Стабильность антигенов, экспрессируемых в растениях, проверялась многими исследователями. Так, растения клевера, синтезирующие лейкотоксин Lkt-50 из Mannheimia haemolytica, сшитый с зеленым флуоресцентным белком GFP, были высушены при комнатной температуре и обычной влажности в течение 1-4 суток. Через 3 суток исходный вес листьев уменьшился на 80%, однако не было заметной деградации лейкотоксина и потери его иммуногенности. Исследователи пришли к выводу, что сшитый белок не требует низкой температуры для хранения. Подробный анализ стабильности антигена HBsAg был предпринят Смитом с соавторами. Определение количества HBsAg сильно зависело от концентрации детергента тритон Х-100 в экстракционном буфере. Добавление аскорбата натрия в концентрации 1-20% w/v повышало уровень антигена, реагирующего с моноклональными антителами, в 4-10 раз. Оптимальная концентрация детергента в буфере позволяла хранить выделенный из растений HBsAg до месяца без потери активности. Протеолиз антигена удалось предотвратить добавлением обезжиренного молока, в этом случае антиген мохно было хранить до двух месяцев. Эти исследования показали способ повышения иммуногенности и стабильности антигенов, синтезируемых трансгенными растениями. Лиофилизированные и измельченные в пудру клубни картофеля, синтезирующего белок VP60 вируса кроличьей геморрагической болезни, сохраняли его высокую иммуногенность после нескольких месяцев хранения.

Таким образом, можно с уверенностью заключить, что трансгенные растения имеют все перспективы стать безопасными и экономически выгодными системами для получения разнообразных биологически активных веществ для фармакологии [5]

В настоящее время для производства гетерологичных белков используют бактерии, грибы, клеточные культуры насекомых и млекопитающих, трансгенные животные и растения. Во многих системах уровень экспрессии эукариотических белков нативной структуры ограничен неспособностью к формированию дисульфидных связей, а также отсутствием у прокариотических организмов энзиматических систем постсинтетической модификации. Другой причиной, лимитирующей использование многих систем экспрессии, является высокая стоимость производства из-за использования трудоемких методов выращивания, многокомпонентных стерильных питательных сред. При использовании культур клеток млекопитающих или трансгенных животных возможно присутствие в конечном белковом продукте патогенных вирусов и прионов.

В связи с вышесказанным, трансгенные растения имеют большой технологический потенциал для высокоэффективного производства безопасных гетерологичных белков в промышленном масштабе. Растения обладают рядом важных преимуществ, поскольку наращивание растительной биомассы при применении разработанных агротехнических приемов является достаточно простым и недорогим процессом, требующим небольших энергетических затрат. Кроме того, растительные объекты обладают необходимыми механизмами энзиматической постсинтетической модификации эукариотических белков. При использовании растений в качестве продуцентов отсутствует вероятность их заражения патогенными вирусами млекопитающих. Получение трансгенных растений с тканеспецифической экспрессией позволяет упростить процесс выделения и очистки белков, либо вовсе его исключить при синтезе рекомбинантных белков в составе съедобных вакцинных препаратов [6].

Получение коммерческих количеств фармакологически ценных белков человека является одним из перспективнейших направлений современной биотехнологии. Основными системами для наработки белков являются бактерии, дрожжи, растения и животные. По оценке американских экспертов, рынок белковых лекарственных препаратов животного происхождения к 2013 году достигнет 18,6 миллиардов долларов. Уже сейчас первые препараты поступили в клинику, а несколько десятков белков находятся на разных стадиях доклинических испытаний [7].

В середине 80-х годов на Европу обрушился вал дешевого мяса из США. Мясо получалось дешевым, т.к. американские фермеры кормили своих животных различными гормонами повышающими рост биомассы животного. Позже выяснилось, что дети, потребляющие такое мясо, росли быстрее, но при этом набирали лишний вес. Разразился скандал. Ученые пришли к выводу, что надо не вводить гормоны роста, а сделать так, чтобы животное их само синтезировало.

Схематично это выглядит так. В лаборатории конструируется молекула, содержащая в себе ген, ответственный за синтез нужного гормона. Затем эта конструкция интегрируется в генный аппарат животного, организм которого под воздействием своих собственных управляющих элементов, так называемых промоторов, начинает синтезировать внутри себя эти самые гормоны. Это могут быть гормоны роста, могут быть инсулиноподобные факторы роста, могут быть гормоны, обладающие другими функциями.

Помимо синтеза гормонов роста (для быстрого набора массы у мясных пород) в организме животного можно увеличить синтез некоторых других веществ, содержащихся, например, в молоке. В Великобритании существует стадо коров, молоко которых идеально подходит для приготовления сыра чеддер.

Особо актуальным является создание животных способных продуцировать несвойственные их виду белки. Так, например, сообщалось о разработках направленных на получение свиней, способных продуцировать интерферон человека, потребности в котором в современной медицине достаточно велики. Другим примером являются коровы, способные продуцировать молоко с лактоферрином (не входящим в состав обычного коровьего молока), использующегося при искусственном вскармливании младенцев.

Например, в подмосковных Горках живет стадо трансгенных овец. Эти животные, которым был "подсажен" ген от быка, продуцируют с молоком химозин крупного рогатого скота - фермент, необходимый для производства твердого сыра. По старой технологии химозин получали из экстрактов ткани желудка новорожденных телят. Теперь их жизнь сохранена. Только от одной овцы за одну лактацию можно получить до 30 г фермента, которого хватит для того, чтобы осадить казеин в 300,000 кг молока и получить 30 т сыра.

Так же есть наработки по пересадке гена, кодирующего белок лактоферрин. Этот белок в природе присутствует только в человеческом молоке, он важен для фармацевтической промышленности(в основном применяется при искусственном вскармливании младенцев), и, следовательно, достаточно дорог и получение больших количеств препарата нереально из-за дефицита сырья. Производство же лактоферрина из молока трансгенных животных снимет эти проблемы.

Приведенные примеры отражают основное направление развития технологии получения трансгенных животных в качестве живых "фабрик" по производству биологических активных веществ (в основном белков), находящих широкое применение в различных областях промышленного производства и медицины [8].

Трансгенные животные, продуцирующие биологически активные вещества медицинского и технологического назначения

На первом этапе практического применения молекулярной генетики были созданы рекомбинантные микроорганизмы, а позднее трансгенные клеточные линии млекопитающих, которые выращивались в системах биореакторов и были способны производить белки, закодированные экзогенными (чужеродными) генами. Эти системы были успешно использованы в получении ценных продуктов фармакологического и медицинского назначения, таких как инсулин, некоторые кровесвёртывающие факторы, человеческий гормон роста и др.

По сравнению с трансгенными животными, как продуцентами ценных биологически активных белков, микроорганизмы и клеточные системы имеют следующие недостатки:

1. Выход белка из культуральных клеток более низкий.

2. Процесс выращивания клеток приводит к изменению структуры протеинов и, как следствие, к снижению их биологической активности.

3. Создание данных клеточных культур в промышленных реакторах, является сложной и дорогой процедурой.

Преимущества трансгенных животных: 1. Животные лишь в начале могут быть трудно создаваемыми и дорогими, но однажды созданная линия таких особей воспроизведёт себе подобных. 2. Они могут продуцировать чрезвычайно большое количество белков с низкой стоимостью. Поэтому наибольший прогресс, в создании трансгенных биореакторов, достигнут в целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы и производстве белков с молоком. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина, в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной железы.

3. Выделение рекомбинантного белка с молоком, с одной стороны, удобный приём его получения от животного с применением естественного приёма традиционного доения, а с другой стороны, безопасен для животного.

4. Одним из основных этапов в получении трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является идентификация промотора, который будет направлять экспрессию в секреторный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены промоторы аS1-казеина, Я-казеина, б-лактольбумина; Я-лактоглобулина и сывороточного кислого протеина (WAP).

Использование молочной железы для производства чужеродных протеинов обосновывается её огромной синтетической белковой продуктивностью. Общая концентрация эндогенных молочных белков в зависимости от вида животных составляет 2-10% т. е. на уровне 20-100 г на 1 л. Этого достаточно длякоммерческого производства фармацевтически важных белков.

Таблица 3. Содержание белка в молоке разных видов животных

Среди рекомбинантных белков, полученных из молока трансгенных животных, известны следующие:

- человеческий белок С;

- альфа -1- антитрипсин;

- химозин.

Получение этих белков достигло такой стадии, которая представляет коммерческий интерес. В 2006 году разрешено производство и реализация на фармацевтическом рынке сентритромбина, полученного из молока трансгенных коз (фирма «GTC Терапевтик»).

Одним из основных преимуществ трансгенной технологии, является её высокая экономическая эффективность. Потребность мирового рынка в рекомбинантных белках в 2000 году оценивалась в 13 млрд. долларов, а рынок антител в настоящее время составляет более 1 млрд. долларов. Производством белков фармакологического назначения с помощью трансгенных животных занимаются более 20 фирм во всём мире. Если стоимость 1 г рекомбинантного белка в культуре клеток биореактора колеблется в пределах 100-1000 долларов в зависимости от выхода белка и мощности биореактора, то затраты на его производство с молоком сельскохозяйственных животных составляет 40-50 долларов.

Другим преимуществом этой технологии является высокая производственная ёмкость молочной железы трансгенных животных.

Если принять во внимание, что концентрация рекомбинантного белка в молоке будет, по меньшей мере, 1 мг/мл, то можно подсчитать число животных, необходимых для обеспечения количества того или иного фармацевтического белка.

Таблица 4. Количество трансгенных животных, необходимых для обеспечения мирового рынка отдельными фармацевтическими белками

Из данных таблицы можно сделать вывод, что шести коз и двух коров достаточно, чтобы обеспечить годовую потребность мирового рынка с белке С, тогда как для такого же его производства потребуется 5 млн. литров донорской крови. При этом надо учесть, что использование трансгенных животных позволяет избежать переноса вирусной инфекции.
Группа учёных в Эдинбурге (Великобритания) в 1992г. получила трансгенных овец с человеческим геном альфа-1-антитрипсина и бета глобулиновым промотором. У четырёх овец содержание этого белка составляло более 1 г/ л, а одна овца сначала продуцировала 60 г/л, а затем стабилизировалась на 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. Все овцы здоровы и не имеют каких-либо нарушений лактации. При таком уровне может быть получено более 10 кг белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы лёгких.

Активно проводится работа по созданию трансгенных животных с целью получения от них белков молока обладающих целебными свойствами. Уже созданы в США, Австралии, Японии и Беларуси трансгенные коровы, свиньи, козы продуцирующие лекарственные вещества против: инфекционных заболеваний, тромбоза, гемофилии, малярии, диабета и др.

Группа учёных в Москве (Л. Эрнст, Г. Брем, М. Прокофьев, И. Гольдман, 2004 г) впервые получила трансгенных овец с геном химозина, которые продуцируют с молоком в среднем 200-300 мг фермента химозина в 1 л молока. Этот источник получения химозина может заменить традиционный способ его получения из сычугов молочных телят и ягнят, но его стоимость в 10 раз ниже.

Испытан новый американский препарат - антитромбин, полученный из молока трансгенных животных. Считается, что он является лучшим и произвел революцию в излечении людей от инфарктов.

Созданы трансгенные коровы и козы, в молоке которых содержится человеческий альбумин, способствующий снижению кровяного давления.
В Канаде от выдающейся трансгенной козы получают белки человека на сумму 20 000 долларов ежедневно [9].

Заключение

Генноинженерная биотехнология делает свои первые успешные практические шаги. Уже сейчас проявляется тенденция ее разделения на несколько специализированных направлений.

В настоящее время описано получение многих видов трансгенных растений, синтезирующих белки, ценные для фармакологии и медицины. Эти виды включают как лабораторные модельные растения (табак, арабидопсис), так и традиционные сельскохозяйственные культуры: злаковые (рис, пшеница, кукуруза) и плодово-овощные культуры (томаты, бананы, картофель). По-видимому, в ближайшем будущем будут разработаны различные специализированные системы продукции белков фармацевтического назначения: «растение (орган, ткань) - ген целевого белка - регуляторные элементы генетической экспрессии». Для биосинтеза низкомолекулярных биологически активных вешеств выбор растений-продуцентов будет определяться присутствием и количественным содержанием конкретных вторичных метаболитов - субстратов для проведения целевой энзиматической реакции. Выбор растения-продуцента биологически активных веществ фармацевтического назначения будет определяться и такими требованиями как экономичность, затраты на культивирование растений и их хранение, легкость выделения из них целевых белков.

Список литературы

1. http://meduniver.com/Medical/Microbiology/131.html

2. http://www.biotechnolog.ru/ интерактивный учебник по биотехнологии (Кузьмина Н.А. Омский государственный педагогический университет

3. http://www.bioplaneta.ru/research/ecology/deodorization.php

4. Gleba, Y. Y.; Giritch, A. Plant Viral Vectors for Protein Expression // Recent Advances in Plant Virology. -- Caister Academic Press, 2011.

5. «Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии» 2006. № 2. С. 3-12 Е.Б. Рукавцова, Я.И. Бурьянов, Н.Я. Шульга, В.А. Быков

6. http://www.dissercat.com/content/sintez-v-rasteniyakh-poverkhnostnogo-antigena-virusa-gepatita-b-povyshenie-biologicheskoi-be#ixzz2iNfWdAGX

7. http://pharmapractice.ru/5155

8. http://www.rusbiotech.ru/novice/zvery_chto.php

9. http://ggau.by/moodle/mod/resource/view.php?id=6074

Размещено на Allbest.ru