Почвенные микроорганизмы-антагонисты, активные в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium и р. Bipolaris

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Защита растений от вредных организмов является исключительно актуальной проблемой повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Среди методов и средств защиты растений преобладающим остается химический, так как обладает быстротой и наглядностью действия, надежностью и эффективностью в широком диапазоне внешних факторов. Однако не лишен он и ряда недостатков, основными из которых являются нарушение биологического равновесия в природе, накопление остаточных количеств химических средств защиты в сельскохозяйственной продукции и прогрессирующей к ним устойчивости патогенных организмов, высокая стоимость фунгицидов и катастрофическое загрязнение окружающей среды. Для создания альтернативных химическим методам защиты растений от болезней проводится интенсивный поиск бактерий и грибов, способных служить агентами биологического контроля развития болезней. Микроорганизмы представляют продукт живой природы; размноженные в искусственных условиях для защиты растений, они легко вписываются в экологическую систему, практически не нарушая ее целостности. Продукция, обработанная биологическими средствами, безопасна для здоровья человека, пчел и теплокровных животных.

Все вышесказанное как нельзя лучше обуславливает актуальность выбранной темы магистерской диссертации.

Цель работы: выделить почвенные микроорганизмы-антагонисты, активные в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium и р. Bipolaris.

Для достижения поставленной цели решаются следующие задачи:

1. Провести скрининг почвенных грибов, проявляющих антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium и р. Bipolaris.

2. Провести скрининг почвенных бактерий, проявляющих антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium и р. Bipolaris.

3. Провести количественную оценку антибиотической активности выделенных микроорганизмов-антагонистов.

4. Провести сравнительный анализ антибиотической активности выделенных изолятов в отношении грибов р. Bipolaris и различных штаммов р. Fusarium.

5. Провести сравнительный анализ антибиотической активности изолятов, выделенных из различных почв, отобранных в разных местах.

почвенный гриб бактерия фитопатогенный

1. Обзор литературы

1.1 История развития биологической защиты растений

Первым шагом в развитии практического биометода было применение американскими энтамологами в конце XIX века в Калифорнии хищного жука Rodolia cardinalis Muls. для борьбы с австралийским желобчатым червецом Iceria purchasi Mask., ставшим угрозой процветающей цитрусовой промышленности США. Успешные опыты с родолией стимулировали исследования в области биологической защиты как в США, так и в других странах, в том числе России.

Микробиометод первоночально был разработан для борьбы с вредными насекомыми [40]. Это было обусловлено, в частности, тем, что длительная эпизоотия шелковичного червя разорила многих шелководов и нанесла миллиардные убытки стране. В 1865 году Пастер выявил, что причиной болезни шелкопряда являются микробы, и они поражают организм на всех стадиях развития [120].

Впервые явление антагонизма было отмечено в 1877 году Л. Пастером, когда в одном из опытов в питательную среду, где выращивалась культура возбудителя сибирской язвы, из воздуха попали микробы и быстро размножились, а культура бацилл исчезла. Единственным объяснением могло быть предположение, что сибиреязвенные бациллы были уничтожены микробами из воздуха. Врагами палочки сибирской язвы, как показали последующие опыты, оказались гнилостные бактерии - синегнойные палочки. Л. Пастер охаректиризовал это явление как «борьбу за существование между сибиреязвенным организмом и его сородичами» [90, 120].

Работы Пастера вызвали большой интерес у российского ученого И. И. Мечникова в начальный период его деятельности [15]. В 1879 году Мечников впервые обосновал перспективы использования микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми на примере энтомопатогенного гриба Metarrihizium anisopliae Metsch. [40].

Исследования в области биологической защиты растений приняли систематический характер после организации в 1927 г. в Ленинграде (Санкт-Петербурге) Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений (ВИЗР).

В СССР систематическое изучение антагонизма как природного явления и создание научной основы его теории начались в 50-х годах нашего столетия советскими учеными (Н. А. Красильников, М. И. Нахимовская, А. И. Кореняко и др.) [90].

Изучение физиологических функций микробов-антагонистов Н. А. Красильников начал уже в 30-40-е годы; с 50-х годов он сосредоточил свое внимание на разработке принципов и методов использования антибиотиков в растениеводстве.

До начала работ Н. А. Красильникова уже был накоплен определенный запас знаний о явлении микробного антагонизма [29]. О первых успешных результатах в этом направлении сообщил в 1924 г. Ч. Портер [156], затем Р. Бамберг [130] и Кисслинг [146], которые использовали таксономически неидентифицированные бактериальные культуры для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур.

Первые успешные результаты по практическому применению идентифицированных микробов-антагонистов в нашей стране были достигнуты уже в 30-е годы в отделе почвенной микробиологии Института микробиологии, которым в те годы руководил Д. М. Новогрудский. Инициатором этих исследований был Я. П. Худяков, работами которого была создана теоретическая основа нового направления. Важное значение имели его опыты по инфицированию семян пшеницы бактериями рода Pseudomonas, оказавшимися способными лизировать патогенные грибы [29]. Эти бактерии Худяков назвал «миколитическими» [111].

Идеи Я. П. Худякова получили подтверждение в работах Е. Ф. Березовой и А. Н. Наумовой [8], а Д. М. Новогрудский провел серию экспериментальных работ, в которых названые идеи получили широкое развитие. В 1936 г. Новогрудский впервые ввел термин «бактерии-антагонисты» [80].

Первые указания на наличие антагонистических свойств у актиномицетов появились в работе Р. Грейг-Смита, опубликованной в 1918 году. Автор описывал угнетение актиномицетами роста грибов и бактерий. Этот эффект он приписал конкуренции микроорганизмов за источники питания [140]. Более конкретные данные о способности актиномицетов лизировать живые и мертвые клетки бактерий привел Д. Лиске [148].

Первые в нашей стране систематические исследования антагонистических свойств актиномицетов провела М. И. Нахимовская под руководством Д. М. Новогрудского. В 1937 она опубликовала работу, в которой представила обширный список тестобактерий, при воздействии на которые проявилось угнетающее действии актиномицетов, описала методы тестирования и т. д. [75]. Эти исследования осуществлялись под руководством Н. А. Красильникова. В 1939 г. М. И. Нахимовская уже представила обширную классификацию форм антагонистических взаимодействий микробов, выявленных ею [76].

В связи с этим следует сказать, что к началу 40-х годов уже имелся определенный запас знаний об антагонистических взаимодействиях микробов, используемых в практических целях. Но работы в этой области носили преимущественно эмпирический характер [29]. Н. А. Красильников характеризовал достигнутый уровень работ в этом направлении лишь как «Заманчивую перспективу в борьбе с грибковыми поражениями растений» [54].

К середине 40-х годов Н. А. Красильников разработал новую концепцию дальнейших исследований данной проблемы [29]. Н. А. Красильников обосновал возможность использования жизнедеятельных культур микробов-антагонистов для борьбы с возбудителями заболеваний растений, который сводился к отрицании внутривидового и утверждению существования лишь межвидового антагонизма [56]. Внедряя в растениеводство бактериологический способ защиты растений, тем самым он предлагал до минимума свести обработку полей ядохимикатами. Однако пропаганда Красильниковым этого метода совпала с началом широкого распространения химического метода защиты растений, последствия которого вскоре оказались очень серьезными [29].

В 1939 г. швейцарским ученым Паулем Мюллером были открыты инсектицидные свойства ДДТ. Когда этот препарат и созданные позже другие стойкие хлорорганические инсектициды получили в 40-60-е годы широкое распространение, методы биологического контроля стали считаться бесперспективными или малоэффективными. Тем не менее и в это время они продолжали развиваться. Однако вскоре восторги по использованию ДДТ и других стойких хлорорганических инсектицидов сменились глубоким разочарованием, поскольку последствия их применения оказались очень серьезными. После опубликования в США книги Рейчел Карсон «Безмолвная весна» (1962 г.), внимание широкой общественности по-настоящему было привлечено к вопросам охраны окружающей среды. Острейшие проблемы, возникшие в результате применения стойких хлорорганических пестицидов, дали новый стимул исследованиям по созданию альтернативных методов регулирования численности вредных организмов, как за рубежом, так и в нашей стране [16, 40].

Большой вклад в развитие микробиологического метода защиты растений внесли сибирские ученые. В 1950 г. при Иркутском государственном университете организована лаборатория под руководством Е. В. Талалаева. Здесь разработан препарат дендробациллин на основе энтомопатогенной бациллы Bacillus dendrolimus, впоследствии отнесенной к Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus. В 1959 г. в Биологическом институте СО АН СССР (ныне Институт систематики и экологии животных, Новосибирск) была создана лаборатория по изучению болезней насекомых, в которой работали известные ученые - доктора наук В. И. Полтев, А. Б. Гукасян, В. В. Гулий. Здесь разработаны вирусные препараты против ряда вредителей леса.

В 1962 г. в Красноярском крае в очагах размножения сибирского шелкопряда А. Б. Гукасян выделил бациллу B. Insectus, впоследствии отнесенную к B. thuringiensis subsp. thuringiensis [15, 28]. На основе выделенного штамма был создан препарат инсектин. Впоследствии и дендробациллин, и инсектин начали использовать на сельскохозяйственных культурах. В Красноярском государственном университете в 70-е годы ХХ в. были начаты работы по изучению энтомопатогенов и микробов-антагонистов возбудителей болезней растений [15].

Естественных врагов возбудителей болезней растений стали использовать значительно позже, чем регуляторов численности вредителей. Первый отечественный биопрепарат против корневых гнилей триходермин разработан в конце 60-х гг. в ВИЗР под руководством Н. С. Федоринчика на основе Т. viride (lignorum) (Fr.) Реrs. Фунгицидным действием обладает антибиотик трихотецин, метаболизируемый грибом Тrichothecim roseum Link. Этот препарат разработан во ВНИИбакпрепарат (Москва) под руководством М. Т. Петрухиной. Только в 80-е годы XX в. разработка биопрепаратов против болезней растений стала более интенсивной благодаря использованию такихантагонистических микроорганизмов как, бактерии рода Рseudomonas (Р. fluorescens Mig, Р. auerofaciens Kluyver), Bacillus subtilis Ehrenberg и др. Это препараты ризоплан (впоследствии планриз), бацифит (впоследствии бактофит) и др. [15, 40].

Для координации работ в области биологической защиты растений в 1970 г. был создан Всесоюзный научно-исследовательский институт биологических методов защиты растений в Кишиневе (ныне Молдавский НИИ биометодов). После распада СССР в 90-е годы ХХ в. организован Всероссийский НИИ биологической защиты растений в Краснодаре.

Необходимость объединения усилий ученых всего мира по разработке биологических методов подавления вредных видов привела к созданию в 1971 г. Международной организации по биологической борьбе с вредными организмами (МОББ). Цель этой организации - способствовать международному сотрудничеству в области развития биологических средств защиты растений, проведения научных исследований, пропаганды биологических методов защиты растений на национальном и международном уровнях. В состав организации и ее региональных секций входит более 70 стран [15, 19].

Начавшийся в 90-е годы прошлого века общий кризис экономики и аграрного сектора негативно сказался и на биологической защите растений. Тем не менее, вскоре снова наметилась тенденция возрастания роли биологических методов в общей системе интегрированной защиты растений, возникла новая идеология биологической защиты, адаптированная к региональным условиям, основанная на использовании расширяющегося ассортимента биологических средств защиты растений и сохранении природных регуляторов численности вредных видов. Особенность современного этапа развития биологической защиты растений -- расширение сети региональных государственных биолабораторий и коммерческих фирм, которые обеспечивают и производство, и применение биологических средств защиты растений, объединяя специалистов, развивающих и производственные, и исследовательские аспекты биологической защиты растений [16].

1.2 Характеристика возбудителей корневых гнилей зерновых

Возбудители корневых гнилей злаков относятся к классам высших грибов и характеризуются различными паразитическими свойствами. В Сибири главная роль принадлежит грибам р. Bipolaris и р. Fusarium, которые относятся к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecti или Deuteromycetec), порядка Hyphomycetales. [49, 50, 81, 110, 115, 118].

Наибольшее распространение корневые гнили приобрели в Сибири, где наиболее благоприятные условия для их жизнедеятельности [98, 99, 118]. В Красноярском крае главная роль принадлежит грибам Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker. и видам рода Fusarium [112].

Грибы р. Bipolaris преобладают в Сибири - в зонах степи, южной лесостепи, в северной лесостепи (засушливые годы), в Казахстане, Зауралье, Поволжье, где расположены основные массивы посевов яровой пшеницы и ячменя [116]. Ежегодные потери от обыкновенной корневой гнили в данных регионах составляют 15-20%, а в засушливые годы - до 50% урожая [22, 51, 118].

Виды рода Fusarium широко распространены в Сибири - зонах тайги, подтайги, северной лесостепи (увлажненные годы), в Прибалтике, Белоруссии, Нечерноземной зоне, Ставропольском крае [116].

В Красноярском крае наиболее частая встречаемость заболевания отмечается в районах, расположенных в зоне тайги и подтайги равнины (Большемуртинский, Бирилюсский, Большеулуйский, Козульский, Пировский, Тюхтетский). В условиях резких температурных колебаний весеннего периода, а также влажной осени, фузариоз усиливается в районах Каннской, Чулымо - Енисейской, Красноярской лесостепей [112].

Фитоэкспертиза семян (1996-2004 гг.) свидетельствует, что в основных районах производства зерна в России инфицированность зерновых культур грибами р. Fusarium link составила 5-25 % (в ряде проб 30-60%), р. Bipolaris sp. - 11-37 % (в ряде проб 50-60 %) [1].

Отмечено, что на пшенице паразитируют 28 видов рода Fusarium. В условиях Сибири их 11 видов. К наиболее распространенным относятся: F. gibbosum Appel et Wr. Emend. Bilai, F. oxysporum Schlecht., F. sambucinum Fckl., F. avenaceum (Fr.) Sacc., F. sporotrichiella Wr. Emend. Bilai, F. solani (Mart.) Appel et Wr., F. graminearum Schwabe [20, 118, 121]. Исследования Чулкиой В. А. (1985) свидетельствуют о некоторой приуроченности F. oxysporum и F. graminearum к теплым районам (степь), а F. avenaceum - к холодным (подтайга).

На искусственных питательных средах грибы р. Bipolaris образуют многоклеточный субстратный и воздушный мицелий от белого до оливково-черного цвета. Размножение осуществляется с помощью веретеновидных многоядерных конидий размером 40-120 х 15-30 мкм [34, 149], которые образуются на обособленных ответвлениях гиф - конидиеносцах апикально. Конидии имеют толстую оболочку, от светло-коричневого до темно-бурого цвета, большей частью удлиненно-яйцевидные, правильной или неправильной формы, без перегородок или, чаще, имеют их от 8 до 13 [116, 118, 166].

Гриб развивается в диапазоне температуры от 0 до плюс 40єС. Интенсивный рост мицелия и спорообразование происходят при температуре от плюс 22 до плюс 28єС и влажности воздуха 90%, отчленение конидий - при низкой относительной влажности воздуха (22%) и замедляется при высокой. Такие условия являются обычными в период вегетации яровых зерновых культур, что благоприятствует накоплению конидий и распространению их воздушными течениями. В случае попадания на листья или другие надземные органы растения они прорастают при наличии капельно-жидкой влаги или при относительной влажности воздуха выше 80%. Оптимальная температура для их прорастания от плюс 24 до плюс 28єС, минимальная плюс 6єС, максимальная плюс 36єС [51, 82, 101, 116, 164]. Конидии Bipolaris sorokiniana не теряют жизнеспособности в течении нескольких месяцев при температуре от минус 32 до минус 43єС и даже минус 50єС, поэтому они хорошо переносят суровые сибирские зимы [102, 127].

Грибы рода Fusarium размножаются микро- и макроконидиями Микроконидии большей частью одноклеточные, образуются на воздушном мицелии в ложных головках или цепочках [116]. Микроконидии иногда образуются путем почкования макроконидий [12].

Макроконидии многоклеточные, веретеновидно-серповидной формы [116]. Они образуются в воздушном мицелии на простых или разветвленных конидиеносцах, иногда на коротких отростках или выступах гиф, в спородохиях и пионнотах. Спородохии представляют собой скопление разветвленных или простых конидиеосцев на сплетении гиф, образующих в виде слизи макроконидии. У пионнотов слизистый слой макроконидий образуется на таких же конидиеносцах, отходящих более или менее сплошным слоем от субстратного мицелия или в виде слизистых, в последствии сливающихся бугорков на воздушном мицелии.

Хламидоспоры являются наименее дифференцированными органами вегетативного размножения грибов рода Fusarium. Хламидоспоры отличаются от остальных клеток мицелия более толстой оболочкой, иногда двойной, гладкой, шиповатой или мелкобугорчатой, большим диаметром по сравнению с остальными клетками гиф мицелия и большей частью круглой формой. Хламидоспоры могут образовываться в гифах мицелия (промежуточные) в виде различной длины цепочек или клубочков, а также на концах гиф (верхушечные) одиночно, в виде коротких цепочек или собранные в клубочки (узлы). Они играют роль в биологии видов, их выживаемости, способствующие длительному сохранению их семенах, почве или на растительных остатках [12].

Мицелий фузариев разнообразен, его дифференциация проявляется у разных видов в зависимости от условий культивирования и возраста культуры, чаще белый, бело-розовый, розово-сиреневый или бурый. Воздушный и субстратный мицелий различаются толщиной, длиной клеток, степенью вакуолизации и образования хламидоспорного типа клеток. Клетки гиф субстратного мицелия обычно более широкие, чем воздушного. Диморфизм - превращение мицелиального типа роста в дрожжеподобный, и наоборот, - свойственен многим видам Fusarium. Эти изменения мицелия имеют приспособительный характер и являются реакцией на определенные условия среды [12, 13].

Фузарии как и грибы р. Bipolaris - мезофиллы, оптимум температуры для развития которых лежит в пределах от плюс 18 до плюс 28єС [43], хотя некоторые из них, особенно фитопатогенные виды, могут расти и развиваться в пределах от 0 до плюс 35єС [12]. При этом рост мицелия в длину, прорастание конидий и образование спороношения разных видов фузариев происходит при разных температурах. Так, исследования показали, что рост мицелия четырех видов фузариумов (F. nivale, F. rubiginosum, F. metachroum, F. subulatum) отмечен при температуре от плюс22 до плюс 26єС. Установлено значительное влияние температуры на морфологию гиф гриба F. graminearum. У F. avenaceum при температуре плюс 15єС и выше отмечено образование анастомозов. А для гриба F. solanum, у которого максимум накопления биомассы отмечен при температуре от плюс 20 до плюс 28єС, а минимум от плюс 12 до плюс 14єС. Накопление биомассы у гриба F. oxysporum, наоборот, наиболее высокое при пониженных положительных температурах от плюс 12 и плюс 20єС [43].

Влажность почвы оказывает большое влияние на выживаемость в ней патогенов. Виды рода Fusarium лучше сохраняли жизнеспособность в почве при влажности 15-25% от полной влагоемкости (ПВ) и погибали в случае превышения этой величины. В условиях контролируемой влажности почвы самое слабое развитие болезни было при увлажнении ее в пределах 60% от ПВ [118].

Границы кислотности и щелочности для видов фузариум колеблются в широких пределах. Большинство видов фузариум способны расти и развиваться в довольно широкой амплитуде значений рН среды от 2 до 9 с оптимумом в пределах рН 3,5-5,0 [43, 105].

Существенным фактором в экологии, особенно фитопатогенных видов фузариев, является углекислота. Кислород и углекислота необходимы им для вегетативного роста, спорообразования, прорастания конидий и направленности биохимических процессов. При этом разные виды по-разному реагируют на эти факторы. Например, F. oxysporum высоко резистентен к пониженному содержанию кислорода в атмосфере и в таких условиях может выживать очень долго. Эта особенность вида имеет значение для выживания гриба и распространении его в почве. Отдельные виды фузариум проявляют значительную устойчивость к давлению кислорода [43]. Например, вид F. solani выдерживал давление кислорода до 10 атмосфер [12].

При определении зон локализации патогенов обнаружено, что растения ярового ячменя поражаются корневыми гнилями постоянно, зоны патогенного влияния на которых поделены между грибами: зерновка и первичные корни поражены в основном грибами р. Bipolaris; вторичные корни и междоузлия инфицированы грибами р. Fusarium. Видимо, это связано с тем, что данные возбудители болезней занимают разные экологические ниши в окружающей среде, поэтому не происходит конфронтации между ними, в связи с чем корневые гнили являются комплексным заболеванием [97].

По способу питания возбудители обыкновенной корневой гнили являются необлигатными паразитами с широким кругом хозяев. Так, грибы р. Bipolaris способны паразитировать более чем на 100 видах растений, как однодольных, так и двудольных, однако основными хозяевами являются дикорастущие и культурные злаки [25, 31, 116]. Хорошо усваивают как органические, так и минеральные формы азота, способны к длительному росту и споруляции на растительных остатках.

Благодаря большому запасу питательных веществ конидии могут прорастать и формировать мицелий в отсутствии экзогенных источников питания [6, 31]. Способность грибов р. Bipolaris к свободному существованию ограничена из-за конкуренции с почвенной микрофлорой. По некоторым сведениям, вытеснение патогена из пораженных органов происходит еще в период вегетации растения [53]. Тем не менее, в благоприятных условиях гриб сохраняется в почве в виде конидий и хламидоспор, а также в форме мицелия на растительных остатках в течение многих месяцев и даже лет [7].

Болезнь на растениях различными симптомами проявляется в течении всей вегетации - от всходов до уборки. Симптомы заболевания очень разнообразны и зависят от способа и места внедрения патогена, а также от условий протекания инфекционного процесса и устойчивости растения к заболеванию. Наиболее часто грибы р. Bipolaris поражает надземные и подземные органы растения в месте контакта воздух-земля. Источником инфекции служат находящиеся в почве конидии, а также мицелий, сохраняющийся на растительных остатках. В первую очередь происходит заражение первичных корней, колеоптиля и прикорневых листьев, после чего инфекция может распространиться на эпикотиль, вторичные корни, стебель и узел кущения. Впоследствии наблюдается побурение и отмирание пораженных органов. В результате инфекции происходит нарушение связи в системе корень-стебель, что ведет к снижению оттока питательных веществ к зерну и как следствие - уменьшению скорости созревания и потерям урожая.

В течение вегетационного периода при наличии достаточной влажности происходит споруляция гриба на пораженных органах растения. Попадая на листья, конидии во влажных условиях прорастают и вызывают заболевание, называемое пятнистостью листьев. Характер повреждения зависит от внешних условий и чувствительности растения к заболеванию. При благоприятных для возбудителя условиях - высокой влажности и температуре - болезнь проявляется в виде некрозов, окруженных обширными хлорозами. При неблагоприятных для развития инфекции условиях наблюдаются мелкие компактные некрозы в местах внедрения патогена, хлорозы отсутствуют [24, 51, 53, 86, 100, 103, 117, 133, 143, 136].

При попадании конидий патогена на колос происходит заражение семян, что приводит к появлению семенной инфекции и развитию заболевания, известного как "черный зародыш" зерновых [24, 84, 119]. Такой путь передачи возбудителя считается наиболее вредоносным, поскольку ведет к наибольшим потерям урожая. Семенная инфекция вызывает снижение полевой всхожести на 14-66% за счет гибели проростков на ранних этапах вегетации, а также значительное уменьшение скорости роста и продуктивности выживших растений [116]. В связи с этим посев нужно проводить семенами высокого класса [93].

Заболевания, вызываемые различными видами фузарий, включают поражение наземной и корневой части растения. В наземной части растения фузарии вызывают главным образом гнили стебля, поражения репродуктивных органов растения, зерна. Из заболеваний корневой системы наиболее вредоносны фузариозы всходов, корневые гнили. Проявление характерных симптомов заболевания при разных типах фузариозов растений зависит от физиологического состояния растения, степени его устойчивости, величины инфекционной нагрузки, специфической физиологической активности возбудителя (быстроты роста, образования токсинов, ферментов и т. д.). [12].

Цепь поражения состоит из следующих звеньев: фузариозное зерно + инфицированные пожнивные остатки + падалица - фузариозная корневая гниль - гибель проростков - фронтальная колонизация растений + аэрогенная инфекция - фузариоз колоса - фузариозное ядовитое зерно [106].

Существует два основных пути инфицирования растений. При семенной инфекции во время прорастания зараженных зерен начинает расти и находящаяся в них грибница, которая быстро переходит в корешки и проростки, в результате развивается корневая гниль всходов.

Когда фактором передачи возбудителя являются почва и растительные остатки, конидии грибов прорастают под влиянием корневых выделений растений - экссудатов, которые служат источниками питательных веществ и энергии, необходимой для проникновения гриба в растение [43].

Было выяснено, что под влиянием корневых выделений растений-хозяев прорастает только часть покоящихся пропагул гриба. При повторной волне прорастания пропагул шанс попадания их в экологическую нишу - ткани растений-хозяев возрастает. Благодаря этому, популяция избегает гибели значительной части своих особей при неблагоприятных условиях в период прорастания, данная способность возбудителя является ценным эволюционным признаком, повышающим выживаемость его в природе [93].

Таким образом, обыкновенная корневая гниль зерновых поражает практически все органы растения. Наибольшие потери урожая от заболевания наблюдаются в засушливые годы. При этом отмечают взаимное усиление повреждающего действия засухи и возбудителя обыкновенной корневой гнили. Можно предположить, что ослабление растения за счет осмотического и теплового стресса облегчает его колонизацию патогеном. Высказываются также предположения о сходном механизме действия засухи и патогена на растительный организм. Так, отмечено сходство физиологических и биохимических изменений в растениях при засухе и при поражении обыкновенной корневой гнилью [45, 87, 88].

Патогенность грибов р. Bipolaris и р. Fusarium тесно связана с их способностью продуцировать фитотоксины. Фитотоксины - это продукты метаболизма патогенных микроорганизмов, которые могут вызывать повреждения тканей растений и играть значительную роль в патогенезе [78].

Микотоксины оказывают влияние на интенсивность дыхания, снижают фотосинтетическою активность, нарушают азотный и углеводный обмен, повреждают клеточные мембраны, ингибируют репликацию митохондриальной ДНК, вызывают нарушение митотического цикла в меристемах, что служит причинами задержки роста и развития пораженных растений или их гибели [10, 12, 37].

В настоящее время известно семь токсинов, продуцируемых разными видами грибов р. Helminthosporium. Из них четыре хозяин-специфические (продуцируются грибами, которые являются строго специализированными или поражают узкий круг растений-хозяев, и токсичны только для хозяев этих видов грибов): викторин, Т-, НС- и НS-токсины. И три неспецифические (токсичны для многих растений, независимо от того, является ли это растение хозяином продуцирующего токсин микроорганизма): гельминтоспораль, офиоболины и карботоксин.

Викторин продуцируется грибом Н. victoriae - возбудителем гельминтоспориоза овса, ячменя, ржи, риса и фасоли. Болезнь поражает в первую очередь проростки и стебли. Кроме того, гриб вызывает корневую гниль овса, ячменя и ржи [78]. Викторин - первый хорошо изученный токсин, который выделен из культуральной жидкости гриба еще в 1957 г. [157]. Токсин повреждает ультраструктуру мембран хлоропластов, ядер, вакуолей, эндоплазматического ретикулума [142]. Изолированный токсин, подобно Н. victoriae, вызывает в организме растения-хозяина разнообразные изменения: быструю потерю электролитов, нарушение дыхания и фиксации СО2 в темноте, подавление синтеза белка и ингибирование роста, торможения процессов поглощения веществ [141].

Т-токсины продуцирует гриб Н. maydis, вызывающий заболевание - южный гельминтоспориоз. Известны две расы: высоковирулентная раса Т, продуцирующая токсин, и раса О, которая токсин не продуцирует и не обладает высокой вирулентностью. Раса Т поражает только гибриды кукурузы с техасской (Т) цитоплазматической мужской стерильностью. Она вызывает некрозы листьев, листовых влагалищ, оберток початка и серо-черную гниль початков [161]. Т-токсины специфически действуют на проницаемость мембран клеток кукурузы с Т-цитоплазмой. Они индуцируют разнообразные реакции, такие как утечка ионов, ингибирование роста и закрывание устьиц [150].

НС-токсин выделен из культурального фильтрата Н. carbonum, возбудителя гельминтоспориозной пятнистости листьев кукурузы. Выделенный токсин учеными R. Pringle, R. Scheffer (1967) в концентрации 0,5 мкг/мл подавлял рост корней восприимчивых сортов кукурузы на 50%; на устойчивые сорта он оказывал подобное действие в концентрации 50 мкг/мл. При более низких концентрациях токсин стимулировал рост корней восприимчивых сортов.

НS-токсин (гельминтоспорозид). Возбудитель, продуцирующий данный токсин - Н. sacchari. Вызывает глазковую пятнистость листьев сахарного тростника, вызывает образование пятен в форме глаза, от которых распространяются длинные красно-коричневые полосы [78].

Гельминтоспораль. Н. sativum - один из возбудителей корневой гнили, пятнистости листьев, сажистого налета на колосьях и «черного зародыша» семян пшеницы, ячменя и других злаков. Данный токсин ингибирует электронный транспорт между флавопротеином и цитохромом "С" в хлоропластах и митохондриях, нарушает проницаемость мембран, ингибирует окислительное фосфорилирование, окисление сукцината и а-кетоглутарата, подавляет синтез белков и нуклеиновых кислот, а также синтез а-амилазы, снижает активность АТФ-азы. На макроуровне действие гельминтоспорала и его производных проявляется в ингибировании прорастания семян, роста проростков и каллусных культур восприимчивых растений. Токсичность очищенных препаратов, выраженная в концентрации, снижающей на 50% рост центрального корня у проростков пшеницы, колеблется от 4 мкг/мг для гельминтоспорала до 50-80 мкг/мг для его производных.

Из японского изолята гриба было выделено вещество, несколько отличающееся от гельминтоспорала и получившее название гельминтоспорол. Гельминтоспорол способен ускорять рост растений. На всходы риса и огурца он действует подобно гибберелловой кислоте, но в высоких концентрациях угнетает развитие корней и проростков пшеницы и салата [78, 89, 108, 109, 126, 132, 159, 160, 138].

Офиоболины (А-F) представляют группу хозяин-специфичных токсинов, продуцируемых различными видами рода Helminthosporium. Офиоболин А продуцируется Н. oryzae, H. turcicum, H. leersii, H. zizaniae, H. heterostrophus и др. Офиоболин В выделен из H. zizaniae, H. heterostrophus, Н. oryzae. Предполагается, что токсины изменяют проницаемость мембран клеток растений: через 10 мин. после обработки токсином наблюдалось увеличение вытекания электролитов и растворов, содержащих углеводы, в листьях и корнях риса [78].

Карботоксин продуцируется грибом Н. carbonum. Чистый токсин в концентрации 25 мкг/мл подавлял рост корней проростков кукурузы и был одинаково токсичен как для восприимчивых, так и для устойчивых сортов [158].

Из культур р. Fusarium были выделены и всесторонне изучены многочисленные фитотоксины. Микотоксины фузариев обычно не являются характерными для определенного вида [78].

Продуцентами фузариевой кислоты являются многие штаммы видов: F. oxysporum, F. solani, F. moniliforme, F. heterosporum,F. subglutinans, F. sambucinum, F. napiforme, F. crookwellense. Фузариевая кислота образуется преимущественно в культуральной жидкости; проявляет токсикоорганотропное действие различной степени в зависимости от дозы и вида растения [11, 74, 129].

Микомаразмин - токсин, образующийся при культивировании штаммов F. oxysporum, а также in vivo в пораженных грибом растениях. Токсин обладает специфическим действием на ткань листьев между жилками, вызывая некрозы, нарушает полупроницаемость плазматических мембран и водный баланс растения.

Нафтазарины - производные нафтахинонов: фузарубин, яваницин, мартицин, изомартицин, норяваницин и новарубин - являются характерными метаболитами F. javanicum, F. solani, F. martii var. pisi. Токсины образуются в ростовом субстрате и пораженных растениях; нарушают проницаемость плазматических мембран и разрушают хлоропласты [155].

Монилиформин - продуцируется F. moniliforme и F. fusariudes. В концентрации 20 мкг/мл он подавляет рост колеоптилей пшеницы на 24 % [78].

Группу опасных токсинов представляют трихотецины, особенно принадлежащие к типу А (Т-2 токсин, НТ-2 токсин, неозоланиол (НЕО), диацетоксицирпенол), синтезируемые F. sporotrichioides и F. poae, а также к типу В (деоксиниваленол (ДОН) и его производные - ниваленол, фузаринон-Х), продуцируемые F. graminearum и F. culmorum [135]. Особую опасность вызывает нарастающее загрязнение зерна пшеницы новыми для нашей страны опасными канцерогенными микотоксинами фумонизинами при поражении растений F. moniliforme. В России за последние 5 лет оно увеличилось с 10 до 75% [73].

Интоксикация сельскохозяйственных продуктов, вызванная фузариозом, может стать причиной отравления людей и животных. Фузариозные зерна пшеницы называются «пьяным хлебом», т. е. они на столько ядовиты, что человек, поевший такой хлеб, под влиянием нервного расстройства не может устоять на ногах, падая как пьяный. Основным источником инфекции «пьяный хлеб» являются семена, в которые проникает возбудитель фузариоза, находящийся на поверхности [9, 10, 14, 23, 30, 43]. Причина заболевания - гриб F. graminearum и некоторые близкие к нему виды (например, F. avenaceum и F. nival). Они развиваются на хлебных злаках еще в поле. Заражение озимых происходит от инфекции, находящейся в почве в мицелии или на остатках растений в виде мицелия, конидий или сумкоспор в перитециях [37].

Обобщая изложенный материал, можно сказать, что за последние годы накоплен обширный материал о возбудителях корневых гнилей злаковых культур: изучены распространение, биология, вредоносность, систематика, а также меры борьбы с этими болезнями. В последние годы, в связи с возрастающими требованиями к защите окружающей среды и экологической чистоте получаемой продукции, наиболее приемлем биологический метод в борьбе с корневыми гнилями злаковых культур, основанный на поиске антагонистов, подавляющих своих конкурентов.

1.3 Использование микробного антагонизма в защите зерновых культур

Известно, что болезни растений, в том числе зерновых культур, распространены широко и причиняют существенный вред сельскому хозяйству. Для борьбы с ними используют химический метод [35]. Еще 20 лет назад внимание уделяли преимущественно его положительным качествам: быстрота и наглядность действия, надежность и эффективность в широком диапазоне внешних факторов среды. В последующие годы стали видны и ощутимы отрицательные стороны его применения [18, 19]. Борьба с фитопатогенами, и в первую очередь грибными, в настоящее время осуществляется преимущественно с использованием фунгицидов [26]. Появление на рынке новых химических фунгицидов принципиально не меняет общую ситуацию в защите растений от болезней [79].

Для создания альтернативных химическим методам защиты растений от болезней проводится интенсивный поиск бактерий, актиномицетов и грибов, способных служить агентами биологического контроля развития болезней, и применение их в виде концентрированных продуктов метаболизма (антибиотиков) либо живых культур.

В настоящее время разработаны некоторые биопрепараты, созданные на основе бактерий-антагонистов (алирин Б, бактофит, фитоспорин, ризоплан и др.), актиномицетов (фитобактериомицин, гризин, валидомицин, касугомицин и др.) и грибов - антагонистов (трихотецин, триходермин-БЛ, деструксин, боверицин, микоафидин-Т, вертициллин-М и др.) [15, 16, 17, 47, 69, 94, 96,].

Микробиологические средства из года в год находят все большее применение. При их разработке основной задачей является выделение из различных почв наиболее выносливых и часто встречающихся сапрофитных микроорганизмов, которые в состоянии вытеснить патогенные формы с минимальным отрицательным воздействием на окружающую среду [44, 144].

Антагонисты - наиболее перспективные и надежные помощники человека при использовании биологического метода борьбы. В настоящее время их изучению уделяется большое внимание [16, 43]. Поскольку фитопатогенные грибы из р. Fusarium и р. Bipolaris в основном связаны с почвой, именно в ней эти возбудители чаще всего и подавляются антагонистами [42].

1.3.1 Бактерии-антагонисты

Использование бактериальных антагонистов основано главным образом на механизме антибиоза, регулирующем взаимоотношения полезных и вредных (с точки зрения производителя сельскохозяйственной продукции) микроорганизмов. Антибиоз играет наиболее важную роль в зоне ризопланы (зона ризосферы, окружающая корни и корневые волоски растении в пределах до 100 мкм). Использование регуляторных механизмов направлено не на полное уничтожение популяции фитопатогена, а на существенное ограничение ее развития и снижение вредоносности. Источником получения штаммов бактерий-антагонистов служат супрессивные почвы, в которых фитопатогены либо угнетены, либо элиминированы [16].

Высокая антагонистическая активность по отношению к патогенам выявлена у более десятка различных родов бактерий [39]. Среди бактерий наиболее часто явление антагонизма встречается у спороносных палочек, принадлежащих к роду Bacillus, и неспоровых из рода Pseudomonas.

Бактерии рода Bacillus являются перспективными агентами защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, благодаря своей высокой приспособляемости и выживаемости в неблагоприятных условиях [60]. Род Bacillus объединяет большое количество видов бактериальных организмов палочковидной формы, которые в аэробных условиях образуют одну рефрактивную эндоспору. Образование эндоспор после фазы интенсивного вегетативного роста и размножения как бы завершает жизненный цикл клетки, переходящий в покоящуюся форму, способную прорастать в благоприятных для развития бактерий условиях. Биологическое значение образование спор, по-видимому, заключается в способности переживать неблагоприятные экстремальные условия, что создает определенные преимущества данным микроорганизмам [77].

Одним из весьма интересных является вопрос о возможном участии в спорогенезе специфических полипептидных структур - антибиотиков полипептидов. Эти вещества, синтезируемые бактериями рода Bacillus и обладающие более или менее выраженной токсичностью против микроорганизмов, составляют большую (описано свыше сотни веществ), известных под общим названием антибиотиков. Ряд специалистов в области биосинтеза антибиотиков высказывает мнение, что образование этих веществ может быть тесно связано с процессами дифференциации образующих их организмов, а также оказывает существенное влияние на физиологические и биохимические свойства последних [5, 32, 48, 77, 128].

Бактерии рода Bacillus синтезируют, как правило, антибиотики полипептидной природы, причем один вид и даже штамм образует семейство близких пептидов. Так, в культурах Bacillus subtilis обнаружено до 66 различных антибиотических пептидов, B. brevis - 23. Из одного штамма B. subtilis № CIB 8872, выращиваемого на определенной среде, выделено сразу 10 антимикробных веществ. Различные штаммы B. polimyxa синтезируют до 20 полимиксинов, а также пептиды, близкие, но отличающиеся от полимиксинов по составу [77].

Результаты опытов подтверждают, что Bacillus subtilis и ее метаболиты могут быть использованы для создания экологически безвредного биопрепарата для семян пшеницы против F. oxysporum [91].

S. C. Chambers, I. R. Millington (1974) в своих опытах исследовали бактерии B. subtilis. В условиях чистой культуры на жидкой и полутвердой среде Чапека с разным содержанием углерода и азота одновременно высевали гриб F. culmorum и различные бактерии, встречающиеся в ризосфере пшеницы. Установлено, что бактерии угнетают рост гриба.

Как правило, B. subtilis образуют на питательной среде выпуклые колонии ризоидной формы [85]. Хорошо растет на МПА, пептонно-кукурузном агаре и других средах. Размер клеток 0,7...0,8х2...3 мкм. В почве бациллы находятся в виде спор, или вегетативных клеток. При температурах почвы, близких к О°С, большая часть бацилл образует споры. Чем выше рН (щелочные почвы), тем больше процент спор B. subtilis. Бациллы хорошо развиваются в ризосфере пшеницы, ячменя, кукурузы [16]. Л. Ю. Кузьмина, А. И. Мелентьев (2003) установили, что на численность интродуцированных бацилл-антагонистов в ризосфере пшеницы оказывают температурные условия развития растений. Так, результаты А. И. Мелентьева (2000) показывают, что плотность клеток B. subtilis ИБ-15 в ризосфере пшеницы, выращиваемой при всех трех температурных режимах, практически не изменялась на протяжении 2-3 недель, вегетации. Лишь на 16-е сутки при температурах плюс 21 и плюс 30°С и на 21-е сутки при плюс 13єС отмечен достоверное увеличение плотности интродуцированных бактерий [60, 69].

Водные режимы почв оказывают большое влияние на формирование микробного ценоза почвы и ризосферы [41]. Очевидно, при изменении температурно-влажностных режимов почвы в ризосфере растений могут создаваться условия как благоприятные, так и не благоприятные для активной колонизации ризосферы интродуцируемыми культурами. Исследования Меленьева показывают, что при недостаточном влогообеспечении (37% ПВ) плотность клеток B. subtilis ИБ-15 в ризосфере пшеницы поддерживалась на высоком уровне - порядка 107 КОЕ/г - и практически не изменялась на протяжении всего эксперемента. При благоприятном влагообеспечении растений (67% ПВ) отмечена тенденция к медленному снижению плотности клеток, тогда как при переувлажнении почвы (100% ПВ), наоборот, происходило непрерывное увеличение численности клеток [16].

Таким образом, для практического использования бацилл в защите злаковых культур от болезней необходимо детальное изучение их способности приживаться и распространяться в прикорневой зоне растений при постоянно изменяющихся гидротермических режимах.

Среди ризосферных бактерий особое место занимают бактерии рода Pseudomonas, проявляющих высокую антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным микроорганизмам [131], а также способность к стимуляции роста сельскохозяйственных культур. Так, исследования Минаевой (2007) показали, что обработка семян бактериями Pseudomonas sp. B-6798 и смесью с другими ризобактериями снижает общую пораженность возбудителями семенных инфекций на 12-36 % за счет значимого (р<0,01) уменьшения количества семян пораженных гельминтоспориозно-фузариозными возбудителями корневых гнилей. Показано, что под действием бактерий Pseudomonas sp. B-6798 в лабораторных тестах происходит увеличение длины проростка в зоне бактериального концентрационного оптимума в 1,5-3,5 раза, сухой биомассы - 1,5-5 раз, количества корней второго порядка (для кукурузы) и суммарной длины корневой системы (для пшеницы и овса) - 1,7-3,0 раза и 1,5-3,6 раза соответственно. В полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития растений под действием бактерий Pseudomonas sp. B-6798 как в монокультуре, так в смешанной культуре с другими ризобактериями в 1,1-2,9 раз относительно контроля, которая наиболее отчетливо проявляется на начальных этапах их развития.

В СССР исследования в этом направлении были начаты Я. П. Худяковым (1935), который выделил бактерии рода Pseudomonas, лизирующие F. graminearum, F. lini для предохранения льна и пшеницы от заболевания фузариозом [111] Эти микроорганизмы с успехом были использованы в широких полевых опытах для борьбы с фузариозом разных полевых культур [72, 95].

Из окрашенных веществ, синтезируемых бактериями рода Pseudomonas, были выделены химические вещества, обладающие антибиотическими свойствами, - пиоцианин, хлорорафин, оксихлорорафин, феназин-1-карбоновая кислота и эругинозин. Все перечисленные пигменты обладают антибиотической активностью против фитопатогенных грибов [36, 152].

Важную роль в ограничении численности фитопатогенных микроорганизмов играют синтезируемые псевдомонадами сидерофоры -- соединения, осуществляющие транспорт железа. Их отличительная способность -- образование стабильных комплексов с трехвалентным железом. Связывая ионы трехвалентного железа в почве, сидерофоры лишают многие виды фитопатогенных грибов необходимого элемента питания, что приводит к остановке развития последних. К сидерофорам относится псевдобактин (пиовердин), полученный из разных видов Pseudomonas. Установлено, что подавление прорастания хламидоспор Fusarium oxysporum сидерофорами происходит при концентрации железа в почве 10?ІІ...10-27М. Препараты на основе сидерофоров (псевдобактин, агробактин и др.) не только снижают численность популяции патогенов, но и стимулируют рост растений [95, 16, 125].

Кроме антибиотиков, бактерии рода Pseudomonas синтезируют витамины. Советские и зарубежные исследователи еще в 30-х годах нашего столетия отмечали, что в состав желто-зеленого флуоресцирующего пигмента, синтезируемого псевдомонадами, входят рибофлавин, фолиевая кислота, птерин [36].

В настоящее время имеются сведения об антагонистической активности бактерий р. Mycobacterium. Так, в исследованиях Н.В. Козловской, И.О. Обгольцевой, Е.П. Яковлевой (1998) обнаружено, что бактерии р. Mycobacterium обладают антагонистической активностью в отношении фитопатогенного гриба Fusarium solani, выделенного из стебля огурца [46]. Ю. М. Возняковская и О. Г. Широков (1962) обнаружили антагонистическое действие M. Mucosum и M. Globiform на Botrytis cinerea [2]. Сведения об антагонистической активности этих бактерий в отношении фитопатогенов в литературе крайне ограничены Учитывая высокую антагонистическую активность различных видов микобактерий, при более тщательном изучении возможно обнаружение среди них высокоактивных в отношении фитопатогенов штаммов, синтезирующих антибиотики [46]. Кроме того, микобактерии прекрасно развиваются в почве с минимальной влажностью, при температуре, которая задерживает рост фитопатогенных грибов [36].

1.3.2 Актиномицеты-антагонисты

Впервые о возможности применения актиномицетов и продуцируемых ими антибиотиков в растениеводстве было заявлено рядом ученых на конференции в г. Ереване в 1958 году. Принципы использования антагонистически активных микроорганизмов были разработаны Н. А. Красильниковым [55, 57, 58, 59].

В настоящее время среди актиномицетов выделены штаммы, антагонистически активные в отношении возбудителей различных болезней. Так, в Турции для биологической борьбы с некоторыми видами почвенных патогенов рекомендована раса С/2-9 актиномицета Streptomyces ochraceiscieroticus, ею обрабатывают семена, рассаду, почву в целях защиты сельскохозяйственных культур. В Великобритании S. griseus, встречающийся на соломенных тюках и других субстратах с соломой, на которых выращивали огурцы в теплицах, также подавлял корневые гнили [19]. Существуют штаммы актиномицетов, антагонистически активные в отношении фузариоза. Исследованиями М. М. Кулдыбаева, Г. Ш. Сейкетова получен спиртовой концентрат антибиотика актиномицета штамма 23/791 с активностью 19000-65000 ед/мл по отношению к F. oxysporum и F. solani [61]. Имеются штаммы актиномицетов-антагонистов бактериоза томатов, вертициллезного увядания хлопчатника, антракноза цитрусовых, папайи и сахарного тростника [163], мучнистой росы огурцов [165].

Большинство исследователей свидетельствует, что высокой антагонистической активностью обладают преимущественно представители рода Streptomyces. Доказана высокая эффективность использования метаболитов актиномицетов в качестве ингибиторов роста патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания сельскохозяйственных растений [104, 114, 134, 153].

Актиномицеты в процессе своей жизнедеятельности, помимо антибиотиков, способны синтезировать витамины, аминокислоты, ауксины, которые также применяются в растениеводстве для повышения урожайности и стимулирования прорастания семян [36, 58; 66, 67, 113].

Одна из характерных особенностей лучистых грибков - большая изменчивость. При наблюдении в микроскопе культур актиномицетов можно легко обнаружить разнообразие морфологии клеток. Одни клетки имеют однородную плазму, другие - зернистую, вакуолистую. Гифы мицелия в отдельных участках могут выглядеть раздутыми и не окрашиваются основными красками. В других участках гифы могут покрываться почкообразными выростами. Величина отдельных клеток может также сильно варьировать. Можно сказать, что в культурах нет совершенно одинаковых двух-трех клеток. Такое явление называется полиморфизм, или возрастной изменчивостью организма.

Благодаря разнообразию своих клеток актиномицеты имеют большую возможность приспособиться к различным условиям среды. Кроме того, они неразборчивы в выборе пищи. Благодаря таким свойствам они широко распространены в природе, могут легко выращиваться в лабораторных условиях.