарушение этих правил может привести к тяжелым последствиям: травматизму, пожару, взрыву и т. п. Помещения, где проводятся пожаро- и взрывоопасные работы, должны иметь средства пожаротушения (огнетушитель, песок, асбестовое одеяло, вода и др.). Все сотрудники обязаны выполнять требования должностных инструкций, инструкций по охране труда, правила внутреннего трудового распорядка (начало и окончание рабочего дня, запрещение курения на рабочем месте, распития спиртных напитков).

К работе в химической лаборатории допускаются лица, прошедшие медицинское освидетельствование и инструктаж по технике безопасности в возрасте не младше 18 лет.

Организация работ по технике безопасности в лаборатории и общее руководство возлагается на руководителя дипломной работы, который следит за ведением лабораторного журнала. Студенты должны изучить свойства имеющихся в лаборатории химических веществ и реактивов, используемых для работы. Студенты не должны уходить с рабочего места при проведении анализа с легко кипящими и воспламеняющимися веществами, не оставлять без наблюдения нагревательные приборы. Каждый студент должен заниматься только своей работой.

Запрещается ведение работ без ведома руководителя. Не допускаются к работе с приборами и оборудованием сотрудники, предварительно не ознакомленные с правилами работы на них. Запрещается работа с неисправным оборудованием. Принимать пищу разрешается только в строго определенном месте. Все личные вещи студентов должны находиться в отведенном для этого месте.

На лабораторных столах не должно быть вещей, не относящихся к выполняемой в данный момент работе. Вытяжной шкаф нельзя загромождать предметами, не связанными с выполнением текущей работы. Огнетушители размещают на видных и легкодоступных местах.

В лаборатории запрещается работать с огнеопасными и взрывоопасными веществами при зажженных горелках и включенных электронагревательных приборах. В лаборатории следует работать в халате из хлопчатобумажной ткани, с длинными рукавами. При необходимости использовать средства индивидуальной защиты (перчатки, очки и т. п.) При получении травмы пострадавшему нужно оказать первую медицинскую помощь и обратиться к врачу

По окончании работы в лаборатории проверить, отключены ли приборы от электрической сети. Вымыть посуду, закрыть кран водопровода.

С лицами, вновь принятыми на работу, переведенными из одного подразделения в другое, командированными и практикантами проводится вводный инструктаж заведующим лабораторией с целью ознакомления с общими положениями по безопасности труда и производственной санитарии, с порядком и правилами поведения на территории ИПХЭТ СО РАН. Сотрудники Лаборатории № 8 при посещении огнеопасных производственных подразделений для выполнения работ должны проходить вводный инструктаж у заведующего Лабораторией № 8 или начальника участка экзаменуемого. Одновременно выдается удостоверение на право самостоятельного ведения работ.

В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 по степени воздействия на организм вещества подразделяются на 4 класса опасности:

1 ПДК менее 0,1 мг/м3 - чрезвычайно опасные;

2 ПДК 0,1…1,0 мг/м3 - высокоопасные;

3 ПДК 1,1…10,0 мг/м3 - умеренно опасные;

4 ПДК более 10,0 мг/м3 - малоопасные.

В тех случаях, когда проводится работа с неприменяемыми ранее продуктами, в прописи подробно должны быть указаны токсические свойства этих веществ и правила работы с ними. При проведении вводного и повторного инструктажа необходимо рассматривать требования по обеспечению защиты от статического электричества.

Горючие и взрывоопасные материалы в соответствии с «Правилами защиты от статического электричества» по уровню чувствительности к электрическому разряду

разделяются на 4 группы:

I очень высокая - минимальная энергия воспламенения менее 0,1 мДж;

II высокая - минимальная энергия воспламенения от 0,1 до 5,0 мДж (нитроглицерин);

III средняя - минимальная энергия воспламенения от 5,0 до 20,0 мДж (октоген);

IV низкая - минимальная энергия воспламенения более 20 мДж.

Минимальная энергия воспламенения вещества (чувствительность к электрической искре Wmin) представляет собой наименьшую энергию электрического разряда, достаточного для зажигания данного вещества.

При работе с растворителями, кислотами, щелочами, пожаровзрывоопасными веществами работник обязан знать свойства продуктов; соблюдать правила личной гигиены: работать в х/б халате или костюме, х/б белье, тапочках, перчатках, защитных очках или маске из оргстекла, респираторе. Вся спецодежда, применяемая для защиты работающих, должна соответствовать нормативным документам. В лаборатории каждому работнику необходимо знать меры оказания первой помощи при несчастном случае, изложенные в настоящей инструкции. Во всех случаях после оказания первой помощи необходимо немедленно вызвать врача по телефону 03, сообщить руководителю подразделения и главному специалисту по ОТ и ЭБ; в случае загорания - вызвать пожарную команду по телефону 01. За соблюдение правил техники безопасности, пожарной безопасности и спец. режима ответственность несут заведующий лабораторией, непосредственные руководитель и исполнитель работы. В соответствии с Трудовым кодексом РФ - «Лица, допустившие нарушение правил техники безопасности, пожарной безопасности и охраны труда, привлекаются к строгой дисциплинарной ответственности, а в надлежащих случаях и к уголовной». Каждый сотрудник обязан ежегодно проходить медицинский профилактический осмотр. Посещение лаборатории посторонними лицами регламентируется общим положением о пропускном режиме.

4.2 Требования охраны труда перед началом работы

Организация работы по технике безопасности, пожарной безопасности, промышленной санитарии, охране труда и общее руководство возлагаются на заведующего лабораторией. Работы могут проводить лаборанты, техники, инженеры в соответствии с письменным заданием в рабочем дневнике (для лаборантов и техников). При выполнении задания особое внимание следует обращать на соблюдение правил техники безопасности. В случае возникновения неясностей по выполнению задания необходимо обратиться за разъяснением к руководителю работ. Работа проводится по плану, утвержденному заведующим лабораторией. Перед началом работы руководитель обязан составить и записать в рабочую тетрадь исполнителя (лаборанта, техника) методику проведения опыта с указанием мер по технике безопасности, под которой он должен расписаться. За технически грамотное составление прописи руководитель работы несет полную ответственность. Исполнитель знакомится с заданием под роспись.

При повторном проведении работ в рабочей тетради делается ссылка на пропись, по которой ведется работа и записываются данные опыта. Запрещается проведение работ, не указанных в задании и не предусмотренных соответствующими инструкциями. В каждой комнате должен быть ответственный за соблюдение правил ТБ и ПБ, назначенный заведующим лабораторией. Рабочая комната, все рабочие столы, вытяжные шкафы должны содержаться в чистоте и порядке. В помещении не должно находиться ничего лишнего, захламляющего оборудование. Ежеквартально в каждой комнате должна проводиться генеральная уборка. Работу в комнатах лаборатории разрешается проводить только при наличии исправной приточно-вытяжной вентиляции, исправного оборудования, исправных средств пожаротушения и связи, индивидуальных средств защиты, аптечки первой помощи.

Все операции, сопровождающиеся выделением вредных газов, паров или пожаро- и взрывоопасных веществ, а также все работы с легковоспламеняющимися жидкостями должны проводиться в вытяжных шкафах; створки при работе должны быть закрыты. В случае необходимости створки следует приподнимать не более чем на 20…30 см так, чтобы в шкафу находились только руки. Количество и скорость удаляемого из шкафа воздуха регулируется дроссельной заслонкой в зависимости от плотности загрязненного воздуха. Легкие пары удаляются через прямоугольное отверстие в верхней части шкафа. Тяжелые пары удаляются через щелевое отверстие и канал в задней стенке шкафа. Вентиляция должна включаться за 15 мин до начала работы и отключаться через 15 мин после окончания работы в вытяжном шкафу, причем до полного проветривания помещения запрещается зажигать источники открытого огня и включать электроприборы. Выключатели и штепсельные розетки должны быть расположены вне шкафа. Вести работу в неисправных шкафах запрещается! Гидрозатворы раковин и приемников должны быть в исправном состоянии и постоянно заполнены водой.

Химические отходы должны сливаться в специально предназначенные для этой цели сосуды. Помещать в одну тару несовместимые вещества запрещается! Слив отходов в канализацию запрещается! Хранение веществ в комнате может производиться с учетом их свойств и групп совместимости согласно перечню, подписанному заведующим лабораторией и ответственным за технику безопасности. Запрещается иметь и применять в лаборатории какие-либо реактивы, продукты без соответствующих этикеток и надписей на таре с четким указанием их наименования. Запрещается писать на этикетках названия в виде формул! Обязательно должно быть указано полное общепринятое название вещества или продукта.

Запрещается хранение в вытяжных шкафах огне- и взрывоопасных веществ при проведении опасных работ!

Запрещается оставлять без присмотра работающее оборудование, особенно связанное с нагревом! Стеклянную посуду с кислотами, щелочами, ЛВЖ, ПВОВ и другими веществами разрешается переносить только в специальных переносках, выложенных внутри асбестом. Наличие ЛВЖ и горючих жидкостей в рабочей комнате разрешается в количествах не выше утвержденной нормы.

Исполнитель обязан:

- до начала работы проверить наличие инструкций по охране труда, журнала с заданием; чистоту приборов, приспособлений, рабочего места, посуды; исправность вентиляции, оборудования; наличие и исправность заземления, разрядника, средств пожаротушения;

- содержать в чистоте и порядке рабочую комнату;

- выполнять правила технической и пожарной безопасности;

- включить вентиляцию за 15 мин до начала работы, с началом работы разрешается включать электронагревательные приборы;

- работать в соответствующей спецодежде с использованием защитных средств;

- знать основные свойства веществ, применяемых в работе;

- аккуратно вести записи о проделанной работе в рабочем журнале;

- своевременно сдавать на уничтожение отходы растворителей, нестойких веществ, мусор;

- по окончании той или иной операции выключить электроприборы, воду и т. п.;

- перед началом работы снять с себя заряд статического электричества.

4.3 Требования охраны труда во время работы

1) Правила работы со стеклянной посудой

Стеклянные трубки небольшого диаметра следует ломать только после надреза их напильником или специальным ножом для резки стекла; концы трубок для предохранения от порезов необходимо обернуть полотенцем. Для того, чтобы облегчить вставку стеклянных трубок в резиновые пробки или резиновые трубки, а также надевание резиновых трубок на стеклянные трубки или палочки при сборке приборов, нужно смочить снаружи стеклянную трубку (палочку) и внутренние края трубки или отверстия у пробки водой, глицерином или вазелиновым маслом. Острые края стеклянных трубок нужно оплавить или сгладить напильником. При сборке стеклянных приборов или отдельных частей следует применять эластичные соединения и прокладки. Особенно тщательная защита приборов и стеклянных деталей требуется в местах крепления их на металлических кольцах штативов или в держателях. При вставке стеклянных трубок в просверленную пробку последняя не должна упираться в ладонь, её следует держать за боковую поверхность. Трубку нельзя сильно сжимать и держать ее нужно возможно ближе к вставленному в пробку концу. При вставке пробки в горлышко колбы или другого тонкостенного сосуда следует держать сосуд за горлышко по возможности ближе к месту установки пробки, обернув при этом руку полотенцем. Стеклянную посуду (тонкостенные химические стаканы и колбы) из обычного стекла нельзя нагревать на открытом огне без асбестовой сетки. Такую посуду нужно осторожно ставить на керамическую или цементную поверхность. Стеклянные изделия необходимо оберегать от царапин и следить за тем, чтобы они не лопнули при нагревании. При сборке установки из посуды на шлифах требуется смазывать шлифы вазелином или вакуум-смазкой, вазелиновым маслом.

2) Правила работы с растворителями

Растворители подразделяются на легковоспламеняющиеся жидкости (ЛВЖ), горючие и негорючие. К ЛВЖ относятся такие, у которых температура вспышки в открытом тигле не превышает 61 єC (эфир, ацетон, этанол и т. д.). К горючим относятся вещества с Твсп выше 61 єC (глицерин, диэтиленгликоль, диметилсульфоксид). К негорючим относятся четыреххлористый углерод, хлороформ. Растворители, необходимые для работы в лаборатории, должны храниться в прочных, толстостенных склянках емкостью 1 л, заполненных жидкостями не более чем на 0,8 объема. Хранить растворители в тонкостенной посуде запрещается! Сосуды с растворителями в соответствии с перечнем и допустимой нормой загрузки помещают в металлические заземленные ящики, дно которых застелено асбестом. Ящики с растворителями запрещается располагать на пути выхода из помещения! Запрещается держать огнеопасные жидкости вблизи отопительных и нагревательных приборов и мест, где может быть искрение и открытый огонь!

Отработанные растворители запрещается выливать в канализацию, их необходимо собирать в заземленную металлическую канистру и сдавать на уничтожение методом сжигания! Помещать в одну тару вещества, которые могут реагировать между собой, запрещается! Все работы с огнеопасными жидкостями, а также переливание их разрешается только в вытяжных шкафах при наличии у работника защитных средств и спецодежды (х/б халат, тапочки, резиновые перчатки, защитные очки, маски из оргстекла и т. п.). Запрещается использование одежды из шелковых и шерстяных тканей! Переливание огнеопасных жидкостей при наличии в комнате включенных нагревательных приборов открытого типа или спиртовок запрещается! В отдельных случаях, по разрешению ответственного исполнителя, с горючими нетоксичными растворителями разрешается работать на лабораторном столе. В этом случае также запрещается работать в комнате со спиртовкой, электроприбором с открытым обогревом!

Кипячение, перегонка и нагревание легковоспламеняющихся жидкостей разрешается только на водяной бане или бане с другой безопасной средой, обогреваемой электроплиткой закрытого типа или электронагревателем. Температура бани не должна превышать температуру кипения жидкости более, чем на 20 . Запрещается вести перегонку жидкостей досуха! При вакуумной разгонке легковоспламеняющихся и горючих жидкостей выключение подогрева производят при температуре жидкости в бане не менее, чем на 50 ниже температуры ее воспламенения. Для предотвращения кипения с толчками, бурного вскипания и выбросов следует применять «кипелки» (запаянные с одного конца капилляры, стеклянную вату и другие пористые материалы). Вводить «кипелки» или другие пористые материалы разрешается только в холодную жидкость.

При случайном проливе огнеопасной жидкости и обнаружении утечки паров их из приборов необходимо выключить все электронагревательные приборы, хорошо проветрить помещение, собрать пролитый растворитель ветошью (если необходимо в противогазе) и только после полного проветривания помещения по разрешению руководителя работы можно вновь включить приборы и возобновить работу. Ветошь упаковать в парафиновую бумагу и в полиэтиленовую пленку и сдать на уничтожение.

Запрещается хранить огнеопасные жидкости вместе с неорганическими кислотами и различными окислителями. В случае использования осушителей для сушки растворителей необходимо на этикетке указать наименование растворителя и осушителя. При работе с органическими растворителями необходимо следить, чтобы они не попали на одежду или халат. Пропитанная растворителем одежда при воспламенении за несколько секунд может вызвать тяжелые и даже смертельные ожоги. Запрещается использовать огнеопасные жидкости не по прямому назначению: для мытья полов, стирки, чистки одежды и др. Общий запас хранящихся в каждом рабочем помещении огнеопасных жидкостей не должен превышать сменную потребность. При выполнении работ с большим количеством огнеопасных жидкостей надлежит получить письменное разрешение руководства, согласованное с пожарной охраной. Огнеопасные вещества могут находиться на рабочем месте лишь в количествах, нужных непосредственно для работы.

При загорании растворителей пламя следует гасить:

- при загорании жидкостей, смешивающихся с водой (спирт, ацетон), огнетушителем, водой, песком, асбестовым одеялом;

- при загорании жидкостей, не смешивающихся с водой, огнетушителем, песком, асбестовым одеялом, начиная с периферии. Запрещается применять воду.

ЛВЖ чувствительны к электрической искре, поэтому необходимо соблюдать меры защиты от статического электричества.

При работе с ЛВЖ и горючими жидкостями запрещается:

- загромождать рабочие столы и вытяжные шкафы посудой с ЛВЖ и ГЖ;

- держать ЛВЖ и ГЖ вблизи нагревательных приборов;

- допускать разлив и разбрызгивание ЛВЖ и ГЖ;

- выливать в канализацию остатки растворителей;

- производить нагревание ЛВЖ и ГЖ непосредственно на огне; нагревание можно производить только на водяной бане, песчаной бане или на банях с какой-либо другой безопасной жидкостью.

Перед началом работы с растворителями необходимо ознакомиться с их свойствами и правилами обращения. Метиловый спирт, дихлорэтан, бензол являются сильнодействующими ядовитыми веществами (СДЯВ).

На этикетках должны быть отличительные знаки безопасности. СДЯВ, необходимые для текущей работы, нужно ежедневно по окончании рабочего дня сдавать ответственному лицу и хранить в запертом и опечатанном шкафу. Применение их допускается лишь в тех производственных процессах, где они не могут быть заменены другими, менее токсичными веществами.

Ацетон.

бесцветная легковоспламеняющаяся жидкость, смешивается с водой и органическими растворителями, Ткип = 56,2 , Твсп = -18 . Взрывоопасные концентрации в смеси с воздухом (2,55…12,8) %. Наркотик, последовательно поражающий все отделы центральной нервной системы. При вдыхании в течение длительного времени накапливается в организме. Медленное выделение из организма увеличивает возможность хронического отравления. Рекомендуется применение различных мазей или «биологических перчаток» (как в случае толуола, ксилола). ПДК - 200 мг/м3.

Изопропиловый спирт.

бесцветная легковоспламеняющаяся жидкость с Ткип = 82,4 ,
Твсп = 22,5 , смешивается с водой, этиловым спиртом, бензолом. Может раздражать слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей, пары могут повредить сетчатку глаза и зрительный нерв. Наблюдались случаи смертельного отравления при приеме внутрь более 400 мл. При отравлении необходимы свежий воздух, покой, согревания, сердечно-сосудистые средства, ингаляции кислорода. ПДК - 10 мг/м3.