Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

8. Перед пробуждением, март (tт°=6-7°С).

Исследовали также группу сусликов, не спавших зимой, а содержащихся в условиях вивария на полном рационе и в отапливаемом помещении.

2.2.2 Условия искусственной гипотермии

На крысах поставлены следующие опыты:

1. Нормотермия (контроль);

2. Иммобилизация в течение 1 часа;

3. Умеренная гипотермия 33-30°С;

4. Глубокая гипотермия 20-19°С;

5. Пролонгирование глубокой гипотермии (20-19°С) в течение 2 часов;

6. Кратковременная гипертермия 42°С.

Контрольную группу составляли животные, содержащиеся в условиях вивария. Гипотермию проводили в холодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода таким образом, что охлаждение животного до 33-30°С наблюдалось через 15-20 минут, а 20-19°С достигалось через 50-60 минут, и эта температура поддерживалась при пролонгировании в течение двух часов. Гипертермию проводили в той же камере с добавлением теплой воды, где соответствующая температура достигалась через 15-25 минут. Дополнительным контролем для охлажденных до глубокой гипотерии 20°С служили иммобилизованные крысы, содержащиеся в холодовой камере без охлаждения в течение 1 часа.

Температуру тела животных измеряли ректально ртутным термометром, на глубине.

2.3 Обработка биологического материала

2.3.1 Получение сыворотки

Животное, находящееся в соответствующем состоянии для исследованиия, декапитировали, после чего отбирали кровь, оставляли ее 30 минут при комнатной температуре. Для получения сыворотки кровь центрифугировали 15-20 минут при 3000 об/мин. Полученную сыворотку аккуратно отбирали и переливали в пробирку.

2.3.2 Приготовление гомогенатов тканей

Мозг, сердце и печень, выделенные на холоду, промывали в охлажденном физиологическом растворе, удаляли мелкие капилляры, и высушивали фильтровальной бумагой. Далее ткани измельчали, гомогенизировали в соответствующих средах гомогенизации в соотношении 1: 9 (ткань: среда), а затем фильтровали. Полученный фильтрат использовали в эксперименте.

2.4 Методы биохимического анализа

2.4.1Определение автолитической активности нейтральных протеаз

При определении автолитической активности нейтральных протеаз по методу Baundry (1981) и Nilsson, Karlsson (1986) измерения проводили на спектрофотометре СФ 46 при 280 нм.

Метод основан на способности ароматических аминокислот, поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280нм.

2.4.2 Определение общей активности нейтральных протеаз

Общую активность нейтральных протеаз определяли модифицированным методом Лоури (Алейникова, Рубцова, 1988).

Приготовление субстрата

Взвешивали 1 г казеина и растворяли его в небольшом количестве (25 мл) гидроортофосфата натрия 0.05Н Na2HPO4 и доводят до кипения при постоянном помешивании. Затем в раствор добавляли 0.1 N NaOH, доводя рН до 7.4. Далее к раствору приливают дистиллят с соответствующим значением рН и доводли объем раствора до 100 мл. Дистиллят нужного значения рН также готовили, приливая к нему 0.1 N NaOH.

Состав проб для определения общей активности нейтральных протеаз

К 0.5 мл субстрата приливали 0.5 мл 10% гомогената и помещают на инкубацию в термостат при температуре 37°С на 60 минут. Затем к инкубату добавляли по 1 мл 0.3 N раствора ТХУ и выдерживали в течение 15 минут. Далее пробы фильтровали. К 0.5 мл фильтрата приливали 0.5 мл 0.0025 М раствора CuSO4, 4 мл 0.5 N раствора NaOH и 1 мл раствора Фолина. Через 20 минут проводится колориметрирование на фотоэлектроколориметре при л=670 нм.

Контроль: 1 мл ТХУ+ 0.5 мл гомогената. Через 5 минут добавляли 0.5 мл субстрата.

Стандарт: 2 мМ раствор тирозина

Расчет активности фермента производится по формуле:

, где

V - активность фермента, мкмоль/г

Eоп - экстинкция опытного раствора

Ек - экстинкция контроля

Ест - экстинкция стандартного раствора

Тинк - время инкубации, мин

Активность нейтральных протеаз выражали в мкмоль образовавшегося тирозина в расчете на 1 г ткани.

2.4.3 Определение активности Са2+-зависимой нейтральной протеазы

Общую и Са2+-зависимую активность нейтральных протеаз определяли по методу Baundry (1981) и Nilsson, Karlsson (1986).

Гомогенаты тканей готовили на 50 мМ Трис- HCl буфере, рН=7.4.

Субстрат: 1 % раствор казеина, приготовленный в 0.1н растворе NaOH, нейтрализовали 0.2н раствором HCl.

Растворы: 1 мМ CaCl2 и 25мМ EGTA также готовили на 50 мМ Трис- HCl буфере, рН=7.4.

1. Для определения общей активности нейтральных протеаз инкубационная смесь состояла:

0.3 мл 1 % казеина

0.5 мл 10% гомогената

0.2 мл 1 мМ CaCl2

2. Для определения Са2+-независимой активности нейтральных протеаз инкубационная смесь состояла:

0.3 мл 1 % казеина

0.5 мл 10% гомогената

0.2 мл 25мМ EGTA

Пробы инкубировали 1 час при 37°С. Далее реакцию останавливали 1 мл 15% ТХУ. Пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. 1 мл безбелкового центрифугата нейтрализовали 0.15 мл 10% раствора NaOH и в нем определяли количество фолинположительных соединений по методу Лоури. Оптическую плотность исследуемых образцов измеряли при л=750 нм. Значения активности для Са2+-активируемой нейтральной протеазы типа I представляли собой разность оптических плотностей для общей и Са-независимой активности.

Активность выражали в мкмоль тирозина/100 мг белка за 1 час.

В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали тирозин.

2.4.4 Определение активности глицилглицин-дипептидазы

Активность глицилглицин дипептидазы определяли нингидриновым методом Ли и Такахаши с модификациями (Рева и др., 1982) в печени и в больших полушариях головного мозга бодрствовавших зимой и пробуждающихся весной сусликов. Каждую выделенную ткань взвешивали и гомогенизировали в холодном 0.25М растворе сахарозы в соотношении 1:9 (вес: объем) в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. В среду гомогенизации добавляли 0.001М хлористый кобальт. Все операции проводили на холоду.

Инкубационная смесь содержала 0.4 мл 0.005М раствора глицил-глицина в фосфатном буфере рН 7.6 и 0.4 мл гомогената с 0.001М хлористым кобальтом. Инкубацию проб тканей проводили в ультротермостате при 37?С и 10?С в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 0.4 мл 5% раствора ТХУ. В контрольные пробы ТХУ добавляли перед внесением субстрата.

Пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли прирост глицина нингидриновым методом.

Цветная реакция

В пробирку отбирали 0.4 мл фильтрата, добавляли 1 мл нингидринового реактива, тщательно перемешивали стеклянной палочкой для получения однородной смеси. Далее пробу помещали на 12 минут (точно!) в кипящую баню и после этого охлаждали холодной водой.

Интенсивность окраски измеряли на КФК-2 при 570 нм против контрольных проб.

Активность фермента выражали в мкмоль глицина, освободивщегося при гидролизе глицилглицина за 30 минут инкубации при 37?С и 10?С (рН 7.6) в расчете на 100 мг ткани и на мг белка.

Приготовление реактивов

l. 0,05М фосфатный буфер рН 7.6

0.2М раствор фосфата калия -5мл

0.2М раствор гидроокиси калия -4.24мл

довести водой до 20мл и определить рН -7.6

2. 0,5 М цитратный буфер рН -5.5

0.5М раствор лимонной кислоты -5.1 мл

0.5 М раствор цитрата натрия -14.9мл

3. 0,001 М СоСl2 *6Н2О (М.м =238г)

Взвесить 23.8 мг -СоСl2* 6Н2О и добавить в 100 мл 0.25М раствора сахарозы.

4. Нингидриновый реактив (готовить непосредственно перед цветной реакцией)

100мг нингидрина взвесить на торсионных весах и растворить в 12 мл 0.5М раствора цитратного буфера рН 5.5 при подогревании на водяной бане (400С). Раствор охладить и к нему добавить 24мл глицерина. Реактив тщательно перемешать.

5. 0.25М раствор сахарозы. 8.55г сахарозы перенести в колбу на 100мл и растворить в небольшом количестве воды и затем довести до 100мл.

2.4.5 Определение белка по методу Лоури

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот (триптофан и тирозин) с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи (Lowry et al., 1951).

0.4 мл исследуемого раствора смешивали с 2 мл раствора С, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляли 0,2 мл реактива Фолина - Чокальтеу. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и через 30 минут колориметрировали при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости 5 мм. Предварительно строили калибровочный график по стандартному раствору альбумина и по нему определяли содержание белка в опытной пробе.

2.4.6 Исследование температурной зависимости активности

нейтральных протеаз

Для изучения температурной зависимости активности нейтральных протеаз пробы инкубировали при 10, 20, 30, 37 и 40?С. Время инкубации во всех случаях составляло 60 мин. Полученные результаты представлены в Аррениусовских координатах : lg V - 1000/Т, где V - скорость реакции, Т -273+ температура инкубации.

На графиках в Аррениусовских координатах вычисляли положение точки излома и энергии активации выше и ниже излома.

Энергию активации определяли из наклона прямой по следующей формуле:

Ea=-R•tgб

где R - газовая постоянная,

б - угол, образуемый прямой с осью абсцисс (Мейланов, 1999).

2.5 Статистическая обработка результатов исследования

Полученные данные подвергнуты вариационно-статистической обработке по методу малой выборки (Кокунин, 1975).

При определении степени различия средних арифметических двух сравниваемых вариационных рядов вычисляли показатели существенности разницы t (коэффициента Стьюдента). Затем, на основании t по таблице Стьюдента определяли вероятность различия Р. При Р<0,05 различие оценивалось как достоверное (вероятность различия более 95%).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Активность нейтральных протеаз в тканях суслика в динамике

зимней спячки

В клетках различных тканей животных и человека обнаружены протеолитические ферменты с оптимумом действия в зоне нейтральных значений рН. К таким ферментам относят Са2+ - зависимые нейтральные протеазы и различные металлопротеазы, основная функция которых состоит в ограниченном протеолизе белковых молекул. Субстратами данных ферментов являются белки цитоскелета и ядерного матрикса, вещество Р, опиоидные пептиды, нейромедиаторы, протеинкиназа С, фосфолипазы и др. (Гусев., 1998).

Протеолитические ферменты играют значительную роль при адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям окружающей среды, в осуществлении защитных функций организма (Cuninghaim, 1987).

Весьма своеобразным и интересным приспособлением для переживания неблагоприятных условий является зимняя спячка, наблюдающаяся у многих видов млекопитающих (Kortner, Geiser, 2000).

Уменьшение температуры тела при зимней спячке может колебаться в очень широких пределах. Температура тела гибернирующих сусликов поддерживается на несколько градусов выше температуры окружающей среды (Carey et al., 2003). В динамике зимней спячки механизмы терморегуляции сохраняются, но они поддерживают температуру тела на еще более низком уровне. При этом биохимические процессы, работа органов и систем организма гибернантов не тормозятся, а перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Карманова, 1995; Woods, Storey, 2004).

Гибернация сопровождается экстремальными изменениями в физиологии. Температура тела, уровень метаболизма, сердечные ритмы и другие параметры деятельности организма падают во время зимней спячки до уровня, который может быть летальным для гомойотермов, но не для гибернантов. Кроме того, восстановление функций до, приблизительно, нормального уровня происходит во время пробуждения со скоростью, которая может затрагивать клеточные и системные регуляторные пути, типичные для негибернантов (Carey et al., 2000; Terleky, Dice, 1993). В связи с этим, результаты, полученные на зимоспящих, могут быть использованы и для выяснения механизмов терморегуляции у гомойотермных организмов.

Нами исследована общая активность нейтральных протеаз различных тканей в динамике зимней спячки сусликов.

Как видно из таблицы 1, у бодрствующих сусликов (в июле) максимальная активность нейтральных протеаз наблюдается в печени.

Высокая активность нейтральных протеаз в печени может быть связана с тем, что печень в организме является «биохимической лабораторией», где пересекаются все метаболические пути ,и процессы распада и синтеза белков протекают наиболее интенсивно.

В сентябре, у бодрствующих сусликов, в печени наблюдается незначительное повышение активности нейтральных протеаз. Такие же незначительные колебания общей активности нейтральных протеаз печени происходят и в остальные месяцы осени - перед началом спячки. Таким образом, в печени бодрствующих (лето и осень) и готовящихся к спячке сусликов нет серьезных изменений в общей активности нейтральных протеаз. Резкое, почти в 2 раза, снижение активности ферментов в печени, по сравнению с предыдущими этапами исследования, выражено в 1-ый месяц спячки. Значительно, почти в 3 раза, возрастает активность нейтральных протеаз к третьему месяцу спячки и перед пробуждением, относительно месяца спячки (табл. 1; рис. 1).

Естественно, что перед выходом из спячки в печени происходит подготовка к синтезу новых белков, которому должен предшествовать процесс пополнения пула аминокислот, за счет распада «старых», выполнивших свою функцию белков.

Таблица 1 Общая активность нейтральных протеаз в тканях (мкмоль тирозина/г влажной ткани) и сыворотке крови (мкмоль тирозина /л) сусликов (n=4-5)

Ткани	Бодрствующие (июль) нормотермия 38°С	Бодрствующие (сентябрь) нормотермия 38°С	Перед спячкой (октябрь) tт?=16-19°С	Начало спячки (ноябрь) tт? =10-13°С	1 месяц спячки tт? =5-8°С	2 месяц спячки tт? =3-4°С	3 месяц спячки tт? =5-8°С	Перед пробуждением t т? =6-7°С
Мозг	3.3±0.5	5.9±1.0 p<0.05	4.6±0.2 p<0.05	1.3±0.2 p<0.01	-	0.7±0.02 p<0.001	5.2±0.8 p<0.05	6.0±0.6 p<0.05
Печень	10.2±1.0	13.2±0.2	10.9±0.9	13.4±0.2	6.9±0.4 p<0.05	11.5±0.5	18.1±1.6 p<0.05	18.7±1 p<0.01
Сердце	2.4±0.3	6.9±1.0 p<0.01	7.4±1.0 p<0.001	5.5±0.6 p<0.01	3.0±0.4	8.1±1.0 p<0.001	8.5±0.9 p<0.001	9.5±0.5 p<0.001
Кровь	1.3±0.2	2.9±0.2 p<0.01	3.8±0.3 p<0.001	2.5±0.3 p<0.01

P - значение достоверно относительно бодрствующих сусликов (июль)

Рис. 1. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) активности нейтральных протеаз печени сусликов на разных этапах зимней спячки. Здесь и далее: * - достоверность различий относительно бодрствующих сусликов в июле

Рис. 2. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) активности нейтральных протеаз мозга сусликов на разных этапах зимней спячки.

В мозгу бодрствующих (июль) сусликов общая активность нейтральных протеаз составляет 1/3 часть от активности ферментов в печени (табл.1). В сентябре общая активность нейтральных протеаз достоверно повышается на 79% по сравнению с июлем (рис.2).

Общая активность нейтральных протеаз в мозгу сусликов в октябре выше, чем летом (в июле), но начинает уменьшаться по сравнению с бодрствующими сусликами в сентябре. В начале спячки (ноябрь) уровень общей активности нейтральных протеаз снижен на 60%, а в 1-ый месяц зимней спячки падает до нуля. Эти данные согласуются с тем, что в этот период в головном мозгу происходит подавление синтеза и распада белков (Эмирбеков, Львова, 1985; Жегунов и др., 1993; Storey, 2004).

Ко 2-му месяцу зимней спячки активность ферментов начинает повышаться и составляет 20% от летнего контроля. Третий месяц зимней спячки и пробуждение от нее характеризуются повышением общей активности нейтральных протеаз в мозгу, по сравнению с таковой у бодрствующих животных. Таким образом, перед зимней спячкой и при выходе из спячки общая активность нейтральных протеаз в мозгу находится на одинаково повышенном уровне (~ в 2 раза) по сравнению с летними бодрствующими животными.

По данным Фрерихс с сотр. (Frerichs et al., 1998) скорость синтеза белков в мозге сусликов при гибернации составляет всего 0.04% от его уровня у активных животных. В большей степени синтетические процессы в тканях гибернирующих сусликов сохраняются в коре почки, поджелудочной железе и печени (Жегунов, 1990). Наиболее низкая скорость синтеза белков при гибернации отмечается в тканях селезенки, мозга, мышц и легких (Жегунов, Микулинский, 1987). Интенсивность синтеза белков при этом снижается не только за счет уменьшения скорости этого процесса, но и за счет полного прекращения синтеза некоторых индивидуальных белков (Storey, 2004).

Считают, что снижение интенсивности белкового синтеза при гибернации связано с необходимостью экономить энергетические ресурсы, когда уменьшается скорость кровотока, содержание субстратов и потребление кислорода (Frerichs et al., 1998; Storey, 2004).

Выход из зимней спячки готовится заранее. Еще в состоянии гибернации в нейронах гиппокампа активным образом идет синтез, накопление и выход в цитоплазму РНК, резко повышается синтез белка (Гордон и др., 1987). Интенсификацию синтеза белка в тканях пробужающихся сусликов можно связать с общей для всех клеток необходимостью восполнения потерянных и измененных во время зимней спячки функциональных и структурных белков или же замены части энзимов на специфические изоформы, необходимые при данной температуре.

Усиленный синтез в мозгу белков, в особенности некоторых фракций, в первый период после пробуждения от зимней спячки носит репаративный характер и связан с активацией всех жизненных процессов в организме, а также с необходимостью восполнить количество белков, содержание которых было уменьшено при зимней спячке. Наряду с ускорением синтеза происходит и распад белковых молекул (Эмирбеков, Львова, 1985).

Процесс пробуждения от гибернации находится по контролем ЦНС. При этом важную роль играют эндокринные железы, особенно надпочечники, значительно активируется симпатическая нервная система.

Известно, что одними из субстратов нейтральных протеаз являются энкефалины, которые, как и все регуляторные пептиды, обладают широким спектром биологического действия. Для проявления широкого спектра физиологических свойств энкефалинов одну из главных ролей играют нейтральные протеазы, определяющие количество их активных форм в организме, а также «качественный» состав секретируемых регуляторных пептидов.

Выделение из клетки активных энкефалинов, которые мигрируют к клеткам-мишеням (через кровеносное русло или синаптическую щель), где связываются со специфическими рецепторами, происходит при изменении концентрации Са2+ (Лишманов и др., 1997). Выполняя в организме функции нейромодуляторов, нейромедиаторов и гормонов, энкефалины влияют на многие системы организма (Панченко и др., 1999).

Процесс синтеза новых, или модификация структуры и функции имеющихся в клетке белков, может играть существенную роль в приспособлении клеток гетеротермных животных к функционированию в различных температурных условиях

При пробуждении сусликов от зимней спячки в их тканях синтезируется большое количество белков, уже характерных для активных животных. Появляются также специфические белки, которых нет у активных и спящих животных.

Рис. 3. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) активности нейтральных протеаз сердечной мышцы сусликов на разных этапах зимней спячки.

Таким образом, процесс пробуждения сусликов требует присутствия в клетках специфических белков, которые активно синтезируются (Жегунов, Микулинский, 1987; Жегунов и др., 1991).

В сердечной мышце, в отличие от печеночной ткани, уже в сентябре (бодрствование) общая активность нейтральных протеаз повышается в 2.9 раз, а в октябре - в 3.1 раза (рис.3), по сравнению с июлем. Учитывая, что в сентябре уже наступает сезон подготовки к зимней спячке, такое существенное повышение общей активности нейтральных протеаз можно объяснить ревизией белкового состава тканей, а также появлением новых пептидов (Croall, Demartino, 1991; Chua et al., 2000), возможно, за счет реакций ограниченного протеолиза.

В сердечной мышце такая высокая общая активность нейтральных протеаз сохраняется до впадения в спячку (в 1-й месяц спячки активность ферментов минимальная). По мере выхода из спячки общая активность нейтральных протеаз вновь повышается. Можно предположить, что для сердечной мышцы, в отличие от печени очень важна общая активность нейтральных протеаз не только при подготовке, но и на всех этапах зимней спячки.

3.2 Активность нейтральных протеаз в тканях суслика в ходе

самосогревания после индуцированного пробуждения

Пробуждение зверьков после длительного состояния зимней спячки можно рассматривать как процесс адаптации к новым условиям, связанный с интенсификацией обмена веществ, возрастанием потребления кислорода и повышением температуры тела. В связи с этим нам представлялось интересным исследование изменения активности нейтральных протеаз на этапах самосогревания сусликов при пробуждении от зимней спячки (табл. 2).

Нами обнаружено, что наиболее существенное изменение общей активности ферментов в ходе индуцированного пробуждения происходит в мозгу (рис. 4, 8). Повышение температуры тела с 3?С до 10?С приводит к повышению общей активности нейтральных протеаз в 4 раза. Дальнейшее повышение температуры тела пробуждающихся животных до 20?С приводит к еще большему росту активности ферментов (в 6 раз), относительно глубокой зимней спячки. Однако, согревание зверьков до 25 и 30?С не приводит к дальнейшим изменениям активности нейтральных протеаз. Полное самосогревание животных до 37?С приводит к росту общей активности ферментов в 8 раз относительно зимней спячки.

Таблица 2. Общая активность нейтральных протеаз в тканях (мкмоль тирозина/г влажной ткани) сусликов на этапах самосогревания после индуцированногопробуждения (n=5); инкубация проб при 37°С

Ткани	Спячка t?=3-4°С	Самосогревание до температуры тела:
		10?С	20?С	25?С	30?С	37?С
Мозг	0.7±0.02	2.7±0.2 p<0.01	4.2±0.5 p<0.001	4.8±0.4 p<0.001	4.5±0.6 p<0.001	5.7±0.2 p<0.001
Печень	11.5±0.5	12.2±0.5	18.8±1.0 p<0.01	18.3±0.4 p<0.01	16.5±2.0 p<0.05	21.6±0.5 p<0.001
Сердце	8.1±1.0	8.2±0.3	10.3±1.4	10.2±1.0	10.2±1.1	9.4±0.9

P - значение достоверно относительно данных при спячке

Как было отмечено ранее, процесс пробуждения от гибернации находится под контролем ЦНС, вследствие чего в мозгу происходят весьма сложные биохимические изменения, которые приводят к такому значительному росту активности протеолитических ферментов при повышении температуры тела.

Как видно из табл. 2 и рис. 5 в печени, также как и в мозгу наблюдается повышение общей активности нейтральных протеаз по мере повышения температуры тела пробуждающихся сусликов. При самосогревании до 20?С наблюдается повышение общей активности нейтральных протеаз на 63%. В интервале от 20 до 30?С достоверных различий в изменении активности ферментов нет. Полное самосогревание животных до 37?С приводит к повышению общей активности нейтральных протеаз на 88% относительно зимней спячки.

Рис. 4. Динамика (в % по отношению к контролю) изменения активности нейтральной протеазы мозга сусликов по мере самосогревания после 2-х месячной спячки (tт°=3-4°С). Здесь и далее:* - достоверность различий относительно зимней спячки

Рис. 5. Динамика (в % по отношению к контролю) изменения активности нейтральной протеазы печени сусликов по мере самосогревания после 2-х месячной спячки (tт°=3-4°С).

Рис.6. Динамика (в % по отношению к контролю) изменения активности нейтральной протеазы сердечной мышцы сусликов по мере самосогревания после 2-х месячной спячки (tт°=3-4°С).

Рис. 7. Общая активность нейтральных протеаз в тканях суслика на этапах самосогревания (tинкубации=37?С).

Рис. 8. Общая активность нейтральных протеаз в тканях суслика на этапах самосогревания (tинкубации соответствует температуре тела животного).

В сердечной мышце достоверных изменений общей активности нейтральных протез по мере самосогревания сусликов нет (рис. 6).

Так как инкубация проб при 37?С определяет «оптимальную» активность ферментов и не соответствует истинным значениям при той же температуре тела животного, нами определена общая активность нейтральных протеаз при температурах инкубации, соответствующих температуре тела сусликов (рис. 8).

Так называемая «истинная» активность нейтральных протеаз по мере повышения температуры тела в разных тканях повышается по-разному. Наиболее равномерно этот процесс протекает в мозгу, а наиболее выражена кривая зависимости общей активности нейтральных протеаз от температуры тела в печени, т.е. по мере согревания суслика она в печени стремительно растет и достигает наибольших значений по сравнению с мозгом и сердечной мышцей. Если «оптимальная» активность нейтральных протеаз в сердечной мышце не зависит от температуры тела (рис. 7), то «истинная» активность нейтральных протеаз, как видно из рис. 8, значительно возрастает, особенно в интервале температур 25-37?С. Таким образом каждая ткань: мозг, печень и сердце неодинаково готовятся к выходу из спячки.

Разная температурная зависимость активности нейтральных протеаз в различных тканях свидетельствует о том, что в каждой ткани зимоспящего животного существуют свои нейтральные протеазы, работающие в своем режиме и со своими субстратами.

Таким образом, в ходе пробуждения от зимней спячки в организме сусликов происходят изменения, направленные на поддержание метаболизма при данном физиологическом состоянии.

3.3 Активность нейтральных протеаз в тканях крыс при гипотермии

Известно, что теплокровные животные в норме регулируют температуру своего тела в жестких пределах, в отличие от гетеротермных животных, адаптированных к изменениям температуры в широком диапазоне. При попадании в неблагоприятные условия внешней среды у гомойотермных животных возможен срыв регуляторных механизмов. Если неблагоприятное воздействие связано с низкой температурой, тогда возникает переохлаждение. Длительное и жесткое холодовое воздействие приводит к истощению энергетических резервов организма (Эмирбеков, Львова, 1985). Глубокая гипотермия является опасным для жизни гомойотермного организма состоянием и ее пролонгирование увеличивает риск летального исхода (Жегунов и др., 1993). Гипотермия снижает уровень метаболизма и таким образом уменьшает потребность в кислороде. Гипотермия имеет свой благоприятный эффект за счет снижения уровня метаболизма, но тем не менее не является нормальным физиологическим состоянием и может вести к различным неблагоприятным последствиям (Sessler, 1997).

3.3.1 Протеолитическая активность нейтральных протеаз при

гипотермии

Общая протеолитическая активность нейтральных протеаз (субстрат казеин) в тканях крыс распределена примерно также, как и у бодрствующих (летних) сусликов.

По нашим данным (табл. 3) максимальная активность нейтральных протеаз наблюдается в печени, а минимальная - в сыворотке крови. В мозгу общая активность нейтральных протеаз составляет 29.1%, в сердечной мышце - 44.8%, а в сыворотке крови - 16.8% от уровня ее активности в печени.

При умеренной гипотермии 30-33°С в печени и сердечной мышце наблюдается общая тенденция к снижению активности нейтральных протеаз. Достоверное снижение активности нейтральных протеаз при глубокой гипотермии 18-20°С по достижении, наблюдается во всех исследуемых тканях также, как и значительное повышение активности ферментов при пролонгировании глубокой гипотермии в течение 2-х часов.

Таблица 3 Общая активность нейтральных протеаз в тканях (мкмоль тирозина /г влажной ткани) и сыворотке крови (мкмоль тирозина /л) крыс (n=6)

Ткани	Контроль 37°C	Гипотермия 30-33°С	Гипотермия 18-20°С	Пролонгирование гип.20°С 2 часа	Гипертермия 42°С	Иммобилизация 1 час
мозг	4.5±0.5	3.3±0.4	1.8±0.2 Р1<0.001 Р2<0.001	8.9±0.4 Р1<0.001 Р2<0.001	3.1±0.4	4.0±0.4
сердце	7.0±0.2	3.0±0.5 Р1<0.001	3.4±0.2 Р1<0.001	12.0±0.4 Р1<0.001 Р2<0.001	3.1±0.6 Р1<0.001	7.0±0.6
печень	15.5±0.5	12.2±0.6 Р1<0.01	8.0±0.7 Р1<0.001 Р2<0.001	13.9±1.8 Р2<0.001	7.5±0.8 Р1<0.001	11.2±1 Р1<0.001
кровь	2.6±0.2	2.0±0.07	1.7±0.2 Р1<0.01	3.7±0.3 Р1<0.01 Р2<0.001	2.3±0.2	2.4±0.3

Р1 - значение достоверно относительно контроля

P2 - значение достоверно относительно предыдущего этапа гипотермии

Рассматривая каждую ткань в отдельности, можно отметить, что в мозгу (рис.9) при умеренной гипотермии 30-33°С происходит незначительное снижение общей активности нейтральных протеаз.

При гипертермии 42 С снижение общей активности нейтральных протеаз в мозгу также незначительно.

Рис. 9. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) общей активности нейтральных протеаз мозга крыс при разных температурах тела. Здесь и далее: * - достоверность различий относительно контроля

Длительная гипертермия возникает при максимальном напряжении физиологических механизмов терморегуляции (Zee, 2002). Пребывание организма в условиях гипертермического воздействия может приводить к метаболическим и функциональным изменениям, которые, в свою очередь, могут оказать негативное влияние на характер жизнедеятельности отдельных органов (Инжеваткин и др., 2000; Фрадкин и др, 2002). Однако, при кратковременном (15-20 минут) воздействии температуры: как низкой (30-33°С), так и высокой (40-42°С) мы предполагаем неспецифическую реакцию на стресс, а не на температурный фактор.

Анализ научной литературы показывает, что при гипотермии обновление белков тормозится несравненно резче, чем обновление веществ имеющих энергетическое значение. Так, при понижении температуры тела на каждые 10°С скорость обновляемости белков мозга снижается примерно на 62% (Mortensen, Dale, 1995).

Глубокая гипотермия 18-20°С приводит к снижению общей активности нейтральных протеаз мозга и оно составляет 60% относительно контроля.

Пролонгирование глубокой гипотермии 18-20°С в течение 2 часов вызывает 5-кратное повышение общей активности исследуемых ферментов в мозгу относительно предыдущего этапа охлаждения. Столь значительное повышение общей активности нейтральных протеаз может быть связано с реакцией организма на длительное воздействие холодового стресса.

К группе нейтральных эндопептидаз синаптической фракции относятся металлопротеиназы, осуществляющие процессинг и деградацию таких регуляторных пептидов, как вещество Р, энкефалины, нейротензин, динорфин др.

Метаболическая деятельность ферментов мозга входит в компенсаторный механизм, функционирующий при низкой температуре тела. Молекулярные механизмы компенсации могут состоять в изменении физико-химических констант, в изменении пропорций изоферментов, приспособленных к определенной температуре (Эмирбеков и др., 1980).

Полученные нами данные, возможно, объясняются данными, установленными другими авторами о возрастании образования и секреции опиоидных пептидов в мозгу и увеличении их концентрации в крови при различных видах стресса (Менджерицкий и др., 1995).

При низкой температуре тела теплокровного животного в белках мозга модифицируются не только высшие структурные категории, но и меняется их аминокислотный состав. Изменение аминокислотного состава, видимо, связано как с изменением биосинтеза белков мозга, так и с активностью протеолитических ферментов (Эмирбеков, Нурмагомедова, 1979).

Сердце, как наиболее адаптивный орган в первые 15-20 минут охлаждения реагирует двукратным снижением общей активности нейтральных протеаз, которое поддерживается в течение часа глубокого охлаждения (рис.10). При гипотермии 30-33°С происходит снижение общей активности нейтральных протеаз на 56.7%, при гипотермии 18-20°С - на 50.6%, при гипертермии 42?С - на 55.9% относительно контроля. Достоверных различий результатов при этих трех состояниях нет. При дальнейшем (2-х часовом) воздействии холодового фактора происходит повышение активности ферментов на 71%, по сравнению с контролем, а относительно глубокой гипотермии по достижении, в 3.5 раза.

Рис 10. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) общей активности нейтральных протеаз сердечной мышцы крыс при разных температурах тела.

Сопоставление активности эндогенной опиоидной системы и степени устойчивости сердца к стрессорным повреждениям свидетельствует о том, что любой фактор, вызывающий увеличение уровня опиоидных нейропептидов в организме, повышает резистентность сердца к стрессорным, холодовым и аритмогенным воздействиям (Лишманов и др., 1998).

Повышение активности нейтральных протеаз, следовательно, и энкефалинов при пролонгировании глубокой гипотермии, возможно, играет защитную роль и может вносить свой вклад в антиаритмический эффект, так как известно, что энкефалины существенно уменьшают стрессорные повреждения сердечной мышцы.

При умеренной гипотермии 30-33°С и глубокой гипотермии 18-20°С в печени (рис. 11) крыс активность ферментов снижается на 21.3% и 48.4%, соответственно.

Максимальное снижение общей активности нейтральных протеаз в печени наблюдается при гипертермии 42°С (на 51.7%).

Рис 11. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) общей активности нейтральных протеаз печени крыс при разных температурах тела.

Гипертермия рассматривается многими исследователями как один из перспективных методов профилактики и терапии ряда заболеваний. При гипертермическом воздействии особое значение приобретает состояние органов, непосредственно участвующих в поддержании гомеостаза организма. Одним из таких органов является печень (Инжеваткин и др., 2000).

При пролонгировании глубокой гипотермии достоверных различий в изменении активности ферментов относительно контроля нет, а относительно гипотермии 18-20?С активность нейтральных протеаз значительно повышается (на 75%).

В сыворотке крови к ферментам, активным в нейтральном диапазоне рН, относятся карбоксипептидаза В, плазмин, калликреин.

Калликреин-кининовая система крови является центральным звеном в комплексе гуморальных систем, регулирующих гомеостаз и осуществляющих адаптивно-защитные реакции организма, активно участвующие в снабжении органов и тканей кислородом при гипоксических состояниях. Ее активация является неспецифической реакцией организма и носит, в основном, защитный характер (Гельцер, Жилкова, 2005).

Плазмин обладает тромболитическим эффектом и снижает свертываемость крови. В организме он присутствует в виде неактивного предшественника - плазминогена, чья концентрация в плазме крови достигает 0.2 г/л (Кузнецова и др., 2004).

В наших исследованиях (рис. 12) в сыворотке крови общая активность нейтральных протеаз достоверно изменяется только при глубокой гипотермии по достижении и при ее пролонгировании. Глубокая гипотермия приводит к снижению активности ферментов относительно контроля на 35%, а длительное (2-х часовое) охлаждение вызывает повышение активности нейтральных протеаз на 42%.

В качестве дополнительного контроля нами была использована иммобилизация животных, которая, как оказалось, не влияет на общую активность нейтральных протеаз в сердечной мышце. При этом в мозгу и сыворотке крови отмечается незначительное снижение, а в печени оно достоверно.

Рис 12. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) общей активности нейтральных протеаз сыворотки крови крыс при разных температурах тела.

Повышение общей активности нейтральных протеаз при пролонгировании глубокой гипотермии, возможно, связано с повышением концентрации ионов Са2+ в клетке. Поддержание физиологических концентраций Са2+ в цитозоле можно считать важнейшей функцией клетки (Иванов и др., 1999).

Содержание Са2+ в межклеточной жидкости в 10-20 тысяч раз больше, чем в цитозоле и составляет около 10-8 М. Однако, при этом ионы кальция играют ключевую роль в регуляции различных процессов внутриклеточного метаболизма. (Siesjo, Bengtsson, 1989). Поэтому Са2+ постоянно перемещается в клетку из межклеточной среды через определенные каналы в клеточной мембране.

Известно, что при гипотермии угнетаются процессы синтеза АТФ, наступает дефицит энергии и замедляется транспорт Са2+ из цитозоля в межклеточную среду. Незначительное (с 10-8 М в норме до 10-6 М) повышение Са2+ в цитозоле приводит к активации различных протеолитических и липолитических ферментов в клетке (Hochachka, Somero, 2002).

Таким образом, полученные нами результаты относительно повышения общей активности нейтральных протеаз при пролонгировании глубокой гипотермии, возможно, коррелируют с накоплением ионов Са2+ и, соответственно, с повышением активности Са2+ - зависимой нейтральной протеазы. В связи с вышеприведенными данными значительный интерес представляет исследование Са2+ - зависимой активности нейтральных протеаз ферментов кальпаиновой системы.

3.3.2 Автолитическая активность тканей мозга и печени крыс при

гипотермических состояниях

Автолитической активность нейтральных протеаз определена в мозгу и печени крыс в норме, при умеренной гипотермии 30?С по достижении, при пролонгировании умеренной гипотермии 30?С в течении трех часов и при пролонгировании глубокой гипотермии 20?С в течении двух часов. Активность автолиза измерялась при следующих температурах инкубации: 10, 20, 30 и 37?С.

Если протеолитическая активность подразумевает распад экзогенного субстрата - казеина, то в данном случае происходит распад внутриклеточных эндогенных белковых субстратов.

В мозгу контрольных (нормотермических животных) активность автолиза наиболее выражена при 30?С. Охлаждение крыс до температуры тела 30?С не приводит к измению автолиза в мозгу и в печени. Пролонгирование этого состояния в течение трех часов по-разному сказывается на температурной зависимости автолиза в этих тканях. Так, в мозгу температурная зависимость автолиза ниже, чем в норме, а в печени, наоборот картина температурной зависимости представлена кривой, характеризующей высокую активность автолиза при всех температурах инкубации.

Таким образом, можно говорить о тканевой специфичности атакуемости эндогенных субстратов нейтральными протеазами мозга и печени.

Результаты наших исследований показали, что в норме максимальная автолитическая активность нейтральных протеаз также, как и протеолитическая, наблюдается в печени при температуре инкубации 37?С. Общим с протеолитической активностью нейтральных протеаз также является то, что при пролонгировании глубокой гипотермии 20?С в течении двух часов автолитическая активность повышается как в мозгу, так и в печени крыс (в печени повышение достоверно).

Кроме того, наблюдается тканевая специфичность активности автолиза: в печени контрольных крыс автолитическая активность при 37?С ниже, чем при гипотермических состояниях; в мозгу - при гипотермии 30?С по достижении и при пролонгировании глубокой гипотермии активность нейтральных протеаз выше относительно контроля, а при пролонгировании умеренной гипотермии - ниже. Можно сказать, что в печени при всех состояниях, за исключением трехчасовой умеренной гипотермии 30?С, в промежутке от 10 до 20?С достоверных изменений нет.

Рис. Температурная зависимость автолитической активности нейтральных протеаз в печени крыс при гипотермии

При температуре инкубации 30?С изменения автолитической активности также недостоверны, за исключением умеренной гипотермии в течение трех часов, где активность повышается на 28%. При температуре инкубации 37?С при гипотермии 30?С по достижении, активность нейтральных протеаз повышается на 41%, при пролонгировании умеренной гипотермии - на 56%, при пролонгировании глубокой гипотермии также на 56%.

Рис. Температурная зависимость автолитической активности нейтральных протеаз в мозгу крыс при гипотермии

В мозгу наблюдается совершенно иная картина. Уже при температуре инкубации 10?С пролонгирование умеренной гипотермии вызывает снижение автолитической активности нейтральных протеаз на 31%, гипотермия 30?С по достижении вызывает повышение. При температуре инкубации 20?С автолитическая активность при всех состояниях находится на одинаково повышенном уровне относительно активности нейтральных протеаз при пролонгировании умеренной гипотермии. При 30?С также нет достоверных изменений при всех этих состояниях.

Интересным является то, что характер кривых при пролонгировании умеренной гипотермии схож как в мозгу, так и в печени.

Изменение автолитической активности в тканях может быть связано либо с конформационными изменениями белковых субстратов и их атакуемостью протеиназами, либо активацией самих нейтральных протеаз.

Известно, что в белках мозга гипотермических животных наблюдаются характерные изменения в содержании амидных групп. Уже на начальных этапах гипотермии изменяется соотношение лабильного и прочносвязанного амидного азота, суммарных и водорастворимых белков мозга (Эмирбеков, Львова, 1985).

Охлаждение организма приводит к модификации белковых молекул мозга, которое выражается в изменении их аминокислотного состава и высших структурных категорий (Эмирбеков и др., 1980).

3.4 Са2+ - зависимая активность нейтральных протеаз в тканях крыс

при гипотермии

Результаты исследования изменения активности Са2+ - зависимой нейтральной протеазы представлены в таблице 4. Максимальная активность ферментов кальпаиновой системы обнаруживается в сердце и составляет 52.4±2.7 мкМоль тирозина/мг белка (рис. 13).

Если принять контрольное значение активности кальпаинов в сердечной мышце за 100%, то в мозгу, печени и сыворотке крови она составляет 44, 62.5 и 20.6%, соответственно.

Рис. 13. Активность Са2+-зависимой нейтральной протеазы в сердечной мышце крыс при разных температурах тела. Здесь и далее: * - достоверность различий относительно контроля.

Таблица 4 Активность Са2+ -зависимой нейтральной протеазы в тканях и сыворотке крови (мкмоль тирозина/мг белка) крыс (n=6)

Ткани	Контроль 37°C	Гипотермия 30-33°С	Гипотермия 18-20°С	Пролонгирование гип.20°С 2 часа	Гипертермия 42°С
мозг	23.3±0.6	19.8±1.3 Р1<0.025	7.2±0.9 Р1<0.001 Р2<0.001	25.3±0.3 Р1<0.01 Р2<0.001	19.0±0.9 Р1<0.01
сердце	52.4±2.7	40.3±4.0 Р1<0.05	21.6±1.8 Р1<0.001 Р2<0.001	51.5±0.6 Р2<0.001	21.3±0.7 Р1<0.001
печень	32.8±2.1	26.6±0.8 Р1<0.05	14.4±1.3 Р1<0.001 Р2<0.001	32.0±0.4 Р2<0.001	18.5±0.4 Р1<0.001
кровь	10.8±0.6	7.7±0.4 Р1<0.01	8.5±0.4 Р1<0.01	8.6±0.09 Р1<0.05	7.0±0.4 Р1<0.01

P1 - значение достоверно относительно контроля

P2 - значение достоверно относительно предыдущего этапа гипотермии

Умеренная гипотермия 30-33°С вызывает снижение активности ферментов относительно контроля на 23%.

Глубокая гипотермия 18-20°С приводит к дальнейшему снижению активности кальпаинов в сердечной мышце крыс на 58.7%. Гипертермия 42°С вызывает также снижение относительно контроля на 59%.

Пролонгирование глубокой гипотермии в течении 2-х часов приводит к повышению активности кальпаина сердечной мышцы на 138%, относительно глубокой гипотермии.

В сердечной мышце выделена Са2+ - зависимая нейтральная протеаза, обладающая энкефалиназной активностью. В то же время известно, что энкефалины способны включаться в механизмы формирования и регуляции ответа организма на чрезвычайные воздействия (Лишманов и др., 1992), что, видимо, и происходит при 2х часовом пролонгировании глубокой гипотермии.

В мозгу активность кальпаинов составляет 23.28±0.6 мкмоль тирозина/мг белка.

Основные функции кальпаинов мозга, очевидно, связаны с ограниченным протеолизом определенных цитоплазматических и мембранных белков, включая белки рецепторы и протеинкиназу С, а также белков цитоскелета клетки, выполняющих важную роль в регуляции внутриклеточного метаболизма. Кальпаины мозга участвуют также в реализации таких функций нейронов, как аксональный транспорт, трансмембранная передача сигнала, долговременная память и др. (Seubert et al., 1988).

Ключевая роль кальпаинов в нервной системе определяется в большей степени тем, что эти пептидгидролазы характеризуются двойной системой контроля их активности; одной, общей для всех протеолитических ферментов и обеспечиваемой специфическими эндогенными ингибиторами и реактивными предшественниками ферментов, и другой - регулируемой концентрацией эндогенного Са2+. Сочетание в первичной структуре Са2+ - зависимой нейтральной протеазы протеолитического и Са2+ - связывающего доменов, по-видимому, дает возможность строго регулировать активность фермента и включать его в обмен в зоне локального повышения концентрации Са2+, определяя тем самым топографию и временный контроль биологического процесса (Азарян, 1989).

При умеренной 30-33°С и глубокой 18-20°С гипотермии, а также гипертермии 42°С активность кальпаинов мозга понижается на 15%, 69% и 19%, соответственно (рис. 14).

Пролонгирование глубокой гипотермии 18-20°С в течение 2-х часов вызывает почти 3х кратное увеличение активности кальпаинов относительно глубокой гипотермии.

Поскольку активация Са2+ - зависимых нейтральных протеаз происходит при увеличении концентрации ионов Са2+ в примембранной области до 100 и более мкмоль, то полученные нами результаты могут свидетельствовать об ингибировании активности Са2+-АТФазы, с помощью которой осуществляется перемещение каждого иона Са2+ из цитозоля в межклеточную среду (Иванов и др., 1999).

Рис. 14. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) активности Са2+- зависимой нейтральной протеазы в мозгу крыс при разных температурах тела.

Са2+ - АТФаза необходима для снижения внутриклеточного Са2+ до низких уровней, что достигается за счет энергии АТФ. Этот насос обладает высоким сродством к Са2+, но довольно низкой транспортной способностью (около 0.5 нМоль Са2+/мг белка в 1с). Фермент активируется кальмодулином, а также кислыми фосфолипидами и ненасыщенными длинноцепочечными жирными кислотами. Утверждается, что различные гормоны, такие как тироксин, окситоцин и инсулин, ингибируют помпу в зависимости от ткани и экспериментальных условий (Сарис, Карафоли, 2005).

Согласно литературным данным, при умеренной активации Са2+ - зависимых нейтральных протеаз, осуществляющих ограниченный протеолиз нейроспецифических белков цитоскелета нейронов (в том числе основного структурного компонента синаптосомальных мембран - фодрина), происходит демаскировка и увеличение количества NMDA-рецепторов глутамата, что способствует развитию гипервозбуждения. Дальнейшее увеличение свободного Са2+ и активация Са2+ - зависимых нейтральных протеаз может стать причиной деструкции цитоскелета и последующей гибели нейронов (Менджерицкий и др., 1995).

Кроме того, при увеличении концентрации Са2+ происходит связывание глутаминовой кислоты специфическими рецепторами плазматических мембран клеток гиппокампа крыс. Оно сопровождается расщеплением фодрина - спектринподобного белка, локализованного на внутренней поверхности плазматических мембран нервных клеток, и таким образом регулируется пластичность мембран (Ivanov, 1997).

В печени крыс активность кальпаинов (Са2+ - зависимых нейтральных протеаз) составляет 32.76±2.1 мкмоль тирозина/мг белка. При умеренной 30-33°С, глубокой 18-20°С гипотермии, а также гипертермии 42°С активность кальпаинов понижается относительно контроля на 19, 56 и 43 %, соответственно (рис.15). Пролонгирование глубокой гипотермии в течение 2-х часов вызывает повышение активности фермента на 122% относительно глубокой гипотермии, и не изменяет ее по сравнению с контролем.

Кальпаины катализируют образование кининов, участвующих в воспалительных процессах и с помощью ограниченного протеолиза активируют триптофангидроксилазу клеток печени животных, регулирующую биосинтез серотонина (Сологуб, Пашковская, 1988).

Согласно данным Демина и соавторов (1988), сдвиги метаболизма серотонина в головном мозгу при принудительном охлаждении организма крыс сопровождаются не повышением, а понижением функциональной активности серотонинергических структур головного мозга.

Рис. 15. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) Са2+- зависимой активности нейтральных протеаз в печени крыс при разных температурах тела.

При умеренной 30-33°С, глубокой 18-20°С гипотермии, пролонгировании глубокой гипотермии в течение 2-х часов, а также гипертермии 42°С происходит падение активности кальпаинов сыворотки крови на 20 - 35% относительно контрольных данных (рис. 16).

Рис. 16. Динамика изменения (в % по отношению к контролю) Са2+- зависимой активности нейтральных протеаз в сыворотке крови крыс при разных температурах тела.

Совпадение изменений содержания в крови Са2+ с возникновением и ослаблением физиологических эффектов подтверждает предположения о решающей роли этих ионов в угнетении и восстановлении физиологических функций охлажденного организма. С физиологической точки зрения особенно важным является тот факт, что резкую стимуляцию физиологических функций у охлажденных животных вызывает весьма небольшое снижение содержания Са2+ в крови. Имеются данные об индуцированном кальцием протеолизе спектрина и некоторых других белков мембран эритроцитов животных (Иванов и др., 1999).

3.5 Активность глицилглицин-дипептидазы в мозгу и печени сусликов

Особую группу ферментов, осуществляющих заключительные стадии гидролиза белков, составляют дипептидазы, относящиеся к экзогидролазам. Дипептидазы ответственны за пополнение фонда свободных аминокислот для метаболических потребностей организма и имеют особое значение для нервной ткани. Одним из представителей данной группы ферментов, активность которого максимальна при нейтральном значении рН, является глицилглицин-дипептидаза (3.4.13.1).,обладающий строгой субстратной специфичностью (Цыперович, Авдеев,1978). Конечным продуктом его работыявляется глицин, входящий в состав многих белков и биологически активных соединений (Gomeza et al., 2003). Функция глицилглицин-дипептидазы нервной ткани заключается в регуляции уровня глицина в зависимости от ее метаболических потребностей. Глицин также является нейромедиаторной аминокислотой. Рецепторы к глицину имеются во многих участках головного мозга и спинного мозга и оказывают «тормозное» воздействие на нейроны, уменьшают выделение из нейронов «возбуждающих» аминокислот, таких, как глутаминовая кислота, и повышают выделение ГАМК (Li, Han, 2006). Аминокислота глицин служит медиатором в некоторых случаях постсинаптического торможения в спинном мозге. В головном мозге большая плотность глициновых рецепторов обнаружена не только в структурах ствола, но и в коре больших полушарий, стриатуме, ядрах гипоталамуса, проводниках от лобной коры к гипоталамусу, мозжечке (Watanabe et al., 1992). Рецепторы глицина и ГАМК составляют, вероятно, половину всех синаптических рецепторов мозга. Пресинаптические нервные окончания имеют транспортную систему, которая характеризуется высоким сродством к глицину, но не к какой либо другой аминокислоте. Эта система возвращает глицин из синаптической щели.

Нами исследована активность глицилглицин-дипептидазы в головном мозгу (больших полушариях) и печени неспавших зимой и пробуждающихся весной сусликов. Так как, температура тела пробуждающегося суслика 10?С, а неспавшего - 37?С, то нами были выбраны соответствующие температуры инкубации тканей.

Как видно из таблицы 5, при 10?С, температуре, при которой суслики обычно зимой находятся в торпидном состоянии, активность глицилглицин-дипептидазы высокая, независимо от того спали зверьки или нет.