Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ГАМК - гамма-аминомаслянная кислота

EGTA - этиленгликоль тетрауксусная кислота

КП М - карбоксипептидаза М

ММП - матриксные металлопротеиназы

NMDA - N-метил-D-аспартат

ОАНП - общая активность нейтральных протеаз

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТIМП - тканевые ингибиторы металлопротеиназ

ФЛ - фосфолипиды

ХЛ - холестерин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема адаптации животных и человека к низким температурам является актуальной в связи с все большим проникновением человека в полярные районы земли и освоением природных ресурсов Севера и Сибири (Мешалкин, Верещагин, 1985).

Искусственная гипотермия с охлаждением тела до 20-24°С находит применение в хирургии при операциях на сердце и центральной нервной системы. Она значительно снижает обмен веществ головного мозга, и, следовательно, уменьшает потребность его в кислороде. Поэтому мозг в таких условиях способен переносить более длительное обескровливание (вместо 3-5 минут при нормальной температуре, до 15-20 мин при 25-28°С) (Sakurai et al., 2005).

В природе существует несколько различных типов гипотермии, наиболее уникальной из которых является зимняя спячка (Эмирбеков, Львова, 1985). Зимняя спячка - это эволюционно выработанная способность животных приспосабливаться к низким температурам среды путем снижения температуры тела, а, следовательно, метаболизма. У зимоспящих животных температурный диапазон активности биохимических реакций более широкий (от 0 до 38°С) (Эмирбеков, Львова, 1985; Storey, Storey, 2000; Geiser, 2004).

У гипотермированных животных, как и у животных, впадающих в зимнюю спячку, скорость метаболизма снижается по мере снижения температуры (Kataoka, Yanase, 1998). Изменения, вызываемые гипотермией, обнаруживаются во всех изучаемых органах, но вместе с тем установлено, что различные органы по-разному реагируют на глубину и скорость охлаждения (Рыжакова, 1997). Выраженность изменений находится в прямой зависимости от глубины гипотермии (Бернштейн, 1971).

Согласно теории Хочачка (Hochachka, Somero, 2002) при гипотермии угнетаются процессы синтеза АТФ, наступает дефицит энергии, что замедляет транспорт Са2+ из цитозоля в среду. Накапливаясь в цитозоле, Са2+ нарушает метаболизм клетки. Незначительное (с 10-8 М в норме до 10-6 М) повышение Са2+ в цитозоле приводит к активации различных протеолитических и липолитических ферментов в клетке, вследствие чего начинают разрушаться клеточные мембраны (Иванов и др., 1999).

На протяжении многих лет считалось, что основными протеолитическими ферментами клеток животных и человека являются катепсины, осуществляющие деградацию белков в кислой среде. Вместе с тем выявлены протеолитические ферменты с оптимумом действия в зоне нейтральных значений рН. Среди последних особого внимания заслуживают тиоловые протеиназы - кальпаины, активность которых в значительной мере зависит от присутствия в среде ионов Са2+ (Сологуб, Пашковская, 1998). Ферменты этого семейства участвуют в таких процессах как клеточная миграция, цитоскелетное ремоделирование, клеточная дифференциация и апоптоз. Активация кальпаина наблюдается также при таких патологических состояниях как мышечная дистрофия, сердечная и церебральная ишемия, агрегация эритроцитов, нейродегенеративные болезни, катаракта и болезнь Альцгеймера (Khorchid, Ikura, 2002).

В клетках нервной ткани животных и человека имеется, связанная с миелином, Са2+ - активируемая нейтральная протеаза, которая осуществляет расщепление основного белка до полипептидов с молекулярной массой 6-17 килодальтон (кД). Так как основному белку миелина приписывается важное значение в этиологии множественного склероза и близких ему заболеваний, связанных с демиелинизацией, то изучение этой протеазы может содействовать расшифровке механизмов возникновения патологических состояний (Сологуб, Пашковская, 1988).

Зависимость активности кальпаинов от Са2+ может обеспечивать функционирование регуляторного механизма за счет изменения в клетках уровня катиона и участия Са2+ - активируемых нейтральных протеаз в ограниченном протеолизе, что в свою очередь ведет к изменению соотношения активности ряда ферментов (Moldoveanu et al., 2002). Не исключено, что образуемые в этом процессе фрагменты белковых молекул в свою очередь могут служить вторичными мессенджерами и оказывать активирующее или ингибирующее влияние на геном и клеточные ферменты (Kenyon et al., 2003).

В связи с этим, сравнительное изучение активности нейтральных протеаз в различных тканях гетеротермов в динамике зимней спячки, и гомойотермов при гипотермии, представляет значительный интерес.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилось сравнительное исследование активности нейтральных протеаз в тканях гомойо- и гетеротермных животных в условиях искусственной и естественной гипотермии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Исследовать общую активность нейтральных протеаз в мозгу, печени и сердечной мышце в динамике зимней спячки сусликов.

Исследовать общую активность нейтральных протеаз в мозгу, печени и сердечной мышце при 2-х месячной зимней спячки сусликов и в ходе их индуцированного пробуждения.

Исследовать общую активность нейтральных протеаз в мозгу, печени, сердечной мышце и сыворотке крови крыс при гипотермии разной глубины и длительности.

Исследовать активность Са2+ - зависимой нейтральной протеазы в мозгу, печени, сердечной мышце и сыворотке крови крыс при гипотермии разной глубины и длительности.

Исследовать активность глицилглицин-дипептидазы в мозгу и печени пробуждающихся и лишенных зимней спячки сусликов.

Исследовать температурную зависимость общей активности нейтральных протеаз в печени в динамике зимней спячки и индуцированном пробуждении сусликов при температуре тела 10, 20, 25, 30 и 37°С.

Основные положения, выносимые на защиту:

У контрольных крыс и у бодрствующих летом сусликов в зависимости от тканевой локализации (мозг, печень, сердце) наблюдается различие общей и Са2+-зависимой активности нейтральных протеаз.

В динамике зимней спячки сусликов суммарная (общая) активность нейтральных протеаз претерпевает значительные колебания, специфичные для разных тканей.

На этапах самосогревания сусликов, после индуцированного пробуждения общая активность нейтральных протеаз не зависит от температуры тела, особенно, при 20, 25 и 30?С.

Активность глицилглицин-дипептидазы в тканях пробуждающихся и лишенных зимней спячки сусликов отличается.

У крыс по мере снижения температуры тела наблюдается падение активности нейтральных протеаз. Пролонгирование глубокой гипотермии 20°С в течение 2 часов приводит к повышению активности исследуемых ферментов по сравнению с данными при 20°С.

Научная новизна. В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте исследована активность нейтральных протеаз при искусственной и естественной гипотермии у гомойотермных и гетеротермных животных. Выявлены органно-тканевые особенности изменения нейтральных протеаз при исследуемых состояниях животных.

Новыми являются данные об изменении общей активности нейтральных протеаз в динамике зимней спячки и индуцированного пробуждения после 2-х месячной зимней спячки сусликов.

Вперые исследована активность глицилглицин-дипептидазы в тканях пробуждающихся и лишенных зимней спячки сусликов.

Теоретическая и практическая значимость. Изучение метаболизма при искусственном и естественном охлаждении организма в сравнительном аспекте может приблизить нас к пониманию общих механизмов резистентности гомойотермных животных к низкой температуре тела, а также для понимания механизмов формирования патогенеза холодового повреждения. Решение указанных теоретических проблем, может иметь большое практическое значение при использовании метода гипотермии в медицинской практике. Материалы, полученные при выполнении данной диссертационной работы, используются при чтении курса «Энзимология», спецкурса «Кинетика ферментативных реакций», в учебном процессе и на практических занятиях студентов по биохимии ДГУ и филиала ЮФУ в г. Махачкале, в НИР.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на X Республиканской научно-практической конференции (Махачкала, 2005), на Международной научной конференции (Махачкала, 2006), на 10-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2006), на V-й Международной научно-практической конференции (Тамбов, 2007), на совместном заседании кафедры биохимии и биофизики с НИИ биологии ДГУ (3 февраля 2009, протокол №7), на заседании кафедры биохимии и микробиологии Южного Федерального университета (21 марта 2009).

Публикации. По данной диссертационной работе опубликовано 7 работ, в том числе две в рекомендуемых ВАК журналах.

белок протеаза гипотермия спячка

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Протеолиз белков в клетке

К числу фундаментальных достижений биологии последних двадцати лет относится признание протеолиза как особой формы физиологической регуляции (Гомазков, 1996).

Протеолиз - ферментативный гидролиз белков и пептидов, катализируется протеолитическими ферментами (пептид-гидролазами, протеазами) и играет важную роль в регуляции обмена веществ в организме. С протеолизом связаны такие фундаментальные процессы жизнедеятельности, как внутриклеточный распад белков и регуляция их кругооборота, пищеварение, оплодотворение, морфогенез, защитные реакции, адаптационные перестройки обмена. Нарушение протеолиза и его регуляции лежит в основе развития многих патологических состояний (Веремеенко и др., 1988).

Протеиназы - ферменты, осуществляющие гидролиз пептидной связи в белках, включаются в функционирование белковой молекулы на самых ранних этапах биосинтеза и сопровождают белки до конечной стадии их жизненного цикла (полное расщепление, запуск апоптоза) (Ефременко, Конторщикова, 2006).

Различают 2 типа протеолиза: приводящий к полному расщеплению белковых молекул до отдельных аминокислот (тотальный) и частичный, так называемый ограниченный протеолиз, при котором избирательно гидролизуется одна или несколько пептидных связей в молекуле белка. Протеолиз первого типа происходит в результате согласованного действия различных протеолитических ферментов, тогда как реакции ограниченного протеолиза катализируются отдельными специфическими протеазами (Соловьева и др., 1995). Полный протеолиз осуществляется при внутриклеточном распаде белков под влиянием тканевых протеаз (часто называемых катепсинами). Он протекает во многих случаях внутри лизосом - клеточных органелл, содержащих набор гидролитических ферментов. Путем полного протеолиза происходит удаление из организма аномальных белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза. Полное расщепление белковых молекул наблюдается также при различных морфогенетических превращениях и адаптационных перестройках обмена. Под влиянием таких ферментов желудочно-кишечного тракта, как пепсин, трипсин, химотрипсин и ряда других пептидаз, происходит полный протеолиз белков пищи (Мосолов, 1971).

Ограниченный протеолиз белковых молекул имеет первостепенное значение для регуляции обмена веществ в организме. Реакции ограниченного протеолиза участвуют в процессе образования и инактивации практически всех ферментов, гормонов и других биологически активных белков и пептидов и, следовательно, в контроле активности основных биорегуляторов (Furuno et al., 1990). Например, ограниченный протеолиз происходит при превращении неактивных проферментов пепсиногена, трипсиногена и др. в соответствующие активные протеазы, а также при образовании ферментов, участвующих в свертывании крови, фибринолизе, активации системы комплемента, ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем и др. Эти системы организма активируются в результате каскадного процесса, на каждом из стадий которого из неактивного профермента путем ограниченного протеолиза образуется фермент, катализирующий последующую реакцию (Goldberg, Dice, 1974). Примером роли ограниченного протеолиза в биогенезе гормонов может служить специфический гидролиз ряда пептидных связей в молекуле пропиомеланокортина, в результате которого из этого полифункционального биосинтетического предшественника образуются АКТГ, в-липотропин, эндорфины, меланостимулирующие гормоны, из проинсулина - инсулин, из проглюкагона - глюкагон. Таким же образом из своих неактивных предшественников образуются факторы роста и другие регуляторные пептиды. При некоторых эндокринных заболеваниях, например, наследственной проинсулиннемии, нарушен ограниченный протеолиз проинсулина. Основным молекулярным механизмом образования, инактивации и модификации, различных нейропептидов также является ограниченный протеолиз, который тем самым играет существенную роль в реализации таких нейрофизиологических процессов, как память, боль, поведенческие реакции и другие (Веремеенко и др., 1988).

Ограниченный протеолиз представляет собой один из основных механизмов посттрансляционной модификации - процессинга белков, этапа, на котором из вновь синтезированных полипептидных цепей формируются «зрелые» белковые молекулы. С помощью ограниченного протеолиза образуются функционально активные белки и пептиды не только у высших, но и у простейших организмов. Так, путем ограниченного протеолиза вирусного полипептида получаются специфические белки различных вирусов, т.е. ограниченный протеолиз является одним из важнейших механизмов репродукции вирусов и играет большую роль в развитии вирусных инфекций (Wickner, 1999).

В организме различные белки имеют разную продолжительность жизни: для одних белков она составляет минуты, для других - многие сутки. Продолжительность жизни белков и скорость их кругооборота определяются как скоростью их биосинтеза, так и скоростью их протеолиза. Скорость протеолиза белков зависит от ряда факторов, в частности от их взаимодействия с другими веществами: субстратами, коферментами, аллостерическими эффекторами, а также от химических модификаций, которым белок может подвергаться в клетке (гликолизирования, фосфорилирования и др.) (Doherthy, Mayer, 1992).

При переходе организма из одного физиологического состояния в другое (например, на определенных стадиях эмбриогенеза), а также при голодании и некоторых стрессорных реакциях наблюдается резкое усиление протеолиза тканевых белков. Локальное усиление протеолиза белков межклеточного матрикса (коллагена, фибронектина, ламинина, протеогликанов и др.) отмечается, например, в процессе разрушения хряща при ревматоидном артрите, базальной мембраны при гломерулонефрите, а также при инвазивном росте и метастазировании опухолей. Повышенный протеолиз этих белков, а также эластина наблюдается в случае разрушения легочной ткани при эмфиземе легкого, туберкулезе легких и др. Рассеянный склероз и ряд других заболеваний нервной системы, сопровождающиеся демиелинизацией, связаны с усилением протеолиза основного белка миелина. При мышечной дистрофии отмечают повышенный протеолиз белков миофибрилл. Во всех случаях усиленный распад белков обусловлен освобождением внутриклеточных протеаз и нарушением регуляции их активности (Соловьева, 2000).

Изменение протеолиза белков при ряде других заболеваний может быть вызвано синтезом дефектного белка - субстрата. Это наблюдается при некоторых наследственных энзимопатиях, когда недостаточность фермента может быть обусловлена синтезом белка - субстрата, обладающего повышенной чувствительностью к действию протеаз (например, в-галактозидазы при некоторых формах галактосиалидозы), или нарушением ограниченного протеолиза биосинтетического предшественника ферментного белка и образованием вследствие этого аномальной формы фермента (например, аномальной б-субъединицы гексозаминидазы А при некоторых вариантах болезни Тея-Сакса).

Катализирующие гидролиз белков пептидгидролазы (протеазы, пептидазы) представляют собой большую группу ферментов, различающихся по своим физико-химическим свойствам, структуре и субстратной специфичности. Эти ферменты имеют универсальное распространение и локализованы в различных субклеточных структурах: ядре, лизосомах, митохондриях, пластинчатом комплексе, микросомной и плазматической мембранах, цитозоле и др. Различают две большие группы протеаз: эндопептидазы, расщепляющие в белках внутренние пептидные связи, и экзопептидазы, которые гидролизуют связи на N- и C-концевых участках пептидной цепи. По строению активного центра фермента и механизму его действия выделяют 4 семейства эндопептидаз: аспартильные, сериновые, цистеиновые и металлопротеазы.

Аспартильные протеиназы представляют собой многочисленную группу ферментов, встречающихся в организмах животных, растений, грибов и ретровирусов. Аспартильные протеазы представлены семейством пепсина. Они включают пищеварительные ферменты типа пепсина и химозина, лизосомальный катепсин D и ферменты процессинга белков, подобные ренину, некоторые протеазы из грибов (пенициллопепсин, ризопуспепсин, эндотиапепсин), а также вирусные протеазы вируса СПИДа (HIV) (ретропепсин). Почти все они, независимо от источника, проявляют способность катализировать реакцию гидролиза пептидных связей в кислой и слабокислой среде. Как правило, два остатка аспарагиновой кислоты участвуют в кислотно-основном катализе в активном центре фермента. Вначале, один аспартат акцептирует протон от H2O активного центра, который атакует углерод карбонила пептидной связи. Одновременно, другой аспартат дает протон кислороду карбонильной группы образующегося пептида (Кашпаров и др., 2000).

Среди протеолитических ферментов особый интерес представляют наиболее распространенные в организме сериновые протеиназы, в том числе локализованная в азурофильных гранулах нейтрофильных лейкоцитов человека гранулоцитарная эластаза. Возрастание активности эластазы во внеклеточном пространстве рассматривается как основное звено патогенеза многих заболеваний, при которых происходит инфильтрация тканей активированными нейтрофилами, наблюдаемая, прежде всего при воспалительных процессах. Попадая в кровеносное русло, эластаза может разрушать белки протеолитических систем плазмы, тем самым, нарушая процессы защиты и адаптации (Немкова, 1994).

К сериновым протеазам принадлежит трипсин, химотрипсин, эластаза, подавляющее большинство протеаз плазмы крови (факторы свертывания крови, фибринолиза, системы комплемента, кининовой системы), многие внутриклеточные и бактериальные протеазы. Эти ферменты, хотя и отличаются своей третичной структурой и специфичностью, но имеют одинаковую геометрию активного центра и поэтому катализируют реакции по одному и тому же механизму. Три аминокислотных остатка формируют домен-каталитическую триаду, обеспечивающую проведение катализа (например, Гис 57, Асп 102 и Сер195 у химотрипсиногена).

Во время катализа происходит нуклеофильная атака кислорода гидроксильного остатка серина протеазы на углерод карбонила гидролизуемой пептидной связи. При этом образуется промежуточный ацилферментный комплекс. Гидролиз возникающей при этом сложной эфирной связи приводит к образованию второго продукта гидролиза (Дин, 1981).

К цистеиновым протеазам относятся многие катепсины: B, H, L, ряд бактериальных и растительных ферментов, из которых наиболее изучен папаин. Это группа гомологичных белков с однотипной трехмерной структурой. Отличия в специфичности катепсинов обусловлены локальными различиями в структуре субстрат - связывающей области. Цистеиновые протеазы по механизму действия напоминают сериновые, однако ведущая роль в катализе отводится цистеину. Во время катализа происходит передача протона SH-группы цистеина на молекулу смежного гистидина, и атом серы обеспечивает нуклеофильную атаку на углерод карбонила гидролизуемой пептидной связи. Возникающий тиоэфир, связывающий новый С - конец пептида с тиолом цистеина - промежуточное звено реакции (подобно ацилферментному комплексу в механизме катализа сериновыми протеазами). Остатки Цис25 и Гис159 (в папаине) играют такую же роль, как Сер195 и Гис57 в химотрипсине (Halang et al., 2000).

Лизосомальные цистеиновые протеиназы вовлечены в процессы неопластической трансформации. Они деградируют многие белки и компоненты внеклеточного матрикса и осуществляют деструкцию ткани. В процессе иммунного ответа они участвуют в процессинге антигенов, а также могут модифицировать белки плазматической мембраны. Эти протеиназы осуществляют протеолиз короткоживущих белков, которые регулируют злокачественный рост (Дилакян, 2000).

Матриксные металлопротеиназы относятся к семейству цинковых металлопротеиназ, функция которых связана с обменом соединительного матрикса в норме и при патологии. Известно более 20 представителей этого семейства, которые на основании специфичности можно разделить на пять подсемейств: 1-колагеназы; 2-желатиназы; 3-стромелизины; 4-мембранный тип матриксных металлопротеиназ; 5-матриксные металлопротеиназы, не относящиеся к известным подсемействам. Они играют основную роль в гидролизе экстраклеточного матрикса благодаря своей способности разлагать практически все его компоненты: коллагены всех типов, эластин, протеогликаны, ламинин и т.д. Кроме того, металлопротеиназы могут участвовать в процессе канцерогенеза, воздействуя на различные пути передачи сигнала в клетке, основные компоненты соединительнотканного матрикса, на межклеточные взаимодействия, а также продуцируя различные биологически активные молекулы (Клишо и др., 2005).

Металлопротеиназы относятся к энергозависимым протеиназам. Энергозависимые протеиназы осуществляют селективный внутриклеточный протеолиз - важный механизм контроля качества функциональных белков и поддержания их необходимого уровня в клетках. Эти протеиназы выполняют две основные функции: деструктивную (освобождают клетки от дефектных и мутантных белков) и регуляторную (осуществляют деградацию ряда короткоживущих регуляторных белков). Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТФ. Ферменты проявляют высокую селективность, поскольку производят отбор субстратов - мишеней из общего пула внутриклеточных белков, большая часть которых не должна повреждаться. При этом специфичность по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемую связь, у энергозависимых протеиназ зачастую не выражена. Деградация белков - субстратов происходит по процессивному механизму - без высвобождения высокомолекулярных промежуточных продуктов (Ротанова, 2000).

Экзопептиды разделяют на аминопептидазы и карбоксипептидазы, дипептидиламинопептидазы и дипептидилкарбоксипептидазы, которые катализируют отщепление аминокислот или дипептидов от N- и С-конца пептидной цепи соответственно, и дипептидазы, катализирующие гидролиз дипептидов. Многие экзопептидазы являются металлоферментами.

Большинство протеаз синтезируются в виде неактивных предшественников - проферментов: их активация происходит в результате ограниченного протеолиза, протекающего либо аутокаталитически, либо под действием определенных протеаз. Многие протеазы подвергаются аутолизу (самоперевариванию), при этом часто теряют ферментативную активность. В некоторых случаях (например, у Са2+ - зависимых нейтральных протеаз) на определенных этапах аутолиза отмечают активацию ферментов (Klionsky, 2000).

Активность протеиназ зависит, как правило, от скорости их образования из неактивных предшественников и инактивации специфическими ингибиторами, которые присутствуют в клетках, тканях, в плазме крови и составляют так называемый антипротеолитический потенциал. При взаимодействии протеолитических ферментов и их ингибиторов сохраняется определенное равновесие, которое может нарушаться при определенных патологических условиях, что ведет к негативным последствиям для организма, вплоть до развития критических состояний (Бенделик и др., 1999).

С помощью систем таких ингибиторов осуществляются регуляция активности протеаз в физиологических условиях и предохранение белков от их действия. Нарушение баланса между протеазами и соответствующими ингибиторами часто приводит к развитию патологии. Многие высокомолекулярные ингибиторы протеаз - белки с доменами, которые блокируют активный центр фермента, затрудняя к нему доступ субстрата.

Ингибиторы протеолиза нашли широкое применение в медицинской практике для лечения нарушений свертывания крови, фибринолиза, при панкреатитах. Иммобилизованные ингибиторы применяются в стоматологии для лечения воспалительных процессов в ротовой полости. Особое место в этом ряду занимает использование ингибиторов протеолиза в лечении приобретенного иммунодефицита человека. Оно позволило выявить не только положительные эффекты влияния ингибиторов на течение заболевания, но и показать возможное побочное их действие. Протеаза ВИЧ (HIV) выполняет важные функции в жизненном цикле вируса и поскольку она обладает особым типом специфичности, не характерным для большинства протеаз животных и человека (катализирует гидролиз пептидных связей фен-про и тир-про, на которые редко действуют протеазы животных) были синтезированы искусственные ингибиторы этой протеазы. Использование таких ингибиторов совместно с аналогами нуклеотидов позволило значительно снизить смертность от СПИДа, однако выявило ряд побочных эффектов в форме липодистрофии, гипертриацилглицеролемии и повышения резистентности к инсулину (Ефременко, Конторщикова, 2006).

Мировой опыт свидетельствует о высокой информативности, точности, специфичности анализа активности протеолитических ферментов при многочисленных патологических состояниях. В настоящее время ведется разработка методов определения активности протеиназ в плазме крови для применения в клинической практике. Известно, что по уровню активности протеиназ (эластаза, катепсин G, B) можно предсказать развитие сепсиса до появления его клинических признаков. Активность лейцинаминопептидазы используется для дифференциальной диагностики заболеваний гепатобилиарной системы и костной ткани, когда повышена активность щелочной фосфатазы. Активность панкреатической эластазы повышается в крови при остром и хроническом панкреатитах раньше, чем уровень других ферментов, на субклинической стадии (Ефременко, Конторщикова, 2006).

Для нормализации протеолиза пищевых белков при некоторых желудочно-кишечных заболеваниях применяют препараты пепсина, трипсина, химотрипсина; для лизиса сгустков фибрина при тромболитической терапии используют плазмин (фибринолизин), стрептокиназу и др.; при лечении гнойных ран, ожогов, пролежней, для протеолиза белков некротизированных тканей применяют трипсин, химотрипсин и некоторые другие протеазы. При заболеваниях, сопровождающихся усиленным протеолизом белков (например, при панкреатитах) используют препараты ингибиторов протеаз: трасилол и др. (Бенделик и др., 1999).

В целом, определение активности протеолитических ферментов необходимо использовать в качестве чувствительного критерия для контроля за безопасностью применения различных лекарственных средств (особенно препаратов, содержащих протеолитические ферменты и их ингибиторы), и эффективностью проводимых диагностических и лечебных программ.

В клетках живых организмов существует несколько стратегий белкового распада. Главные протеазы клеток млекопитающих это лизосомальные катепсины, кальпаины и протеасомы (Shringarpure et al, 2001). Мембранно-связанные белки и белки клеточной поверхности в основном разрушаются лизосомами (Doherty et al,2002), в то время как пул цитозольных белков (80-90%) направляется для распада к протеасоме (Orlowski, Wilk, 2000).

Большая часть неспецифического белкового распада имеет место в лизосомах (Громакова, Коноваленкова, 2003).

Лизосомы человека активно изучаются, прежде всего, в медицинском аспекте. Этот интерес обусловлен двойственностью потенциала лизосом. В норме они выполняют разнообразные функции, но могут быть и «везикулами - самоубийцами», если в клетке происходит повреждение лизосомной мембраны, изолирующей лизосомные ферменты. Связь лабилизации лизосом с клеточным повреждением и гибелью установлена многочисленными исследованиями, однако в настоящее время уже на молекулярно-биологическом уровне демонстрируется их участие в процессах стимулируемого апоптоза (Guicciardi, 2004), панкреонекроза и другой патологии (Пупышев, 2006).

Известно, что активность лизосомальных ферментов, на долю которых приходится ~ 70% общей деградации белков, находится под гормональным контролем. Показано участие инсулина, глюкагона, адреналина, тиреоидных гормонов в регуляции лизосомного пути белковой деградации (Табукашвили и др., 1991).

В печени глюкагон вызывает метаболическую утилизацию некоторых аминокислот, а инсулин стимулирует их потребление. Это показывает, что оба гормона влияют на аутофагию изменением внутриклеточного пула аминокислот. Глюкокортикоиды стимулируют печеночный протеолиз, но, предполагается, что этот эффект осуществляется благодаря увеличению синтеза протеина, т.е. для аутофагии необходим синтез мембранных белков. Точно также, тироксин-вызванный белковый распад в печени может осуществляться благодаря увеличению концентрации лизосомных ферментов (Grinde, 1985).

Лизосомы - это органеллы, которые содержат огромное количество гидролаз, способных разрушать большинство внутриклеточных и внеклеточных макромолекул (Sahagian, Novikoff, 1994). Протеазы, способные к деградации белков внутри лизосом, называются катепсинами (Bohley, Seglen, 1992). В общем, лизосомы ответственны за непрерывное обновление большинства внутриклеточных белков (большей частью долгоживущих белков) в печени, почках и других тканях.

Лизосомы стабильны при рН=7, в то время как при рН=5 они становятся отчасти «рыхлыми». Время прохождения лизосомальных ферментов от эндоплазматического ретикулума до лизосом приблизительно 2 часа. Кроме того, лизосомальные ферменты имеют период полужизни в течение дня и могут быть достаточно стойкими к распаду другими лизосомальными ферментами (Ahlberg et al, 1985).

Лизосомные протеиназы участвуют в осуществлении внутриклеточного распада белков и регуляции их кругооборота, а также реализации сложнейших биологических процессов, таких, как рост и развитие организма, морфогенез, метаморфоз. Эти процессы, реализуемые кооперативным взаимодействием разных типов клеток, сопровождаются деструкцией ткани, которая происходит под действием освобождающихся внутриклеточных ферментов. Среди них присутствуют как лизосомные, так и другие протеиназы, которые секретируются в среду сразу после их биосинтеза (Покровский, Тутельян, 1976).

Лизосомные протеиназы большинства клеток представлены ферментами относящимися к аспартильным (катепсин Д), цистеиновым (катепсины В, Н, L и некоторые другие) и сериновым (катепсин G, эластаза) пептидгидролазам (Дин, 1981; Покровский, Тутельян, 1976). В лизосомах некоторых клеток обнаружены и металлопротеиназы (эластаза макрофагов).

Лизосомные протеиназы секретируются из клеток под влиянием ряда гормонов, витаминов, циклических нуклеотидов, иммунных комплексов, многих токсинов и ряда других факторов (Vaes, 1985). Часть этих ферментов (до 20%) секретируется в среду сразу после биосинтеза, не попадая в лизосомы.

Существует несколько механизмов, с помощью которых белки могут транспортироваться в лизосомы. Наиболее охарактеризованные из них: везикулярное слияние (эндоцитоз и кринография), макроаутофагия, микроаутофагия и направленный белковый транспорт через мембрану лизосом (Cuervo et al, 1997).

Первичные лизосомы способны полностью разрушать белковое содержимое некоторых видов внутриклеточных везикул после мембранного слияния. Везикулы, содержащие секреторные белки, отделяются от аппарата Гольджи и высвобождают свое белковое содержимое во внеклеточную среду после слияния везикул с мембраной плазмы (Покровский, Тутельян, 1976). При определенных условиях, когда требуется снижение белковой секреции, 20 - 70% этих везикул сразу сливаются с лизосомами в процессе, называемым кринографией, после которого секреторные белки полностью деградируются (Glaumann, 1989; Lenk et al, 1991). Таким способом переносятся к лизосомам короткоживущие белки (Ahlberg et al, 1985; Маянская, Панин, 1981).

Достаточно хорошо охарактеризованным является слияние лизосом с эндосомами - везикулами, содержащими некоторые внутриклеточные белки (Mukherjee et al, 1997). В данном случае лизосомные белки синтезируются в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, где они гликолизируются путем переноса олигосахаридных остатков. На последующей стадии, типичной для лизосомальных белков, терминальные маннозные остатки фосфорилируются по С-6. Таким образом, лизосомальные белки в процессе сортировки приобретают концевой остаток маннозо - 6 - фосфат. В мембранах аппарата Гольджи имеются молекулы - рецепторы, специфичные для маннозо - 6 - фосфат - остатков и за счет этого специфически узнающие и селективно связывающие лизосомальные белки. Локальное накопление этих белков происходит с помощью клатрина. Этот белок позволяет вырезать и транспортировать подходящие мембранные фрагменты в составе транспортных везикул и эндолизосом, которые затем созревают с образованием первичных лизосом (Короленко, 1983, 1990). В заключение от маннозо - 6 - фосфата отщепляется фосфатная группа. Маннозо - 6 - фосфат - рецепторы используются вторично в процессе рецикла. Снижение рН в эндолизосомах приводит к диссоциации белков от рецепторов. Затем рецепторы с помощью транспортных везикул переносятся обратно в аппарат Гольджи. В других случаях рецептор не используется вторично в процессе рецикла, а доставляется к лизосоме для деградации вместе с лигандом (Mukherjee et al, 1997; Koening, Edwardson, 1997).

Большое количество внутриклеточных белков может быть деградировано в лизосомах в ходе процесса, называемого макроаутофагией (Mortimore, 1995). При этом участки цитоплазмы, включающие цитозольные белки, также хорошо как и органеллы, окружаются мембраной, превращаясь в двумембранные структуры, известные как аутофагосомы или аутофагические вакуоли. Белки внутри аутофагосом далее полностью деградируются после слияния с лизосомой (Калахая и др., 1984).

В таких органах как печень, макроаутофагия имеет место для большей части внутриклеточного распада, особенно на ранних этапах голодания (Grinde, 1985). Белковое фосфорилирование играет важную роль среди механизмов, контролирующих макроаутофагию (Blommart, 1995). При определенных условиях в таком процессе деградации показана селективность, несмотря на то, что белки в изолированную цитоплазму захватываются неселективно. Например, пероксисомальная аутофагия может активироваться при таких условиях, когда пероксисомы не нужны длительное время. Слияние лизосом с аутофагосомой происходит по такому же механизму, что и эндоцитозный и секреторный пути, что доказывает взаимосвязь между этими процессами (Cuervo, Dice, 1998).

Второй процесс внутриклеточной белковой изоляции лизосомами называется микроаутофагией. Во время микроаутофагии только небольшие участки цитоплазмы захватываются небольшими инвагинациями на поверхности лизосом. После интернализации этих везикул и распада окружающей их мембраны цитоплазматические белки разрушаются внутри лизосом (Посохов и др.,1992). В отличие от макроаутофагии, которая в основном активируется при условиях лишения питательных веществ, микроаутофагия ответственна за продолжительный основной распад долгоживущих белков (Mortimore et ll, 1988).

Третий механизм лизосомального распада цитозольных белков происходит после транспорта через лизосомальную мембрану. Этот путь был впервые описан в культуре человеческих фибробластов, а далее охарактеризован в печени крысы. Приблизительно 30% цитозольных белков разрушаются таким образом (Cuervo, Dice, 1995). Такой белковый транспорт схож во многом с транспортом белков в другие клеточные компартменты (Schartz, Dobberstein, 1996). Основные компоненты системы направления транспорта белков через лизосомальную мембрану следующие: цитозольный шаперон 73 кД (hsр 73), рецепторный белок на лизосомальной мембране (lgp 96) и внутрилизосомальная форма цитозольного шаперона (lys - hsр 73). Для этого пути уже идентифицированы несколько субстратов: рибонуклеаза А, глицероальдегид-3-фосфат дегидрогеназа, альдолаза, некоторые субъединицы 20S протеасомы, факторы транскрипции такие как c-fos и IkB, а также б-2-макроглобулин - секреторный белок, который также локализуется в цитозоле гепатоцитов и проксимальных трубчатых клетках печени (Cuervo, Dice, 1998).

Субстратный белок после взаимодействия с hsр 73 направляется к лизосомам, где после связывания и транспорта через лизосомальную мембрану полностью разрушается в лизосомальном матриксе. Субстратные белки содержат в своей последовательности мотив биохимически сходный с пентапептидом KFERQ, который разрушается цитозольным шапероном 73 кД. Связывание hsр 73 с этим участком субстратного белка приводит к продвижению комплекса к лизосомальной мембране. Гликопротеин лизосомальной мембраны 96 кД (lgp 96 у крыс или lamp 2 у людей и мышей) активен как рецептор для субстратного белка. Связывание лизосомальной мембраны и захват в лизосомальный матрикс являются временно ограниченными и прямо зависят от уровней лизосомального lgp 96 и hsр 73 (Cuervo, Dice, 1995).

Одним из наиболее изученных лизосомальных ферментов является катепсин Д. Катепсин Д (3.4.23.5) - растворимая аспарагиновая протеаза, основная функция которой, является расщепление белков и пептидов внутри лизосом. Эта функция осуществляется каталитическим механизмом, вызванным двумя аспартатными остатками, расположенными глубоко в активном центре. Причины, по которым катепсин Д относится к семейству аспарагиновых пептидаз А1 - это их общий каталитический механизм: низкое значение рН, оптимальное для их функционирования и высокий уровень сходства как первичных, так и третичных структур (Conner, 2002). Катепсин Д обнаруживается в лизосомах большинства человеческих клеток (Fusek, Vetvicka, 1995).

Существует высокая степень сходства последовательностей среди эукариотических членов семейства аспарагиновых пептидаз. Например, триады Асп-Тре-Глу вокруг двух аспарагиновых остатков активной стороны фактически идентичны. Очень схожими, но не идентичными являются последовательности активирующих пептидов. Но сходность первичных структур выходит за пределы этих триад (Baldwin et al., 1993). Длинные сегменты вокруг аспартатных триад высоко консервативны. Позиции цистеиновых остатков, тирозина 75 и их окружения также консервативны. Тирозин 75 локализован в, так называемом, подвижном участке, чья подвижность частично покрывает активную сторону (Conner, 2002).

Пептидазы, относящиеся к семейству А1, образованы двудольной структурой, и обе доли структурно схожи, что предполагает наличие общего предшественника - димерной молекулы, состоящей из двух идентичных субъединиц, которые генной дубликацией и генным слиянием эволюционировали в мономерную двудольную структуру. Вторичная структура образована большей частью в-структурой с небольшими сегментами б-спиралей (Metcalf, Fusek, 1993). Катепсин Д содержит глубокое активное углубление, которое образовано стенами двух долей. На дне этого углубления локализованы 2 активных остатка аспарагиновой кислоты. Активная сторона углубления связывает либо ингибитор, либо субстрат. Катепсин Д также имеет 3 дисульфида, расположенные в очень консервативных местах, а также 1 дисульфид между цистеиновыми остатками 27 и 96.

Особенностью этого фермента, как и всех остальных аспарагиновых пептидаз является превращение новотранслированных белков в зимогены, а затем последовательно в активные ферменты. Эти пептидазы синтезируются как пре-про-ферменты (Conner, Richo, 1992). На первом протеолитическом пострансляционном этапе происходит отщепление сигнальной «пре» последовательности. Сигнальная последовательность состоит из 20 аминокислотных остатков и удаляется внутри шероховатого эндоплазматического ретикулума. Зимогены, образованные после первого пострансляционного процессинга, направляются к месту их активации, где они полностью превращаются в активные ферменты. Активация включает распад про-последовательности. Активирующий пептид бывает обычно длиной 44 аминокислотных остатка. Активация происходит как внутримолекулярно, так и внемолекулярно. Во время автоактивации, так называемый, псеудокатепсин Д все еще сохраняет С-терминальную часть активного пептида. Полная активация происходит только с участием других лизосомальных ферментов (Fusek, Vetvicka, 2005).

Важной особенностью катепсина Д является его специфическое ингибирование пепстатином А, который является нековалентным, конкурентным и тесно-связывающим ингибитором (Abdel-Mequid, 1993).

Важной особенностью нормального клеточного цикла катепсина Д является его строгая локализация в кислых компартментах лизосом и различных прелизосомальных и эндосомальных везикулах. Существует, как минимум, 2 пути, по которому клетки направляют катепсин Д в эти компартменты. Во-первых, маннозо-6-фосфат на концах олигосахаридов, прикрепленных во время пострансляционной модификации, распознается двумя рецепторами, которые транспортируют прокатепсин Д к лизосомам и другим кислым компартментам (Figura, Hasilik, 1986). Существует 2 рецептора: катион-независимый маннозо-6-фосфат рецептор, чья молекулярная масса близка к 300 кДа и катион-зависимый маннозо-6-фосфат рецептор с молекулярной массой 46 кДа. Оба рецептора связывают лизосомальные ферменты в сети аппарата Гольджи, образуют комплексы и затем переносятся через клатрин-покрытые везикулы к прелизосомальным кислым компартментам. При низком значении рН происходит высвобождение лизосомальных ферментов от рецепторов, которые затем возвращаются к аппарату Гольджи, в то время как лизосомальные ферменты продолжают направляться к лизосомам. Оба рецептора присутствуют также и на поверхности мембраны плазмы (Zhu, Conner, 1994). Катион-независимый маннозо-6-фосфат рецептор способен связывать внеклеточный прокатепсин Д и переносить внутрь клетки. На самом деле функция этого рецептора более сложная. Кроме того, связывая и направляя лизосомальные ферменты, он функционирует также как рецептор для инсулин-подобного фактора роста II (Fusek, Vetvicka, 2005).

Второй путь направления катепсина Д к лизосомам независим от маннозо-6-фосфата и полностью не изучен (Dittmer et al., 1999). Определенная роль этого пути заключается во взаимодействии прокатепсина Д с просапонинами. Эти две молекулы образуют комплексы и движутся к кислым компартментам независимо от маннозо-6-фосфат рецептора. Предположено, что N-терминальная часть псеудокатепсина Д (другими словами С-конец активирующего пептида) может быть включена во взаимодействие между прокатепсином Д и просапонином. Комплексы этих двух молекул обнаружены внеклеточно (Gopalakrishnan et al., 2004).

Прокатепсин Д образуется после первого протеолитического распада, включая удаление сигнального пептида сигнальными пептидазами. Молекула прокатепсина Д имеет молекулярный вес 52 кД. Она состоит из 392 аминокислотных остатков и при нормальных физиологических условиях гликолизируется по двум остаткам аспарагина. Активирующий пептид длиной 44 аминокислотных остатка находится над углублением активной стороны (Koelsch et al., 1994).

Прокатепсин Д транспортируется к лизосомам и в кислой среде подвергается дальнейшему протеолитическому процессингу, где активирующий пептид отщепляется (как автопротеолизом, так и протеолитическим действием других, в основном, цистеиновых лизосомальных пептидаз), образуя катепсин Д, содержащий одну цепь из 348 аминокислотных остатков. При других физиологических условиях единственная цепь катепсина Д преобразуется в двуцепочечную молекулу (у человека за счет отщепления маленького пептида длиной 7 аминокислотных остатков между положением 98 и 105) (Fusek et al., 1992). В действительности тяжелые и легкие цепи обычно образуются смесью нескольких микрогетерогенных цепей, которые различаются за счет незначительных изменений в молекулярном весе. Эксперименты in vitro показали, что в результате автопротеолиза прокатепсин Д превращается в так называемый псеудокатепсин Д, который все еще содержит С-терминальную часть активирующего пептида (Fusek, Vetvicka, 2005).

Основная функция катепсина Д - это внутриклеточный катаболизм внутри лизосомального компартмента (Conner, 2002). Катепсин Д также включается в процессинг антигенов, гормонов и нейропептидов (Mohamadzadeh et al., 2004). Прокатепсин Д также принимает участие в программированной клеточной смерти - апоптозе (Bidere et al., 2003; Takuma et al., 2003; Emert-Sedlack et al., 2005). Увеличение экспрессии катепсина Д наблюдается при заживлении ран, псориазе и опухолях кожи (Egberts et al., 2004).

Хотя большая часть катепсина Д обнаружена в растворимой части клеток человека, но 20% все же являются мембранно-связанными (Diment et al., 1998).

Высокие концентрации прокатепсина Д были обнаружены в грудном молоке человека (Vetvicka et al., 1993). В 80-е годы во время исследования основных белков, секретируемых раковыми клетками груди линии MCF7, было обнаружено, что основная масса белка - это молекулы с молекулярным весом 52 кДа (Fusek, Vetvicka, 2005). Дальнейшее исследование показало, что эта молекула соответствует прокатепсину Д, который секретируется в высоких концентрациях из определенного типа раковых опухолей груди в присутствии эстрогена. Двадцать пять лет спустя было засвидетельствовано, что прокатепсин Д экспрессируется и секретируется во многих раковых клетках и во многих из них добавление эстрогена и прогестерона увеличивало его экспрессию и секрецию (Rochefort et al., 2000).

У клеток с эстроген-положительным рецептором прокатепсин Д секретируется только после стимуляции эстрогеном, в то время как существенная секреция происходит в клетках с эстроген-отрицательным рецептором. В клетках с эстроген-положительным рецептором эстроген взаимодействует и регулирует экспрессию прокатепсина Д на уровне промотера. Секретируемый прокатепсин Д имеет способность к стимуляции роста и пролиферации раковой клетки, то есть способствует метастазам раковых клеток (Vetvicka et al., 2002).

Катепсин Д может служить независимым прогностическим фактором многих типов рака. Используя многоклеточные антитела специфические для про-формы, было показано, что уровень прокатепсина Д увеличивается в плазме пациентов с метастазом рака груди (Leto et al., 2004; Loscha et al., 2004).

Общая экспрессия катепсина Д в раковых клетках увеличивает концентрацию прокатепсина Д. Это в основном лежит в увеличении насыщения маннозо-6-фосфат-рецепторного пути, также как и других альтернативных путей. Эти клетки будут также направлять больше прокатепсина Д в лизосомы, что ведет к увеличению протеолитической активности лизосомального компартмента. С другой стороны, катепсин Д протеолитически активен при рН около 5.5 и трудно обнаружить такое низкое значение рН внеклеточно в тканях опухоли (Meijer-van Gelder et al., 2001; Laurent-Matha et al., 2005).

Роль сахаридных остатков, частично их возможное взаимодействие с маннозо-6-фосфат-рецепторами, привлекает внимание исследователей. В 1994 году было описано, что простое удаление сахаридных цепей с использованием гликозидазы, не имеет эффекта на митогенные активности in vitro. Было также протестировано добавление высоких концентраций маннозо-6-фосфата, который может конкурировать за взаимодействие с рецепторами и при этом не определяется никакой митогенной активности (Glondu et al., 2001). Показано, что прокатепсин Д нормально взаимодействует in vitro с маннозо-6-фосфат-рецептором и может быть поглощен этим рецептором. В некоторых экспериментах in vivo были обнаружены различия в функционировании этих рецепторов. Оказалось, что в определенных опухолях, рецептор функционирует ненормально. Одна гипотеза заключается в том, что высокие концентрации прокатепсина Д насыщают катион-независимый маннозо-6-фосфат-рецептор, что приводит к снижению связывающих сторон как для маннозо-6-фосфат-связывающих сторон, так и для инсулин-подобного фактора роста II. Как следствие этого, недостаточное функционирование маннозо-6-фосфат-рецептора может быть причиной смены функции маннозо-6-фосфат-рецептора и может помочь канцерогенезу (Vetvicka et al., 2004). Результаты показали, что предотвращение гликолизирования с помощью мутации на гликолизированной стороне прокатепсина Д не теряет его митогенной и пролиферативной активности. Предположено, что ни связывание маннозо-6-фосфата, ни сахарные остатки не влияют на развитие роста опухоли (Vetvicka et al., 1999; Laurent-Matha et al., 2005).

Таким образом, функция прокатепсина Д состоит не только в том, что он является предшественником гидролитического фермента в лизосомах, но также и в том, что он включается во взаимодействие с другими молекулами, которые имеют митогенный эффект на определенные ткани. Это взаимодействие облегчается активирующим пептидом и оно может быть частью нормального физиологического функционирования прокатепсина Д (Glondu et al., 2001). Однако, становится опасно, когда раковые клетки начинают экспрессировать и секретировать прокатепсин Д. Предположено, что прокатепсин Д, экспрессируемый и секретируемый из первичных раковых клеток, вызывает рост как родительских, так и окружающих клеток. Это приводит к более быстрому росту опухоли тканей и также увеличивает риск образования метастазов (Антонов, 1991).

1.2 Структура и функции нейтральных протеаз

Все нейтральные протеазы можно подразделить на внутриклеточные и внеклеточные. К внутриклеточным нейтральным протеазам относится Са2+- зависимая протеаза - кальпаин [3.4.22.17].

В 1964 году Гурофф впервые описал эту протеазу, которая была окончательно выделена как фермент в 1978 году в растворимой фракции мозга. С тех пор активность кальпаина была идентифицирована в различных тканях и обнаружено его участие во многих клеточных процессах.

Кальпаины - это семейство цитозольных цистеиновых протеиназ, чья ферментативная активность зависит от Са2+. Члены этого семейства участвуют в таких процессах как клеточная миграция, цитоскелетное ремоделирование, клеточная дифференциация и апоптоз. Активация кальпаина наблюдается также при таких патологических состояниях как мышечная дистрофия, сердечная и церебральная ишемия, агрегация эритроцитов, нейродегенеративные болезни, катаракта и болезнь Альцгеймера (Khorchid, Ikura, 2002).

В условиях гипоксии кальпаин подвергается гиперактивации, что непосредственно ведет к деструкции цитоскелета нейронов, а в дальнейшем приводит к гибели клеток по механизму некроза или апоптоза (Хансон, 1992).