Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

Потенциальными субстратами кальпаинов являются белки цитоскелета, некоторые мембранно - связанные ферменты, белки ядерного матрикса, протеинкиназа С, рецепторы, фосфатазы, факторы транскрипции. Ограниченный протеолиз определенных белков кальпаинами показывает необходимость этого процесса для мембранного слияния. Активация Са2+ - зависимых нейтральных протеаз при апоптозе предшествует морфологическим изменениям и фрагментации хроматина в тимоцитах, подвергнутых облучению или действию дексометазона. Ингибиторы кальпаина предотвращают фрагментацию ДНК и гибель клеток. Было показано, что Са2+ - зависимая протеаза тимоцитов является обязательным компонентом каскада протеолитических ферментов метилпреднизолон - индуцированного апоптоза. Ингибиторы кальпаинов блокируют апоптоз HIV - индуцированных Т-лимфоцитов и восстанавливают иммунный ответ этих клеток, что предполагает потенциальное использование ингибиторов кальпаинов в терапии HIV инфекций. Действие этой нейтральной протеазы практически необратимо, что, по-видимому является одной из причин опасности длительного повышения уровня Са2+ в цитозоле (Kуцый и др., 1999).

В ответ на увеличение концентрации Са2+ кальпаины могут осуществлять ограниченный протеолиз ферментов, изменяя тем самым активность последних, увеличивать сродство рецепторов к лигандам, изменять пластичность мембран клеток, расщеплять миофибриллярные белки и нейтрофиламенты, вызывать деструкцию цитоскелетных компонентов клеток (Гусев, 1998).

Одной из важнейших функций кальпаинов является изменение биологической активности различных белков путем ограниченного протеолиза. В частности, таким образом, происходит активирование киназы фосфорилазы b и инактивация гликогенсинтетазы в мышце кролика. Следовательно, увеличение Са2+ в цитоплазме мышечных клеток, наблюдаемое при их сокращении, ведет к повышению активности кальпаинов и тем самым содействует расщеплению гликогена в этой ткани. С другой стороны, фосфатаза фосфорилазы превращается в активную форму с более низкой молекулярной массой также с участием этих ферментов (Croall, Demartino, 1991).

Основные функции кальпаинов мозга, очевидно, связаны с ограниченным протеолизом определенных цитоплазматических и мембранных белков, включая белки рецепторы и протеинкиназу С, а также белков цитоскелета клетки, выполняющих важную роль в регуляции внутриклеточного метаболизма, и с реализацией таких функций нейронов, как аксональный транспорт, трансмембранная передача сигнала, долговременная память и др. (Seubert et al., 1988).

Ключевая роль кальпаинов в нервной системе определяется в большей степени тем, что эти пептидгидролазы характеризуются двойной системой контроля их активности; одной, общей для всех протеолитических ферментов и обеспечиваемой специфическими эндогенными ингибиторами и реактивными предшественниками ферментов, и другой - регулируемой концентрацией эндогенного Са2+. Сочетание в первичной структуре Са2+ - зависимой нейтральной протеазы протеолитического и Са2+ - связывающего доменов, по-видимому, дает возможность строго регулировать активность фермента и включать его в обмен в зоне локального повышения концентрации Са2+, определяя тем самым топографию и временной контроль биологического процесса (Азарян, 1989).

Кальпаины изменяют активность и некоторых протеинкиназ. Так одна из протеинкиназ, осуществляющая фосфорилирование белка 6S рибосом, активируется кальпаинами, а действие последних усиливается при образовании комплексов инсулина с рецепторами на плазматических мембранах клеток (Kenyon et al., 2003).

При наличии в нейтрофилах человека микромолярных концентраций Са2+, и кальпаин, и протеинкиназа С ассоциируют с плазматическими мембранами. Это связывание обуславливает активацию протеиназы, которая в свою очередь осуществляет ограниченный протеолиз протеинкиназы с образованием активной ее формы, не нуждающейся в Са2+ и фосфолипиде. Активированная таким образом протеинкиназа диссоциирует с мембраны клеток и действует внутриклеточно на белки. В отсутствие протеиназы кальций содействует связыванию протеинкиназы С, однако превращение ее в независимую от кальция и фосфолипида форму не происходит и фермент остается ассоциированным с мембраной (Chua et al., 2000). Активирование кальпаина путем связывания его с мембраной наблюдается и в эритроцитах (Иванов и др., 1999). Имеются данные и об изменениях агрегационных свойств субъединиц цАМФ-зависимой протеинкиназы в клетках легкого новорожденных мышей путем ограниченного протеолиза с участием кальпаина. Следует отметить, образование в тромбоцитах человека Са2+-независимой протеинкиназы (молекулярная масса 50 тыс. дальтон) из более высокомолекулярного, зависимого от этого иона предшественника, также осуществляется при участии кальпаина (Chua et al., 2000).

Кальпаин с помощью ограниченного протеолиза активирует триптофангидроксилазу клеток печени животных, регулирующих биосинтез серотонина, а также катализирует образование из предшественников кининов, участвующих в воспалительных процессах. Из эритроцитов печени была выделена протеиназа, которая расщепляет пируваткиназу, причем последняя дефосфорилируется, и ее сродство к фосфоенолпировиноградной кислоте снижается (Локшина, 1985).

Показано, что действие таких биологически активных факторов, как полипептидные факторы роста, в частности эпидермальный фактор роста, контролируется путем ограниченного протеолиза с помощью кальпаинов. Имеются сообщения, что кальпаины могут принимать участие и в ограниченном протеолизе факторов роста связанных с рецепторами (Сологуб, Пашковская, 1988).

Кальпаины расщепляют различные белки, однако не действуют на низкомолекулярные синтетические субстраты, обычно используемые при определении активностей других протеиназ. Показано, что кальпаины мозга свиньи и обезьяны гидролизуют некоторые нейропептиды и либерины. Из мышцы сердца обезьяны выделен фермент этого типа, обладающий энкефалиназной активностью (Панченко и др., 1999), а из скелетных мышц человека кальпаины, действующие на нейротензин, динорфин, люлиберин, вещество Р и соматостатин. Кальпаины способны расщеплять также казеин, гемоглобин, однако не действуют на альбумин сыворотки крови. Интересно отметить, что фосфорилированные белки более чувствительны к действию этих ферментов, чем неэстерифицированные их формы (Лишманов и др., 1997).

Установлено, что связывание глутаминовой кислоты со специфическими рецепторами плазматических мембран клеток гиппокампа крыс значительно увеличивается в присутствии кальция, и вероятно, также обусловлено действием кальпаина на эти рецепторы. Оно сопровождается расщеплением фодрина - спектринподобного белка, локализованного на внутренней поверхности плазматических мембран нервных клеток, и таким образом регулируется пластичность мембран (Сологуб, Пашковская, 1998).

Наиболее охарактеризованными членами семейства являются m-кальпаин и µ-кальпаин (соответственно, кальпаин II и I). Микромолярные концентрации Са2+ активируют m-кальпаин, а для активации µ-кальпаина требуются миллимолярные концентрации Са2+. Обе изоформы фермента являются гетеродимерами, состоят из большой каталитической 70-80 кДа субъединицы и малой, общей для обоих белков, регуляторной 29-30 кДа субъединицы. Большая субъединица содержит 4 домена (dI-dIV), а малая 2 домена (dV dVI) (Darrel et al., 2003).

Домен I действительно не является доменом, и представляет собой единственную б - спираль, состоящую из 10 аминокислотных остатков, которая заякоривается в полость dVI. Эта спираль очень важна для стабилизации и активации некоторых кальпаинов.

Домен II содержит в себе каталитическую сторону и может быть разделен на 2 субдомена - dIIa и dIIb (Khorchid, Ikura, 2002). Домен содержит остаток Cys в положении 115 (для µ- кальпаина) или 105 (для m - кальпаина), остаток His в положении 272 или 262, остаток Asn в положении 296 или 286. Эти аминокислотные остатки образуют каталитическую триаду, характерную для цистеиновых протеиназ таких как кальпаин или катепсины B, L и S. Замечено, что активная сторона Cys расположена в dIIa, в то время как His и Asn, которые образовывают остаток каталитической триады - в субдомене IIb. Каждый из субдоменов связывает по одному атому Са2+ в пептидной петле, состоящей из 8 (домен IIa) или 9 (домен IIb) аминокислотных остатков. Гомологичная последовательность домена II среди различных видов высока (85-93%) (Moldоveanu et al., 2002).

Домен III имеет последовательность, не гомологичную другим полипептидным последовательностям. В связывании Са2+- связывающих доменов молекулы кальпаина с каталитическим доменом II, участвует домен III, связывая фосфолипиды и участвуя в электростатическом взаимодействии (Hosfield et al., 2001). Анализ аминокислотной последовательности показал, что этот домен также содержит 2 потенциальные Са2+ - связывающие последовательности EF-руки, одна из некоторых находится между доменами II/III (остатки 329-341 для µ-кальпаина; остатки 318-338 для m-кальпаина; в домене IIb кристаллографической структуры m-кальпаина), а другая последовательность находится на границе III/IV доменов (остатки 554-565 для µ-кальпаина; 541-552 для m-кальпаина; в домене IV кристаллографической структуры m-кальпаина). Последовательность на границе II/III доменов не имеет конформацию EF-руки в кристаллографической структуре m-кальпаина крысы и человека и этот регион, возможно, не связывает Са2+ (Strobl et al., 2000). Таким образом, домен III состоит из 8 нитей по типологии схож с С-2 доменом, обнаруженным у различных белков, включая протеинкиназу С и фосфолипазу С, который взаимодействует с Са2+ и фосфолипидами. Кислая петля внутри домена III предположительно играет роль Са2+- способствующей активации кальпаина (Khorchid, Ikura, 2002).

Домены dIV и dVI являются хорошо охарактеризованными Са2+-связывающими доменами, каждый из которых содержит 5 мотивов EF-руки. Пятые мотивы этих доменов взаимодействуют между собой, образуя гетеродимер. Каждый мотив EF-руки схож с таковым мотивом в кальмодулине (24-44% идентичности у µ - кальпаина и 51-54% у m - кальпаина). Кальпаины представляют собой семейство пента-EF-рук, т.е. содержащие 5 мотивов EF-руки и они уникальны не только тем, что содержат определенное количество Са2+ - связывающих мотивов, но также и тем, что первичная последовательность отличается от таковой у кальмодулина.

Домен dV малой субъединицы содержит кластеры остатков Gly на N-конце, которые участвуют в гидрофобной природе белка. Этот домен не виден в рентгеновских лучах, что предполагает то, что этот домен имеет очень гибкую структуру, которая не заякоривается с другими частями молекулы кальпаина (Strobl et al., 2000).

Транслокация кальпаинов к мембране клетки и их ограниченный протеолиз являются результатами активации кальпаина (Cuervo, Dice, 1998).

В 1981 году было открыто, что автолиз происходит в присутствие Са2+ (Suzuki et al., 1981)

Хотя автолиз происходит быстро, он включает несколько последовательных этапов: 1) для большой 80 кДа субъединицы µ - кальпаина NH2-терминальных 14 аминокислотных остатка удаляются первыми и образуется 78 кДа промежуточный продукт, затем удаляются дополнительно 12 аминокислотных остатка с образованием 76 кДа автолитического фрагмента; 2) для большой 80 кДа субъединицы m-кальпаина NH2-терминальных 9 аминокислотных остатков удаляются первыми, затем еще 9 остатков с образованием 78 кДа автолитического фрагмента; 3) для малой 28 кДа субъединицы NH2-терминальных 26 аминокислотных остатков удаляются с образованием фрагмента 26-27 кДа, от которого дополнительно отделяются 37 остатков (до Gly-64) - образуется фрагмент 22-23 кДа и в последнюю очередь отделяется еще более 28 аминокислотных остатков (до Ala-92) с образованием 18 кДа автолитического фрагмента. Малая субъединица автолизируется гораздо быстрее, чем большая субъединица в µ - кальпаине, в то время как в m - кальпаине происходит все наоборот (Brown, Crawfold, 1993).

Эндогенным ингибитором кальпаина является кальпастатин, чья молекулярная масса варьирует от 34 до 280-300 кДа. Хотя гомологичная последовательность среди кальпастатинов не так высока, как у кальпаинов, однако >65% аминокислотной последовательности идентична. Эта последовательность уникальна и не гомологична другим полипептидам, включая цистатины, которые ингибируют многие цистеиновые протеазы, но не кальпаины. Кальпастатин содержит 4 повторения, предельно гомологичные (23-36%), домены из 140 аминокислотных остатков каждый, плюс NH2-терминальный домен, называемый доменом L, который варьирует от 68-78 кДа, завися от размера этого домена L. Обнаружено, что все 4 домена - I,II, III и IV могут ингибировать протеолитическую активность и µ-, и m-кальпаинов. Каждый из доменов состоит из субдоменов: А, В и С. Домен L единственный, который не обладает активностью ингибитора. Способность отдельных доменов ингибировать кальпаин можно расположить следующим образом: домен I>домен IV>домен III>домен II (от более к менее эффективному) (Kawasaki et al., 1989). Эффективное ингибирование кальпаинов кальпастатином требует, чтобы кальпастатин связывался с молекулой кальпаина в трех местах: Са2+- зависимое включение субдомена А кальпастатина с доменом IV в кальпаине, субдомена С кальпастатина с доменом VI в кальпаине и субдомена В с участком около активной стороны кальпаина (домен IIa или IIb или обоими).

Связывание кальпастатина, содержащего субдомены А и В, с кальпаином предотвращает связывание кальпаина с мембранами, предполагая, что связывание кальпаинов с мембранами осуществляется доменами IV и VI, «кальмодулин-схожими» доменами в молекуле кальпаина, потому что субдомены А и В кальпастатина связывают домены IV и VI, соответственно (Kawasaki et al., 1993).

Присутствие Са2+ делает кальмодулин более гидрофобной молекулой и Са2+ также может увеличивать гидрофобность «кальмодулин-схожих» доменов кальпаинов.

Таким образом, из-за того, что наиболее эффективное ингибирование кальпаинов с кальпастатином требует участия всех субдоменов кальпастатина - А, В и С, то, возможно, что все три субдомена должны связываться с кальпаином для максимального ингибирования (Kawasaki et al., 1989).

Многообразие эффектов Са2+-зависимых нейтральных протеиназ обеспечивается активацией ряда ключевых ферментов обмена, рецепторов, а также расщеплением разнообразных белков (миофибриллярных, мембранных белков, цитоскелета). Особенности действия и субклеточная локализация этих протеиназ в местах клеточно-матриксных контактов предполагают определенные взаимоотношения кальпаин-кальпастатиновой системы и компонентов внеклеточного матрикса (Строев и др., 1997).

Карбоксипептидаза М (КП М, КФ 3.4.17.2) была обнаружена Skidgel и соавторами в цитоплазматических мембранах периферических тканей и мозга (Skidgel et al., 1984).

Фермент широко распространен в человеческой плаценте, почках, легких (Skidgel et al., 1991), периферических нервах, головном мозге (Nagae et al., 1992), желтом теле, гранулярных клетках растущих и незрелых фолликулов (Yoshioka S. et al., 1998), эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, лейкоцитах (De Saint-Vis et al., 1995), Активность карбоксипептидазы М в нервной ткани на порядок ниже, чем в плаценте, а в периферических нервах выше, чем в головном мозге. В мозге фермент обнаружен в клетках глиии, а также в комплексе с миелином и миелинформирующими клетками (Nagae et al., 1992).

КП М является гликопротеином с Mr 62000 (Deddish et al., 1990, Skidgel et al., 1986). Фермент представлен одной полипептидной цепью и связан с плазматической мембраной при помощи остатка гликозил-фосфатидилинозитола (Deddish et al., 1990, Skidgel et al., 1986). При воздействии трипсина и фосфолипазы С КП М переходит в растворимую форму за счет удаления остатка гликозил-фосфатидилинозитола (Deddish et al., 1990, Skidgel et al., 1996). Этот процесс возможен и in vivo, так как фермент обнаружен в моче и амниотической жидкости (Skidgel et al., 1996). При химическом дегликозилировании образуется полипептид с Mr 48000, который состоит из 439 аминокислотных остатков (Skidgel et al., 1991).

Максимальная активность КП М отмечается при рН 7,0. В активном центре фермента находится ион Zn2+ (Skidgel et al., 1986). Ионы Со2+ повышают активность КП М в 1,5 - 2 раза, причем степень активации возрастает при снижении рН. Действие фермента ингибируется ионами Cd2+, о-фенантролином, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой (Deddish et al., 1990).

КП М отщепляет остатки только основных аминокислот, причем в отсутствие ионов Со2+ предпочтительней отщепляет аргинин, а в присутствии Со2+ - лизин. Фермент в большей степени проявляет эстеразную активность, чем пептидазную (Deddish et al., 1990, Skidgel et al., 1986). In vitro КП М отщепляет остатки аргинина и лизина с С-конца Met5-энкефалин-Arg6, Met-энкефалин-Lys6, Leu5-энкефалин-Arg6, брадикинина, динорфина А1-13 (Skidgel et al., 1986), фактора роста эпидермиса (Skidgel et al., 1996), анафилотоксинов С3а, С4а и С5а, различных синтетических пептидов (Deddish et al., 1990, Skidgel et al., 1984).

Считают, что карбоксипептидаза М участвует в инактивации или модулировании активности пептидных гормонов до или после их взаимодействия с рецепторами, вовлекается в процессы клеточного роста и дифференциации. В связи с этим представляет интерес изучение активности КП М при введении галоперидола и диазепама.

Каспазы (КФ 3.4.22) - это внутриклеточные пептидгидролазы, имеющие активированный цистеин внутри высококонсервативного активного сайта, включающего пентапептид QACXG, который определяет связывание пептидного субстрата и его гидролиз после остатка аспарагиновой кислоты. В настоящее время все известные каспазы пронумерованы согласно времени их открытия (Мартынова, 2003).

Каспазы обнаружены во всех тканях млекопитающих, где они выполняют различные физиологические функции. Для каждого типа клеток характерны уникальные каспазозависимые сигнальные пути. Каспазы-3, -9 участвуют в ремоделировании клеток и тканей, в дифференцировке и пролиферации гемопоэтических клеток, в негативной селекции тимоцитов, в развитии мозга и сердечной мышцы в эмбриональный период и регулируют активность ферментов головного мозга, каспазы-3 - в противовирусной защите путем активации IL-16. Изменение физиологического состояния клетки приводит к изменению мишеней действия каспаз, например, при апоптозе каспазы активируют мембранносвязанные факторы транскрипции, которые в живой клетке поддерживают гомеостаз холестерина и активируются другими ферментами (Гуляева, 2003).

Каспаза синтезируется в клетке первоначально в виде неактивного профермента, состоящего из N-концевого полипептида (так называемого продомена), большой и малой субъединиц и связывающего региона между ними (Мартынова, 2003).

Образование активных форм каспаз инициируется протеолитическим расщеплением по связи Asp-Xaa во внутренних сайтах между доменами, что приводит к последовательному высвобождению малой субъединицы, связывающего региона, большой субъединицы и удалению продомена. Большая и малая субъединицы из разных прокаспаз собираются в единый комплекс. Активная форма каспазы - это тетрамер, в котором связь осуществляется двумя малыми субъединицами, окруженными двумя большими субъединицами. Два каталитических центра формируются аминокислотами большой и малой субъединиц (Куцый и др., 1999).

Среди эффекторных каспаз каспаза 3 в нервной ткани привлекает особое внимание, поскольку принято считать, что именно этот фермент тесно связан с программируемой гибелью нейронов. Этот фермент рассматривают как фермент, принадлежащий к группе апоптических каспаз, передающих и реализующих сигнал к клеточной гибели (Гуляева, 2003).

Каспазы участвуют в изменении всех частей клетки при апоптозе, что определяет его морфологические характеристики. Они расщепляют структурные белки цитоскелета (актин, фодрин), фокальные киназы, что приводит к потере адгезии клетки. Важно подчеркнуть, что каспазы расщепляют только незначительную фракцию белков в клетке, что, однако, достаточно для ее полной разборки на апоптические тельца. Каспазы обуславливают такой важный признак апоптоза, как олигонуклеосомную фрагментацию ДНК, которая осуществляется ДНК-фрагментирующими факторами, активированными каспазозависимыми эндонуклеазами, а также при каспазозависимом расщеплении поли(АДФ-рибоза)полимеразы и потере ферментов репликации и сплайсинга ДНК (Уманский, 1996).

К внеклеточным нейтральным протеазам относятся матриксные металлопротеазы (ММП) или матриксины, функция которых связана с обменом белков межклеточного матрикса. Эти ферменты играют решающую роль при развитии таких физиологических процессов, как морфогенез, резорбция и ремоделирование тканей, миграция, адгезия, дифференцировка и пролиферация клеток, а также при патологических состояниях (ревматический артрит, гломерулонефрит, пародонтиты, изъязвление роговой оболочки глаз и др.). Кроме того, исследования последних лет позволили открыть новые функции ММП в опухолевой прогрессии: участие в выходе депонированных факторов роста, расщепление некоторых биоактивных молекул с образованием веществ с новыми биологическими свойствами, участие в канцерогенезе ряда опухолей, мощный ангиогенный эффект, участие в поддержании жизнеспособности опухолевых клеток. Все перечисленные свойства делают их ключевыми маркерами опухолевой прогрессии (Клишо и др., 2005).

Семейство ММП обладает некоторыми общими характерными чертами. В то же время на основании данных по структурной организации и субстратной специфичности в семействе ММП выделены четыре подсемейства: коллагеназы, желатиназы, стромелизины и остальные ММП, не относящиеся к перечисленным подсемействам. ММП представленных подсемейств могут различаться способом активации проферментов и особенностями взаимодействия с эндогенными ингибиторами.

ММП синтезируются и секретируются целым рядом клеток: фибробластами, эпителиальными клетками, фагоцитами, лимфоцитами и онкогенно-трансформированными клетками. За способность этих ферментов специфически гидролизовать все основные белки матрикса они были названы металлопротеиназами или матриксинами. В настоящее время известно около 15-18 представителей этого семейства, охарактеризованных в различной степени. Все члены семейства обладают общими характерными чертами: 1) содержат цинк в активном центре и относятся к кальций-зависимым протеиназам, ингибируются хелатными агентами; 2) каталитический домен содержит мотив HEXXHXXGXXH, три остатка гистидина которого связывают атом цинка в активном центре; 3) обладают сходной доменной структурой; 4) гидролизуют один или несколько компонентов матрикса и базальных мембран; 5) секретируются в виде проферментов, пропептидный домен содержит консервативную последовательность, которая отвечает за активацию про-ММП; 6) проферменты активируются рядом протеиназ, тиолмодифицирующими агентами и хаотропными реагентами; 7) ингибируются специфическими тканевыми ингибиторами; 8) последовательности кДНК всех ММП имеют высокую степень гомологии с кДНК коллагеназы; 9) промоторные участки генов содержат несколько сходных регуляторных последовательностей (Соловьева и др., 2000).

Активность ферментов в тканях зависит от уровня их генов и от наличия активаторов и ингибиторов ферментов в окружающей среде. ММП в обычных условиях содержатся в тканях в незначительных количествах. Эти протеиназы относятся к «индуцируемым» ферментам, синтез которых на уровне транскрипции контролируется рядом факторов: цитокинами, факторами роста, химическими соединениями, факторами, действующими на поверхность клетки (конканавалинА, фрагменты фибронектина и др.), факторами, тормозящими уровень синтеза (глюкокортикоиды, эстроген, прогестерон и др.). Действие этих факторов зависит от типа клеток и вида животного. Анализ промоторов показал, что они содержат общие элементы, отвечающие за механизмы регуляции экспрессии генов глюкокортикоидами, эстрогеном, прогестероном и др.

На пострансляционном уровне в физиологических условиях известны два основных пути регуляции активности ферментов: 1) активация зимогенов и 2) взаимодействие с эндогенными ингибиторами. Все зимогены ММП содержат в пропептиде консервативную последовательность в пропептиде, в которую входит остаток Cys. Рентгеноструктурные исследования показали, что этот остаток образует координационную связь с атомом Zn2+ в активном центре и локализован недалеко от С-конца пропептидных фрагментов ММП. Активация проферментов in vivo может происходить с помощью протеиназ, а также тиолмодифицирующих и хаотропных агентов. В обоих случаях активация, по-видимому, происходит ступенчато и на конечном этапе участвуют ММП, уже находящиеся в активной форме (Клишо и др., 2005).

Про-ММП активируется рядом протеолитических ферментов. В большинстве случаев активация проферментов происходит ступенчато: на первой ступени протеиназа-активатор атакует участок пептидной цепи, локализованный в середине пропептида, в результате чего образуется промежуточный продукт с незначительной активностью. На следующей ступени остаток пропептида удаляется с помощью внутримолекулярной реакции или при действии других активных форм ММП. Последовательность в гидролизуемом участке пропептида определяет тип протеиназ, способных активировать данную ММП.

Активность ММП в физиологических условиях регулируется специфическими тканевыми ингибиторами ММП-ТIMП. В настоящее время хорошо изучены три ТIMП из различных тканей человека. Они связываются с про-ММП и активными ММП стехиометрически, ингибируя, таким образом, как автокаталитическую активацию латентных форм ММП, так и активные ферменты. ТIMП различаются по их специфическому действию на ММП. Так, ТIMП-1 значительно лучше ингибирует желатиназу В (ММП-9), в то время как ТIMП-2 подавляет активность желатиназы А (ММП-2). Ингибиторы могут быть инактивированы с помощью ряда протеиназ - трипсина, химотрипсина, стромелизина-3 и эластазы нейтрофилов.

В тканях ММП могут ингибироваться также б2-макроглобулином, который способен нековалентно связываться с этими ферментами. До 95% ингибированной коллагеназы в плазме крови находятся в комплексе с б2-макроглобулином. Предполагается, что б2-макроглобулин выступает основным регулятором коллагенолиза в физиологических жидкостях.

В нормальных физиологических условиях матриксины играют центральную роль в процессах морфогенеза, ремоделирования и резорбции тканей. Они принимают участие в деструкции матрикса при ряде заболеваний (пародонтиты, хронические язвы роговой оболочки глаза, а также процессы инвазии и метастазирования опухолей).

Матриксины в физиологических условиях секретируются из клеток в очень незначительных количествах. Одной из характерных особенностей синтеза этих ферментов является его способность к индукции, т.е. синтез и секреция ММП могут контролироваться многими факторами (Винокурова и др., 2002).

В процессах эмбрионального развития и морфогенеза деструкция соединительно-тканного матрикса является центральной, критической стадией. Экспериментально на мышах было показано, что на стадии имплантации эмбриональных клеток в матку в них экспрессируются гены ММП-1,-2,-3 и особенно ММП-9, а также ТIMП-1. В клетках материнской ткани, окружающей эмбрион, в течение 5-6 дней экспрессируется ген ТIMП-3 (ингибитора желатиназ), но экспрессия и синтеза ТIMP-1 и -2 ни в материнских, ни в эмбриональных клетках не наблюдалось. Определенное соотношение синтеза ММП и специфических эндогенных ингибиторов обеспечивает внедрение эмбриона в стенку матки.

В период метаморфоза травоядные головастики становятся плотоядными лягушками. Это превращение сопровождается целым каскадом изменений в пищеварительном тракте. Клетки первичного эпителия подвергаются апоптозу, происходит его замена вторичным складчатым эпителием. Высокий уровень стромелизина-3 (ММП-11) был найден в кишечнике головастика в период метаморфоза, который был индуцирован тиреоидным гормоном, а также в его хвосте, но не при развитии задних конечностей. Предполагается, что тканевое ремоделирование вызывается стромелизином-3 и, возможно, другими матриксинами, что приводит к обширной гибели клеток в период метаморфоза. Ранее отмечалось участие коллагеназы I типа в этих процессах (Соловьева, 2002).

Образование новых кровеносных сосудов - необходимый этап в процессах развития организма, заживления ран и воспаления. Процесс требует отделения эндотелиальных клеток от базальных мембран и их миграции через соединительно-тканных барьер. Ряд факторов, стимулирующий ангиогенез (фактор роста фибробластов, эндотелиальных фактор роста и др.), стимулируют и продукцию ММП. ММП-1,-2,-3 и -9 были обнаружены в стимулированных эндотелиальных клетках; уровень каждого фермента зависел от источника и вида клеток. Действие ингибитора ММП, в том числе ТIMП-1, не инвазивный процесс эндотелиальных клеток подтверждает участие ММП в ангиогенезе .

Участие ММП в опухолевой трансформации, а также в процессах инвазии и метастазирования опухолей хорошо доказано in vitro и in vivo. Несколько ММП было впервые клонировано из генов опухолевых клеток (желатиназа А, желатиназа В, коллагеназа 3, матрилизин, стромелизин-1, стромелизин-2, МТ-ММП-1, МТ-ММП-4), или кодирующая их последовательность была обнаружена в генах метастатических опухолей (стромелизин-3). ММР были найдены в опухолях человека, локализованных в опухолях человека, локализованных в легких, желудке, прямой кишке, простате и др.

Полученные многочисленные данные свидетельствуют о том, что увеличенная экспрессия ММП коррелирует с деструктивными изменениями в матриксе и с туморогенным фенотипом клеток, а также зависит от вида опухоли и ткани (Дилакян, 2000).

К первому, наиболее изученному подсемейству ММП относятся коллагеназы. В настоящее время известны четыре представителя этого семейства: интерстициальная коллагеназа, или коллагеназа I типа (ММП-1), коллагеназа нейтрофилов (ММП-8), коллагеназа 3 (ММП-13), коллагеназа 4 (ММП-18). ММП-1 - первый тканевой фермент, который гидролизовал спиральную область коллагена. В настоящее время известно, что ММП-1 синтезируется рядом клеток: нормальными и трансформированными фибробластами, хондроцитами, эпителиальными клетками, макрофагами. ММП-8 была открыта в нейтрофилах, за что и получила свое название нейтрофильной коллагеназы. ММП-3 найдена в клетках карциномы молочной железы, а также в клетках костной ткани грызунов. Свое название коллагеназы получили за способность гидролизовать нативный коллаген в спиральной области (Соловьева и др., 2002).

Желатиназы гидролизуют нефибриллярный коллаген IV типа, образующий базальные мембраны; считается, что именно эти протеазы инициируют инвазивные процессы. Группа желатиназ состоит из ММП-2 (желатиназа А) и ММП-9 (желатиназа В). В гистологических препаратах опухолей ММП-2 обнаруживали, в основном, в инвазивном фронте рака. Другие исследователи утверждают, что наиболее выраженную экспрессию ММП-2 наблюдали в клетках стромы около продвигающихся краев опухоли. Основными продуцентами ММП-2 при опухолевом росте могут быть опухолевые клетки или фибробласты окружающей ткани, однако их роль в этом процессе точно не определена.

Группа стромелизинов состоит из ММП-3 (стромелизин-1), ММП-10 (стромелизин-2) и ММП-11 (стромелизин-3).

Матрилизин (ММП-7) - самая короткая металлопротеиназа.

Мембранные ММП локализованы на поверхности опухолевых клеток и отличаются от других ММП тем, что имеют трансмембранный домен. В настоящее время известно 4 представителя этой группы, но наиболее изучен один - ММП-14 (МТ1-ММП). МТ1-ММП была преимущественно обнаружена в опухолевых тканях плоскоклеточной карциномы головы и шеи, в то время как образцы нормальных тканей ее практически не содержали. МТ1-ММП может локально гидролизовать компоненты тканевых барьеров. Одним из главных субстратов является коллаген I типа - основной компонент экстраклеточного матрикса. Хотя МТ1-ММП не может разлагать коллаген IV типа в базальной мембране, она связывает и активирует про-ММП-2, одну из коллагеназ типа. Однако разложение экстраклеточного матрикса - это не единственная функция МТ1-ММП. Этот фермент также регулирует взаимодействие клеток с экстраклеточным матриксом, расщепляя клеточные адгезивные молекулы, что, в конечном счете, способствует клеточному перемещению (Клишо и др., 2005).

В настоящее время проводятся многочисленные исследования по разработке ингибиторов ММП как перспективных лекарственных препаратов.

В сыворотке крови к ферментам, активным в нейтральном диапазоне рН, относятся карбоксипептидаза В, плазмин, калликреин.

Калликреин-кининовая система крови является центральным звеном в комплексе гуморальных систем, регулирующих гомеостаз и осуществляющих адаптивно-защитные реакции организма, активно участвующих в снабжении органов и тканей кислородом при гипоксических состояниях. Ее активация является неспецифической реакцией организма и носит, в основном, защитный характер (Гельцер, Жилкова, 2005).

Плазмин обладает тромболитическим эффектом и снижает свертываемость крови. В организме он присутствует в виде неактивного предшественника - плазминогена, чья концентрация в плазме крови достигает 0.2 г/л (Кузнецова и др., 2004).

Особую группу ферментов, осуществляющих заключительные стадии гидролиза белков, составляют дипептидазы, относящиеся к экзогидролазам. Дипептидазы ответственны за пополнение фонда свободных аминокислот для метаболических потребностей организма и имеют особое значение для нервной ткани. Одним из представителей данной группы ферментов, активность которого максимальна при нейтральном значении рН, является глицилглицин-дипептидаза (3.4.13.1). Конечным продуктом этого фермента является глицин, входящий в состав многих белков и биологически активных соединений. Есть группа аминокислот, которые вырабатываются в печени, такие аминокислоты называют заменимыми. К ним относится и глицин. По последним сведениям он способствует нормализации работы гипофиза, оказывает хорошее действие при терапии мышечной дистрофии, гипогликемии (Gomeza et al., 2003).

Глицин также является нейромедиаторной аминокислотой. Рецепторы к глицину имеются во многих участках головного мозга и спинного мозга и оказывают «тормозное» воздействие на нейроны, уменьшают выделение из нейронов «возбуждающих» аминокислот, таких, как глутаминовая кислота, и повышают выделение ГАМК. Обладает некоторыми ноотропными свойствами, улучшает память и ассоциативные процессы. Глицин обладает глицин- и ГАМК-ергическим, альфа1-адреноблокирующим, антиоксидантным, антитоксическим действием; регулирует деятельность глутаматных (NMDA) рецепторов (Li, Han, 2006).

Глицин относится к средствам, способствующим нормализации работы сосудов головного мозга. Кроме того, он в организме может связывать ядовитые вещества, при этом яды деактивируются. Встуапя во взаимодействие с определенными веществами, глицин становится строительным материалом для выработки протеинов, ферментов и гормонов, а также и иных необходимых для организма веществ.

Глицин помогает доставить к клеткам достаточное количество кислорода, тем самым он снимает излишнюю напряженность в клетке и снижает активность нейромедиаторов.

Глицин - тормозной нейротрансмиттер в механизмах острой церебральной ишемии (Gusev et al., 2000). Он служит медиатором в некоторых случаях постсинаптического торможения в спинном мозге. Специфическим антагонистом глицина является стрихнин, аминокислоты.

Традиционно считалось, что глицин проявляет нейротрансмиттерные свойства на уровне спинного мозга, продолговатого мозга и моста, высвобождаясь в основном из сегментарных интернейронов и проприоспинальных систем и ингибируя посредством аксо-дендрических и аксо-аксональных контактов мотонейроны (Turecek, Trussel, 2001). Позднее была доказана роль глицина как тормозного нейротрансмиттера практически во всех отделахцентральной нервной системы. В головном мозге большая плотность глициновых рецепторов обнаружена не только в структурах ствола, но и в коре больших полушарий, стриатуме, ядрах гипоталамуса, проводниках от лобной коры к гипоталамусу, мозжечке. Был сделан вывод, что ГАМК и глицин являются равноценными нейротнасмиттерами, обеспечивающими защитное торможение в ЦНС, роль которого возрастает в условиях повышенного выброса глутамата (Watanabe et al., 1992).

Ингибирующие свойства глицин проявляет посредством взаимодействия не только с собственными глициновыми рецепторами, но и с рецепторами ГАМК. Вместе с тем экспериментально доказано, что глицин в субмикромолекулярных концентрациях необходим для нормального функционирования глутаматных NMDA-рецепторов. Активация NMDA-рецепторов возможна лишь при условии связывания глицина с их специфическими (нечувствительными к стрихнину) глициновыми сайтами, т.е. глицин является их ко-агонистом. В нормальных условиях in vivo обычные концентрации эндогенного глицина полностью связывают участки глутаматных рецепторов. Потенцирующее действие глицина на NMDA-рецептор проявляется в концентрациях ниже 0,1 мкмоль, а концентрации от 10 до 100 мкмоль полностью насыщают глициновый сайт. Введение высоких концентраций глицина (100 мкмоль и 1 млмоль) крысам в условиях недостатка кислорода не вызывает длительной модуляции активности NMDA-рецепторов в гиппокампе (Parsons et al., 1997). Получено подтверждение, что повышенные концентрации глицина, которые возникают при ишемии (10-100 млмоль), не активируют NMDA-индуцированную деполяризацию in vivo и, следовательно, не увеличивают эксайтотоксичность (Оbrenovitch et al., 1997). Интересно, что введение животным высоких доз глицина или некоторых его агонистов (1-амино-1-карбоксициклопропана), являющегося почти полным агонистом, и D-циклосерина, обладающего 40-60% эффективности глицина оказывает противосудорожное действие, а также усиливает эффекты противоэпилептических средств (Peterson, 1991). Такое влияние глицина и его агонистов было бы невозможным, если бы основным механизмом нейротрансмиттера являлась активация глутаматергических систем.

Наряду с нейротрансмиттерным глицин обладает также общеметаболическим действием, связывает низкомолекулярные токсичные продукты (альдегиды, кетоны), в больших количествах образующиеся в процессе ишемии (Лаврецкая, 1985; Meister, 1957; Williams, 1963). В эксперименте на крысах с фокальной ишемией переднего мозга введение глицина в дозе 20 мг/кг (в течение первых 2 ч после операции и далее 1 раз в день в течение 9 дней) сопровождалось значительным повышением концентрации глицина в ткани мозга (в стриатуме - на 63%, в париетальной коре - на 45%), достоверно увеличивало скорость оборота ГАМК как в зоне ишемии, так и в окружающей ткани по сравнению с контрольной группой животных (Castillo et al., 1996). На фоне применения глицина отмечалось значимое снижение концентраций продуктов оксидативного стресса в зоне ишемии, что сопровождалось быстрой нормализацией поведения и условных рефлексов у крыс. Установлено эффективное действие глицина через рецепторные зоны, что значительно расширяет его терапевтические возможности. Через 10 мин после нанесения меченного тритием глицина на конъюнктиву глазного яблока, интраназально, на слизистую оболочку щеки методом сцинтиляционной спектрометрии регистрировали его повышенное потребление в разных мозговых структурах и цереброспинальной жидкости. Нанесение глицина на конъюнктиву глазного яблока сопровождается увеличением его концентрации до максимальной в первые 30 мин в зрительном перекрестке и через 2 ч - в зрительной зоне коры (Бадалян, Скворцов, 1985).

Из вышесказанного понятно насколько велика роль нейтральных протеиназ в нормальном функционировании организма животных и человека.

1.3 Обмен белков при гипотермии и зимней спячке

Поскольку белковые вещества составляют основу биохимизма всех тканей, то исследование особенностей обмена белков при гипотермических состояниях весьма важно для познания своеобразия внутриклеточных биохимических процессов, происходящих при пониженной температуре (Палладин и др., 1972).

При охлаждении теплокровного организма возникает чрезвычайная ситуация, которая сопровождается изменениями метаболизма в целом, прежде всего в обмене белков головного мозга. Так, при понижении температуры тела на каждые 10?С скорость обновляемости белков мозга снижается примерно на каждые 62% (Lajtha, Sershen, 1975).

Животных, способных поддерживать температуру тела за счет внутренней теплопродукции, называют эндотермными - в отличие от эктотермных, температура тела которых зависит от температуры окружающей среды. К эндотермам относятся в первую очередь все теплокровные, т.е. млекопитающие и птицы (теплокровных и холоднокровных животных нередко называют соответственно гомойотермными и пойкилотермными). Впадающих в спячку теплокровных можно определить как гетеротермные эндотермы; гетеротермия означает периодическое изменение температуры, в данном случае - ее падение ниже уровня, соответствующего активному образу жизни (Игнатьев и др., 2001).

Сезонные изменения климата и происходящие в связи с ними перерывы в составе растительных и животных кормов резко влияют на всех животных. Во время зимы и огромное большинство их видов защищается тем или иным способом от непосредственного действия неблагоприятных климатических условий или от вызванного ими отсутствия корма или влаги.

Спячка, состояние «глубокого сна», характеризующееся существенным понижением температуры тела, энергозатрат и интенсивности всех физиологических процессов (Buck, Barnes, 2000).

У видов, впадающих в зимнюю спячку, температура тела обычно падает ниже 10?С. Минимальная температура 3?С зафиксирована у длиннохвостых сусликов, хотя у большинства особей этого вида она не опускается ниже 5?С (Carey et al., 2003). Интенсивность метаболизма (оцениваемая по потреблению О2 и выделению СО2 в единицу времени) в состоянии оцепенения снижается примерно до 5% от уровня основного обмена и может не достигать даже 1% уровня, свойственного активно ведущей себя особи. (Wang, Lee, 1996; Калабухов, 1985).

Особенности регуляции метаболизма у зимнеспящих связаны с повышением регуляторной нагрузки продуктов деградации белков - пептидов, аминокислот, мочевины. Для белков мозга сусликов при зимней спячке характерно своеобразное физико-химическое состояние, которое изменяется при пробуждении. Можно утверждать, что в становлении физико-химической конфигурации белковых молекул в мозгу при поддержании зимней спячки решающую роль играют процессы дезамидирования и амидирования белков.

Изменения в содержании амидных групп белковых фракций и общего количества белка при зимней спячке подтверждают мысль (Головина и др., 1985) о том, что метаболизм и физико-химическое состояние, как отдельных белков мозга, так и общего содержания белка в мозге, обеспечивают вхождение организма в зимнюю спячку, ее поддержание и выход из нее (Гусейнов, 1992).

Основой поддержания метаболизма клеток и функций органов является постоянный синтез и обмен белков, остановка которого означает гибель животных, а нарушения ведут к различным патологиям. Во время гипотермии животных происходит нарушение процессов утилизации аминокислот, а также синтеза и обмена белков (Жегунов и др., 1993). Если через 1-1,5 ч наблюдается незначительное включение метки в белки после введения меченых аминокислот охлажденным в течение 2 ч сусликам, то позже этого времени синтез белков прекращается практически полностью. Не отмечено какого-либо заметного включения метки в белки грызунов, гипотермированных в течение 12 ч. Тем не менее, суслики в состоянии глубокой гипотермии могут находиться до 96 ч с последующим разогревом и восстановлением всех функций. Это говорит о способности зимоспящих животных в течение нескольких суток гипотермии обходиться без синтеза и обмена белков. Так как у сусликов продолжают функционировать на пониженном уровне все функции и ткани, то следует предположить, что в условиях гипотермии обмен функционально важных молекул белков, поддерживающий гомеостаз клеток, сильно заторможен, т.е. при гипотермии зимоспящих существенно удлиняется время жизни белков. Следует предположить, что именно способность белковых молекул длительное время функционировать без нарушений и определяет способность зимоспящих выдерживать длительное искусственное охлаждение в отличие от гомойотермных крыс, перенесших охлаждение только до 19-20?С не более чем в течение 24 ч (Жегунов и др., 1991).

Поддержание всех процессов даже на замедленном уровне должно сопровождаться расходованием запасных веществ (Калабухов, 1985). Первичным источником топлива во время покоя являются липиды. Важность сохранения тканевых белков состоит в том, что от мышечной массы зависит продукция тепла во время пробуждения, а также способность к движению весной (Frerichs et al., 1994; Wang, Lee, 1996). То, что белки не используются в качестве источника энергии при гибернации, подтверждается тем, что в плазме не изменяется концентрация небелкового азота, также не увеличивается и содержание мочевины, хотя функция почек полностью прекращается (Калабухов, 1985; Buck, Barnes, 2000).

Было установлено, что активность ферментов, участвующих в обмене низкомолекулярных азотистых веществ в головном мозгу, при зимней спячке сусликов изменяется в зависимости от глубины и продолжительности гибернации, но в общем сохраняется на довольно высоком уровне (Эмирбеков, Мукаилов, 1971; Эмирбеков, Даудова, 1977; Исмаилов, Эмирбеков, 1980; Эмирбеков, Львова, 1984).

Известно, что теплокровные животные в норме регулируют температуру своего тела в жестких пределах, в отличие от гетеротермных животных, адаптированных к изменениям температуры в широком диапазоне. При попадании в неблагоприятные условия внешней среды у гомойотермных животных возможен срыв регуляторных механизмов и тогда возникает переохлаждение. Гипотермия имеет свой благоприятный эффект за счет снижения уровня метаболизма, но тем не менее не является нормальным физиологическим состоянием и может вести к различным неблагоприятным последствиям (Sessler, 1993).

Появление «дефектных» молекул белков в условиях глубокой гипотермии приводит к их быстрому удалению путем активации системы распада. Известно, что скорость распада модифицированных белков в 10 раз превышает среднюю скорость распада обычных белков (Эмирбеков, Львова, 1985).

У гомойотермных животных снижение температуры тела до 20?С (даже кратковременное) приводит к адаптивным изменениям ферментативного аппарата мозга (Кличханов и др., 2000).

При искусственном охлаждении теплокровного организма не отмечено четко прослеживаемой температурной зависимости, подчиненной закону Аррениуса в ферментативной системе клеточного дыхания. Заметное снижение влияния температуры на эффективность биологического катализа в субклеточных органеллах, возможно, обусловлено конформационными изменениями белкового компонента энзимов в условиях низких температур и определенными сдвигами в конфигурации химических связей активного центра, а также проницаемостью мембран, что может привести к облегчению или затруднению влияния различных эффекторов, участвующих в регуляции ферментов в клетке (Хватова, Семенова, 1979).

Обнаружено, что гипотермия 20?С приводит к увеличению удельной активности кислой пептидгидролазы в 1.5 раз (Нурмагомедова и др., 1983).

Принудительное охлаждение гомойотермного животного изменяет активность мембранного фермента мозга - глутаматсинтетазы. Глутаматсинтетазная активность больших полушарий мозга крыс при гипотермии 25?С несколько увеличивается, а при дальнейшем углублении (20?С) снижается до контрольного уровня нормотермии. В то же время в начальный период охлаждения (35?С) активность глутаматсинтетазы снижается на 30%. У гипотермированных адреналэктомированных крыс глутаминсинтетазная активность больших полушарий мозга увеличивается в 2-3 раза. Активность другого мембранного фермента АТФазы мозга при гипотермии значительно снижается (Сепанян и др., 1963).

В клетках теплокровных животных, как зимоспящих, так и незимоспящих, действует эволюционно выработанный механизм, который при изменении температуры компенсирует активность ферментов. У строгих гомойотеров гомеостатические механизмы постоянно поддерживают температуру тела на определенном уровне. При этом физико-химические свойства ферментов соответствуют этому температурному уровню (38±4) (Storey, 1997).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследования

Эксперименты были проведены на малых сусликах (Citellus pigmaeus Pallas) массой 200-250 г, являющихся типичными представителями зимоспящих животных (Калабухов, 1985) и белых беспородных крысах - самцах, весом 180-200 г.

2.2 Постановка эксперимента

2.2.1 Условия гибернации

Сусликов отлавливали в районе Буйнакского перевала (Республика Дагестан), весной - летом, методом залива нор, и до наступления холодов содержали в условиях вивария на смешанном растительно-зерновом рационе. Для индукции зимней спячки грызунов переводили в темное и неотапливаемое помещение с температурой воздуха, соответствующей температуре вне помещения вивария, и переводили на сухие корма. После снижения температуры воздуха до +8-6?С животные укладывались в стеклянные баллоны с подготовленной подстилкой. Ежедневно проверялась активность животных методом «опилочной пробы». В торпидном состоянии сусликов исследовали в середине баута.

Для изучения процессов, происходящих в ходе пробуждения сусликов, животных через два месяца после начала гибернации, в середине баута спячки помещали в холодильник для достижения температуры тела 2,5?С. После этого сусликов переносили в помещение с температурой 25?С для самосогревания. Для экспериментов брали сусликов по достижении температуры тела 10, 20, 25, 30 и 37?С.

Температуру тела животных измеряли в прямой кишке через каждые 10-15 мин. Было установлено, что температура тела достигает 10?С за 25-30 мин, 20?С - за 120-140 мин, а 37?С - за 160-180 мин.

На интервале температур 10 и 20?С у животных появляется сильная дрожь, значительно учащается пульс и дыхание. После достижения температуры тела сусликов 20?С дальше она возрастает очень быстро, при этом животные открывают глаза и поднимаются на лапки, начинают свистеть.

Сусликов исследовали в следующие периоды зимней спячки:

1. Бодрствующие, в июле-августе (нормотермия 38°С);

2. Бодрствующие, в сентябре (нормотермия 38°С);

3. Перед спячкой, начало октября (tт°=16-19°С);

4. Начало спячки, ноябрь (tт°=10-13°С);

5. Через 1 месяц спячки (tт°=5-8°С);

6. Через 2 месяца спячки (tт°=3-4°С);

7. Через 3 месяца спячки, начало февраля (tт°=4-5°С);