Исследование роста микромицетов на различных субстратах

ВВЕДЕНИЕ

Микроскопические грибы значительно различаются способностью усваивать разные соединения углерода и синтезировать из них составные части клетки. Некоторые виды могут использовать для питания разнообразные соединения. С другой стороны, известно множество различных специализированных типов микромицетов, которые нуждаются в специфических соединениях. Нефть, газообразные углеводороды, парафин, воск, резины, гудрон, капрон и многие другие синтетические материалы, а также пестициды после попадания в почву начинают разлагаться плесневыми грибами и бактериями. Практически не существует органических соединений, которые не усваивались бы микроорганизмами.

Роль грибов в экологических системах велика и разнообразна. В трофических цепях они являются консументами, вторичными или третичными, но в основном выполняют функции редуцентов, минерализуют органические вещества растительного и животного происхождения. Мощные фотосинтетические системы в биосфере компенсированы столь же мощными и многообразными гидролитическими системами (ферментами) микробного мира. Микроскопические грибы являются важнейшими компонентами этой каталитической системы, способной трансформировать практически все природные органические соединения. Возможность использовать в качестве единственного источника углерода природные биополимеры определяется способностью грибов синтезировать соответствующие гидролитические экзоферменты, расщепляющие нерастворимые полимеры до мономеров, способных проникать в клетку.

Разнообразная группа органотрофных организмов, грибов и бактерий, осуществляющих деструкционную ветвь в цикле углерода, характеризуется кооперативными отношениями, при которых грибы-редуценты включаются в процесс после того, как легко разлагаемые органические вещества уже использованы бактериями (Домарадский, 2007).

Любое органическое вещество вначале расщепляется до более простых соединений, а последние вовлекаются в тот или иной биосинтетический процесс. Возникающая при расщеплении энергия накапливается в АТФ или в других соединениях, имеющих макроэргические связи. Таким образом, органические субстраты обеспечивают как энергетическую, так и конструктивную стороны обмена плесневых грибов и бактерий. Следовательно, вопрос об углеродном питании и о влиянии источников углерода на развитие микроорганизмов является очень существенным при проведении любых микробиологических экспериментов (Лилли, 1957).

Целью данной работы является изучение особенностей использования чистыми культурами микромицетов различных источников углерода.

В соответствии с поставленной целью задачами исследования является определение у коллекционных штаммов микроскопических грибов:

1) способности использовать модельные источники углерода (сахара, многоатомные спирты, крахмал, целлюлозу);

2) способности к росту на природных субстратах (растительный опад, камыш, сено, опилки, кора) по радиальной скорости роста;

3) способности к ассимиляции природных субстратов (растительный опад, камыш, сено, опилки, кора) на основе метода проращивания грибных зачатков во влажной камере.

Практическая значимость работы заключается в том, что в работе изучены биохимические особенности 10 штаммов коллекционных микромицетов. Полученные данные могут служить основой составления паспортов штаммов.

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОНИШ

1.1 Влияние экологических условий на рост микромицетов

1.1.1 Сравнительный анализ скорости радиального роста микромицетов, выделенных из различных экотопов

На сегодня экологические проблемы становятся не менее актуальными, чем запросы микробиологической промышленности (Кочкина, 1978; Великанов, 1983; Жданова, 1982-2000; Паников, 1991). Надежды на их решение связывают с так называемым системным подходом, который предполагает использование количественной информации о природных объектах (Паников, 1991). Здесь чрезвычайно остро ощущается недостаток знаний в отношении почвенных микроорганизмов (Гильманов, 1983; Parton, 1988), и большая часть дефицита информации относится именно к вопросам роста микробных популяций (Паников, 1991). Этот недостаток обусловлен тем, что фундаментальные основы и принципы микробиологических исследований вырабатывались в отрыве от решения экологических задач. По данным ряда авторов (Кочкина, 1978; Паников, 1991), экологически наиболее корректно выращивание грибных колоний на агаризованных средах, так как пространственно-неоднородный рост микроскопических грибов наиболее приближен к их росту в природных условиях.

Таким образом, изучение ростовых процессов способствует описанию многообразия адаптивных поведенческих реакций у микроорганизмов в изменяющихся условиях среды (что важно для экологии) (Паников, 1991).

Известно, что под действием неблагоприятных факторов, в том числе и радиационного загрязнения, у организмов происходят глубокие изменения, которые проявляются на морфологическом, физиологическом и биохимическом уровнях. В то же время такой физиологический показатель, как скорость роста, является достаточно консервативным для каждого вида микромицетов (Кочкина, 1978).

В работах последних лет было показано, что при длительном существовании микромицетов на высокорадиоактивных субстратах радиальная скорость роста некоторых видов существенно изменяется (Жданова, 2000; Вембер, 2001). Для того чтобы проанализировать, у каких именно видов происходят подобные изменения (в зависимости от их систематического положения и морфологических особенностей), Блажеевской с соавторами проведено сравнительное изучение радиальной скорости роста у различных видов микромицетов. Часть штаммов каждого из видов была представлена грибами, выделенными из радиоактивно загрязненных местообитаний, а другая часть - из радиоактивно чистых экотопов (Блажеевская, 2002).

Скорости роста изученных штаммов грибов оценивали с учетом места их выделения и характера среды культивирования.

По скорости радиального роста все изученные виды можно условно разделить на три основные группы: 1) виды с наивысшей скоростью роста - Ulocladium consortiale и Alternaria alternatа; 2) вид Cladosporium sphaerospermum, скорость роста которого была наиболее низкой; 3) остальные изученные виды занимали промежуточное положение по этому параметру (Блажеевская, 2002).

Большое значение заслуживает характер ритмических колебаний роста изученных культур. Биологические ритмы присущи всем уровням живой материи - от молекулярных и субклеточных структур до биосферы, что обеспечивает единство живой и неживой природы. Все они отражают процессы регулирования функций организма (Романов, 1980).

Биохимический механизм циркадных ритмов связывают с обменом нуклеиновых кислот (Шаркова, 1971). Имеющиеся данные указывают на то, что с усилением ритма инициируется обмен РНК. Биоритмы митоспоровых грибов отражают неограниченно восстанавливаемый адаптивный онтогенез, формирующийся на основе сигналов окружающей среды, генетический механизм которого базируется на высокой способности грибов к формированию многоядерности и ядерного дуализма (Беккер, 1983).

Характер и продолжительность ростовых ритмов, так же как и радиальная скорость роста, зависят от систематического положения гриба, его возраста (возраста культуры), концентрации в среде основных источников питания и энергии, а также других экологических факторов (Романов, 1980; Бухало, 1988). Ритмы грибов варьируют от 4 - 5 часов до 7 - 9 суток, нескольких недель и даже лет (Шаркова, 1971).

Блажеевской Ю. В. было показано, что штаммы с замедленной ритмичностью (>1-суточных) выделены из наиболее радиоактивно загрязненных местообитаний. Кроме того, среди штаммов с наибольшей продолжительностью биоритмов (1 - 2-суточные) преобладали штаммы с невысокой скоростью роста. В подавляющем большинстве случаев изученные виды примерно одинаково росли на голодной среде и сусло-агаре. В чистых и загрязненных почвах нет заметной разницы между количеством видов, предпочитающих богатую среду, и количеством видов, одинаково растущих на обеих средах. Замедление ростовых процессов отмечено только у штаммов, долгое время существовавших на субстратах с высоким уровнем радиоактивного загрязнения. Подобное замедление скорости роста может свидетельствовать об адаптивной перестройке метаболических процессов у штаммов, длительное время растущих на высокорадиоактивных субстратах (Блажеевская, 2002).

1.1.2 Особенности роста микроскопических грибов в стандартных условиях культивирования

А. Е. Ивановой (1999) было исследовано формирование микроколоний из двух типов колониеобразующих единиц (при размножении спорами и фрагментами мицелия) в стандартных для почвенно-микробиологических анализов условиях - на среде Чапека при 25 ^_С после взбалтывания на качалке.

Было установлено, что в зависимости от вида гриба и типа КОЕ наличие и величина лаг-фазы могут различаться. Так, у гриба Mucor hiemalis длительность лаг-фазы при росте мицелия из фрагментов гиф разной длины была меньше, чем при росте из спор. А при росте мицелия из фрагментов гиф Alternaria alternatа и Penicillium spinulosum лаг-фаза в данных условиях вовсе не наблюдалось. В то же время при прорастании спор A. alternatа лаг-фаза тоже не отмечена, а прорастание спор P. spinulosum наступало лишь через определенный интервал времени.

Длительность экспоненциальной фазы была короче при развитии грибных микроколоний из фрагментов мицелия, чем из спор. Чем больше была начальная величина растущих фрагментов, тем короче были сроки прохождения экспоненциональной фазы роста. Удельная скорость роста в экспоненциональной фазе при развитии мицелия из фрагментов гиф M. hiemalis и P. spinulosum была меньше, чем при развитии из спор. Для этих видов характерны мелкие споры, а фрагменты имеют в несколько раз больший первоначальный объем гиф. При формировании микроколоний A. alternatа скорости экспоненциального роста мицелия из разных КОЕ существенно не отличались, возможно, благодаря малой разнице в размерах конидий A. alternatа (d=10-30 мкм) и жизнеспособных мелких фрагментов.

Ветвление мицелия, растущего из разных КОЕ, на первых этапах формирования грибных микроколоний также может отличаться. В экспоненциальной фазе роста в микроколониях, растущих из спор, единица гифального роста (ЕГР) часто была выше (то есть ветвление реже), чем в микроколониях, растущих из фрагментов гиф.

Линейный рост при развитии колоний из фрагментов гиф наступал раньше. Далее в этой фазе скорости мицелия из фрагментов гиф и спор грибов не различались; величина ЕГР стабилизировалась и не зависела от типа исходных КОЕ. То есть, в линейной фазе роста все различия между микроколониями, сформированными из разных КОЕ, нивелировались (Иванова, 1999).

1.1.3 Влияние экологических условий на жизнеспособность мицелия микроскопических грибов

При определении жизнеспособности грибного мицелия разной длины в различных экологических условиях среды, установлено, что увеличение концентрации органического вещества (сахарозы) в интервале 0-20 г/л было благоприятно для фрагментов Mucor hiemalis, способность к росту у которых возрастала (Иванова, 1999). Высокая концентрация сахарозы (100 г/л), наоборот, подавляла рост крупных фрагментов M. hiemalis. Число жизнеспособных фрагментов мицелия разной длины Penicillium spinulosum больше при низких концентрациях сахарозы, а ее высокое содержание подавляет рост мелких (30-60 мкм) фрагментов. При высоком содержании сахарозы увеличивается доля растущих после взбалтывания на качалке коротких фрагментов (20-100 мкм, или 3-6 клеток) Alternaria alternatа, а жизнеспособность крупных фрагментов гиф (> 130 мкм, или > 9 клеток) не изменялась. Однако, после обработки ультразвуком высокий уровень сахарозы (100 г/л) подавлял рост фрагментов A. alternatа любой длины.

При низких температурах у всех исследованных видов грибов (Alternaria alternata, Mucor hiemalis, Penicillium spinulosum) было отмечено значительное снижение способности к росту. Наиболее чувствительным оказался вид P. spinulosum, для которого 4 ^_С - это нижний температурный предел роста: при 4 ^_С даже крупные фрагменты практически не растут. Мелкие фрагменты M. hiemalis тоже теряли способность к росту при 4 ^_С. В несколько (4-6) раз уменьшалась жизнеспособность фрагментов A. alternatа.

Максимальная способность к росту мелких фрагментов M. hiemalis отмечалась при 25, 30 ^_С. Жизнеспособность фрагментов A. alternatа практически не изменялась при 20, 25, 30 ^_С. Мелкие и крупные фрагменты P. spinulosum наибольшую способность к росту проявляли при 20 ^_С, при увеличении температуры до 30 ^_С их жизнеспособность снижалась.

Изменение кислотности среды не оказывало существенного влияния на жизнеспособность фрагментов M. hiemalis и A. alternatа. Число способных к росту фрагментов P. spinulosum было наибольшим в нейтральных условиях среды, уменьшение pH от 7,0 до 3,5 приводило к снижению жизнеспособности всех фрагментов P. spinulosum, а мелкие фрагменты в кислых условиях не росли вовсе. С увеличением кислотности наблюдается подавление роста фрагментов мицелия. В варианте с максимальной кислотностью среды (pH 3,0) рост коротких (20-50 мкм) и средней длины (51-100 мкм) фрагментов отсутствовал практически полностью. Наиболее стабильный и сбалансированный рост фрагментов различной длины отмечается в вариантах с нейтральной и слабощелочной реакцией среды - 7,0 и 8,0 pH. При этом активный рост наблюдается и у коротких, и у длинных фрагментов (Григорьев, 2004).

Загрязнение возрастающими дозами тяжелого металла - кадмия оказывало негативное влияние на способность к росту всех фрагментов P. spinulosum. Напротив, присутствие кадмия вызывало повышение жизнеспособности фрагментов разной длины мицелия A. alternatа и малых (85 - 140 мкм) фрагментов M. hiemalis (Иванова, 1999).

1.2 Особенности использования микромицетами различных природных веществ в качестве единственного источника углерода

1.2.1 Разложение легкоусвояемых органических веществ

Важнейшая, быстрее всего усвояемая пища плесневых грибов состоит из моносахаридов и других низкомолекулярных водорастворимых соединений углерода, которые могут непосредственно поглощаться протопластом. Почти все организмы ассимилируют простые сахара и аналогичные им молекулы одинаково, однако грибы, конкурируя за эти питательные вещества, обладают некоторыми существенными преимуществами. Как только какой-либо живой или мертвый органический субстрат основательно увлажняется, возникает водный раствор, содержащий по крайней мере следы питательных веществ. Тотчас же там развиваются талломы «подходящих» грибов, быстро образуются их новые вегетативные единицы, и стремительно размножающаяся популяция полностью берет на себя использование данного источника пищи. За подобные субстраты с грибами конкурируют бактерии; получит ли преимущество кто-то из них или они будут сосуществовать относительно «равноправно», зависит от обстоятельств, и общего правила здесь вывести невозможно.

В отсутствие источников азота некоторые грибы окисляют глюкозу до глюконовой кислоты. При этом pH падает ниже 2,0, и обычные бактерии уже не могут размножаться, однако сами грибы при последующем поступлении азота способны утилизовать глюконовую кислоту. Примеров, объясняющих превосходство грибов над бактериями особенностями первичного обмена веществ, немного. Что касается превращений низкомолекулярных органических соединений, для грибов специфичны определенные пути разложения сахаров.

Разложение сахаров. В клетку часто проникают моносахариды - продукты внеклеточного разложения полисахаридов; ди- и олигосахариды также поглощаются из окружающей среды и включаются в метаболизм. Необходимые для этого ферменты либо широко распространены (мальтоза, сахароза и так далее), либо обнаружены у более или менее многих представителей грибов (Lodder, 1970; Barnett, 1979).

Наиболее обычный источник углерода - глюкоза. Полное разложение одного ее моля дает 675 ккал энергии. Другие гексозы (глюкоза - не обязательно) включаются в универсальный процесс разложения только после фосфорилирования; этим же путем идут продукты расщепления внеклеточных полисахаридов, запасных и входящих в состав клеточной стенки макромолекул.

Первая реакция разложения гексоз протекает с использованием энергии.

При этом с участием фермента гексокиназы из глюкозы, фруктозы и маннита возникают соответствующие гексозо-6-фосфаты, а из галактозы под действием галактокиназы - галактозо-1-фосфат, который затем изомеризуется. Разложение сахаров протекает в грибной клетке следующими основными путями.

Фруктозодифосфатный путь (ФДФ, гликолиз, путь Эмбдена-Мейргофа-Парнаса) может вести к полному окислению, неполностью окисленным конечным продуктам или ответвляться в сторону образования сырья для биосинтеза. Гликолитические реакции в клетке начинаются с фосфорилирования глюкозы (в форме фосфатов сахара более рекционноспособны). При трансформации глюкозы в пировиноградную кислоту по пути Эмбдена-Мейргофа-Парнаса выделяется свободная энергия, достаточная для образования четырех молекул АТФ. Однако две из них требуются для превращения глюкозы в фруктозо-1,6-дифосфат, и только две молекулы АТФ остаются для процессов синтеза.

Пентозофосфатный путь (ПФ) либо поставляет промежуточные продукты для последующего биосинтеза, в том числе нуклеотидов, либо продолжается по типу ФДФ.

При разложении через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовую кислоту (КДФГ, путь Энтнера-Дудорова =ЭД) продукты расщепления КДФГ, образующейся путем дегидратации 6-фосфоглюконовой кислоты (глицеральдегидфосфат, пировиноградная кислота; быстро и непосредственно попадают в систему гликолиза).

С помощью глюкооксидазы (ГО) некоторые виды Aspergillus и Penicillium окисляют непосредственно глюкозу до глюконовой кислоты, которая выделяется в среду или включается в ПФ; возникающая при этом ядовитая для всех организмов перекись водорода ферментативно разрушается.

В глиоксилатном цикле (ГЦ) - побочном пути цикла лимонной кислоты (ЦЛК) - изолимонная кислота, возникающая из ацетил- кофермента А и щавелевоуксусной кислоты, превращается в янтарную и глиоксиловую кислоты; последняя, реагируя с ацетил- коферментом А, дает яблочную кислоту, позволяющую продолжаться ЦЛК. Недостаток субстрата для ЦЛК может возникать, например, из-за расходования б- кетоглутаровой кислоты для синтеза аминокислот, тогда глиоксилатный путь заменяет отсутствующие промежуточные звенья (реакции пополнения, анаплеротические последовательности). Глюкоза и продукты ее разложения стимулируют нормальное протекание ЦЛК и подавляют ГЦ, который может активироваться присутствием в среде ацетата или глицина.

Полное окисление. С помощью дыхательных ферментов процесс соединения водорода с кислородом, дающий энергию почти всем организмам, подразделяется на мелкие этапы с незначительными различиями в энергосодержании исходных веществ и продуктов («биологический взрыв гремучего газа»). В ходе этих отдельных реакций, в частности, регенерируется АТФ. Ферментные системы различных организмов, несмотря на существенные общие черты неодинаковы. Так, у оомицетов отсутствует цитохром С₁, свойствовенный грибам и растениям, а у одного из представителей рода Aspergillus отмечен цитохром, не отравляемый цианидом - (аналогичный В-цитохрому растений).

Доступность и использование различных путей разложения углеводов. То, какой путь задействован, зависит от организма, среды и состояния клетки, например от активности ее ферментов. Для определения этого количественно оценивают превращения субстрата соответствующими ключевыми ферментами.

Полиолы. Многоатомные спирты (полиолы), например маннит, рибит, глицерин, - результат окисления глюкозо-фосфата или соответствующих предшественников, конкурентного глюконеогенезу, спиртовому брожению или полному окислению в ЦЛК, а также синтезу макромолекул или другим реакциям с использованием АТФ и восстановлением НАДФ. Возможно, полиолы вместе с трегалозой служат у грибов формой транспорта углерода в гифах; они способны регулировать восстановительную силу, энергоснабжение, осмотические условия, содержание запасных веществ и рост. Некоторые авторы считают состав полиолов у грибов важным таксономическим признаком: у хитридиомицетов, аскомицетов, базидиомицетов и дейтеромицетов преобладает маннит, у зигомицетов его нет или же он не относится к главным компонентам; в целом у грибоподобных протистов полиолов меньше, чем у настоящих грибов. Наряду с такими наиболее частыми многоатомными спиртами, как глицерин (почти у всех) и манит (у всех грибов, кроме ряда зигомицетов), обнаружены также эритрит, рибит и арабит, известные и у водорослей. Концентрация рибита у Mucorales (Zygomycetes) зависит от питания (рост при потреблении рибозы). Арабит в крови человека указывает на грибную инфекцию (например, поражение Candida albicans); у здоровых людей он отсутствует. Здесь также выделяются оомицеты, у которых не обнаружено никаких полиолов; некоторые другие группы низших грибов (грибоподобных протистов) до сих пор изучены в этом плане недостаточно (Мюллер, 1995).

1.2.2 Разложение трудноразлагаемых веществ

Плесневые грибы в качестве источника углерода могут использовать такие трудноразлагаемые вещества, как целлюлоза, крахмал, лигнин, пектиновые вещества, нефть, пестициды.

Разложение целлюлозы. Основными источниками целлюлозы для грибов в природных условиях служат древесина и различные растительные остатки. Среди микроскопических грибов, разлагающих целлюлозу известны представители следующих родов: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticillium. Но только некоторые из них продуцируют полные внеклеточные целлюлолитические системы (эндо- и экзоглюканазы в-глюкозидазу). Среди них Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium funiculosum, Fusarium solani. Для культуральной жидкости большинства других грибов этой группы характерно отсутствие экзоглюканазы, то есть эти грибы могут деградировать более аморфные формы целлюлозы.

Деградация высокоупорядоченной формы целлюлозы осуществляется благодаря синергическому действию комплекса целлюлолитических ферментов. При любой комбинации экзо- и эндоглюканаз Trichoderma koningii, Fusarium solani, Penicillium и Funiculosum отмечается выраженный синергизм. Однако синергизм между экзоглюканазами этих грибов и эндоглюканазами грибов, не продуцирующих экзоглюканазу (Myrothecium verrucaria), не выявлен. Нет также синергизма между экзоглюканазами грибов и эндоглюканазами рубцовых бактерий. Последнее указывает на существенные различия целлюлолитических систем грибов и бактерий (Марьиновская, 2006).

Целлюлоза является линейным полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в молекуле клетчатки, как и в молекуле целлобиозы связаны в-гликозидной связью. Поэтому клетчатку можно рассматривать как полимер целлобиозы. Нормэн и Фуллер (1942) считают, что большинство грибов способно усваивать клетчатку. Несмотря на то, что использование клетчатки грибами имеет большое значение в круговороте веществ в природе, процесс этот изучен далеко не полно.

Обычно считают, что первым этапом использования целлюлозы грибами является ее гидролиз. Гидролиз целлюлозы можно схематически представить следующим образом: целлюлоза > целлодекстрины > целлотетроза > целлобиоза > d-глюкоза. Известен штамм Aspergillus oryzae, выделяющий целлюлазу и целлобиозу (Лилли, 1957).

Разложение крахмала. Как и целлюлоза, крахмал является полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в его молекуле соединены между собой б-гликозидной связью, поэтому основной структурной единицей молекулы крахмала, как и молекулы гликогена, следует считать мальтозу. Зеленые растения синтезируют крахмал, животные и грибы образуют гликоген. Ферментативный гидролиз крахмала может быть схематически представлен следующим образом: крахмал>декстрины>мальтоза>d-глюкоза. Декстрины, имеющие разветвленную углеродную цепочку, лишь частично гидролизуются амилазой. Декстрины с неразветвленной углеродной цепочкой полностью превращаются в мальтозу (Мирчинк, 1988).

Крахмал нерастворим в воде. Лишь грибы, образующие амилазу, обладают способностью усваивать крахмал. Существует немало грибов, неспособных развиваться на средах с крахмалом, однако большинство из них может усваивать этот полисахарид. Было установлено, что 26 различных изученных видов и штаммов оомицетов из числа сапролегниевых усваивали как крахмал, так и продукты его гидролиза (декстрины, мальтозу и глюкозу), но не были способны ассимилировать 13 других источников углерода, включая сюда и фруктозу. Позднее А. С. Марголин (1942) показал, что 19 из 21 вида грибов, усваивающих мальтозу, обладали также способностью использовать и декстрин (Лилли, 1957).

Разложение пектиновых веществ. Среди грибов имеются активные разлагатели пектина, который является существенным компонентом растительного опада. Пектин образует в растениях межклеточное вещество, из которого состоят так называемые срединные пластинки, соединяющие между собой отдельные клетки растения. Они придают тканям прочность. Пектин представляет собой высокомолекулярное соединение углеводной природы - полисахарид, в котором метоксилированные остатки галактуроновой кислоты связаны между собой в-1,4-глюкозидными связями.

Многие грибы образуют пектинолитические ферменты. Высокая пектинолитическая активность обнаружена у некоторых эпифитных грибов, главным образом Aureobasidium pullulans и видов Cladosporium. Пектинолитические грибы занимают значительное место среди типичных представителей лесной подстилки - это виды родов Cladosporium, Alternaria, Aposphaeria, Penicillium, фитопатогенные грибы родов Fusarium, Verticillium, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum.

Ферментативное разрушение пектиновых веществ в растениях имеет значение в патогенезе некоторых заболеваний. Фитопатогенные грибы разрушают пектин срединной пластинкой и пектаты в первичных клеточных оболочках, что приводит к изменению их физико-химических свойств и создает условия для внедрения паразита, а также в результате действия пектинэстеразы образуются вещества - полигалактурониды, способные закупоривать сосуды, что в конечном итоге приводит к увяданию растений.

Существенное значение разрушения пектиновых веществ грибами имеет при разложении растительного опада. Практическое использование пектиназ грибов - применение в пищевой промышленности при приготовлении фруктовых соков для их осветления, а также при мочке льна (Мирчинк, 1988).

Разложение лигнина. Грибы - почти единственные разрушители лигнина. Способность грибов осуществлять глубокое разрушение лигнина представляет собой уникальное явление.

Лигнин - наиболее распространенное в природе полимерное циклическое соединение. В наибольшем количестве лигнин содержится в древесине и древесном опаде. Содержание его в опаде хвойных пород составляет 28 - 34 %, лиственный пород - 18 - 28 %. В химическом отношении лигнин не является индивидуальным веществом с вполне определенными свойствами и составом.

Исследования, касающиеся микробной деградации лигнина, относятся к одной из наиболее сложных биологических проблем, поскольку лигнин пока не может быть точно определен как химическое вещество. Также не могут быть точно определены и промежуточные реакции его биологического превращения. Наиболее активные группы микроорганизмов, разрушающих лигнин, принадлежат к древоразрушающим базидиомицетам, вызывающим белую гниль. Однако до настоящего времени неизвестны полностью все стадии ферментативных реакций в процессе разложения лигнина, то есть известны далеко не все ферменты, осуществляющие этот процесс.

Отличия деградации лигнина от деградации других полимеров заключается в том, что такие полимеры, как протеины, полисахариды, нуклеиновые кислоты, состоят из регулярно повторяющихся единиц, в то время как лигнин состоит из различных мономеров, имеющих различные типы связей. Большинство микроорганизмов, воздействующих на лигнин, вызывают в нем очень незначительные изменения, которые проявляются в основном в уменьшении числа метоксильных групп и очень слабой потере в весе. Некоторые сумчатые и несовершенные грибы могут расти на средах, содержащих препарат лигнина в качестве единственного источника углерода, такие, как Fusarium lactis, F. nivale и некоторые другие, но они не вызывают существенных изменений в молекуле лигнина (Мирчинк, 1988):

Участвуя в разложении многих углеродсодержащих веществ растительного опада и древесины в первую очередь трудноразлагаемых полимерных соединений, где грибам принадлежит ведущая роль, они занимают значительное место в круговороте углерода, являясь поставщиками СО₂ в атмосферу.

Среди грибов есть организмы, разлагающие жиры и воска, входящие в состав растительных и животных тканей. Это определяется наличием у них ферментов липаз. Наибольшей активностью липолитических ферментов обладают виды Mucor lipolyticus, Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Penicillium verrusum, Penicillium roquefortii. Многие выделены с поверхности растений, являясь эпифитами и способны разлагать также восковые налеты на поверхности растений.

Известна также способность грибов разлагать как алифатические, так и ароматические углеводороды. В этом отношении наибольшей активностью характеризуются грибы рода Aspergillus (Мирчинк, 1988).

Разложение хитина. Хитин постоянно присутствует в почве, достигая десятых долей процентов, входит в состав наружного скелета беспозвоночных животных и клеточных стенок грибов. По ряду физико-химических свойств хитин сходен с целлюлозой, однако наличие в молекуле ацетамидных групп придает ему особо ценные в практическом отношении свойства. Известно, например, что бактериальная хитиназа используется в качестве средства защиты растений от возбудителей болезней. Препарат на основе этого фермента является перспективным экологически безопасным средством биологического контроля за фитопатогенными грибами (Deboer, 1998; Eltarabily, 2000). Микроорганизмы воздействуют на хитин с помощью экзоферментов (хитиназы и хитобиазы), в результате чего образуются хитотриозы и хитобиозы, расщепляющиеся затем до мономеров и N-ацетилглюкозоамина (Шлегель, 1987). Способностью к образованию хитиназы обладают многие бактерии (Актуганов, 2003; Ramirez, 2004). В первую очередь реагируют на присутствие хитина быстрым размножением мицелиальные прокариоты - актиномицеты (Калакуцкий, 1977; Schrempf, 2001). Наличие высокой хитиназной активности микроорганизмов дает возможность извлечения азота и углерода из труднодоступных соединений, каковым является хитин, и, как следствие, включение этих элементов в круговорот почва - атмосфера. Однако проблема разложения хитина в почве до настоящего времени остается недостаточно раскрытой (Манучарова, 2005).

Манучаровой Н. А. с соавторами было проведено исследование хитинолитического прокариотного и эукариотного микробного комплекса в черноземе в ходе сукцессии, инициированной внесением хитина и увлажнением почвы.

Наблюдение за динамикой хитинолитических популяций в ходе сукцессии, инициированной увлажнением почвы и внесением хитина, с помощью люминесцентной микроскопии показало, что численность бактерий, длина мицелия актиномицетов и грибов в варианте с внесением хитина была выше по сравнению с контрольным вариантом (увлажнением почвы без внесения хитина), причем такая закономерность наблюдалась на всех этапах сукцессии. Максимальные значения численности бактерий, длины мицелия грибов и актиномицетов отмечены на 7 - 14-е сутки после начала опыта. На протяжении всего эксперимента биомасса грибов превышала биомассу прокариот как в контрольном варианте, так и в варианте с хитином. Значительное возрастание биомассы эукариот в варианте с хитином по сравнению с контролем отмечалось на 7-е сутки сукцессии, однако к середине сукцессии (14-е сутки опыта) биомасса грибов начала снижаться, что, вероятно, связано с сопряженными процессами отмирания части мицелия и перехода к стадии спороношения.

Наблюдение за динамикой популяций в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением хитина в почву, проводимое методом посева, показало, что численность хитинолитических прокариотических микроорганизмов, выделяемых из образцов с добавлением хитина, была выше на всех этапах сукцессии по сравнению с контролем (Манучарова, 2005).

Разрушение грибами нефтепродуктов. В последние десятилетия в связи с возродившимся интересом к процессам микробного превращения углеводородов были обнаружены мицелиальные грибы, деятельность которых приводит к деструкции нефти и ее производных. В настоящее время доказано, что утилизировать нефтепродукты, в том числе различные топлива, во время хранения и транспортировки способны многие виды грибов и бактерий (Андреюк, 1980).

Нефтепродукты как среда обитания грибов характеризуются рядом особенностей: 1) содержат большое количество сравнительно доступного углерода и минимальное - азота при почти недоступном пространственном расположении его в молекуле; 2) в них почти отсутствует доступная активная вода. Это оказывает существенное влияние на синтез de novo грибной клетки.

Вопросы необходимого соотношения C:N у грибов при росте на нефтепродуктах в биохимическом аспекте исследованы еще мало и уровень этих данных уже не отвечает современным представлениям о возможностях грибной клетки. Очевидно, здесь имеет место не только типичный гетеротрофный процесс, но также определенное подобие хемотрофии и автотрофии, причем стадии роста отличаются и специфичны по способности к разным типам трофики. Особенно это проявляется в период формирования репродуктивных структур (Ниязова, 1982; Бабьева, 1983). Спецификой роста грибов на нефтепродуктах является их способность распространяться на поверхности, то есть возможность использовать при этом активную воду из воздуха, а также расти в толще нефтепродуктов, то есть ограничивать свои потребности в воде за счет активной воды самих нефтепродуктов (Евдокимова 1982).

Рост грибов (кладоспориев, пенициллиев, аспергиллов и некоторых других видов и штаммов) в разных нефтепродуктах характеризуется различным типом размещения мицелиальной пленки. Наиболее типичный - на разделе фаз, однако чаще всего наблюдается еще и глубинный рост, при котором развивается не только в толще жидкости - до 20 см. Причем интересно, что рост этих штаммов при определенном соотношении нефтепродуктов и воды мало зависит от высоты слоев смеси, а также воздуха в надсубстратном пространстве. Это свидетельствует о большой возможности мицелиальных грибов выдерживать жесткие условия и приспосабливаться к потреблению необходимых для метаболизма веществ не совсем обычными биохимическими и физиологическими путями.

В настоящее время установлено, что способность окислять углеводороды нефти не является специфической чертой отдельных видов грибов. Это не редкая их особенность, а одна из физиологических функций. Однако, несмотря на большое сходство химических и физических свойств фракций нефтепродуктов, у большинства видов грибов четко проявляется избирательное отношение к их утилизации (Бабьева, 1983).

Разрушение полимерных материалов. Синтез полимеров и создание на их основе материалов, обладающих повышенной стойкостью к факторам окружающей среды и воздействию различных организмов, привел к обострению экологической обстановки из-за накопления больших объемов отходов, содержащих эти соединения в разных отраслях промышленности. В последние десятилетия во многих странах уделяется большое внимание созданию полимерных материалов и их модификаций, утилизация которых возможна под воздействием микробиоты. В качестве добавок к пластификаторам исследователи используют природные компоненты такие, как крахмал, производные целлюлозы, протеин, хитозан и так далее. На основе этих композитных полимеров ряд фирм выпускает пластики для производства изделий разового пользования, упаковки пищевых продуктов, плоских пленок и так далее, которые обладают способностью к биодеградации при компостировании и так далее (Власова, 2001; Фомин, 2001). Состав микроорганизмов, контаминирующих техногенные материалы и способных вызывать их биодеградацию, очень разнообразен как в таксономическом отношении, так и по их физиолого-биохимической активности. Среди них ведущее место занимают представители дейтеромицетов, способные развиваться на обширном сортименте материалов, содержащих соединения как природного происхождения, так и искусственного синтеза (Биоповреждения, 1987; Коваль, 1989).

Было проведено исследование О. В. Сычуговой с соавторами (2003) с целью изучения возможности роста и развития видов микромицетов на композиции пленочного сополимера этилена и винилацетата с термопластичным крахмалом.

В процессе данного исследования было установлено, что они способны утилизировать данный источник углеродного питания. Однако динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, при одной и той же навеске крахмала не одинакова, что особенно четко проявляется на 4 - 10-е сутки. Выявляется и некоторая разница в темпе роста видов грибов на нативном и растворимом крахмале разного происхождения, а также на средах Чапека и Гетченсона, взятых в качестве контроля (Сычугова, 2003).

Изменения морфологических признаков и образования новых структур у тест - культур на модифицированных средах при замене сахарозы на крахмал и росте на полимере не отмечаются, и они сопоставимы с параметрами, приведенными в определителях (Пидопличко, 1953; Ellis, 1971; Watanabe, 2000). Отличия выявлены у них только в темпах формирования морфологических структур. Хотя в литературе и приведены данные о влиянии субстрата на появление новых морфологических структур у грибов (Богомолова, 2001), однако, вероятнее всего, онтогенез и темпы развития определяются геномом вида, реализация программы которого зависит от влияния различных факторов (Шевцова, 1987; Долгова, 1997).

На поверхности пленки, содержащей термопластичный крахмал фиксируются сформированные пучки конидиеносцев Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Penicillium funiculosum, Chaetomium globosum, Trichoderma viride. Другие виды из взятого набора тест-культур не растут на данном субстрате или формируют слабое спороношение и в более поздние сроки.

Рост мицелия и формирование спороношения на композиции пленочного сополимера дает основание предполагать участие некоторых видов грибов в биодеструкции полимера из сополимеров этилена и винилацетата (СЭВА) с добавлением термопластичного крахмала (ТПК). Это дает возможность при последующих пересевах на смесях СЭВА и ТПК отобрать наиболее активные виды и их штаммы для разработки биотехнологии по его утилизации (Сычугова, 2003).

Таким образом, микроскопические грибы могут использовать в качестве источников углерода разнообразные органические вещества, тем самым являясь важными деструкторами различных природных материалов: целлюлозы, крахмала, лигнина, гемицеллюлозы, жиров, углеводородов, а также синтетических материалов, таких как пластики, пленки, упаковки пищевых продуктов. Поэтому предполагаемое исследование актуально и своевременно.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объекты исследований

В качестве объектов исследования были выбраны коллекционные штаммы микромицетов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus, а также штаммы родов Alternaria sp., Penicillium sp., Cladosporium sp., Trichoderma sp., Verticillium sp. Культуры были взяты из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ. Данные виды микромицетов были выделены из основных типов почв Астраханской области и из растительных субстратов: Aspergillus flavus и A. fumigatus из бурой полупустынной почвы Орловского смешанного леса, Alternaria sp. и Cladosporium sp. - из листьев клубники, Penicillium sp. - из каштановой почвы Дубового леса, Trichoderma sp., Verticillium sp. - из каштановой почвы Ясеневого леса.

В качестве источников углерода использовали модельные: сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза; природные материалы (растительный опад, камыш, опилки, кора, сено).

2.2 Отбор и подготовка почвенного образца

Образцы почв для микробиологических исследований отбирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые пакеты или стеклянную посуду.

При отсутствии возможности анализировать образцы непосредственно после сбора, их в течение нескольких часов высушивают на воздухе, предохраняя от прямых солнечных лучей.

При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо провести следующие операции: очистить от камней, трав; разрушить почвенные агрегаты, используя метод растирания почвы в стерильной фарфоровой чашке пестиком (Градова, 2001).

2.3 Методы выделения плесневых грибов

При выявлении и учете микромицетов производят посев из разведения почвенной суспензии на плотные питательные среды. Наиболее часто используют подкисленные молочной кислотой, сусло - агар и синтетические среды с простыми углеводами (например, среда Чапека). Подкисление производят для того, чтобы убить бактерии.

При выявлении грибов, которые не развиваются на кислых средах, используют красители: бенгальский розовый, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый. Применяют также комбинации из красителей и антибиотиков.

Грибы, которые не выдерживают конкуренцию за моносахара, выделяют на «голодные среды» - водный агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с разведенным в 8-10 раз суслом. На этих средах микромицеты развиваются значительно медленней и образуют мелкие колонии. При выделении микромицетов, разлагающих целлюлозу, лигнин, гумусовые вещества, источник углерода добавляют к синтетической минеральной среде (Бабьева, 1989).

2.4 Методы идентификации плесневых грибов

Культуральные признаки грибов описывают на плотных питательных средах в чашках Петри. При описании культуральных признаков грибов отмечают внешний вид колоний, текстуру колоний (бархатистая, шерстистая, шероховатая, войлочная), окраску колоний, диффузию пигмента в агар, складчатость колонии, наличие экссудата.

Для характеристики морфологических признаков сначала рассматривают чашки при малом увеличении, а затем готовят микроскопический препарат - раздавленная капля (Бабьева, 1989).

Идентификация мицелиальных грибов основана главным образом на сопоставлении макроскопических и микроскопических признаков исследуемой культуры с ранее описанными признаками известных грибов. Для каждой идентифицируемой культуры необходимо определить цвет поверхности (у некоторых организмов и обратной стороны) и фактуру колоний, а также скорость роста по диаметру колоний (макроскопические признаки). Дальнейшая работа по идентификации связана с приготовлением препаратов репродуктивных органов: необходимо отмечать характер септирования гиф, тип конидиогенных клеток и вид их репродуктивных пропагул. Принадлежность грибов устанавливают по наличию разнообразных конидиальных спороношений как открытых, так и внутри специальных вместилищ - пикнид и отсутствии каких-либо половых спороношений. Применяемая на практике идентификация основана в основном на морфологических признаках конидиального спороношения, которые чрезвычайно разнообразны. Принадлежность к классу и роду устанавливают по определителям (Егоров, 1986; Билай, 1987; Саттон, 2001; Еремеева, 2007; Booth, 1971; Pitt, 1991; Klich, 1992).

2.5 Принципы составления питательных сред для грибов. Основные принципы композиции сред

При составлении питательных сред для грибов обычно пользуются результатами предварительных исследований по выяснению значения для роста и развития изучаемого объекта концентрации отдельных компонентов (источников углерода, азота, зольных веществ и витаминов).

Основными правилами, которых придерживаются при составлении сред, способствующих росту грибов, являются следующие:

1) целесообразно применять отдельные источники углерода и азота;

2) концентрация вещества, служащего источником азотного питания, должна сильно уступать концентрации вещества - источника углерода (примерно в 10 - 15 раз).

Хотя среды натурального происхождения более благоприятны для роста большинства грибов, однако при физиологических экспериментах по изучению развития и обмена у грибов использовать их нежелательно, так как их состав непостоянен. Для этих экспериментов обычно используются синтетические среды. Одной из первых синтетических сред для грибов (культур видов аспергиллов и пенициллов) была среда Роллена следующего состава (г/л):

сахароза - 72 (около 5 %);

винная кислота - 4,0 (для подкисления среды);

фосфорнокислый аммоний - 4,0;

углекислый калий - 0,6;

сернокислый аммоний - 0,25;

сернокислый цинк - 0,07;

сернокислое железо - 0,07;

кремнекислый калий - 0,07;

дистиллированная вода - 1,5 л.

Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):

сахароза - 30,0;

NaNO₃ - 2,0;

MgSO₄ - 0,5;

FeSO₄ - 0,01;

KH₂PO₄ - 1,0;

KCl - 0,5;

дистиллированная вода - 1,0 л.

Для многих грибов указанные здесь среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов - дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов - паразитов растений - ткани растения - хозяина; выращивание грибов - копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).

2.6 Приготовление питательных сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 150 мл, рассчитанной на 10 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм и 120 ^_С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.

2.7 Определение способности плесневых грибов использовать различные источники углерода

2.7.1 Определение радиальной скорости роста на твердой среде

Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

В качестве единственного источника углерода использовали сахара (лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, сорбит), крахмал, целлюлоза, природные целлюлозные материалы (растительный опад, камыш, опилки, кора, сено). Источники углерода добавляли в среду в мелко нарезанном виде. Все источники углерода добавлялись в среды количеством 45 г/л.

В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека без сахарозы с различными источниками углерода. Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования - 24 ^_С. Параллельно производят посев на среду Чапека с сахарозой (контроль 1) и без сахарозы (контроль 2). Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.

Определение радиальной скорости роста грибов проводили на плотной питательной среде за определенный промежуток времени. После 48 часов инкубации при 24 ^_С измеряли диаметр выросших на чашках колоний при помощи линейки. Эту операцию повторяют через каждые двое суток в течение двух недель.

За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают среднее арифметическое измерение. Вычисление радиальной скорости проводят по формуле:

K_r = (r - r_o) / (t - t_o),

где k - радиальная скорость роста;

r_o - радиус колоний в начальной момент времени t_o;

r - радиус колоний в момент времени t (Паников, 1991).

2.7.2 Изучение прорастания спор в капле субстрата

На основании метода проращивания грибных зачатков во влажной камере, можно определять способность грибов к ассимиляции различных субстратов. На предметные стекла с лункой наносятся споровая суспензия в гидролизате (камыша, опилок, сена, растительного опада, коры), сверху накрывали покровными стеклами, и помещали во влажную камеру. Предварительно гидролизаты готовили: мелко измельченные растительные материалы заливали дистиллированной водой количеством 10 г на 1 л, кипятили в течение 15 минут для наибольшего выхода воднорастворимых органических веществ из растительных субстратов, затем подвергали стерилизации при 120 ^_С в автоклаве. Споровую суспензию готовили следующим образом: микроскопические грибы 10 дней выращивали на среде Чапека в пробирках (скошенный агар), после производили смыв 10 мл гидролизата. Для удаления обрывков мицелия суспензию фильтровали через 2-слойную стерильную марлю. Чистоту и плотность суспензии проверяют при микроскопировании в камере Горяева. Для основных опытов плотность споровой суспензии составляет 10⁶ спор в мл. Прорастание спор начинают учитывать через 24 часа. Прорастание спор рассчитывается как отношение числа проросших спор к общему числу просмотренных. Наблюдение проводят на 1, 2, 3, 7, 15-е сутки. Стекла микроскопировали, учитывая прорастание спор (%), длину проростков (в мкм) (Кураков, 2001).