НАЗАРОВ и др.

Размещено на http://www.allbest.ru/

36

Биотехнология, 2005, >

«Углеводородокисляющие микроорганизмы - перспективные объекты экологической биотехнологии»

Содержание

• Введение
• 1. Методы микробиологической химии
• 1.1 Трансформация растущей культурой
• 1.2 Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток
• 1.3 Трансформации, осуществляемые спорами грибов и актиномицетов
• 1.4 Непрерывные методы микробиологической трансформации органических соединений
• 1.5 Соокисление и кометаболизм
• 1.6 Политрансформации
• 2. Роль микробиологической трансформации
• 2.1 Роль микробиологической трансформации в процессах деградации чужеродных соединений
• 2.2 Трансформация феноксиуксусных кислот17
• 2.3 Трансформация феноксиалкилкарбоновых кислот
• 2.4 Трансформация галогенпроизводных циклических углеводородов
• 2.5 Трансформация карбаматов
• 2.6 Трансформация замещенных мочевины
• 2.7 Трансформация триазинов
• 2.8 Биодеградация поверхностно-активных углеводородов
• 3. Характеристика основных углеводородокисляющих микроорганизмов
• 3.1 Краткая характеристика микроорганизмов рода Acinetobacter
• 3.2 Краткая характеристика микроорганизмов рода Candida
• 3.3 Краткая характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas
• 3.4 Краткая характеристика микроорганизмов рода Arthrobacter
• 3.5 Краткая характеристика микроорганизмов рода Bacillus
• 3.6 Краткая характеристика микроорганизмов рода Actinomyces
• 3.7 Краткая характеристика микроорганизмов рода Nocardia
• 3.8 Краткая характеристика микроорганизмов рода Rhodococcus
• 4. Биодеструкция нефтешламов
• 4.1 Деструкция нефтешламов ассоциациями микроорганизмов
• 4.1.1 Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus
• 4.1.2 Культивирование Pseudomonas sp. 142NF(pNF142)и Rhodococcus sp. S67 в виде монокультур или в смешанной культуре
• 4.1.3 Обезвреживание нефтешламов ассоциацией микроорганизмов родов Bacillus, Rhodococcus и Fusarium
• 4.2 Биоремедиация нефтешламов компостированием
• 4.3 Биоремедиации почв и водной среды
• 4.3.1 Использование психротолерантных штаммов-нефтедеструкторов для биоремедиации почв и водной среды
• 4.3.2 Биоремедиация почв в условиях северных регионов России
• 4.4 Биодеструкция углеводородов нефти методом непрерывного культивирования
• 4.5 Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью
• Список использованных источников

Введение

Предприятия нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности являются одним из основных источников загрязнения окружающей среды. Неблагоприятное воздействие нефтешламов на окружающую природную среду и невозобновляемость углеводородного сырья делают вопрос переработки отходов весьма актуальным.

Существуют различные способы переработки и утилизации отходов нефтеперерабатывающей промышленности с помощью механических, физико-химических, химических и биологических методов. При выборе способа утилизации приоритет в основном отдается способам, направленным на извлечение из нефтешламов углеводородного сырья. Однако не решена проблема доочистки образовавшихся в результате переработки твердых отходов и водной фазы. Наиболее перспективным способом очистки нефтешламов представляется комплекс мер, сочетающих различные методы очистки.

В настоящее время все большее применение находят биологические методы очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, основанные на применении активных микробных штаммов, проявляющих способность использовать в качестве источника углерода и энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.

Соединения, которые подвергаются полной деградации, могут использоваться микроорганизмами в качестве источника углерода, а также источника энергии или в процессах метаболизма. Разрушение стойких органических соединений в природе происходит, как правило, в результате совместного действия микроорганизмов и абиотических факторов. Микробиологическая минерализация является наиболее эффективным и экологически приемлемым способом удаления органических ксенобиотиков из окружающей среды.[1]

Целью бакалаврской работы является анализ и систематика современных литературных данных по использованию углеводородокисляющих микроорганизмов для решению экологических проблем. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- получить представление о современных методах борьбы с нефтяными загрязнениями воды и почвы;

- рассмотреть свойства известных на сегодняшний момент микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды нефти;

- ознакомиться с культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами углеводородокисляющих микроорганизмов

1. Методы микробиологической химии

Современная методология микробиологической трансформации позволяет использовать для осуществления того или иного химического превращения любой микроорганизм. В исследовательской и производственной практике набор микробных культур, используемых для трансформационных реакций, намного меньше, чем полный список всех известных микроорганизмов. В первую очередь находят применение в качестве культур-трансформаторов сапрофитные организмы, способные развиваться на сравнительно простых средах, гетеротрофы, отличающиеся интенсивным обменом веществ.

Существуют, наконец, «звезды» микробиологической трансформации - отдельные виды или даже штаммы, известные своей способностью проводить разнообразные превращения. В настоящее время такими «звёздами» являются следующие штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов: Pseudomonas sp. 22, Rhodococcus erythropolis 21, Microbacterium tefaciens 6, Pseudomonas sp. 9, Bacillus sp. 282, Arthrobacter sp. 283, штаммы дрожжей NF 4-2 и NF 5-1, Y. lipolytica NF5-1, Pseudomonas sp. KL-1, Rhodococcus erythropolis BKM AC-1339Д, Pseudomonas sp. 142NF (pNF142), Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus erythropolis AC-1339 Д, Bacillus subtilis ВКМ 1742 Д, Fusarium species №56, Pseudomonas aureofaciens 1393, Rhodococcus erythropolis Sh5, Microbacterium liquefaciens AshlO, Pseudomonas putida Sh-1, Pseudomonas sp. Ash-10, Rhodococcus sp. Sh-5 и Pseudomonas sp. KL-1.

В настоящее время существуют следующие методы использования энзиматической активности отдельных участков метаболической системы микробной клетки для осуществления химических превращений экзогенных веществ:

1. Использование ферментативных свойств нормально развивающихся культур:

а) Трансформация растущей культурой в периодических условиях.

б) Использование ферментативной активности определенных фаз развития:

- трансформация суспензиями неразмножающихся клеток;

- трансформация спорами;

- непрерывные методы.

2. Методы, основанные на дезорганизации обменных процессов клетки:

а) применение в различной степени поврежденных и дезинтегрированных клеток;

б) ингибирование определенных участков метаболических путей;

в) применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов.

3. Использование ферментных препаратов, иммобилизованных ферритов и клеток.

4. Политрансформация.

5. Соокисление и кометаболизм

Практически реализуемые методы обычно представляют собой результат комплексного применения нескольких подходов. [2]

1.1 Трансформация растущей культурой

Наиболее прост метод проведения трансформационных реакций, когда трансформируемый субстрат вносится в культуру, растущую на какой-либо полноценной питательной среде. Большая часть микробиологических превращений стероидов осуществляется этим методом. Обычно трансформирующая культура выращивается на оптимальной питательной среде, трансформируемое вещество вводится или в начале процесса, или по ходу развития культуры. Продукт реакции экстрагируется в момент, когда его концентрация в культуральной жидкости достигает наибольшего значения.

В преобладающем большинстве случаев трансформационная активность микроорганизмов существенно меняется в процессе роста культуры, а максимальная скорость образования продукта проявляется клетками лишь в определенном физиологическом возрасте, в определенной фазе развития. Известно, что важнейшей характеристикой ферментационного процесса является соотношение между ростом клеточного вещества и образованием продуктов. Разные ферментации заметно различаются по этому признаку. Наиболее естественной классификацией ферментационных процессов является схема, разработанная Гейденом. Основные принципы этой схемы могут быть положены и в основу классификации физиологических типов трансформационных процессов.

Трансформации I типа характеризуются тесной связью между- ростом и накоплением продукта, так что второй тип процессов является непосредственным результатом превращения источника углерода в энергетическом обмене. К процессам этого типа относятся трансформации, представляющие собой накопление промежуточных продуктов катаболизма, например неассимилируемых фрагментов молекул ростового субстрата. Типичными примерами могут служить окисление нафталина с образованием салициловой кислоты, алкилбензолов с длинными алифатическими заместителям в ароматические кислоты и т.п. В этих процессах ростовой субстрат является и трансформируемым веществом. Отличительная черта этих трансформаций - совпадение максимумов скоростей ростового и трансформационного процессов. Поэтому воздействия, регулирующие рост, соответственно, влияют на накопление продукта трансформации.

Сложнее для изучения и регулирования процессы, где ростовой трансформируемый субстраты различны. У трансформаций II типа максимумы скоростей ростового и трансформационного процессов несколько сдвинуты. Типичен случай, когда наибольшая трансформационная активность приходится на фазу замедления роста (следующую за экспоненциальной). Биомасса в это время нарастает линейно.

Трансформация III типа отличается четко выраженной двухфазностью. Трансформационный процесс является в данном случае типичным вторичным процессом, его максимальная удельная скорость соответствует стационарной фазе роста культуры. В некоторых случаях трансформация начинается лишь по окончании роста. Так идет окисление цис-пропенилфосфоновой кислоты в фосфомицин культурой Penicillium spinulosum.

Изучение корреляции между ростовым и трансформационным процессами служит непременным условием для успешного регулирования оптимизации трансформации. Установив фазу развития, в которой культура проявляет наибольшую трансформирующую активность, исследователи пытаются использовать для проведения реакции клетки, тем или иным путем стабилизированные именно в этом состоянии. Существуют, по крайней мере, два подхода, позволяющие это сделать - использование суспензий неразмножающихся клеток и стабилизация физиологического состояния культуры с помощью методов непрерывного культивирования.

1.2 Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток

Этот метод широко распространен в микробиологической практике особенно в области трансформации стероидов. Он может быть использован сравнительно легко в тех случаях, когда трансформации осуществляются грибными культурами, мицелий которых может быть без особых технологических затруднений отделен от среды выращивания в нужный момент и ресуспендирован в буферном растворе или даже водопроводной воде, где и осуществляется трансформационная реакция. Достоинство этого; метода заключается и в том, что простая трансформационная среда облегчает выделение продукта в отличие от трансформаций, осуществляемых растущей культурой, где в качестве сред часто используют очень сложные по составу растворы, включающие, например, такие комплексные ингредиенты, как кукурузный экстракт.

Метод трансформации суспензиями неразмножающихся клеток позволяет использовать культуру определенного физиологического состояния, которое соответствует строго определенному возрасту. Так, в гидроксилирование кортексолоны с помощью культуры Ticghemella Hi 333 наиболее интенсивно осуществляется 19-часовым мицелием. Суспензии отмытых клеток используются также для трансформации кортексолонов в гидрокортизон и ацетат кортизона, дезацетилирования ацетата кортизона (Mycobac-album 726) и ряда других превращений.

1.3 Трансформации, осуществляемые спорами грибов и актиномицетов

Трансформации, осуществляемые спорами, заслуживают специального внимания. Они обладают рядом удобств как технологические процессы. Неожиданно высокая энзиматическая активность, которую демонстрируют споры, осуществляющие трансформации органических веществ, еще раз напоминают, насколько условны многие схемы, воспринимаемые как не подлежащие сомнению.

В конце 50-х годов было обнаружено, что давно известное превращение жирных кислот в метилкетоны, осуществляемое некоторыми плесенями в процессе созревания сыра «Рокфор», является функцией спор. Особенность этой трансформации заключается в том, что проросшие споры и мицелиальные клетки практически не обладают трансформирующей активностью. Отмытые споры (0 час) образуют кетон и поглощают кислород с максимальной интенсивностью. 16-часовая культура, у которой около половины спор проросло, продуцирует по сравнению с исходной суспензией спор меньше половины кетона и значительно меньше поглощает кислорода. Через 48 часов все споры прорастают, образование кетона и поглощение кислорода прекращаются.

Описания трансформация - не уникальное свойство культуры Penicillium roqueforti. Она широко распространена среди грибов, представителей как рода Penicillium, так и других родов - Aspergillus, Curvularia, Paecilomyces, Scopulariopsis.

1.4 Непрерывные методы микробиологической трансформации органических соединений

Процессы получения продуктов, непосредственно связанные с ростом микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования, осуществляются сравнительно легко. Некоторые из них - производство уксусной кислоты, этилового спирта - уже нашли применение в промышленности.

Основным достоинством непрерывного культивирования является возможность поддерживать микробную культуру в течение длительного времени в стабильном физиологическом состоянии при постоянных условиях культивирования. Техника многостадийных систем позволяет стабилизировать культуры даже в состоянии, физиологически весьма далеком от фазы наиболее интенсивного (экспоненциального) роста, что необходимо в случае микробиологических процессов, не связанных с ростом.

Проточные системы интенсивно используется при трансформации соединений, не связанных непосредственно с ростом культур. Для реализации таких трансформаций первостепенное значение имеет правильное понимание соотношения процессов роста и превращения трансформационного субстрата, изучение оптимальных условий для той или иной фазы развития. Двухстадийный непрерывный процесс позволяет расчленить фазы развития культуры.

Используют для биодеструкции углеводородов нефти такие микроорганизмы как Rhodococcus, Candida, Pseudomonas, Bacillus, Fusarium, Nocardia и другие.

1.5 Соокисление и кометаболизм

Термин «соокисление» возник в мировой литературе в конце 1950-х годов. Он впервые был упомянут в работах по окислению углеводородов микроорганизмами Pseudomonas methanica. Эта культура использует в качестве источника углерода и энергии метан, но не способна расти за счет его гомологов, тем не менее окисляет этан, пропан и бутан в процессе роста за счет метана или будучи выращенной на метане. Это явление и было названо «соокисление».

В 1960-х годах был предложен более общий термин «кометаболизм». Строгое определение понятия «кометаболизм» отсутствует, и разные авторы толкуют его весьма произвольно.

Некоторые исследователи - специалисты в области почвенной микробиологии - называют кометаболизмом процессы трансформации органических соединений (в частности, пестицидов), осуществляемые микроорганизмами, растущими или выращенными на субстратах, индуцирующих синтез трансформирующей ферментной системы.

Большинство специалистов-микробиологов определяют кометаболизм как ферментативные процессы, которые осуществляются микроорганизмами лишь сопряженно с использованием ростовых субстратов. Другими словами, этот феномен характеризуется тем, что трансформационная реакция проявляется лишь в присутствии ростового субстрата определенной структуры и при условии его использования. Тесная взаимосвязь между ростовыми и трансформационными процессами, зависимость трансформационного процесса от природы ростового субстрата и являются характерными и отличительными чертами кометаболизма.

Взаимосвязь между окислением ростового субстрата и превращением трансформируемого вещества может быть очень тесной. Например, культура Nocardia corallina 1А окисляет 3-метилпиридин, п-ксилол и ряд других структурно близких соединений в циклические кислоты только при наличии в среде ростового субстрата. Отмытые клетки этой культуры в буферном растворе названные соединения не окисляют. Трансформация начинается только после внесения ростового субстрата в систему. Наиболее интенсивно окисляется 3-метилпиридин культурой, растущей на полноценной питательной среде.

Ярким примером полифункциональности, которая реализуется в условиях кометаболизма, могут быть реакции культуры Nocardia corallina 1А. Этот организм окисляет метилы у таких соединений, как м- и п-ксилолы, 3-метилпиридин, м- и п-нитротолуолы; при этом накапливаются соответствующие циклические кислоты. При появлении аминогруппы в молекуле трансформируемого субстрата культура в тех же условиях осуществляет ее ацелирование, не действуя на метил. У хлортолуолов элиминируется хлор и расщепляется кольцо, крезолы расщепляются без окисления метила и т.д.

Представители родов Arthrobacter, Brevibacterium, Cellumonas, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia способны осуществлять различные окислительные превращения бензола и п-ксилола в соокислительных условиях, т.е. в процессе роста на н-парафинах или на глюкозе. Схема превращения бензола изображена на рисунке 1, схема превращения ксилола на рисунке 2.



Рисунок 1 - Превращение бензола в соокислительных условиях

Рисунок 2 - Превращение п-ксилола в соокислительных условиях

Интересным примером процессов кометаболизма является превращение алкалоида бревикарина в бревиколлин грибными культурами Penicillium sp. и Rhizopus sp., которое заключается в циклизации алифатического радикала. В таблице 1 основные типы процессов, осуществляемых микроорганизмами в условиях кометаболизма.

Таблица 1 - Основные типы процессов, осуществляемых микроорганизмами в условиях кометаболизма

Микроорганизм	Ростовой субстрат	Трансформируемый субстрат	Продукты трансформации
1	2	3	4
Nocardia corallina 1А	Глюкоза, н-алканы и др.	3-метилпиридин	Никотиновая кислота
Nocardia corallina V-49	н-гекса-декан	п-Ксилол	3,6-диметилкатехол
Nocardia corallina V-49	н-гекса-декан	п-Ксилол	Цис, цис - 1,3-диметилмуконовая кислота
Nocardia corallina 1А	Бутират	п-Ксилол
Mycobacterium vaccae JOB-5	2-Метилбутан	Циклогексан	Циклогексанон
Pseudomonas methanica	Метан	Пропан	Пропанол
Arthrobacter sp.	Дрожжевой экстракт	Гекадекан	Смесь 2-,3-,4- гесадеканонов
Candida cloacae M-1	Ацетат	Гексадекан	Тетрадекандикарбоновая кислота
Nocardia corallina 1А	Глюкоза, гексадекан	п-Толуидин	П-Ацетаминтолуол
Pseudomonas ovalis 6-1	Этанол
Pseudomonas ovalis 6-1	Этанол
Corynebacterium sp	Глюконат	D-ксилоза	Ксилит
Penicillium sp., Rhizopus sp.	Сахароза

Таким образом, реакции кометаболизма очень разнообразны и часто встречаются в мире микроорганизмов. Характерная черта этих процессов - взаимосвязь между превращениями трансформируемых субстратов и косубстратов. Косубстраты можно разделить на три группы:

а) соединения, являющиеся легко используемыми субстратами для роста, но при росте на которых удельный выход продукта трансформации невысок - глюкоза, манит;

б) соединения, на которых культура слабо растет или вообще не растет, но активно трансформирует - мальтоза, глицерин, ксилоза;

в) соединения, являющиеся плохими субстратами как для роста, так и для трансформации - ацетат, этанол.

Особенность кометаболизма заключается в том, что субстрат не обязательно служит источником углерода. В некоторых случаях косубстрат претерпевает лишь частичные превращения, т.е. трансформируется, также как и основной трансформируемый субстрат, например, при окислении 3 - метилпиридина и п-ксилола культурой Nocardia corallina 1А в присутствии кислозы, которая превращается данным организмом в частично окисленные продукты.

В настоящее время выделяют три типа кометаболизма:

1) трансформация основного субстрата в процессе роста микроорганизма за счет косубстрата;

2) трансформация основного субстрата в процессе трансформации косубстрата, который в данном случае не является источником углерода;

3) деградация основного субстрата в процессе роста культуры за счет косубстрата.

1.6 Политрансформации

Трансформация сложных органических молекул часто предполагает более чем одну ферментативную реакцию. В ряде случаев для получения практически ценных продуктов требуются весьма существенные перестройки молекулы субстрата, которые могут быть реализованы только действием комплекса ферментов. Отдельные трансформации, осуществляемые этими ферментами, могут относиться к различным классам, например окисление и гидролиз, или окисление, восстановление и гидролиз и т.п.

В тех случаях, когда не удается подобрать микроорганизм, осуществляющий сразу несколько превращений трансформируемого субстрата, или выход политрансформации монокультурой недостаточно высок, используют последовательно или одновременно несколько микроорганизмов.

При осуществлении последовательной трансформации возникают технологические трудности. При работе со смешанными культурами появляются проблемы, связанные с взаимодействием микроорганизмов. В ряде случаев в условиях совместного культивирования микроорганизмы функционируют иначе, чем в монокультуре. Культивирование в смеси может не только угнетать, но и индуцировать ферментативную активность.

2. Роль микробиологической трансформации

2.1 Роль микробиологической трансформации в процессах деградации чужеродных соединений

В последнее время накапливается все больше данных о том, что микробиологическая трансформация играет существенную роль в процессах обезвреживания и полной деградации чужеродных веществ, загрязняющих среду в результате деятельности человека. Попадая в почву или воду, эти соединения видоизменяются или распадаются до конечных продуктов в основном в результате физико-химических процессов, микробиологического разложения и поглощения высшими растениями. Микробиологические процессы имеют важное значение, в частности, в деградации пестицидов вносимых в почву в больших количествах. Поэтому микробиологическая трансформация и деградация пестицидов с точки зрения экологической проблемы имеет целенаправленное использование для очистки окружающей среды.

Существуют четыре возможных пути превращения пестицидов:

1) энзиматическое воздействие, которое ведет к полной потере ингибиторных свойств, так называемая детоксикация, или инактивация;

2) трансформация пестицидов в токсические вещества - процесс, именуемый активацией;

3) трансформация, результатом которой является превращение пестицида в соединение с другим спектром ингибирующего действия;

4) трансформация с образованием соединения-стимулятора.

Во всех случаях анализ продуктов превращения пестицидов, безусловно, очень важен, так как промежуточные единения в свою очередь влияют на микробную популяцию, урожай и т.д.

Современный этап исследований микробиологического воздействия на пестициды характеризуется выраженным интересом к метаболическим путям их деградации, закономерностям накопления промежуточных продуктов и их свойствам. В связи с накоплением интермедиатов производится детальное исследование кооперативного действия почвенной микрофлоры на чужеродные соединения так называемого комменсализма.

Пристальное внимание уделяется кометаболизму как феномену регуляции ферментативной активности микроорганизмов, позволяющему мобилизовать потенциальные возможности микроорганизмов.

Кометаболизм играет существенную роль в деградации микроорганизмами многих пестицидов, в том числе и тех, которые ранее были внесены в список «устойчивых». Например, ДДТ и его аналоги, а также полихлорароматика (2,3,6-ТБК и 2,4,5-Т) были описаны как устойчивые вещества, поскольку не удавалось выделить микроорганизмы, использующие их как субстрат для роста. В условиях кометаболизма появилась возможность осуществить частичную деградацию этих соединений. Кометаболизм гербицидов, например галогепированных производных бензола, чистыми культурами может привести к образованию промежуточных продуктов - фенолов и катехолов, которые в свою очередь могут метаболизироваться другими бактериальными формами. Если кометаболизм гербицидов осуществляется смесью культур с внесением дополнительного субстрата как источника углерода и энергии, то можно осуществить полную минерализацию гербицида.

углеводородокисляющий микроорганизм гриб кометаболизм

2.2 Трансформация феноксиуксусных кислот

Хлорзамещенные феноксиуксусные кислоты введены в качестве селективных гербицидов в конце Второй мировой войны. Они применяются для борьбы с сорняками на хлебных посевах и газонах. Особенно широкое применение нашли 2,4 -дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), 2-метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота (2М-4Х), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусиая кислота (2,4,5-Т).

Первые работы по микробному превращению феноксиалкановых кислот касались в основном устойчивости этих соединений и воздействию микроорганизмов. Было показано, что 2,4-Д разлагается быстро, а 2М-4Х и 2,4,5-Т - медленно. Автоклавирование ингибирует этот процесс, а тепло, влага и органические вещества ускоряют разложение гербицидов.

Способность использовать феноксиалкановые кислоты в качестве единственного источника углерода характерна для многих представителей почвенной микрофлоры. Это в основном представители родов Achrornobacter, Arthrobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, Corynebacteriurn. Концентрации феноксиуксусных кислот, разлагаемые микроорганизмами, могут быть достаточно высокими от 300 мг/л до 2,0 г/л и выше.

В зависимости от таксономического положения микроорганизмов пути метаболизма феноксиалкановых кислот различны. В настоящее время известно два пути: через оксифеноксиуксусные кислоты и через фенолы. Эти пути представлены на рисунке 3.

Рисунок 3 - Пути метаболизма: через оксифеноксиуксусные кислоты и через фенолы

2.3 Трансформация феноксиалкилкарбоновых кислот

В метаболизме высших щ- и г-кислот существенную роль играет Я-окисление. Расщепление 2,4-дихлорфеноксиалкилкарбоновых кислот бактериями рода Flavobacterium происходит двумя путями:

1) Я - окисление боковой алифатической цепи;

2) расщепление эфирной связи.

При Я-окислении щ-дихлорфеноксиалкилкарбоновых кислот с четным числом атомов в боковой цепи наблюдается ступенчатое отщепление двууглеродных фрагментов и образуются простые феноксиалкановые кислоты. Этот механизм отражён на рисунке 4.

Рисунок 4 - Ступенчатое отщепление двууглеродных фрагментов при Я-окислении щ-дихлорфеноксиалкилкарбоновых кислот

При Я-окислении алифатической боковой цепи с нечетным числом углеродных атомов образуется 2,4-дихлорфеноксиформиат, спонтанно разлагающийся в соответствующие фенолы. Реакции данного преобразования изображены на рисунке 5.



Рисунок 5 - 2,4-дихлорфеноксиформиат, спонтанно разлагающийся в соответствующие фенолы

Гриб Aspergillus niger осуществляет бетта-окисление боковой цепи и гидроксилирование гамма-феноксимасляной и омега-феноксивалериановой кислот в ароматическом ядре. При этом образуются соответственно 4-оксифеноксиуксусная и бетта-(4-оксифеноксипропионовая) кислоты. Помимо бетта-окисления, видимо, в молекуле 2,4-дихлорфеноксимасляной кислоты (2,4-ДМ) происходит разрыв эфирной связи (омега-связи), в результате образуются фенолы и жирные кислоты. Данная реакция изображена на рисунке 6.

Рисунок 6 - Разрыв эфирной связи в молекуле 2,4-дихлорфеноксимасляной кислоты (2,4-ДМ)

Разрыв эфирной связи, в отличие от бетта-окисления, немедленно инактивирует гербицид.

2.4 Трансформация галогенпроизводных циклических углеводородов

Галогенпроизводные циклических углеводородов остаются в почве неизменными в течение многих лет после внесения. Хлордан сохраняется в почве 12 лет после обработки, гептахлор - 9, альдрин - 4 года. Альдрин при этом превращается в диэльдрин, который накапливается в почве в количестве 10% от внесенной дозы.

Устойчивость хлорфенолов к микробному разложению в трансформации зависит от положения и числа атомов хлора в фенольном кольце. Широко применяемый гербицид пентахлорфенол (пента) считается одним из наиболее персистентных соединений семейства хлорфенолов. Наиболее активным трансформантом пентахлорфенола является Trichoderma virigatum. Данная культура метилирует пестицид до пентахлорфенола, который менее токсичен.

Полихлорзамещенные бифенилы могут деградироваться и трансформироваться культурами Achromobacter, причем при деградации n'n'-дихлорбифенила образуется n-хлорбензойная кислота, а второе бензольное кольцо расщепляется по мета-пути.

Разложение фунгицида хлоронеба (1,4-дихлор-2,5-диметоксибегоола) и продукта его деградации - 2,5-дихлор-4-метоксифенола осуществляется культурами Fusarium sp., Trichoderma viride и Mucor ramannanus только в присутствии ростовых факторов.

Дихлордифенилтрихлорэтан относится к особо устойчивым соединениям. Трансформация ДДТ чистыми культурами актиномицетов и бактерий осуществляется успешно, но в почве деградация минимальна. Многим исследователям удалось осуществить деградацию ДДТ до водорастворимых метаболитов с помощью грибов, но внесение спор грибов в почву, загрязненную ДДТ, не приносило желаемого результата. Большое влияние ни разложение ДДТ культурами и почве оказывает присутствие аборигенной микрофлоры, метаболитов микроорганизмов, остаточных количеств инсектицидов.

2.5 Трансформация карбаматов

В последнее время широкое применение нашли пестициды, в основе которых лежат анилиновые основания. Возможность их дектосикации с помощью микроорганизмов изучается весьма интенсивно. Первоначально ацетанилид, пропанилид и другие производные гидролизуются до соответствующих анилиновой и алькильной частей, затем анилиновые производные трансформируются в соответствующие азобензолы. Возможна также детоксикация образующихся хлоранилинов путем микробиологического ацетилирования, гидроксилирования или окисления аминогруппы.

Хлорпрофам может быть гидролизован ферментными препаратами Pseudomonas striata по механизму,изображённому на рисунке 7.

Рисунок 7 - Гидролиз хлорпрофама

На скорость ферментативного гидролиза фенилкарбаматов большое влияние оказывают индукционный, стерический, резонансный эффект и размеры молекулы. Скорость гидролиза убывает в ряду С2H5, n-С3H7,изо- С3H7, С6H7CH2 ,когда эти группы находятся в эфирной части.

Широкое применение в трансформации карбаматов нашел фермент - арилациламидаза, который был выделен из культуры Bacillus sphaericus AT2123.

Фермент обладает субстратной специфичностью и катализирует расщепление большого разнообразия субстратов фениламидного типа (ациланилидные гербициды и фенилкарбаматы) до соответствующих анилинов. Наибольшая активность проявлялась в отношении простых ациланилидов.

2.6 Трансформация замещенных мочевины

Условия, благоприятствующие росту микроорганизмов, например, оптимальная температура и влажность, способствуют инактивации гербицидов - производных мочевины. Представители родов Xanthomonas, Sarcina, Bacillus, PeniciUium, Aspcrgillus могуг использовать монурон как единственный источник углерода.

Микроорганизмы способны отщеплять метильные группы и окислять их, а также дезаминировать и декарбоксидировать молекулу гербицида.

В настоящее время предложен следующий механизм разложения хлороксурона, представленный на рисунке 8, состоит в последовательном метилировании и дезаминировании-декарбоксилировании:

Рисунок 8 - Механизм разложения хлороксурона

2.7 Трансформация триазинов

Триазины - гербициды, обладающие широким спектром биологической активности. Селективность триазинов зависит от заместителей в триазиновом ядре. Замещенные хлортриазины, такие как симазин, атразин используются в качестве источника азота грибами Fusarium oxysporum, Fusarium avenaceum, Penicilliuin cyclopium, Penicillium lanosocoerubum, Cylindrocarpon radicicola, Stachybotrys sp., но вышеуказанные организмы не способны усваивать углерод этих соединений.

2.8 Биодеградация поверхностно-активных углеводородов

Поверхностно-активные углеводороды (ПАУ) тем устойчивее к биодеградации, чем больше конденсированных ароматических ядер в молекуле. Полициклические ароматические углеводороды с 2-3 ароматическими кольцами: нафталин, фенатрен, антрацен - менее токсичны и более подвержены воздействию микроорганизмов.

В почвах ПАУ потенциально доступны для многих организмов. Они окисляются отдельными видами бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia и грибов Aspergillus, Pemcillium

В процессе окисления ароматические группы ПАУ подвергаются гидроксилированию с последующим расщеплением дигидроксилированного кольца. Разрыв кольца катализируется диоксигеназами. Дальнейшее расщепление осуществляется через раскрытие ароматического кольца. На рисунке 9 представлены схемы разрыва дигидроксилированного кольца. [2]



Рисунок 9 - Расщепление нафталина

3. Характеристика основных углеводородокисляющих микроорганизмов

При разложении органических загрязнений, попадающих в окружающую среду, ведущая роль принадлежит микроорганизмам.

Наиболее активными и широко распространенными деструкторами нефтепродуктов оказались бактерии родов Pseudomonas, Rhodococcus, Arthrobacter, Candida, Actinomyces, Bacillus, Nocardia и Acinetobacter. Отселектированные микроорганизмы являются природными изолятами, нетоксичными и непатогенными. Микробные культуры активно утилизируют нефть и нефтепродукты, в том числе, трудноразлагаемые, тяжелые фракции нефти. Способность ряда микроорганизмов к деструкции углеводородов нефти при низких температурах позволяет использовать их в биоремедиации загрязненных территорий в условиях холодного климата.[3]

Для свежезагрязненных почв характерна высокая численность почвенных микроорганизмов, представляющих собой бесцветные колонии бактерий родов Pseudomonas и Arthrobacter. Пигментированные колонии рода Rhodococcus, характеризующиеся, как правило, высокой степенью ферментативной активности - единичны. В отличие от свежезагрязненной почвы на более поздних срезках после загрязнения нефтью в почвах увеличивается численность групп олиготрофной микрофлоры, олигонитрофилов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Общая численность остается по-прежнему высокой, Преобладающими видами среди бактерий являются представители родов Rhodococcus и Pseudomonas, относительно высока численность родов Arthrobacter, Flavobacterium, Agrobacterium. Отмечено присутствие грибов родов Mucor, Penicillium и Trichoderma, которые встречающихся также и в незагрязненной почве. [4]

3.1 Краткая характеристика микроорганизмов рода Acinetobacter

Acinetobacter является грам-отрицательных бактерий рода принадлежащих Gammaproteobacteria. Виды рода Acinetobacter строго аэробные неферментирующие грам-отрицательные бактерий. Микроорганизмы представляют собой вытянутые палочки с закруглёнными концами. Рисунок 10 представляет собой фотографию микроорганизма рода Acinetobacter.

Рисунок 10 - Микроорганизмы вида Acinetobacter baumanni

Штаммы Acinetobacter часто вездесущи, проявляют метаболическую универсальность, являются устойчивыми, а некоторые предоставляют удобные системы для современных молекулярно-генетических манипуляций и последующего использования в промышленности. Эти характеристики применимы в биодеградации, биоремедиации, и производстве биополимеров и новых инженерных производных. [5]

3.2 Краткая характеристика микроорганизмов рода Candida

Дрожжеподобные грибы рода Candida -- это одноклеточные микроорганизмы размерами 6-10 мкм, имеющие обычно округлую, овальную, цилиндрическую или эллипсовидную форму. Рисунок 11 представляет собой фотографию микроорганизма рода Candida.[5]

Рисунок 11 - Микроорганизмы рода Candida

Единственной формой размножения грибов рода Candida является почкование (в формировании дочерней клетки участвуют все слои материнской клеточной стенки).

Вместе с тем, характерной особенностью грибов рода Candida является их диморфность. При определенных условиях, в частности, при развитии инфекции, эти грибы способны формировать гифы или псевдогифы, повышающие способность гриба проникать внутрь тканей.[4]

3.3 Краткая характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas

Хемоорганогетеротроф, облигатный аэроб (денитрификатор). Прямая или искривлённая с закруглёнными концами палочка, 1--5 или 0,5--1,0 мкм. Рисунок 12 представляет собой фотографию микроорганизма рода Pseudomonas. [5]

Микроорганизм рода Pseudomonas Растёт на мясопептонно агаре, мясопептонном бульоне (в среде помутнение и пленка, также сине-зелёный цвет). Растёт при 42 °C (оптимум -- 37 °C), селективная среда -- ЦПX-агар (питательный агар с цетилперидиниум-хлоридом). Образует протеазы.



Рисунок 12 - Микроорганизмы рода Pseudomonas

На твёрдых питательных средах диссоциирует на три формы- R-, S-. и M- форму. Продуцирует характерные пигменты: пиоцианин (феназиновый пигмент, окрашивает питательную среду в сине-зелёный цвет, экстрагируется хлороформом), пиовердин (желто-зелёный флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах пигмент) и пиорубин(бурого цвета). Некоторые штаммы осуществляют биодеструкцию углеводородов, в том числе формальдегида.[4]

3.4 Краткая характеристика микроорганизмов рода Arthrobacter

Микроорганизмы представляют собой грамположительные неспорообразующие палочки. В молодых культурах палочки имеют неправильную форму, часто V-образные с булавовидными концами. Нити отсутствуют. Рисунки 13 и 14 представляют собой фотографии микроорганизма рода Arthrobacter. [5]

Рисунок 13 - Микроорганизмы вида Arthrobacter crystallopoietes



Рисунок 14 - Микроорганизмы вида Arthrobacter crystallopoiete

По мере роста культуры палочки распадаются на мелкие кокки диаметром 0,6-1,0 мкм, располагающиеся одиночно, парами и в скоплениях неправильной формы. Являются облигатными аэробами с метаболизмом окислительного типа, оптимальная температура для роста 25-30⁰С. Колонии Arthrobacter устойчивы к высыханию и голоду. [4]

3.5 Краткая характеристика микроорганизмов рода Bacillus

Bacillus -- обширный род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры. Рисунок 15 представляет собой фотографию микроорганизма рода Bacillus.

Рисунок 15 - Микроорганизмы вида Bacillus stearothermophilus

Большинство бацилл -- почвенные сапрофиты. Являются аэробами или факультативными анаэробами, большинство представителей хемоорганогетеротрофы и растут на простых питательных средах. Крупные и среднего размера прямые или слабоизогнутые палочки, способные к образованию устойчивых к неблагоприятным воздействиям, таким как экстремальная температура, высушивание, ионизирующее излучение, химические агенты, большинство видов подвижно и обладают жгутиками, Bacillus anthracis образует капсулы. По методу Грамма окрашиваются положительно. [4]

3.6 Краткая характеристика микроорганизмов рода Actinomyces

Actinomyces -- род актиномицетов семейства Actinomycetaceae. Actinomyces представляет собой длинные ветвящиеся нити (также называемым мицелием), экзоспоры образуются на прямых или спирально закрученных спороносцах, представляющих собой цепочки, содержащие 30-50 спор. Рисунок 16 представляет собой фотографию микроорганизма рода Actinomyces

Рисунок 16 - Микроорганизмы рода Actinomyces

Микроорганизм рода Actinomyces окрашиваются по методу Грама положительно. Хемоорганогетеротрофы, анаэробы или факультативные анаэробы. Способны гидролизовать биополимеры растительного и животного происхождения - например лигнин и хитин. [6]

3.7 Краткая характеристика микроорганизмов рода Nocardia

Nocardia является род слабо-окрашивающихся грамположительных палочковидных бактерий. Этот род образует частично кислотоустойчивые ветвящиеся нити. Некоторые виды не являются патогенными, некоторые виды являются патогенными. Nocardia распространена по всему миру в почве, богатой органическими веществами. Рисунок 17 представляет собой фотографию микроорганизма рода Nocardia. [5]

Рисунок 17 - Микроорганизмы рода Nocardia

3.8 Краткая характеристика микроорганизмов рода Rhodococcus

Rhodococcus является родом нокардиоформных актиномицетов, аэробны, неспорообразующие, частично кислотоустойчивые, неподвижные грамположительные бактерии тесно связананные с микобактериями и коринебактериями. Рисунок 18 представляет собой фотографию микроорганизма рода Rhodococcus. [5]

Рисунок 18 - Микроорганизмы рода Rhodococcus

Способны обитать в широком диапазоне сред и условий, включая почву и воду. Rhodococcus чувствительны к лизоциму. Возможно образование различных форм от палочек до обильно разветвлённого мицелия.

Использование Rhodococcus свидетельствует о его способности к метаболизму вредных экологических загрязнителей, таких как толуол, нафталин и гербициды.

Rhodococcus способны использовать в качестве единственного источника углерода натриевую соль бензойной кислоты, тестостерона, андостерон. Используют в качестве источника азота аланин, глюкозиды, треонин, ацетамид и аспаргин.

Для биодеструкции нефтешламов в настоящее время активно используют микроорганизмы рода Rhodococcus. Многие авторы утверждают (Головцев и другие), что данные микроорганизмы наибольшую углеводородокисляющую активность проявляют в консорциуме с микроорганизме рода Bacillus и Fusarium.[2]

4. Биодеструкция нефтешламов

4.1 Деструкция нефтешламов ассоциациями микроорганизмов

Масштабы загрязнения окружающей среды углеводородами нефти огромны. Существуют различные методы очистки почвы и воды. Однако, наибольшую роль в этом процессе играют микроорганизмы. Существуют несколько способов рекультивации загрязненных земель:

- стимуляция аборигенной микрофлоры;

- внесение селекционных культур углеводородокисляющих микроорганизмов;

- внесение сорбента в почву, загрязненную углеводородами нефти;

- внесение селекционных культур и факторов роста аборигенной микрофлоры.

Практически все вышеуказанные способы направлены на использовании различных углеводородокисляющих микроорганизмов. Как показывает практика, для биоремедиации почвы лучше использовать биопрепараты, содержащие ассоциации микроорганизмов. Ассоциации микроорганизмов обеспечивают наибольшую степень утилизации загрязнителей. При разработке биопрепаратов возникают проблемы конкурентных отношений между микроорганизмами ассоциации и аллохтонной микрофлоры.

4.1.1 Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus

А.Е. Филонов, К.В. Петриков, Т.В. Якшина и их коллеги из Тульского государственного университета осуществили подбор оптимальных параметров как раздельного культивирования нефтеокисляющих микроорганизмов, так и выращивания в смешанной культуре с сохранением наибольшей жизнеспособности клеток и активности ключевых ферментов деградации углеводородов нефти.

В работе были использованы два штамма активных психротроф-ных микроорганизмов -- деструкторов углеводородов нефти из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ: Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), содержащий плазмиду биодеградации полиароматических углеводородов pNF142, и Rhodococcus sp. S67.

Для получения чистой рабочей культуры отдельные колонии пересевали три раза подряд на чашки Петри с агаризованной средой в присутствии нафталина (для бактерий рода Pseudomonas) или дизельного топлива (ДТ) (для бактерий рода Rhodococcus). Условия создавались аэробные.

В качестве добавок использовали салицилат натрия или ДТ. Добавки вносили в экспоненциальной фазе роста.

Условия ферментации штамма Rhodococcus sp. S67 были сходными с условиями культивирования псевдомонад. Состав среды отличался по содержанию кислотного гидролизата казеина (5 г/л) и дрожжевого автолизата (100 мл/л), а также присутствием пептона (5 г/л).

Выращивание смешанной культуры Pseudomonas и Rhodococcus осуществляли в условиях культивирования, аналогичным условиям культивирования родококков. Посев микроорганизмов p. Pseudomonas производили через 12 ч после начала культивирования родококков, одновременно добавляли глюкозу. В конце экспоненциальной фазы роста в среду вносили дизельное топливо. Длительность совместной ферментации составляла 26 ч.

Культивирование штаммов-нефтедеструкторов Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и Rhodococcus sp. S67 проводили в периодическом режиме в ферментерах. В состав использованной питательной среды КГКДА входили: кислотный гидролизат казеина и дрожжевой автолизат.

Ферментацию штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) проводили с добавлением салицилата натрия, поскольку известно, что салицилат является индуктором ферментов деградации полиароматических углеводородов, входящих в состав тяжелых фракций нефти, а также ряда ферментов, обладающих достаточно широкой субстратной специфичностью, а, следовательно, способствует наиболее полной деградации компонентов нефти. На рисунке 22 отображено влияние салицилата, ДТ и глюкозы на кинетику роста штамма Pseudomonas sp. 142NF (pNF142).

В другом эксперименте для индукции ферментных систем деградации углеводородов в процессе культивирования было использовано ДТ в экспоненциальной фазе роста, после чего наблюдали кратковременный рост культуры, а затем его снижение (что можно наблюдать на рисунке 19). Для поддержания роста, в среду добавляли глюкозу. Ферментацию прекращали в фазе замедления роста культуры. [10]

Время роста, ч

Рисунок 19 - Влияние салицилата, ДТ и глюкозы на кинетику роста штамма Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) (данные двух ферментации): 1 -- ферментация с салицилатом; 2 -- ферментация с ДТ

4.1.2 Культивирование Pseudomonas sp. 142NF(pNF142)и Rhodococcus sp. S67 в виде монокультур или в смешанной культуре

Штаммы-деструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus значительно различаются по удельной скорости роста, поэтому для получения близких значений количества клеток разных штаммов в смешанной культуре необходимо вносить посевной материал более быстро растущей культуры псевдомонад после инокуляции родококков. В результате подбора времени инокуляции посевной культуры псевдомонад при проведении совместной ферментации указанных микроорганизмов посев штамма Pseudomonas sp. 142NF производили через 12 ч после начала культивирования штамма Rhodococcus sp. S67.

На рисунке 24 представлены кривые роста микроорганизмов в смешанной культуре. Как видно из графиков на рисунке 20, время посева псевдомонад совпало с началом экспоненциальной фазы роста родококков. Следует отметить синхронность достижения стационарной фазы роста обеими культурами; при этом значения численности микроорганизмов обоих штаммов близки,данные об этом приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Ферментация штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142)

Ферментация	Максимальная численность микроорганизмов, КОЕ/мл	Время культивирования, ч	Максимальная удельная скорость роста д, ч (час роста)	Выход сырой биомассы, г КС	Численность микроорганизмов в КС, КОЕ/мл
Pseudomonas (с салицилатом)	6,7-109	14	1,99 (10-й)	160	4,2-10'°
Pseudomonas (сДТ)	2,1-Ю9	23	1,76 (10-й)	136	1, 8-10'°
Rhodococcus	4,9-1010	24	0,65 (18-й)	200	1,3-1012
Совместная	Р.-4,3-108 Rh- 6,3-108	26	Р.-0,54 (7-й) /8й.-0,44 (15-й)	208	Р.-3,4-10'° Rh- 3,8-10'°



Рисунок 20 - Кинетика роста штаммов Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) (1) и Rhodococcus sp. S67 (2) в смешанной культуре

Как видно из данных таблицы 2, по основным показателям совместная ферментация лишь незначительно уступает раздельному культивированию псевдомонад и родококков, а ее преимущества очевидны: число большинства необходимых технологических операций сокращается почти в два раза. Кроме того, соотношение, равное 1:1, штаммов Pseudomonas sp. 142NF и Rhodococcus sp. S67 в КС можно априори считать эффективным, а их численность (3,4-10¹⁰ КОЕ/мл и 3,8-10¹⁰ КОЕ/мл, соответственно) достаточно высока для использования в составе жидкой формы биопрепарата.

Таким образом, в данной работе были подобраны условия культивирования, позволяющие получить биомассу микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus с высокой численностью живых микроорганизмов, а также с сохранением активности ферментных систем биодеградации углеводородов нефти. Режим совместного культивирования был подобран таким образом, чтобы получать биомассу с равным соотношением численности штаммов Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и Rhodococcus sp. S67 при наименьшей длительности процесса ферментации. [11]

4.1.3 Обезвреживание нефтешламов ассоциацией микроорганизмов родов Bacillus, Rhodococcus и Fusarium

Головцов М.В. из Уфимского государственного нефтяного технического университета в своих исследованиях установил, что наибольшую активность при биодеструкции нефти и нефтепродуктов проявляет консорциум следующих непатогенных микроорганизмов: Rhodococcus erythropolis AC-1339 Д, Bacillus subtilis ВКМ 1742 Д и Fusarium species №56, взятых в соотношении 1:1:1. Данный консорциум способен использовать в качестве источника углерода нефть и нефтепродукты в количестве 1-5 % масс. Деструкцию гексадекана, дизельного топлива, мазута микроорганизмы способны осуществлять в полной минеральной среде. Подобранный консорциум способен разлагать не только легкие фракции нефти, такие как гексадекан, но и более тяжелые фракции нефти, например мазут, т.е. деструктировать широкий спектр углеводородов. Причем консорциум не теряет свою окислительную активность при содержании гексадекана, дизельного топлива, нефти и мазута при 5% масс. Максимальная биодеструкция наблюдается при содержании исследуемых нефтепродуктов в количестве 1% масс. и составляет через 48 суток для гексадекана- 90%, дизельного топлива- 85%, нефти- 82%, мазута- 52%, эти данные иллюстрирует рисунок 21.

Рисунок 21 - Степень биодеструкции нефти и нефтепродуктов ассоциацией микроорганизмов в полной минеральной среде