Общая характеристика березового гриба (чаги)

Размещено на http://www.allbest.ru/

3

Введение

березовый гриб тритерпеновый флавоноид

На современном этапе наблюдается тенденция к увеличению спроса на лекарственные средства, получаемые на основе растительных соединений. Поэтому целесообразно использовать резервы природной флоры Республики Казахстан, представляющих собой уникальные запасы биологически активных соединений, обладающих широким спектром действия. В этом отношении интерес представляет березовый гриб - чага. Чага издавна применялась в народной медицине как симптоматическое средство при язвенной болезни, гастритах, злокачественных опухолях, как средство, регулирующее сердечно-сосудистую и дыхательную системы. Вместе с тем, химический состав чаги изучен слабо, в результате чего встает необходимость в изучении фармакологически активных веществ данного растения и выделение их в индивидуальном состоянии или в виде естественных комплексов. Исходя из этого, определяется цель нашей работы.

Объект исследования: березовый гриб (чага) - стерильная форма фитопатогенного гриба трутовика скошенного семейства гименохеновых грибов.

Цель работы: проект экспертизы природного сырья, проведение фармакопейного и химического исследования березового гриба (чаги).

Задачи исследования: литературный анализ химического состава и биологической активности березового гриба (чаги):

1. обзор основных классов химических соединений содержащихся в березовом грибе (чаги);

2. установление фармакопейных показателей (зольность, влажность, экстрактивные вещества, хромогенный комплекс);

3. изучение химического состава березового гриба (чаги);

4. проект экспертизы природного сырья березового гриба (чаги).

Методы исследования: различные виды хроматографии, перегонка экстракция, ИК - спектроскопия.

Актуальность исследования заключается в том, что полученные результаты исследования позволяют предложить новые подходы к стандартизации природное сырье, являющегося ценным источником биологически активных соединений.

Теоретическая новизна заключается в том, что наряду с известным составом чаги были открыты ранее не определенные вещества, предложена новая методика стандартизации сырья.

Практическая значимость дополнительное исследование чаги позволяет объяснить физиологическое действие препарата и расширяет спектр его применения.

Положения, выносимые на защиту:

1. обоснование актуальности темы на основании литературного обзора;

2. стандартизация фармакопейных показателей березового гриба (чаги);

3. результаты исследования химического состава березового гриба (чаги);

4. биологическая активность спиртового экстракта березового гриба (чаги).

1. Общая характеристика березового гриба (чаги)

1.1 Описание растения

Чага (Fungus betulinus) - стерильная форма фитопатогенного гриба инонотуса скошенного (трутовик косогубчатый, трутовик косой) - Inonotus obliquus Pilat. F. Sterilis [1].

Рисунок 1.1 - Березовый гриб (чага)

Чага представляет собой бесплодную (стерильную) форму трутовика скошенного семейства гименохитоновых грибов. В нижней и средней части стволов живых деревьев (в месте первоначального проникновения спор) развивается бесформенный нарост (желвакообразной формы), выступающий из-под разрывающейся коры, диаметром 5 - 40 сантиметров (называемых чагой (Рисунок 1.1)). С возрастом нарост приобретает вид полушаровидного валика и через 10 - 15 лет достигает веса 4 - 5 кг. Поверхность нароста черная, глубоко растрескивающаяся, внутренняя его часть темно-коричневая, ближе к древесине рыже-бурая с белыми прожилками, состоящими из бесцветных гифов. Участки, прилегающие к стволу, содержат не только гифы гриба, но и клетки древесины [2].

После отмирания дерева развитие чаги прекращается, но на противоположной стороне ствола обычно появляется плодовое тело гриба буро-коричневой окраски, распростертое по субстрату и простирающееся по длине ствола на 0,5 - 1 см. Плодовое тело первоначально развивается под корой, причем по его краю образуется так называемые упорные пластинки, представляющие собой грибневидные выросты с уплощенной верхней частью. Когда заканчивается созревание плодового тела и начинается процесс споруляции, кора дерева под давлением упорных пластинок растрескивается и отстает. Как только кора спадает, споры высыпаются, разносятся ветром, и цикл развития гриба повторяется [2].

Лекарственным сырьем являются наросты, возникающие на березах при поражении их грибом трутовика скошенного [3].

1.2 Места обитания

В природе известно около 25000 видов базидиомицетов, из которых около 500 видов трутовиков. Трутовики широко распространенны в Европе, Азии, северной Америке и Африке, но оценена биологическая активность только небольшой их части. В России, Польше, Белоруссии, Казахстане березовый гриб (чага) более известен как лекарственное средство, которое используется с древних времен [4].

Чага - широко распространенный гриб. Он поражает преимущественно старую или приспевающую березу. Старые деревья более подвержены заражению грибами, так как с возрастом у дерева снижается способность образовывать раневое ядро, препятствующее проникновению спор внутрь древесины. На молодых деревьях лучше сопротивляющихся вредным внешним воздействиям, чага встречается реже. Иногда чага развивается также на ольхе, реже на рябине, клене, буке, вязе. Грибные нити проникают в древесину, постепенно разрушая его (болезнь дерева называется «белой сердцевиной гнилью»). Чага поражает стволы только живых деревьев [5].

Условия произрастания также играют важную роль, например, растущие в горах деревья реже поражаются чагой, так как их древесина имеет более плотную структуру [6]. Наиболее распространена чага в лесах северных широт.

Причиной образования чаги является заражение коры дерева паразитным трутовым грибом. Споры его рассеиваются по воздуху и прорастают лишь в тех случаях, когда попадают на пораженные вследствие различных причин участки коры деревьев. Образующийся нарост постепенно разрастается, значительно увеличиваясь в размерах. Иногда масса его достигает 3 - 5 кг и более. Рост чаги при благоприятных для ее развития условиях может продолжаться более 15 лет.

Форма наростов чаги зависит от характера повреждений, через которые береза заражается трутовым грибом. Большей частью наросты имеют округлую или вытянутую форму.

1.3 Заготовка и качество сырья

Заготавливают чагу только с живых или свежесрубленных, старых берез. На сухостое или валежнике чага разрушается, и содержание в ней биологически активных веществ резко снижается [7].

Собирать чагу можно в любое время года. Однако чаще всего ее заготавливают поздней осенью, зимой или ранней весной, когда на деревьях нет листьев и чагу легче заметить.

Чагу подрубают топором у ствола дерева, а затем от нее отсекают непригодную для использования рыхлую светлоокрашенную часть [8].

Собранную чагу рубят на куски по 3 - 6 см и сушат в сушилках или печах при температуре не выше 50-60 С. Высушенное сырье должно содержать не менее 20 % экстрактивных веществ и не более 12 % влаги. Допускается присутствие рыхлой светло-коричневой или желтой легко крошащейся части древесины - не более 25 %, вросших в куски чаги остатков древесины - не более 5 % [6], хромогенного комплекса не менее 50 %, бересты не более 1 % [9].

Согласно требованиям Фармакопейной статьи ФС 42-53-72 готовое сырье чаги состоит из кусков неопределенной формы с черным, сильно растрескивающимся наружным слоем. Ткань нароста очень плотная, твердая. Цвет темно-коричневый с мелкими желтыми прожилками, число которых увеличивается к внутренней части нароста. Размер кусков около 10 см в поперечнике, запах отсутствует, вкус горьковатый [10].

Сырье чаги упаковывают в мешки по 20 - 30 кг и хранят в закрытом сухом, хорошо проветриваемом помещении, оберегая от сырости. Отсыревшая чага легко плесневеет и становится непригодной к употреблению. Срок годности не более двух лет [10].

1.4 Применение

В народной медицине чага известна также под названием «черный березовый гриб» или березовая губа (губа по-старославянски «gaga»), возможно отсюда название «чага». Чага - старинное излюбленное средство жителей северных районов России, применяемое для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний и даже рака [11-12]. Чагой в сочетании с другими растениями лечат язву желудка и двенадцатиперстной кишки, гастриты. В полевых условиях, в лесу пьют чай из чаги при расстройстве желудка, тяжести и болях в кишечнике. Популярен чай из чаги у охотников и лесников. Он утоляет голод, снимает усталость, бодрит, улучшает общее самочувствие и повышает работоспособность. В некоторых районах жители вместо чая используют чагу. Было замечено, что в таких областях заболеваемость раком меньше, чем в соседних. Чагу используют как общеукрепляющее средство для повышения общего тонуса организма. Больного поят настоем чаги, если нужно снизить артериальное или венозное давление [12].

На электроэнцефалограммах коры больших полушарий в эксперименте наблюдается отчетливое повышение спонтанной биоэлектрической активности коры, что свидетельствует о благоприятном влиянии галеновых препаратов чаги на обмен веществ и функции некоторых отделов коры головного мозга. Настоями чаги лечат пародонтоз, экзему, дерматит, псориаз. Ингаляциями с использованием чаги с травами снимают воспалительный процесс при опухолях гортани, что облегчает дыхание. Ссадины, порезы присыпают порошком чаги, чтобы прекратить нагноение раны [13]. Чага нетоксична, хорошо переносится и практически не имеет противопоказаний к применению. Ее используют в животноводстве. Добавление чаги в рацион свиней стимулирует рост поросят и прибавку в весе. Шрот чаги применяют в качестве удобрения для защиты растений от фитофтороза и симуляции роста. Настои чаги используют для консервирования овощных и ягодных соков. Чага обладает большой адсорбционной емкостью, что позволило ее применять как средство по очистке воды.

Интерес к чаге не угасает. В современной народной и научной медицине чага используется как самостоятельно, так и в составе многокомпонентных препаратов для внутреннего и наружного применения в виде отваров, настоев мазей и прочего [14].

Запатентованы композиции с включением чаги, обладающие общеукрепляющим, тонизирующим, противоопухолевым действием, для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, послеоперационного лечения злокачественных новообразований, синдрома хронической усталости. Широкий спектр действия предполагает наличие богатого комплекса биологически активных веществ.

Из чаги получают препарат «Бефунгин» (экстракт чаги + соли кобальта: CoCl₂ 0,175 % или NiSO₄ 0,2 %), который используется при хронических гастритах, дискензиях желудочно-кишечного тракта, при язвенных болезнях желудка. Используют в форме настоя. Настой чаги не токсичен, но его ограничивают при заболеваниях, сопровождающихся задержкой жидкости в организме [14]. В настоящее время разрешены в качестве общеукрепляющих биологически активные добавки капсулы и фитоэлексир «Чаговит», драже «Экстрабесунгин», бальзам «Березка», таблетки «Литовит Ч», сухой экстракт, порошок и другие производные чаги.

Побочные явления: при длительном применении препаратов чаги у некоторых больных наблюдается повышенная возбудимость вегетативной, нервной системы. Эти явления постепенно исчезают при уменьшении дозы или отмене препарата [3].

1.5 Химический состав

Химический состав чаги впервые исследовал Г. Драгендорф в 1864 году и, не найдя активные субстанции (гликозиды, алколоиды), потерял к ней интерес. Только через 100 лет советские исследователи П.А. Якимов, А.А. Шиврина, Е.В. Ловягина, Е.Г. Платонова и другие провели достаточно полный химический анализ чаги и концентрата на ее основе в сравнении с другими трутовыми грибами.

1.5.1 Терпеновые соединения

Производными циклогексана является большая группа природных веществ преимущественно растительного происхождения, известных под названием терпенов. Они входят в состав смол хвойных деревьев и эфирных масел. Термин «терпены» происходит от названия терпентинового дерева, из смолы которого был получен первый представитель [16].

Для терпенов характерно число атомов углерода, кратное 5, то есть 5, 10, 15 и т.д. Хотя большая часть терпенов - ненасыщенные углеводороды, к этой группе соединений относятся также соответствующие спирты, кетоны, карбоновые кислоты и даже пероксиды.

Монотерпены состоят их двух остатков изопрена С₅Н₈. Соединения, кратные по составу изопрену, очень распространены в растениях. Такие производные называют изопреноидами [16].

В 1920 году Ружичка приступил к классическим экспериментам, в результате которых было сформулировано «изопреновое правило». Это правило, суммировавшее все предшествующие исследования по установлению строения терпенов, гласит, что терпены образуются в результате полимеризации изопрена по типу «голова - хвост». Изопрен сам по себе не является строительным материалом терпенов в растениях. Тем не менее, можно рассматривать терпены как полимеры изопрена [17].

Таким образом, известна следующая классификация терпенов:

По количеству остатков изопрена в молекуле:

- терпены или монотерпены, соответствующие формуле С₁₀Н₁₆ - димеры изопрена;

- сесквитерпены (полуторатерпены) - тримеры изопрена состава С₁₅Н₂₄;

- дитерпены С₂₀Н₃₂ - тетрамеры изопрена;

- тритерпены С₃₀Н₄₈;

- тетратерпены С₄₀Н₆₄;

- политерпены (С₅Н₈)_n.

Иногда углеводороды состава С₅Н₈ (изопрен и его изомеры), называют гемитерпенами, то есть полутерпенами [16].

В свою очередь, каждый ряд терпенов разделяется на группы:

1. Алифатические, или ациклические терпены - соединения с открытой цепью углеродных атомов. Собственно терпены этой группы (С₁₀Н₁₆) содержат три двойные связи;

2. Карбоциклические терпены - содержат одно или несколько колец углеродных атомов. По числу колец терпены разделяют на:

a) моноциклические, содержащие одно шестичленное кольцо и две двойные связи;

b) бициклические, содержащие два кольца, одно из них обычно шестичленное, а второе пяти-, четырех- или трехчленное. Терпены этой группы содержат только одну двойную связь;

c) трициклические, содержат три кольца углеродных атомов, из которых хотя бы одно шестичленное. Терпены этой группы не содержат двойные связи и являются насыщенными карбоциклическими соединениями;

d) дитерпены, тритерпены и политерпены могут содержать и более трех циклов. Производные терпенов по характеру функциональных групп подразделяют на спирты, альдегиды, кетоны, окиси, гидроокиси, перекиси, кислоты галогенопроизводные [17].

Плотность (с) терпенов обычно меньше 1, Т_кип собственно терпенов колеблется от 150 до 190 °С, сесквитерпенов от 230 до 300 °С, дитерпенов выше 300 °С. Терпены не растворимы в воде, но хорошо растворимы в органических растворителях (особенно неполярных). Собственно терпены легко перегоняются с водяным паром, сескви- и дитерпены - труднее, а три- и политерпены практически не перегоняются. Запах терпенов, как правило, приятный. Особенно у алифатических и моноциклических терпенов, их спиртов и эфиров. Терпены весьма реакционноспособные соединения, они легко окисляются на воздухе, особенно на свету, и превращаются при этом в кислородсодержащие полимеры; легко изомеризуются при нагревании, особенно в присутствии кислых агентов. По двойным связям терпены легко гидрогенизируются, гидратируются, присоединяют галогены, кислород, серу. При длительном нагревании без доступа воздуха (400-500 °С) кольца терпенов раскрываются, при этом из бициклических терпенов можно получить моноциклические и даже алифатические терпены. При нагревании до 700 °С и выше все терпены деполимеризуются до изопрена [18].

Из растений терпены выделяют перегонкой с паром, сухой перегонкой, экстракцией летучими растворителями. Индивидуальные терпены выделяют из их смесей фракционной перегонкой в вакууме на колонках, методами хроматографии и другими способами [19].

Тритерпеновые соединения

Тритерпеновые соединения - класс соединений, широко распространенных в различных вегетативных органах березы.

Тритерпены, имеющие гликозидный характер, называют тритерпеновыми сапонинами (гликозидами). Термин «сапонин» или «сапонозид», был впервые предложен в 1819 г. Мэлоном для вещества, выделенного Шрайдером в 1811 г. из мыльнянки. Сапонины представляют собой сложные органические соединения гликозидного характера. Большинство из них вызывают гемолиз эритроцитов крови. Водные растворы сапонинов (или извлечения из растительного сырья) образуют при встряхивании обильную пену, подобно мыльной, в результате чего эти вещества и получили название сапонинов, от латинского слова sapo - мыло. Сапонины весьма токсичны для холоднокровных животных. Они вызывают гибель (или парализуют) их даже в очень больших разведениях (1:1000000). Молекулы сапонинов, как и других гликозидов, состоят из углеводной части и агликона, который называется сапогенином. По структуре сапогенина (агликона) сапонины разделяются на две группы, значительно отличающиеся по свойствам: стероидные и тритерпеновые гликозид. Особое внимание привлекают тритерпеновые, обладающие широким спектром биологического действия и являющиеся ценными лекарственными средствами [20].

Тритерпеновые сапонины - пентациклические терпеноиды, в которых изопреновая структурная единица С₅Н₈ повторяется пятикратно (Рисунок 1.2).

Рисунок 1.2 - Структура пентациклического тритерпена

В их углеводных компонентах могут находиться от 1 до 10 различных моносахаров, отличающихся местами присоединения и видом связи. В состав углеводной части молекулы сапонинов входят моносахара: D-глюкоза, D-галактоза, L-ксилоза, D-галактуроновая кислота, L-рамноза, реже другие [21].

Почти все терпеновые сапонины растительного происхождения можно подразделить по строению агликона на 4 группы (Рисунок 1.3):

Рисунок 1.3 - Основные группы тритерпеновых сапонинов

Производные лупеола - бетулин и бетулиновая кислота - выделены из березы. Бетулиновая кислота является обычным компонентом бересты, листьев, березового гриба (чаги), хотя её содержание значительно ниже, чем бетулина. Береста березы является местом максимальной локализации тритерпеновых гликозидов, в настоящее время изучен химический состав 27 видов берез. Из них наиболее полно - береста березы бородавчатой, из которой выделено 17 производных лупана и олеана [20].

Идентификация бетулина и его аналогов

Для идентификации тритерпеновых соединений нет индивидуальных специфических, качественных реакций. Наиболее часто применяется ТСХ в системах для нейтральных тритерпеноидов: н-бутиловый спирт - этанол - вода; н-бутиловый спирт - уксусная кислота - вода в различных соотношениях; хлороформ - метанол - вода (65:35:10); хлороформ - этанол (10:1), (7:3);

хлороформ - бензол (10:1).

В качестве проявителей используются:

- 20 % серная кислота с последующим нагреванием в сушильном шкафу при 115-120 °С (коричнево-фиолетовое окрашивание);

- 5 % ФМК в спирте с последующим нагреванием в сушильном шкафу до 170 °С (синее окрашивание);

- раствором сульфата церия (III) в 30 % серной кислоте и нагреванием пластин при 110 °С (розовое окрашивание).

1.5.2 Органические кислоты

В составе чаги были обнаружены следующие органические кислоты: щавелевая, муравьиная, уксусная, масляная, ванилиновая, п-оксибензойная кислоты, две тритерпеновые из группы тетрациклических тритерпенов, обликвиновая, инонотовая, агарициновая, гуминоподобная чаговая кислота [3].

Органические кислоты оказывают большое влияние на организм человека, обладая способностью участвовать в обменных процессах. Ароматические карбоновые и оксикарбоновые кислоты обладают противовоспалительным действием [22].

Гуминоподобная чаговая кислота относится к группе гуминовых кислот, представляющих собой смесь природных органических соединения, образующихся при разложении отмерших растений и их гумификации. По химической структуре гуминовые кислоты - высокомолекулярные (M=1300-1500 г/моль) конденсированные ароматические соединения, в которых установлено наличие фенольных гидроксилов, карбоксильных, карбонильных и ацетогрупп, простых эфирных связей и другие. Элементный состав: 50 - 70 % углерода, 4 - 6 % водорода, 25 - 35 % кислорода.

Гуминовые кислоты могут использоваться как стимуляторы роста растений и антисептики при лечении кожных болезней сельскохозяйственных животных [23].

В составе чаги найдены 15 амининокислот, среди которых преобладающими были: глицин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты (40 % от суммы всех кислот), а также тирозин, серин, треонин, лейцин, метионин, лизин, гистидин [24].

Глицин активно участвует в обеспечении кислородом процесса образования новых клеток. Является важным участником выработки гормонов, ответственных за усиление иммунной системы.

Эта аминокислота является исходным веществом для синтеза других аминокислот, а также донором аминогруппы при синтезе гемоглобина и других веществ. Глицин очень важен для создания соединительных тканей.

Глютаминовая кислота служит важным источником аминогруппы в метаболических процессах. Глютаминовая кислота способна присоединять аммиак, превращаясь в глютамин, и переносить его в печень, где затем образуется мочевина и глюкоза, который важен для нормализации уровня сахара, повышении работоспособности мозга, при лечении алкоголизма, помогает бороться с усталостью, мозговыми расстройствами - эпилепсией, шизофренией и просто заторможенностью, при лечении язвы желудка, и формирование здорового пищеварительного тракта.

Аспарагиновая кислота способствует превращению углеводов в глюкозу и последующему запасанию гликогена. Аспарагиновая кислота служит донором аммиака в цикле мочевины, протекающем в печени. Повышенное потребление этого вещества в фазе восстановления нормализует содержание аммиака в организме. Аспарагиновая кислота может встречаться во фруктовых соках и овощах.

Тирозин необходим для нормальной работы надпочечников, щитовидной железы и гипофиза, создания красных и белых кровяных телец. Синтез меланина, пигмента кожи и волос, также требует присутствия тирозина. Тирозин обладает мощными стимулирующими свойствами.

Треонин обладает липотрофными свойствами. Он необходим для синтеза иммуноглобулинов и антител. Важная составляющая коллагена, эластина и протеина эмали; участвует в борьбе с отложением жира в печени; поддерживает более ровную работу пищеварительного и кишечного трактов; принимает общее участие в процессах метаболизма и усвоения. Регулирует передачу нервных импульсов нейромедиаторами в мозгу и помогает бороться с депрессией.

Гистидин почти на 60 % всасывается через кишечник. Он играет важную роль в метаболизме белков, в синтезе гемоглобина, красных и белых кровяных телец, является одним из важнейших регуляторов свертывания крови. В большом количестве содержится в гемоглобине. Гистидин легче других аминокислот выделяется с мочой. Поскольку он связывает цинк, большие дозы его могут привести к дефициту этого металла.

Лейцин необходимой для построения и развития мышечной ткани, синтеза протеина организмом, для укрепления иммунной системы. Понижает содержание сахара в крови и способствует быстрейшему заживлению ран и костей.

Лизин обеспечивает должное усвоение кальция; участвует в образовании коллагена (из которого затем формируются хрящи и соединительные ткани); активно участвует в выработке антител, гормонов и ферментов. Лизин служит в организме исходным веществом для синтеза карнитина.

Метионин является основным поставщиком сульфура, который предотвращает расстройства в формировании волос, кожи и ногтей; способствует понижению уровня холестерина, усиливая выработку лецитина печенью; понижает уровень жиров в печени, защищает почки; участвует в выводе тяжелых металлов из организма; регулирует образование аммиака и очищает от него мочу, что понижает нагрузку на мочевой пузырь; воздействует на луковицы волос и поддерживает рост волос. Так же важное пищевое соединение, действующее против старения, так как оно участвует в образовании нуклеиновой кислоты - регенерирующей составной части белков коллагена. Чрезмерное потребление метионина приводит к ускоренной потере кальция.

Серин участвует в запасании печенью и мышцами гликогена; активно участвует в усилении иммунной системы, обеспечивая ее антителами; формирует жировые «чехлы» вокруг нервных волокон.

Серин может быть синтезирован в организме из треонина. Он также образуется из глицина в почках. Серин играет важную роль в энергоснабжении организма. Кроме того, он является компонентом ацетилхолина [24].

1.5.3 Витамины группы В

Витамины - сложные биологически активные, низкомолекулярные органические соединения, имеющие различное химическое строение. Они необходимы для нормального течения процессов обмена веществ. Большинство из них входит в состав ферментов, являясь их коферментами.

Витамины в организме не синтезируются или некоторые синтезируются, но в недостаточном количестве. Отсутствие витаминов или недостаток их в организме приводит к развитию различных заболеваний - гипо- или авитаминозам. Источниками витаминов служат в развитию различных заболеваний - гипо- или авитаминозам. Источниками витаминов служат в основном пищевые продукты, растения, а также продукты животного происхождения [24].

Витамины классифицируются по растворимости на жиро- и водорастворимые витамины. К жирорастворимым витаминам относятся витамины: A, D, E, K, Q, F; к водорастворимым: B₁, B₂, B₃, B₄, B₅, B₆, B₈, B₁₂, B₁₅, B_C, C, P, H, U.

В состав чаги входит витамин В₁ (Рисунок 1.4) (тиамин, 4-метил-5b-оксиэтил-N-2^\-метил-4^\-амино-5^\-метилпиримидин-тиазолий).

Рисунок 1.4 - Витамин В₁

Тиамин существует обычно в виде солей, одна из которых - тиаминхлорид (С₁₂Н₁₇ОN₄SCl·HCl; M=337,27 г/моль, кристаллизуется с ? Н₂О в виде бесцветных моноклинических игл с Т_плав=233-244 С и 250-252 С). Известны также тиаминбромид (С₁₂Н₁₇ОN₄SBr·HBr·1/2Н₂О; М=435,19 г/моль; Т_плав=220 С и 229-231 С) и тиаминмононитрат (С₁₂Н₁₇ОN₄SNO₃; М=327,37 г/моль; Т_плав=164-165 С и 196-200 С).

Соли тиамина хорошо растворимы в воде, хуже в спирте, не растворимы в эфире, хлороформе, бензоле и ацетоне.

Биологическое значение тиамина обусловлено действием его производного - тиаминдифосфата, образующего из тиамина и АТФ при участии фермента тиаминазы. Тиаминдифосфат является коферментом ряда ферментов, играющих существенную роль в углеводном обмене - пируватдегидрогеназы, -кетоглуторатдегидрогеназы, транскетолазы и дегидрогеназ кетокислот с разветвленной боковой цепью. Тиамин в виде ТДФ принимает непосредственное участие в осуществлении каталитического акта благодаря своей способности диссоциировать с отщеплением протона при втором углеродном атоме тиазолового кольца, после чего тиамин приобретает структуру высокоактивного биполярного иона, который взаимодействует с молекулой превращаемого субстрата [26].

Недостаток тиамина в организме человека и животных ведет к нарушению окисления углеводов, торможению зависящих от тиаминдифосфата процессов энергетического и пластического обеспечения жизненных функций, накоплению в крови и тканях недоокисленных продуктов обмена веществ, что, в свою очередь, приводит к патофизиологическим и патоморфологическим изменениям, создающим картину гиповитаминоза В₁, одной из форм которого является бери-бери.

При недостатке тиамина наиболее значительные патологические изменения развиваются в пищеварительной, нервной и сердечно-сосудистой системах. Характерными проявлениями гиповитаминоза В₁ является общая слабость, потеря веса тела вплоть до кахексии.

Тиамин широко распространен в живой природе. Он присутствует в микроорганизмах, растениях и всех тканях животного организма. В организме человека и высших животных тиамин не синтезируется, поэтому они должны получать его с пищей. Потребность человека в тиамине составляет 0,6 мг на 1000 ккал суточного рациона или 1,5 до 2,4 мг в сутки в зависимости от энергетических затрат [26].

1.5.4 Флавоноиды

Флавоноиды представлены многочисленной группой природных биологически активных соединений - производных бензо-г-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С₆-С₃-С₆ -углеродных единиц (Рисунок 1.5):

Рисунок 1.5 - Схема строения молекулы флавоноидов

Под термином флавоноиды объединены различные соединения, генетически связанные друг с другом и обладающие различными фармакологическим действием.

Свое название они получили от латинского слова «flavus» - желтый, поскольку первый выделенный из растений флавоноиды имели желтую окраску. Флавоноиды широко распространены в высших растениях, значительно реже встречаются в микроорганизмах и насекомых.

Около 40 % флавоноидов приходится на группу производных флавонола, несколько меньше группа производных флавона, значительно реже встречаются флаваноны, халконы, ауроны [15].

В группу флавоноидов входят многие красящие вещества, такие, как антоцианы, придающие тканям растений красную, розовую, синюю и фиолетовую окраски, флавонолы, халконы и ауроны, являющиеся носителями желтой и оранжевой окраски. Встречаются флавоноиды в цветах, плодах, корнях, семенах и древесине [27].

Флавоны - довольно нестабильные вещества, часто встречаются в растениях. Они способны образовывать С-гликозиды. Достаточно часто встречаются только два флавона: апигенин и лютеолин [28].

Флавонолы широко распространены в растительном мире. Наиболее известны из них кемпферол (3,5,7,4¹ - тетраоксипроизводное), встречающийся во многих растениях в форме гликозида, кверцитин (3,5,7,3¹,4¹- пентаоксипроизводное), изорамнетин, мирицетин (3,5,7,3¹,4¹,7¹- гексаоксипроизводное), кверцетагетин и госсипетин (3,5,7,8,3¹,4¹- гептаоксипроизводное) [28]. Это самые окисленные соединения в ряду флавоноидов. Они отличаются от флавонов наличием гидроксильной группы при третьем атоме углерода [28]. Флавонолы нестабильны в присутсвии кислорода [29], способны образовывать полигидроксилированные и полиметоксилированные соединения. Флавонолы окрашены в светло-желтый или желтый цвет.

Изофлавоноиды образуются в связи с перемещением фенильной группы от углеродного атома С₂ к С₃ флавоноидной циклической системы. Большинство известных изофлавоноидов относятся к изофлавонам, но встречаются представители других классов. Биофлавоноиды образуются в результате реакций конденсации, в которые могут вступать многие мономерные флавоноиды [30].

Халконы являются мало изученной группой флавоноидов. В растениях присутствуют исключительно в виде гликозидов.

Наиболее известным представителем является флоридзин (флоретин-2^\-глюкозид), найденный в различных видах Malus, где он содержится в коре корней, листьях, молодых побегах и семенах [30].

2. Экспериментальная часть

Для стандартизации сырья (березового гриба - чаги) необходимо ввести «сигнальные» показатели по которым можно судить о качестве сырья: влажность, зольность, экстрактивные вещества и хромогенный комплекс. Определение фармакопейных показателей проводили согласно методики ГФ 42-53-72 [28].

2.1 Определение фармакопейных показателей

2.1.1 Определение влажности

Для проведения трех параллельных определений было взято 3 фарфоровых тигля. Тигли промыли, высушили, а затем в течение 40 минут прокаливали в муфельной печи. После чего были взвешены. Прокаливание и взвешивание проводили до получения постоянной массы. Затем 3 навески измельченного сырья массой 1 г поместили во взвешенные тигли и поставили в сушильный шкаф, нагретый предварительно до 100-105 С. При данной температуре навески высушивали в течение 3 часов, после чего взвесили. Высушивание производили до достижения постоянной массы, т.е. до тех пор, пока разница между двумя последующими взвешиваниями не будет превышать 0,01 г [15].

Содержание влаги в сырье Х, (%), вычисляется по формуле (2.1):

где m - масса навески сырья до высушивания, г;

m₁ - масса навески сырья после высушивания, г.

Эксперимент был проведен тремя параллельными определениями (Таблица 2.1). За окончательный результат определений принимаем среднее арифметическое трех параллельных определений вычисленных до десятых долей %. Допускаемое расхождение между результатами трех параллельных определений не должно превышать 0.5 %. Статистическую обработку проводили согласно методики Стьюдента по формулам (2.2, 2.3, 2.4) [31-32].

^, (2.2)

где S_x - стандартное отклонение многократного определения одной пробы (для каждой ј - ой пробы);

x_j- полученное значение для ј - го определения;

- среднее значение;

n - число параллельных определений (n = 3).

Точность определения метода при числе параллельных определений равном трем (n =3):

^, (2.3)

где ± ДX - точность определения метода;

t(P,f) - табличное значение коэффициента Стьюдента (2.92);

S_x - стандартное отклонение многократного определения одной пробы (для каждой ј - ой пробы);

n - число параллельных определений (n = 3).

Результаты трех параллельных определений представлены в виде:

, (2.4)

где X_ср - среднее арифметическое всех определений;

± ДX - точность определения метода.

Таблица 2.1 - Содержание влаги в березовом грибе (чага)

№ опыта	1	2	3
Влажность, %	13	12.7	12.9
Среднее значение влажности, %	12.9
Точность метода определения влажности, %	Х =12.9±0.27

Содержание влаги в сырье (чага) составляет 12.9±0.27 %, что соответствует данным Государственной Фармакопеи (13%) [21].

2.1.2 Определение зольности

Навески массой 1 г помещали в предварительно прокаленные до постоянной массы фарфоровые тигли и равномерно распределяли по дну тигля. Тигли с навеской помещали в муфельную печь. Прокаливание ведется при красном калении (550-650 С) до постоянной массы, необходимо избегать спекания золы со стенками тигля. По окончании прокаливания, немного остывшие тигли ставим в эксикатор. Охлажденные тигли взвешиваем. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями не превышает 0,0005 г [15].

Содержание общей золы Х, (%), в абсолютно сухом сырье вычисляется по формуле (2.5):

^, (2.5)

где m₁ - масса золы, г;

m₂ - масса навески сырья, г;

- потеря в массе сырья при высушивании, %.

Эксперимент был проведен тремя параллельными определениями (Таблица 2.2).

Таблица 2.2 - Содержание золы в березовом грибе (чаге)

№ опыта	1	2	3
Зольность, %	8.4	8.8	8.6
Среднее значение зольности, %	8.6
Точность метода определения зольности, %	Х =8.6±0.34

Содержание золы в сырье (чага) составляет 8.6±0.34 %, что соответствует данным Государственной Фармакопеи (9%) [21].

2.1.3 Определение количества экстрактивных веществ

Определение количества экстрактивных веществ проводили при комнатной температуре. Брали три фарфоровые чашки, предварительно доведенные до постоянной массы. В чашки вносили по 5 мл экстракта. Экстракт в фарфоровых чашках выпаривали на водяной бане досуха. Дальнейшее высушивание проводили в сушильном шкафу при температуре 100-105 С.

Содержание экстрактивных веществ Х, (%), рассчитывали от веса сухого сырья по формуле (2.6) [15].

, (2.6)

где m- масса сухого остатка в чашке, г;

m₁- масса сырья, г;

щ- потеря в массе сырья при высушивании, %.

Эксперимент был проведен тремя параллельными определениями (Таблица 2.3).

Таблица 2.3 - Содержание экстрактивных веществ в березовом грибе (чаге)

№ опыта	1	2	3
Экстрактивные вещества, %	21.8	22.0	22.0
Среднее значение экстрактивных веществ, %	21.9
Точность метода определения экстрактивных веществ, %	Х =21.9±0.20

Содержание экстрактивных веществ в сырье (чага) составляет 21.9±0.20 %,что соответствует данным Государственной Фармакопеи (22%) [21].

2.1.4 Определение хромогенного комплекса

10 г измельченного сырья помещают в колбу на 500 мл, приливают 300

мл воды и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Затем соединяют с обратным холодильником и кипятят, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч, после этого фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу емкостью 500 мл.

Сырье переносят на фильтр и промывают теплой водой. Водное извлечение охлаждают до 18-20 °С, доводят объем до метки и тщательно перемешивают. 25 мл фильтрата переносят во взвешенную фарфоровую чашку, выпаривают на водяной бане досуха и сушат при температуре 100-105 °С в течение 3 ч, затем охлаждают в эксикаторе и взвешивают, определяя массу сухого остатка.

Для определения хромогенного комплекса 100 мл фильтрата помещают в стакан емкостью 150 мл, подкисляют 25% раствором HCl (0,5-0,8 мл) до рH 1,0 - 2,0 по универсальной индикаторной бумаге, перемешивают и оставляют на 30 минут. После выпадения осадка фильтруют через складчатый фильтр. 25 мл фильтрата переносят в взвешенную фарфоровую чашку, выпаривают досуха и сушат при температуре 100-150 °С в течение 3 ч.

Содержание хромогенного комплекса в чаге Х, (%), вычисляем по формуле (2.7):

^, (2.7)

где m₁- масса сухого остатка, г;

m₂ - масса сухого остатка без хромогенного комплекса, г;

m - масса измельченного сырья, г;

- потеря в массе сырья при высушивании, %.

Эксперимент был проведен тремя параллельными определениями (Таблица 2.4).



Таблица 2.4 - Содержание хромогенного комплекса в березовом грибе (чаге)

№ опыта	1	2	3
Хромогенный комплекс, %	39.0	38.8	39.3
Среднее значение хромогенного комплекса, %	39.0
Точность метода определения хромогенного комплекса, %	Х =39.0±0.42

Содержание хромогенного комплекса в сырье (чага) составляет 39.0±0.42 %,что соответствует данным Государственной Фармакопеи (39%).

2.2 Исследование спиртового экстракта чаги

Чага широко используется в народной медицине. Для приготовления настоек из чаги чаще всего используется в качестве растворителя этиловый спирт. Поэтому для исследования лекарственных свойств спиртовых экстрактов производим их наработку.

Выделение и идентификация флавоноидов чаги

Березовый гриб - чагу измельчали до мелкодисперсного состояния при помощи электрического измельчителя (РМ-120). Измельченной чагой в виде порошка заполняли изготовленный из фильтровальной бумаги патрон (m_{патрона}=3.82г, m_{патрона+чага}=43.54г, m_чаги=39.72г). Затем патрон помещали в аппарат Сокслета (Рисунок 2.6) и проводили экстракцию спиртом до полного извлечения всех экстрактивных веществ, растворимых в спирте.

В качестве растворителей использовали этиловый спирт. Экстракцию прекращали, когда растворитель в аппарате Сокслета прекращал окрашиваться и оставался бесцветным. Полученный после экстракции раствор (экстракт) изучали с помощью тонкослойной хроматографии с применением цветных реакций.

Рисунок 2.6 - Аппарат Сокслета: 1-экстрагируемое вещество; 2-пористая гильза; 3-трубка сифона; 4-растворитель

Для этого на пластинки «Silufol» наносили анализируемые экстракты. Путем предварительного подбора выявляли наиболее подходящую систему растворителе для хроматографирования флавоноидов.

Для этого использовали следующие системы растворителей:

1. н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5);

2. бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10);

3. хлороформ - бензол - этилацетат (4:8:1).

Анализ хроматограмм в различных системах растворителей показало следующее:

1. в первой системе флавоноиды проявились в виде одного пятна с Rf=0,71, но не проявились другие индивидуальные компоненты (Рисунок 2.7,а);

2. во второй системе наблюдается частичное разделение флавоноидов, но пятна имеют достаточно низкий Rf до 0,1. Однако в данной хроматограмме можно наблюдать другие индивидуальные компоненты такие как фенолокислоты, стерины, терпеновые соединения (Рисунок 2.7,б);

3. третья система часто применяется для терпеновых соединений, хорошо показала разделение фенолокислот кислот от терпеновых соединений. Однако флавоноиды также остались на старте (Рисунок 2.7,в).

Рисунок 2.7 - Спиртовый экстракт чаги в различных системах растворителей

Следовательно, наиболее подходящая система растворителей для хроматографирования флавоноидов является система: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) (Таблица 2.5).

Таблица 2.5 - Качественные реакции на флавоноиды

Реактив	Источник света	Окраска пятен
		Флавонолы	Флавононы	Халконы	Изофлавоны
	Видимый	бл-жел	-	жел	-
	УФ-свет	корич	-	жел-зел	корич
Пары NH3	УФ-свет	яр-зел	бл-жел	красная	тем
5% р-р Na2CO3	Видимый	жел	жел-зел	красная	бл-жел
5% р-р АlCl3	УФ-свет	жел-зел	-	жел	корич

После хроматографирования спиртового извлечения в различных системах растворителей и обработки хроматограмм специфическими проявителями пришли к выводу, что в спиртовом экстракте чаги содержится представители следующих классов: флавоноиды (халконы), терпеновые соединения, фенолокислота, стерины.

2.3 Комплексное исследование химического состава березового гриба - чаги

По литературным данным березовый гриб - чага содержит большое количество соединений, принадлежащих к различным классам биологически активных соединений, что требует дальнейшего их изучение и идентификации.

Для этого последовательно экстрагируем сырье растворителями с повышающимся градиентом полярности (гексан, толуол, этилацетат) в аппарате Сокслета (Рисунок 2.6) с целью разделения биологически активных комплексов по полярности.

Березовый гриб - чагу измельчаем до мелкодисперсного состояния при помощи электрического измельчителя (РМ-120). Измельченной чагой в виде порошка заполняли изготовленный из фильтровальной бумаги патрон. Затем патрон помещали в аппарат Сокслета и проводим последовательно экстракцию гексаном, толуолом, этилацетатом до полного извлечения всех экстрактивных веществ, которые растворимы в гексане, толуоле, этилацетате. Экстракцию прекращали, когда растворитель в аппарате Сокслета прекращал окрашиваться, и оставался бесцветным.

2.3.1 Исследование гексановой фракции чаги

Согласно схеме (Рисунок 2.8) проводим последовательную экстракцию в аппарате Сокслета.

Первоначально проводим экстракцию гексаном при температуре 78°С (Т_кип растворителя) до полного извлечения всех экстрактивных веществ, растворимых в гексане.

Полученный гексановый экстракт упариваем до 10 мл, охлаждаем и наблюдаем выпадение осадка №1. Надосадочную жидкость сливаем и оставляем испарятся при нормальных условиях. В результате чего после 1 часа испарения также наблюдаем выпадение осадка №2 в надосадочной жидкости. Операцию повторяем, в результате чего получаем пять осадков (Таблица 2.6).

Рисунок 2.8 - Схема последовательной экстракции чаги растворителями с повышающимся градиентом полярности

Таблица 2.6 - Выход осадков гексановой фракции

№ осадка	Масса гексанового осадка, г	Процентный выход, %
1	0.09	0.20
2	0.06	0.13
3	0.05	0.11
4	0.03	0.07
5	0.01	0.02
У	0.24	0.53

Исследование осадков гексановой фракции

Полученные осадки перекристаллизовываем этиловым спиртом и проводим хроматографический анализ полученных осадков с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol».

Использовали следующие системы растворителей:

1. хлороформ - бензол - этилацетат (4:8:1);

2. бензол - хлороформ - муравьиная кислота - этанол - этиловый эфир (30:5:5:5:10).

Полученные хроматограммы просушиваем при комнатной температуре, просматриваем их в видимом и УФ - свете, проявляем ФМК.

Исследование осадка №1

При хроматографическом анализе осадка №1 определяем три пятна.

Распределение пятен в различных системах растворителей показано в таблице 2.7.

Таблица 2.7 - Хроматографический анализ осадка №1

№ пятна	Система 1	№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК
1	0.39	-	-	син	1	0.41	-	-	син
2	0.52	-	-	син	2	0.59	-	-	син
3	0.61	-	гол	син	3	0.72	-	гол	син

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке №1 содержится фенолокислота, так как по литературным данным известно, что фенолокислоты флюоресцируют голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом. Оставшиеся два пятна можно отнести к терпеновым соединениям, так как терпеновые соединения не флюоресцируют в УФ-свете, а с ФМК дают синее окрашивание. Идентификацию проводили при «свидетелях» - бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 1 и 2 оказались идентичны бетулину

(Rf₁=0.39; Rf₂=0.41) и лупеолу (Rf₁=0.52; Rf₂=0.59).

В результате хроматографического анализа осадка № 1 можно сделать вывод о том, что осадок №1 содержит фенолокислоту, терпеновые соединения, а именно бетулин и лупеол.

Исследование осадков №2, №3

Хроматографический анализе осадков №2, №3 выявил их идентичность. На хроматограмме выделены четыре пятна. Распределение пятен в различных системах растворителей показано в таблице 2.8.

В обеих системах наблюдаем флюоресценцию голубым цветом пятна с Rf₁=0.73 и Rf₂=0.78, которые при опрыскивании ФМК дают синее окрашивание, что предполагаем наличие фенолокислот.

Идентификацию проводили при «свидетелях» - бетулине, бетулиновой кислоте и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 1, 2, 3 оказались идентичны бетулиновой кислоте (Rf₁=0.17; Rf₂=0.23), бетулину (Rf₁=0.38; Rf₂=0.47) и лупеолу (Rf₁=0.52; Rf₂=0.63).

Отличие фракции 2 и 3 заключается в том что, бетулиновая кислота в осадке №2 находится в большей концентрации, чем в осадке №3.

Таблица 2.8 - Хроматографический анализ осадка №2, №3

№ пятна	Система 1	№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК
1	0.17	-	-	син	1	0.23	-	-	син
2	0.38	-	-	син	2	0.47	-	-	син
3	0.52	-	-	син	3	0.63	-	-	син
4	0.73	-	гол	син	4	0.78	-	гол	син

В результате хроматографического анализа осадков №2, №3 можно сделать вывод о том, что осадках №2, №3 обнаружены фенолокислота, терпеновые соединения, а именно лупеол, бетулин, бетулиновая кислота.

Исследование осадка №4

При хроматографическом анализе осадка №4 определяем два пятна. Распределение пятен в различных системах растворителей показано в таблице 2.9.

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке №4 содержится фенолокислота с Rf₁=0.71 и Rf₂=0.80, так как пятна в системах 1 и 2 флюоресцировали голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявлялись синим цветом.

Оставшееся одно пятно можно отнести к терпеновым соединениям. Идентификацию проводили при «свидетелях» - бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятно 1 оказалось идентично бетулину с Rf₁=0.39 и Rf₂=0.57.

Таблица 2.9 - Хроматографический анализ осадка №4

№ пятна	Система 1	№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК
1	0.39	-	-	син	1	0.57	-	-	син
2	0.71	-	гол	син	2	0.80	-	гол	син

В результате хроматографического анализа осадка №4 были идентифицированы следующие классы соединений: фенолокислота, терпеновое соединение идентифицировано как бетулин.

Исследование осадка №5

При хроматографическом анализе осадка №5 определяем одно пятно (Рисунок 2.9). Положение пятна в различных системах растворителей показано в таблице 2.10.

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке №5 содержится фенолокислота, так как пятно с Rf₁=0.79 и Rf₂=0.85 флюоресцирует голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляются синим цветом.

Таблица 2.10 - Хроматографический анализ осадка №5

№ пятна	Система 1	№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Вид. свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК
1	0.79	-	гол	син	1	0.85	-	гол	син

Рисунок 2.9 - Осадок № 5 в различных системах растворителей: а - хроматограмма в системе 1; б - хроматограмма в системе 2.

В результате хроматографического анализа видим, что осадок № 5 является индивидуальным веществом, в УФ - свете флюоресцирует голубым цветом. Предполагаем, что осадок № 5 является фенолокислотой.

Осадок № 5 представляет собой белые кристаллы, с Т_плав=210-212 °С, растворимые в этаноле (Рисунок 2.10).

Рисунок 2.10 - Кристалл осадка № 5

Хроматографический анализ осадка № 5 в выше приведенных системах (№ 4 и 5) также потверждают индивидуальность соединения.

Пятно в системе 4 имеет Rf=0.93 (Рисунок 2.11,а), в системе 5 имеет Rf=0.30 (Рисунок 2.11,б).

Рисунок 2.11 - Хроматограммы осадка № 5 в различных системах растворителей: а - Осадок № 5 в системе растворителей 4; б - Осадок № 5 в системе растворителей 5.

Для проявления хроматограмм использовали следующие качественные реакции на фенолокислоты [28]:

Реакция азосочетания, приводящая к образованию окрашенных соединений с диазотированным п-нитроанилином: 25 мл 0,3 % раствора п-нитроанилина в 8 % НCl смешиваем непосредственно перед употреблением с 1,5 мл 5 % водного раствора NaNO₂ и полученной смесью обрабатываем хроматограммы. Через несколько минут хроматограмму дополнительно опрыскивают 20 % водным раствором Na₂CO₃.

По литературным данным известно, что п-оксибензойная кислота дает бледно-желтую окраску, переходящую в розовую после опрыскивания раствором карбоната натрия.

Ванилиновая кислота дает желтую окраску, переходящую в фиолетовую, протокатеховая и галловая - желтую окраску, переходящую соответственно в серовато-синию и светло-коричневую, п-кумаровая - желтую окраску, переходящую в синию.

Осадок № 5 дает желтую окраску, переходящую в синию. Исходя их этого предполагаем п-кумаровую кислоту.

Образование комплекса с 1% раствором железоаммониевых квасцов FeNH₄(SO₄)₂ ·12H₂O в воде [16].