Причем степень биодеструкции нефти и нефтепродуктов консорциумом на 10-15% выше по сравнению с монокультурой Rhodococcus erythropolis AC-1339 Д.

Вышеуказанный консорциум способен утилизировать углеводороды нефти и в жидкой полной минеральной среде. В зависимости от количества инокулята и условий культивирования степень биодеструкции будет отличаться. Данные отражены в таблице 3.

Таблица 3 - Степень биодеструкции нефти

Очистка нефтешлама при применении консорциума на 15% больше, чем при экстракции ксилолом, и составляет 72%. Наибольшая степень очистки, более 91%, наблюдается после предварительной экстракции нефтепродуктов из нефтешлама ксилолом и использовании подобранного консорциума. В процессе культивирования консорциума наблюдается прирост гетеротрофных микроорганизмов.

Такая тенденция отражена на рисунке 22.

НАЗАРОВ и др.

Размещено на http://www.allbest.ru/

36

Биотехнология, 2005, >

Рисунок 20 - Рост гетеротрофных микроорганизмов в полной минеральной среде

Биоочистку нефтешлама можно осуществлять путем послойного расположения. Для этого между слоями можно закладывать песок, чернозем и перфорированные трубы для аэрации. С целью уменьшения испарения нефтепродуктов дно и поверхность установки герметизируют покрытием.

Для увеличения эффективности биодеструкции углеводородов нефти в нефтешлам добавляют опилки, а в качестве биостимулятора - спиртовую барду, фосфогипс.

Доочистка нефтешлама подобранным консорциумом с внесением биодобавок (спиртовой барды, фосфогипса) и опилок значительно интенсифицирует процесс очистки нефтешлама. Так, уже на 180-240 сутки степень биодеструкции нефти и нефтепродуктов с консорциумом на 10-15% выше, чем с монокультурой Rhodococcus erythropolis AC-1339 Д. Зависимость содержания нефти в почве и времени показана на рисунке 23. Фосфогипс 1-5 % масс. и спиртовая барда 1-5 % масс. являются активными стимуляторами роста нефтеокисляющих микроорганизмов.[1]

Рисунок 23 - Динамика содержания нефти и нефтепродуктов в нефтешламе на протяжении всего процесса биоочистки

Доочистка с применением подобранного консорциума, отходов спиртового производства и фосфогипса позволяет снизить содержание нефти и нефтепродуктов в нефтешламе до 0,2 мг/г почвы за 450 сут. В случае с монокультурой содержание нефти и нефтепродуктов в нефтешламе составило 0,2 мг/г почвы только на 540 сут.

Таким образом, данный способ доочистки нефтешлама биологическим методом позволяет снизить содержание нефти и нефтепродуктов до нормативно допустимого и может быть рекомендован к промышленному применению.[1]

4.2 Биоремедиация нефтешламов компостированием

В Казанском государственном университете была оценена эффективность обезвреживания и переработки концентрированного нефтехимического шлама путем компостирования в опытно-полевых условиях с помощью комплексного токсико-биологического и химического мониторинга. Компостирование нефтешлама осуществляют на огражденной барьером бетонной площадке с фильтрованием и сбором избыточной жидкости. В качестве разрыхляющего агента использовали отработанный сорбент биофильтра слоем 0,3 м на подготовленной площадке. Извлеченный из шламонакопителя нефтешлам распределяли поверх разрыхлителя с последующим отведением избыточной жидкости. Компостируемые смеси формировали методом послойной укладки. Соотношение шлама и разрыхлителя составляло около 1:2 (по объему). Аэрацию компостируемых смесей обеспечивали с помощью полиэтиленовых перфорированных труб.

Процесс биоремедиации нефтехимического шлама в опытно-полевых условиях можно разделить на две фазы: активную, характеризующуюся высокой скоростью деструкции загрязнений (0--4 мес), и более медленную, отличающуюся низкой скоростью деградации остаточных в основном труднодоступных компонентов нефтяного загрязнения (5--18 мес).

Снижение содержания нефтяных углеводородов при компостировании нефтешлама в комбинации с другими промышленными отходами (какие) представлено в таблице 3. Наибольшее снижение загрязнения происходит при компостировании с добавлением ОПЛ (таблица 3, вариант В).

При компостировании происходит увеличение суммарной концентрации гуминовых и фульвовых кислот. При этом лапрол стимулирует накопление кислот в компосте (таблица 3, вариант В).

Таблица 3 - Химический состав нефтешлама в процессе компостирования

При компостировании нефтепродуктов численность спорообразующих бактерий в начальный период, соответствующий активной фазе ремедиации, снижалась на порядок.(рисунок 24, б. В соответствии с характером используемого метода этот факт может отражать как снижение содержания собственно спор, так и переход данной части микробиоценоза в вегетативную форму со сниженной токсико-резистентностью. [7]

В конце теплого сезона количество бактерий в состоянии спор обычно восстанавливается до начального уровня и в дальнейшем не претерпевает резких изменений (рисунок 24, б), что свидетельствует об устойчивости спор, в том числе в условиях неблагоприятного температурного режима.

Число актиномицетов в процессе компостирования нефтешлама увеличивается на первом этапе. В нефтешламе численность микромицетов изменяется в широких пределах.

Такая динамика может отражать как избирательную токсичность углеводородов и/или их метаболитов, так и конкурентные или антагонистические отношения с другими представителями биоценоза.

Деградация загрязнений является результатом активной жизнедеятельности микробного сообщества, обитающего в нефтешламе, о чем свидетельствует, в частности, повышение числа деструкторов. При создании относительно благоприятных условий собственная микрофлора нефтешламом загрязненных объектов способна к разложению умеренной дозы контаминирующих агентов (5--10 % углеводородов нефти) в результате увеличения численности и повышения активности эндогенного микробного сообщества. Во втором ремедиационном периоде наблюдается уменьшение доли ПАУ-деструкторов, что свидетельствует об исчерпании доступных ростовых субстратов соответствующей химической структуры и о снижении биодоступности остаточного загрязнения.

Рисунок 24 - Динамика роста различных физиологических групп микроорганизмов в процессе компостирования: а -- аэробные гетеротрофы; б -- спорообразующие бактерии; е -- актиномицеты; г -- микромицеты; А, Б, В -- варианты пилотно-полевого компостирования

Снижение биоразлагаемости может являться также результатом связывания продуктов метаболизма нефтяного загрязнения с компонентами гумуса и гумусоподобными веществами, количество которых существенно увеличивалось при компостировании нефтешлама.[8]

Изучение численности микробных популяций в процессе компостирования нефтешлама позволяет выявить следующие закономерности. В течение первого трехмесячного этапа в первую очередь возрастает численность аэробных гетеротрофных бактерий, к которым принадлежат и специфические деструкторы нефтяного загрязнения, что характерно и для нефтешламо-загрязненных почв, не подвергающихся очистительным процедурам. Для весенне-летнего сезона второго ремедиационного периода наиболее показательно увеличение числа актиномицетов, что объясняется их экологической стратегией, а именно, ростом количества этих спорообразующих прокариот на поздних стадиях деструкции труднодоступных субстратов.

При компостировании происходит снижение нефтяного загрязнения до 90%. Полученный грунт не токсичен для растений и инфузорий. [7]

4.3 Биоремедиации почв и водной среды

Еева, Е.К. Емельянова, ОН. Загребельный, СЕ. Олькин, И.К. Резникова, В.Е. Репин в венном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" выделяли психрофильные и галотолерантные микроорганизмы-нефтедеструкторов, способных эффективно деградировать нефть и нефтепродукты в климатических условиях северных регионов с перспективой их использования в целях биоремедиации.

Исследователями был проведён скрининг штаммов по признаку нефтепоглощающей активности. В ходе исследования природных субстратов были выделены мезофильные и психрофильные микроорганизмы и была доказана их нефтеокисляющая способность.

Полученные группой учёных штаммы-нефтедеструкторы идентифицированы как представители родов Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Rhodo:cus, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia и выделены также утилизирующие нефть штаммы дрожжей (в том числе Yarrowia lipolylicd) и плесневых грибов. При различных условиях микроорганизмы-деструкторы утилизировали нефть с разной эффективностью. Отличительной чертой -значительной части штаммов коллекции является способность к росту и окислению нефтепродуктов при пониженных температурах.

Для ряда штаммов (Bacillus sp. 282, Arthrobacter sp. 283, штаммов дрожжей NF 4-2 и NF 5-1) степень биодеградации нефти была выявлена весовым методом. Учёные показали, что за 7 суток культивирования исследованные штаммы утилизировали от 69 до 84 % от исходного содержания нефти. Групповой состав компонентов нефти позволил им выявить соотношение углеводородов к смолам и асфальтенам после биодеградации. Наибольшая деструкция смол и асфальтенов, относящихся к наиболее трудно утилизируемым микроорганизмами фракциям нефти, обнаружена в образцах со штаммами дрожжей NF 4-2 и NF 5-1.

Исследователями было выяснено, что штаммы микроорганизмов-деструкторов Y. lipolytica NF5-1 я Pseudomonas sp. KL-1, входящие в состав ассоциации (исходное соотношение 1:1), способны расти и утилизировать нефтепродукты в широком диапазоне температур (4--35°), рН среды (4--8,5) и при повышенных концентрациях соли (NaCl до 7 %).

При повышенных концентрациях соли, ассоциация штаммов Pseudomonas sp. KL-1 и Y. lipolytica NF5-1 достаточно активно окисляла нефть При 5% NaCl степень утилизации достигала 78 %, а при 7% NaCl -- 73 % за 6 сут. Эта же ассоциация достаточно эффективно утилизировала. [9]

4.3.1 Использование психротолерантных штаммов-нефтедеструкторов для биоремедиации почв и водной среды

Исследования показали, что при совместном использовании штаммы-нефтедеструкторы Pseudomonas sp. KL-1 и Y. lipolytic; NF5-1 обладают высокой биоэмульгирующей и нефтеокисляющей активностью, а также устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды (способны утилизировать нефть в условиях значительных колебаний температуры и рН среды, а также при ее засоленности).,а также выявлена высокая степень утилизации нефти разного фракционного состава выделенными штаммами-деструкторами. Эффективными углеводород-утилизирующими культурами являются Pseudomonas sp. KL-1, Y. lipolytica NF5-1, Candida sp. Nb 2, Arthrobacter sp. Ja 285p, и Arthrobacter sp. Ja 269p., Они перспективны для биотехнологических разработок. Штаммы являются также психротолерантными и солеустойчивыми (до 5--10% NaCl). Это предполагает возможность их использования в засоленных природных субстратах при пониженных температурах.[17]

Было показано, что ассоциация штаммов Pseudomonas sp. KL-1 и Y. lipolytica NF5-1 является эффективной в широком интервале температур (в том числе пониженных); составляющие ее штаммы не проявляют антагонизм по отношению друг к другу и к представителям эндогенной микрофлоры почв, что позволяет рекомендовать данную ассоциацию для дальнейшей разработки комплексных препаратов биоремедиации в условиях северных регионов. [18]

4.3.2 Биоремедиация почв в условиях северных регионов России

Н.Н. Волченко и Э.В. Карасёва в Кубанском государственном университете провели скрининг штаммов -- продуцентов биоПАВ среди нефтеокисляющих бактерий. Объектом исследования являлись изоляты углеводородокисляющих бактерий, полученных из коллекции культур.

Сущность метода заключается в колориметрической оценке количества клеток, находящихся между гидрофильной и гидрофобной фазами.

Для определения эффективности смеси используется индекс эмульгирования (ИЭ). ИЭ представляет собой показатель, характеризующий эмульгирующую активность микробной культуры. Принцип определения заключается в оценке объема эмульсии, образовавшейся в результате встряхивания образца культуры-эмульгатора с гидрофобной жидкостью. ИЭ вычисляют по формуле

ИЭ = (У_Э/У_П) * 100%,

где V₃ -- объем эмульсии,

V_n -- полный объем жидкости, включающий в себя объем водный фазы (культура или супернатант) + объем углеводородной фазы (в нашем случае -- дизтопливо) + объем образовавшейся эмульсии.

Первичному скринингу на наличие поверхностно-активных свойств подверглись 39 изолята углеводородокисляющих бактерий, большая часть которых принадлежала к группе нокардиоморфных актиномицетов. Клетки некоторых штаммов, выращенные на питательном агаре, обладали поверхностно-активными свойствами -- эмульгировали дизельное топливо, но не снижали уровень поверхностного натяжения среды. Исследуемые изоляты были проверены на способность к деградации нормального гексадекана в жидкой минимальной среде. В результате были отобраны 10 культур, продемонстрировавшие разную интенсивность роста.

Наиболее активными являлись культуры F2, В2, J8, в то время как культуры S6, Z5 и HI не проявили активного роста на среде МС-С16. Кроме того, ПН последних культур слабо изменилось по сравнению с ПН при росте на исходной неинокулированной среде. Гидрофобность клеток бактерий также значительно различалась у разных изолятов: максимальной гидрофобностью (87--96 %) обладали бактерии штаммов J8, F2, В2, а минимальной (4--13 %) -- штаммы S6 и Z5.

Важным биотехнологическим свойством культур-продуцентов является локализация синтезируемых клетками биоПАВ вне клетки, в цитоплазме или оболочке. Сравнение величин ПН и ИЭ жидких культур и их супернатантов свидетельствует о том, что у большинства изолятов поверхностно-активные свойства связаны с биомассой бактерий, а не с супернатантом КЖ. Процесс биоремедиации лучше проводить при инокуляции нефтешлама коллекционными культурами -- продуцентами биоПАВ и аборигенными углеводородокис-ляющими бактериями, активированными in vitro. Этот метод является самым эффективным и диаграммы рисунка 26 свидетельствуют об этом.[14]

Рисунок 26 - Концентрация нефтепродуктов в нефтешламе при различных вариантах обработки

При внесении аборигенных штаммов процент деградации нефти аборигенными штаммами был несколько выше. В таблице 5 представлены данные деградации нефти гетеротрофными и нефтеокисляющими микроорганизмыми при добавлении различных агентов. [15]

Таблица 5 - Микрофлора нефтезагрязненного чернозема и уровень деградации нефти в модельном эксперименте при обработке различными агентами (время обработки -- 30 суток)

При сравнении результативности бактериальных культур были получены данные, проиллюстрированные в таблице 6.

Таблица 6. Концентрация микрофлоры в процессе биоремедиации нефтешлама

Таким образом, результатом ремедиации нефтезагрязненной почвы с использованием ПАВ-продуцирующих бактерий является уменьшение концентрации нефтепродуктов, увеличение содержания микрофлоры, снижение токсичности по отношению к высшим растениям. При этом указанные процессы осуществлялись не менее, а иногда и более активно при использовании коллекционной микрофлоры по сравнению с аборигенной. [16]

4.4 Биодеструкция углеводородов нефти методом непрерывного культивирования

В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Т.К. Скрябина РАН А.Н. Шкидченко и Е.С. Иванова изучили возможность восстановления нефтедеструктивной активности микроорганизмов в процессе непрерывного культивирования.

В качестве объектов исследования использовали психрофильные штаммы Pseudomonas sp. 22 ,Rhodococcus erythropolis 21, Microbacterium tefaciens 6 и Pseudomonas sp. 9.

В качестве источника углерода использовали дизельное топливо. Культивирование осуществляли в батареи реакторов непрерывного действия. Впервом реакторе осуществяли получение эмульсии и деструкцию легких фракций углеводородов нефти. Во второй реактор подавали нефть в виде 20%-ной водной эмульсии. Третий реактор служил для дополнительного окисления трудно-разлагаемых фракций углеводородов нефти.

Выделенные из нефтезагрязненных регионов психротрофные штаммы обладали достаточно высокой исходной нефтедеструктивной активностью при культивировании в жидкой питательной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода . Влияние длительного хранения микроорганизмов на их нефтедеструктивную активность отображено на рисунке 27.

Рисунок 27 - Влияние длительного хранения микроорганизмов на их нефтедеструктивную активность: / -- исходная активность; 2 -- активность после 8 лет хранения

Десятидневная инкубация культур при 4--6° сопровождалась биодеструкцией до 50% внесенной нефти. Однако после 8 лет хранения культур на агаризованных средах с периодическими пересевами на среды с нефтью активность штаммов существенно изменилась. Так, для Pseudomonas sp. 9 она снизилась на 67,8%, для Pseudomonas sp. 22 -- на 61%, а для Rh. erythropolis 21 -- на 50% от исходной величины.

Для проточного культивирования исследуемые штаммы нефтедеструкторов выращивали раздельно и смешивали перед внесением в биореактор. В таблице 7 приведены данные об исходном соотношении интродуцированных в инокуляте штаммов-нефтедеструкторов.

В результате длительного непрерывного культивирования интродуцированных штаммов микроорганизмов не только возросла их нефтедеструктивная активность, но также была селекционирована устойчивая ассоциация микроорганизмов-нефтедеструкторов, конкурентоспособная в открытой системе.

Для проверки устойчивости полученной ассоциации почву, содержавшую 5% нефти инкубировали при 4--6° в течение длительного времени. Через 90 сут инкубации содержание углеводородов нефти в почве снизилось на 29% от исходной. Полученные в модельном эксперименте данные подтверждают устойчивость созданной ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытых системах. [12]

Таблица 7 - Содержание интродуцированных штаммов-нефтедеструкторов при проточном культивировании

4.5 Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью