54

ФГОУ ВПО «Астраханский Государственный Технический Университет»

Кафедра «Прикладная биология и микробиология»

Курсовая работа

на тему: «Распространение микроорганизмов рода Clostridium в природе и пищевых продуктах»

Астрахань, 2007

Содержание

Введение

Глава 1

1. Характеристика рода Clostridium

1.2 Патогенные микроорганизмы рода Clostridium

1.2.1 Возбудитель ботулизма

1.2.2 Clostridium perfringens

1.2.3 Возбудитель эмфизематозного карбункула

1.2.4 Возбудитель столбняка

1.3 Значение микроорганизмов рода Clostridium в промышленности

1.3.1 Возбудители порчи баночных консервов

1.3.2 Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium

1.4 Применение ботулинического токсина в медицине

Глава 2 Объекты и методы исследований

2.1. Объекты исследования

2.2 Выявление мезофильных анаэробных микроорганизмов

2.3 Выявление термофильных анаэробных микроорганизмов

2.4 Выявление возбудителей брожения пектиновых

2.5 Выявление возбудителей брожения целлюлозы

2.6 Выявление анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов, вызывающих маслянокислое брожение

3. Выделение бактерий рода Clostridium из разных объектов

3.1 Результаты посевов в жидкую среду Китт-Тароцци для выявления мезофильных и термофильных анаэробных микроорганизмов

3.2 Результаты посевов для выявления возбудителей брожения пектиновых веществ

3.3 Результаты посевов в жидкую среду Омелянского для выявления возбудителей брожения целлюлозы

3.4 Результаты посевов на жидкую среду Виноградского

Выводы

Список литературы

Приложение

Введение

С жизнедеятельностью клостридий связаны различные процессы, протекающие в природе: разложение (гниение) азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот) в анаэробных условиях; анаэробное разложение растительных материалов, таких как клетчатка, хитин. Еще в конце ХIX века было обнаружено, что некоторые клостридии патогенны, т. е. вызывают заболевания человека и животных. В основе патогенности клостридий лежит их способность синтезировать и выделять из клетки высокоэффективные токсины.

Некоторые бактерии рода Clostridium входят в состав нормальной микрофлоры ЖКТ и женских половых путей; иногда их обнаруживают на коже и в полости рта. Из материала, полученного от больных людей, выделены, по крайней мере, 30 видов клостридий. Подобно некоторым другим патогенным анаэробам, клостридии на воздухе не гибнут, но на питательных средах в присутствии кислорода не растут. Для бактерий этого рода характерно обильное выделение газа при культивировании и субтерминальное расположение спор (Ассонов, 1989).

Бактерии группы Clostridium находят и практическое применение. Их используют в производстве масляной кислоты, необходимой для парфюмерной промышленности. Ацетонобутиловое брожение, осуществляемое некоторыми видами клостридий, используют для получения в промышленном масштабе ацетона и бутанола (Воробьева, 1989).

Целью данной курсовой работы является изучение бактерии рода Clostridium, выделенных из различных сред их обитания.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выявление из разных типов почв азотфиксирующих микроорганизмов рода Clostridium.

2. Выявление из разных типов почв микроорганизмов рода Clostridium, участвующих в маслянокислом брожении.

3. Выявление из разных типов почв микроорганизмов рода Clostridium, участвующих в брожение целлюлозы.

4. Выявление микроорганизмов рода Clostridium, из волокон растений и вызывающих брожение пектиновых веществ.

5. Выявление мезофильных и термофильных микроорганизмов рода Clostridium из пищевых продуктов.

Глава 1

1. Характеристика рода Clostridium

Бактерии рода Clostridium, грамположительные спорообразующие облигатные анаэробы, повсеместно распространены в природе. Этот род насчитывает более 60 видов, многие из которых являются сапрофитами. Некоторые сахаролитические клостридии могут использовать в качестве субстрата брожения пектиновые вещества, составляющие покровы растительных клеток. Клостридии, принадлежащие к виду Сl. felsineum, содержат активную пектиназу и могут поэтому получать энергию, осуществляя маслянокислое брожение пектиновых веществ. Этот вид играет важную роль в процессе мацерации волокон при мочке льна.

К роду Clostridium относятся микроорганизмы, не использующие в качестве акцептора водорода молекулярный кислород воздуха. Некоторые из них могут развиваться при пониженном парциальном давлении кислорода. Оптимальными значениями окислительно-восстановительного потенциала среды для их развития являются Eh от 50 до 200 млВ. Клостридии не обладают каталазообразующей способностью.

Микроорганизмы рода Clostridium широко распространены в природе. Один из самых распространенных видов - Clostridium perfringens. Эта бактерия неподвижна, имеет капсулу и на питательных средах споры образует редко. При кипячении споры гибнут. В состав нормальной микрофлоры толстой кишки входит более 30 видов клостридий. В 1 г кала их содержится 10 в степени 9-10. Clostridium ramosum по распространенности немногим уступает Cl. perfringens. Эти два вида повсеместно обнаруживаются в почве, где их концентрация достигает 10000 1/г. Клостридии грамположительны, но в материале, полученном от больных, а также в стареющих культурах нередко бывают грамотрицательными. Поэтому результаты микроскопии окрашенных по Граму мазков следует оценивать с осторожностью.

Многие из них являются постоянными обитателями почвы [Е.Н. Мишустин, М.И. Перцовская и др. (1979); Г.В.Меренюк, Г.И. Пономаренко (1979)]. Вместе с почвой, оставшейся на сырье, клостридии попадают в процессе производства в готовые продукты -- сухие картофельные и овощные.

Л.Е. Прохорович, Л.А. Салтыкова и др. (1975), Н.Н. Мазохина-Поршнякова, Л.П. Найденова (1977) сообщают о высокой обсемененности корнеплодов клостридиями.

И.Я. Овруцкая, В.Е. Новицкая (1983) обнаружили анаэробы рода Clostridium на сыром картофеле и овощах, на полуфабрикатах, в сухом картофельном пюре, сушеном картофеле и овощах.

Клетки имеют форму палочек различной длины и ширины. Длина клостридиальных клеток зависит от условий культивирования и фазы развития.

Расположение клеток в препарате иногда можно использовать как диагностический признак. Так, клетки Сl. perfringens могут располагаться параллельно одна другой, клетки Сl. beijerinkii слабо изогнуты.

Клостридии в основном подвижны, кроме Сl. perfringens. Способность к спорообразованию у них неодинакова: Сl. sporogenes хорошо образует споры (85--90% клеток дают споры), Сl. perfringens на обычных питательных средах, как правило, спор не дает, но иногда все же встречаются единичные споры, остальные клостридии в этом отношении занимают промежуточное положение.

В таблице 1 приведены дифференциальные признаки микроорганизмов рода Clostridium.

Таблица 1

Дифференциальные признаки микроорганизмов рода Clostridium

Вид бацилл	Форма и размеры колоний в анеэробных условиях	Размер клеток, мкм	споры	Общие свойства	Рост на среде Китт- Тароции	Рост на лакмусовом молоке	Температура роста, С0	Образование токсина
			форма	раздутость	Располо- жение
С. botulinum типа А и В	На поверхности агара -- круглые колонии диаметром 3-- 8 мм, плоские, серого цвета, с уплотненным центром и ризоидны ми краями. Поверхность матовая, в глубине агара -- колонии в виде комка ваты, белого цвета, диаметром 5--10 мм	0,8--1,3Х X 4,4--8,6	0	+	СТ	Строгие анаэробы грамположительные в молодой культуре, ка- талазоположнтельные, в основном подвижные, обладают суль-фитредуцнрующей способностью, индол не образуют, ферментируют глюкозу, мальтозу, сахарозу. Не ферментируют манит, рамнозу, сорбит. Разжижают желатин	Помутнение среды и газообразование через 18--24 ч. Размягчение кусочков мяса, образование облаковидного осадка	Пентонизируют, не коагулируют	30-40	+
С, beijerinkii	В глубине агара -- колонии шаровидные, с гладкой поверхностью, белого или кремового цвета, диаметром 2,5--3,0 мм	03--1,5Х Х3,0-7,5	0	+	ЭКС до СТ		Помутнение среды, умеренное газообразование через 14--18 ч	Коагулируют, слабо фраг-ментируют, не пептонизируют	25-30	-

Продолжение таблицы 1

С. pasteu-rianum	В глубине агара -- колонии мелкие, в виде двояковыпуклых линз, слегка опушенные, диаметром 1,0-- 1,5 мм	0,5--0,8Х Х3,4-13,2	0	+	СТ	То же	Помутнение среды, сильное газообразование через 8-- 14 ч.	Не изменяют	25-37	-

С. butyri-cum	В глубине агара -- колонии двояковыпуклые, плотные, желто-белые, диаметром 3,0--5,0 мм	0,6--1,2Х X 3,0-7,0	0	+	ЭКС до СТ	Строгие анаэробы, подвижные, грамположительные в молодой культуре, каталазоот-эицательные, не разжижают желатин, сероводород и индол не образуют. Ферментиуют галактозу, глюкозу, рафинозу, саха-эозу, фруктозу. Не рерментируют дульцит, рамнозу	Помутнение среды, обильное газообразование, запах масляной кислоты через 8-- 14 ч. Рост слабый при отсутствии глюкозы	Бурная ферментация, фраг-ментированное свертывание, не пептонизируют	25-37	-

Принятые сокращения: СТ - субтерминальное расположение; ЭКС - эксцентральное расположение, Э - эллиптические или цилиндрические; Ц -центральное; Т - терминальное и субтерминальное; ЦТ - расположение от центрального до терминального; «+» положительная реакция; «-» отрицательная реакция.

Споры в клетках расположены субтерминально, у Сl. beijerinkii и С. butyricum иногда наблюдается эксцентральное расположение спор. Споры у всех клостридии, за исключением Сl. perfringens, раздувают клетку; в зависимости от формы и расположения споры клетка приобретает вид теннисной ракетки (Сl. botulinum, Сl. sporogenes), веретена или сигары (Сl. beijerinkii, Сl. pasteurianum, Сl. butyricum).

Споры всех клостридий устойчивы к действию многих химических веществ и высокой температуры, а также к высушиванию.

Характер роста активно развивающихся вегетативных клеток на жидких мясных средах может служить дифференциальным признаком. Сl. perfringens обладает короткой лаг-фазой, максимум роста наступает через 4--6 ч. Остальные виды обладают более длительной лаг-фазой и максимум роста у них наблюдается через 18--24 ч.

Все представленные клостридий растут на среде Китт-Тароцци с помутнением среды и газообразованием, но рост Сl. perfringens и Сl. sporogenes сопровождается обильным газообразованием, а Сl. pasteurianum и Сl. butyricum не растут на этих средах в отсутствии глюкозы.

По биохимическим особенностям клостридий разделены на две группы. В первую входят Сl. botulinum типов А и В, Сl. perfringens типа А, Сl. sporogenes, разжижающие желатин, во вторую группу -- Сl. pasteurianum, Сl. butyricum, Сl. beijerinkii, не разжижающие желатин.

Внутри этих групп имеются клостридий, обладающие хорошо выраженными сахаролитическими свойствами (Сl. butyricum, Сl. pasteurianum, Сl. beijerinkii) и клостридий, обладающие незначительной сахаролитической активностью (Сl. sporogenes, Сl. botulinum типа А), а также клостридий, занимающие промежуточное положение по этому признаку (Сl. botulinum типа В, Сl. perfnngens).

Одним из признаков является характер роста клостридий на лакмусовом молоке. Сl. perfringens и Сl. butyricum бурно сбраживают молоко, процесс сопровождается отделением сгустка от сыворотки. В посевах Сl. perfringens сыворотка осветляется, а в посевах Сl. butyricum остается мутной. Рост Сl. perfringens на этой среде происходит при температуре 47°С за 4--5 ч, при 37°С -- за 6--8 ч.

Рост Сl. butyricum происходит только при 37°С за 18--20 ч. Сl. sporogenes и Сl. botulinum свертывают молоко и пептонизируют при 37°С, а Сl. pasteurianum и Сl. beijerinkii молоко не свертывают или свертывают не по всему столбику, лакмус редуцируется.

Из клостридий, встречающихся в сухих картофельных и овощных продуктах, Сl. botulinum и Сl. perfringens образуют токсины, опасные для человека.

Этот признак для Сl. botulinum является постоянным, поэтому при идентификации целесообразно использовать метод постановки биологической пробы, основанный на нейтрализации токсина ботулизма противоботулинической сывороткой соответствующего типа.

Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические особенности анаэробных бактерий рода Clostridium лежат в основе выделения и идентификации этих микроорганизмов из различных объектов исследования, в том числе из сырья, полуфабрикатов сухих и кулинарно подготовленных картофельных и овощных продуктов (Овруцкая,1983).

Clostridium pasteurianum способен активно фиксировать азот. Это облигатно анаэробная крупная споровая палочка, подвижная в молодом состоянии, в заключении цикла развития образует споры. При образовании споры клетка раздувается в виде веретена и наполняется резервным крахмалоподобным веществом - гранулезой. Это вещество синеет при воздействии раствором йода в йодистом калии. Cl. pasteurianum живет за счет сбраживания сахаров с образованием масляной и уксусной кислот и газов СО₂ и Н₂ ; нуждается в витаминах. На среде Виноградского быстро вырождается, теряя способность к спорообразованию, а потом и к росту.

Получить Cl. pasteurianum в чистом виде трудно, так как он живет в довольно тесном симбиозе с аэробной споровой палочкой Bacillus closteroides. Этот спутник ограждает анаэроба от кислорода воздуха, перехватывая его на свои нужды и снабжает его необходимыми витаминами, а сам получает азотистое питание от азотфиксатора. Чистая культура может быть получена из накопительной при получении изолированных колоний на твердой среде. Это может быть среда Виноградского с добавлением автолизата дрожжей. Колонии Cl. pasteurianum вырастают только в эксикаторе, из которого выкачан воздух до остаточного давления 5-10 мм, так как Cl. pasteurianum облигатный анаэроб и не может расти на поверхности твердых сред на воздухе. Чистая культура хорошо развивается на среде Виноградского с добавлением автолизата дрожжей и загущенной небольшим количеством агара для создания более анаэробных условий вследствие замедления диффузии кислорода воздуха (Работнова, 1966).

Азотфиксация интенсивнее происходит на безазотистой среде. Если в среде имеется азот, особенно аммонийный, то азотфиксация ослабевает или совсем прекращается. Cl. pasteurianum живет в широком диапазоне рН от 4,5 до 9,0 .Фиксирует 10-20 мг азота на 1 г сброженного сахара. В более слабой степени, чем Cl. pasteurianum, способностью к азотфиксации обладает вся обширная группа Clostridium. Это было доказано Вильсоном методом с применением N¹⁵ у 15 видов этого рода.

Cl. pasteurianum распостранен очень широко. Он встречается практически во всех почвах, в виде палочек или спор. Но в наибольшем числе и в наиболее активном состоянии Cl. pasteurianum находится в ризосфере растений. Этот микроб сожительствует с растениями, снабжая их азотом и получая от них органические вещества и витамины.

Интересно, что этот облигатный анаэроб обитает главным образом в верхних слоях почвы, наиболее богатых органическими веществами, пронизанных корнями растений. Кислород воздуха ему не вредит, так как Cl. pasteurianum живет под защитой аэробов, перехватывающих кислород воздуха и не допускающих его до анаэроба (Емцев, 1966).

Clostridium perfringens является санитарно-показательным микроорганизмом., так как эти бактерии обитают в кишечнике теплокровных животных и человека. Обнаружение Cl. perfringens свидетельствует о некогда имевшем место фекальном загрязнение (эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохранятся в окружающей среде). В отечественной практике количественный учет клостридий предусмотрен при исследованиях почвы, лечебных грязей, воды открытых водоемов. Определение этого микроорганизма проводят и в некоторых пищевых продуктах, но уже как возбудителя пищевых отравлений.

При санитарно-микробиологическом исследовании почвы учитывают комплекс показателей, среди которых такой как перфрингенс-титр. Для определения перфрингенс-титра пользуются разведениями почвенной взвеси (чистую почву засевают в разведении 10^-1 - 10^-3, загрязненную от 10^-4 до 10^-5). По 1 мл из выбранных разведений засевают в пробирки с 5 мл стерильного обезжиренного молока или железосульфитной средой Вильсона-Блера. Посевы инкубируют при 43°С в течение 24-48 ч, после чего учитывают результаты по характерному свертыванию молока (образование губчатого сгустка в верхней части пробирки и просветление сыворотки) или по образованию колоний Clostridium perfringens в агаровом столбике среды Вильсона-Блера (колонии черного цвета различной интенсивной окраски, имеющие форму двояковыпуклой линзы, комочка ваты или «самолетика»). Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр. Клетки Cl. perfringens - подвижные (реже неподвижные) короткие толстые палочки с закругленными концами. Образуют овальные или круглые эндоспоры, расположенные центрально и придающие клеткам веретенообразную форму ()споры также могут располагаться терминально или субтерминально). В мазках расположены одиночно, попарно, в виде цепочек или параллельно друг к другу, грамположительны, каталазоотрицательны. Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает на молочной среде размножение Cl. perfringens, означает титр этого микроорганизма в почве. Для чистой воды перфрингенс-титр составляет 0,01 и выше, для загрязненной - 0,009-0,0001, для сильно загрязненной - 0,0009 и ниже (Нетрусов, 2005).

1.2 Патогенные микроорганизмы рода Clostridium

1.2.1 Возбудитель ботулизма

Ботулизм вызывает Clostridium botulinum, это тяжелое пищевое бактериальное отравление с преимущественным поражением центральной нервной системы и высокой летальностью. Возбудитель болезни открыт в Голландии Э. ван Эрменгемом в 1896 г. Временной интервал между попаданием токсина в организм и появления первых признаков ботулизма, обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 часов и более. Ботулизм связан, главным образом, с продуктами домашнего приготовления, заготовленными впрок. Общепринятые в домашних условиях способы обработки пищевых продуктов, такие как консервирование в банках, копчение, маринование, соление, не приводят к уничтожению возбудителей ботулизма и их спор и при длительном хранении в этих продуктах может образоваться токсин.

Возбудители ботулизма широко распространены в природе, нормальные обитатели кишечника животных и человека, попадают в почву с фекалиями. Естественный резервуар-почва. Широкое распространение возбудителей ботулизма в почве ведет к попаданию этих микробов на овощи и фрукты, а также к обсеменению сырья, идущего для приготовления консервов, колбас и других продуктов.

Серологическая идентификация Cl.botulinum основана на выявлении экзотоксинов. В зависимости от антигенных свойств которых разделяют на 7 сероваров: А, В, С, D, E, F, G. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна: для бактерий типов А, В, С, D - 35°С, для типов Е и F - 28- 30°С. Патогенность Cl. botulinum для разных теплокровных различна. Заболевания у человека вызывают бактерии типов А, В, Е, F; бактерии типов С, D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана. Главные факторы патогенности Cl.botulinum - экзотоксины, оказывают нейротоксическое действие на организм, в организме возбудитель практически не размножается. Ботулинические токсины довольно устойчивы к температурным воздействиям. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10-15 минут и не разрушается в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Ботулинический токсин - самый сильный из всех биологических ядов.

Cl.botulinum типов А, В, С, D, E, F - очень близки по морфологии, культуральным свойствам и по действию их токсинов на организм человека и животных. Все они дают одинаковую клиническую картину болезни. Различные типы ботулинического микроба отличаются по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов, токсин каждого типа нейтрализуется сывороткой того же типа.

По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки 0,6-1,0 х 3,0-9,0 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры, палочки со спорой имеют вид теннисной ракетки, легко окрашиваются различными анилиновыми красками, молодые клетки грамположительны, при старении культуры (через 4-5 суток роста) палочки окрашиваются грамотрицательно, микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, капсул не образуют.

Возбудители ботулизма - строгие анаэробы, они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы, либо в герметически закрытых банках консервов. Возбудители ботулизма типа Е, а также непротеолитические штаммы типа В и некоторые штаммы типа F образуют на питательных средах и в пищевых продуктах кроме токсина и нетоксичный предшественник токсина - протоксин, который, не убивая мышей при парентеральном введении, проявляет свою биологическую активность при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных в результате воздействия на него протеолитических ферментов.

При добавлении протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) in vitro также происходит активация протоксина, который переходит в токсин. Этот феномен следует учитывать при проведении лабораторной диагностики ботулизма.

Нередко консервные банки, куда вместе с продуктами попадает и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако, часто при наличии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят совершенно доброкачественными и консервные банки не дают «бомбажа». Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла.

Критерии диагностики. Лабораторная диагностика ботулизма преследует цель обнаружения и идентификации ботулинического токсина и выделение возбудителя. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы) и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл, промывные воды желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. Кровь исследуют только на наличие токсина (для чего проводят биологическую пробу), испражнения только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал на наличие возбудителя и его токсина.

Морфология. Клостридии ботулизма -- крупные, полиморфные, с закругленными концами палочки; длина их 4--9 мкм, ширина 0,6--0,8 мкм. Образуют споры овальной формы, которые вместе с вегетативной клеткой напоминают теннисную ракетку. По Граму окрашиваются положительно, подвижные (перитрихи).

Культивирование. Возбудитель ботулизма -- строгий анаэроб. Лучше растет на нейтральной и слабощелочной среде. На среде Китта -- Тароцци вначале происходит помутнение бульона, затем, после оседания микробов на дно, наступает просветление. Клостридии ботулизма разжижают желатину, пептонизируют молоко. Культура ботулинуса во время роста приобретает запах прогорклого масла.

Токсинообразование. Клостридии ботулизма образуют токсин в кормах и продуктах. Он выдерживает кипячение в течение 10--15 мин. Пищеварительные ферменты (пепсин, трипсин) не разрушают токсины типов А, В, С, D, F и во много раз усиливают активность типа Е. Патогенность микроба обусловливается исключительно его токсинообразованием. Ботулинический токсин -- самый сильный из всех микробных ядов. Одного грамма токсина (по данным разных авторов) достаточно, чтобы уничтожить 20--60 млрд. мышей.

В таблице 2 показана токсичность ботулинического токсина в сравнении с другими ядами (данные А. В. Фомина, А. Ф. Коломиец, 1985).

Таблица 2

Токсичность ботулинического и некоторых других ядов для мыши

Вещество	Минимальная летальная доза, микромоль/кг
Ботулинический токсин	3,3-10 -17
Дифтерийный токсин	4,2-10 -12
Кураре	7,2-10 -7
Стрихнин	1,5- 10 -4

Патогенность. К ботулиническому токсину чувствительны животные всех видов. У лошадей наступает паралич глотательной и дыхательной мускулатуры, смертность достигает 100%. У крупного рогатого скота клиника аналогична. У кур наблюдается расслабление шейной мускулатуры и парез ног. Из лабораторных животных к токсину чувствительны морские свинки, белые мыши. Через 3--4 дня после заболевания они погибают. К ботулинической токсикоинфекции чувствителен и человек.

Смертельная доза токсина для человека составляет около 1 мкг (10^-6 г) Устойчивость. Благодаря образованию спор клостридии ботулизма устойчивы к неблагоприятным воздействиям среды. В высушенном состоянии сохраняют жизнеспособность десятилетиями. Хорошо переносят высокие температуры. К низким температурам также малочувствительны, сохраняют жизнеспособность при -- 190°С. Температуру -- 16°С выдерживают в течение года, но при оттаивании разрушаются и выделяют токсин.

Под действием 20%-ного формалина споры погибают через 24 ч, 10%-ного раствора соляной кислоты -- через час, этилового спирта -- через 2 мес.(С.244)

Микробиологический диагноз основан на обнаружении токсина в остатках корма (пищи) или в органах павшего животного. Фильтрат подозреваемого материала вводят подопытным животным и по их клинике определяют болезнь.

Иммунитет при ботулизме антитоксический. Человека лечат специфической противоботулинической сывороткой. Животным сыворотку вводят редко. Надежный метод профилактики болезни --иммунизация ботулиническнм анатоксином (Ассонов, 1989).

1.2.2 Clostridium perfringens

Clostridium perfringens - вид бактерий рода Clostridium - один из наиболее распространенных патогенных видов. По способности образовывать четыре главных токсина (?-, ?-, ?-, ?-) микроорганизмы разделяют на шесть сероваров: А, В, С, D, E и F. Cl. perfringens распространены повсеместно; бактерии выделяют из воды почвы, сточных вод. Они колонизируют кишечник животных и человека (выделяют у 25-35% здоровых лиц). Других природных резервуаров помимо пищеварительного тракта Cl. perfringens не имеют, почва и другие объекты внешней среды обсеменяются ими только фекальным путем. У человека Cl.perfringens вызывает два типа поражений - газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.

Вегетативные клетки Cl рerfringens представлены короткими крупными палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0х1х1,5 мкм). Отличительные особенности бактерий - строго положительная окраска по Граму и отсутствие подвижности. In vivo образуют капсулу. Бактерии хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными. Споры крупные овальные расположены центрально или субтерминально. Термоустойчивость спор сероваров В и D относительно невысока, погибают при кипячении в течение 15-30 мин, споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении в течение 1-6 часов. Cl.рerfringens типа А относительно толерантна к кратковременным кислородным воздействиям и способна расти в высоких столбиках сред, без герметизации вазелиновым маслом. На плотных средах бактерии образуют S-и R- колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями. Сначала они прозрачные, позднее становятся мутными серовато-белыми, R- колонии неправильной формы, бугристые с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты. На агаре с кровью обычно окружены зоной гемолиза. Характерное свойство колоний Cl.perfringens типа А, служащие дифференцирующим признаком, - способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в анаэробных условиях. На желточном агаре бактерии образуют колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата, образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы. Культуры Cl.рerfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. На средах содержащих глюкозу рост происходит очень бурно, с образованием Н₂ и СО₂ и заканчивается через 8-12 часов. Первые признаки роста на среде Китт-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 часа (особенно при 43°С) и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа. Бактерии ферментируют углеводы с образование кислоты и газа. От прочих Cl.рerfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая: расжижает желатину, не разлагает казеин, интенсивно створаживает молоко. Cl.рerfringens образует 12 токсинов (ферментов) и энтеротоксинов. Продуцентами энтеротоксина являются бактерии типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции.

Cl.perfringens, типов В, Д, Е вызывают тяжелые энтеротоксемии у мелкого и крупного скота, а также у птиц, можно предполагать их этиологическое значение при пищевых отравлениях у людей, в случае употребления в пищу мяса животных, обсемененных штаммами этих типов.

Cl.рerfringens типа А вызывает токсикоинфекции легкой и средней степени тяжести. Заболевание развивается остро, с болями в животе, рвотой и диареей (до 20 раз в сутки). Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч, летальные исходы наблюдаются редко. Установлено, что при пищевых токсикоинфекциях, вызываемых Cl.perfringens типа А, основную роль в патогенезе заболевания играет энтеротоксин, вырабатываемый in vivo спорулирующими клетками этих микроорганизмов, которые попадают в желудочно-кишечный тракт при интенсивном обсеменении пищевых продуктов (10⁵ и более в г/см³) указанными бактериями.

Cl.рerfringens типа С вызывает некротический энтерит. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента, в течение 18-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серовара А. Пищевые отравления чаще имеют место после употребления готовых мясных блюд, а также продуктов растительного происхождения, которые оказываются значительно обсемененными клетками Cl.perfringens типа А в результате нарушения правил приготовления и хранения пищи.

Критерии диагностики. При наличии клинических симптомов заболевания результаты бактериологического исследования подтверждают диагноз пищевого отравления, если получены следующие данные анализа: высокая обсемененность Cl.perfringens (более 10⁵ в г/см³) пищевых продуктов или 10⁶ в 1 г фекалий (ИНСТРУКЦИЯ 4.2.10-15-21-2006).

1.2.3 Возбудитель эмфизематозного карбункула

Эмфизематозный, или шумящий, карбункул (эмкар) вызывают Clostridium cnauvoel, это инфекционная остропротекающая неконтагиозная болезнь крупного рогатого скота в возрасте от 3 мес. до 4 лет. Иногда эмфизематозным карбункулом болеют овцы и козы. Болезнь характеризуется появлением в мышечной ткани газовых отеков, которые при надавливании крепитируют. Эмкар встречается почти во всех странах мира.

Морфология. Возбудитель имеет форму палочки с закругленными концами, ее длина 4--8 мкм, ширина 0,6--0,9 мкм (рис. 45). Клостридия Шово -- перитрих. Как в культуре, так и в патологическом материале образует споры, которые придают палочке форму веретена или лимона. Молодые культуры окрашиваются по Граму положительно, старые -- отрицательно.

Культивирование. Возбудитель эмфизематозного карбункула -- строгий анаэроб, растет при температуре 36-- 38°С. Культуру микроба выращивают на мясопептон-ном печеночном бульоне (МППБ). На среде Китта -- Тароцци вначале появляется муть, затем, после оседания спор на дно пробирки, наступает ее просветление. Под вазелиновым или парафиновым маслом образуются пузырьки газа. Культура приобретает запах прогорклого масла. На глюкозокровяном агаре колонии чаще образуют зону гемолиза и возвышение в центре, напоминающее перламутровую пуговицу. Разжижает желатину. Молоко свертывает медленно. Сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, галактозу, левулозу с образованием кислоты и газа.

Патогенность. Эмфизематозным карбункулом болеет рогатый скот. Возбудитель в организм попадает с кормом, чаще в летнее время, когда животные находятся на пастбище. Микроб из желудочно-кишечного тракта проникает в подкожную клетчатку и мышцы, где, размножаясь, образует углерода диоксид, водород и другие газы, что и обусловливает крепитацию.

Из лабораторных животных наиболее восприимчива морская свинка, она является хорошей биологической моделью' для воспроизведения болезни. Ее заражают патологическим материалом внутримышечно в области внутренней поверхности бедра. Смерть морской свинки наступает через 16--72 г. На месте инъекции мышцы темно-красного цвета, геморрагически инфильтрированы, иногда крепитируют (образование газа). Возбудитель образует токсины, которые могут вызвать гибель лабораторных и домашних животных.

Устойчивость. Споры микроба более устойчивы, чем вегетативные формы, при кипячении они сохраняются до 2 ч, при 110°С -- до 40 мин, в высушенном виде -- до 18 лет. Раствор сулемы (1:500) разрушает споры через 10 мин, 3%-ный раствор формалина -- через 15 мин.

Микробиологический диагноз ставят комплексно: на основании микроскопии, выращивания культуры возбудителя и биологической пробы. Для исследования направляют пораженные мышцы. Из них делают препараты, посевы на среду Китта -- Тароцци и готовят суспензию для заражения морской свинки. Выделение культуры возбудителя из материала от павшей морской свинки служит подтверждением правильности постановки диагноза.

Вакцинация. В настоящее время применяют концентрированную гидроокисьалюминиевую вакцину, которая была усовершенствована Ф. И. Коган и А. И. Колесовой в 1959 г. Крупному рогатому скоту и овцам вакцину вводят внутримышечно однократно в дозе 2 мл. Продолжительность иммунитета не менее 6 мес. Телятам, вакцинированным до 6-месячного возраста, вакцину вводят повторно. Против эмкара имеется сыворотка, но ее используют редко.

Лечение не всегда достигает своей цели, запаздывает, так как болезнь протекает остро. В отдельных случаях в общепринятых дозах применяют антибиотики: стрептомицин, дибиомицин, пенициллин.

1.2.4 Возбудитель столбняка

Столбняк вызывает Clostridium tetani, это раневая неконтагиоэная инфекция, известна со времен Гиппократа. Возбудитель болезни открыт в 1884 г. А. Николайераи, чистая культура получена в 1889 г. Ш. Китазато. Клиника болезни -- судороги, уплотнение мышц (жевательных, туловища), искривление шеи, хвоста -- следствие поражения нервной системы, образуемого микробом экзотоксином. Заражения животных и человека происходит при травмах и ранениях. Возбудитель в раны попадает из почвы, где и развивается. Токсин столбняка -- один из сильных микробных ядов.

Морфология. Возбудитель столбняка -- тонкая, подвижная (перитрих) палочка, длина ее 4--8 мкм, ширина -- 0,4--0,6 мкм. Образует округлые споры, которые располагаются на конце клетки, придавая ей вид барабанной палочки. Ранее такие бациллы называли плектридиями.

Культивирование. Бациллы столбняка -- строгие анаэробы. На среде Китта -- Тароцци возбудитель растет медленно, образует газ с неприятным запахом. После оседания микробных клеток на дно пробирки среда просветляется. На агаре столбиком или желатине растет, по уколу елочкой, причем верхушка не достигает поверхности среды. Оптимальная температура роста 35--37°С.

Устойчивость. Вегетативные формы возбудителя столбняка погибают при температуре 60--70°С в течение 30 мин. Споры выдерживают нагревание до 80°С в течение 6 ч, в кипящей воде сохраняются до 40--50 мин, в высушенном состоянии -- до 11 лет. При действии раствора сулемы (1:100) или 5%-ного раствора фенола споры погибают лишь через 10--12 ч.

Микробиологический диагноз на столбняк обычно не проводят, так как клиника болезни очень характерна. При необходимости из места ранения готовят мазки, делают посев на среду Китта -- Тароцци, а также заражают белую мышь. Симптомы столбняка у белой мыши развиваются на 2--3-й день.

Активная иммунизация против столбняка. Иммунитет у животных и человека против столбняка (его токсина) создается путем введения анатоксина. Его готовят из нативного столбнячного токсина, в который добавляют 0,3--0,5% формалина, алюмокалиевые квасцы, фенол и выдерживают при 37°С в течение 2--3 недель.

Квасцовый (депонированный) анатоксин создает иммунитет продолжительностью от 3 до 6 лет. Его вводят крупным животным в дозе 1 мл, молодняку и мелким животным -- 0,5 мл. Противостолбнячную сыворотку применяют в неотложных случаях. Действие ее наступает быстро и бывает эффективным (Ассонов, 1989).

1.3 Значение микроорганизмов рода Clostridium в промышленности

Роль микроорганизмов в микробиологической, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве и других областях трудно переоценить. Особенно важно отметить то, что многие микроорганизмы для производства ценных продуктов используют отходы промышленного производства, нефтепродукты и тем самым производят их разрушение, предохраняя окружающую среду от загрязнения.

1.3.1 Возбудители порчи баночных консервов

Общими для всех видов консервов являются такие дефекты, как бомбаж, плоское скисание, а также дефекты тары: ржавчина, деформация корпуса, донышек, фальцов и продольного шва жестяных банок в виде острых граней, называемых "птичками", деформация и перекос крышек стеклянных банок, трещины и скол стекла, пробоины, подтеки, хлопуши. К бомбажным консервам в отличие от хлопуш, банок с вибрирующими концами относятся постоянно вздутые банки, не меняющие своего положения при нажиме на нее пальцами руки.

Бомбаж - это вздутие банок со стороны дна и крышки. В зависимости от происхождения бомбаж бывает микробиологический, химический и физический (ложный) (Ассонов, 1989).

Микробиологический бомбаж - вздутие банок газами (аммиак, сероводород), образовавшимися в результате развития термоустойчивых микроорганизмов. В процессе их жизнедеятельности образуются газы, вызывающие вздутие банки и даже нарушение герметичности, и токсины, опасные для здоровья потребителя. Бомбаж является результатом недостаточно эффективного режима стерилизации, неудовлетворительного санитарного состояния технологического оборудования, использование сильно обсемененного микроорганизмами сырья, тары, нарушение герметичности банок.

К строгим гнилостным бактериям относятся в основном почвенные клостридии: путрификус (Clostridiuum putrificum) и спорогенес (Clostridiuum sporogenes). Оба вида клостридий известны как возбудители порчи баночных консервов - мясных, рыбных.

Гнилостные микроорганизмы играют большую роль в круговороте веществ в природе, разлагая белковые вещества попадающих в почву трупов животных и растительных остатков. Минерализуя белковые вещества с образованием аммиака, они обогащают тем самым почву нужными для растений формами азота. Однако под влиянием тех же гнилостных микроорганизмов может происходить порча мяса и мясопродуктов, рыбы и рыбопродуктов, яиц, молока и других богатых белками продуктов. Одним из показателей порчи служит наличие в них продуктов распада белка (повышенное содержание аминов, NH3, H2S, жирных кислот).

Банки с микробиологическим бомбажом подлежат уничтожению или технической утилизации. Характерными признаками бомбажа, вызванного бактериями Clostridium botulinum, является образование в консервах большого количества газов, при этом может нарушаться герметичность банок, изменяться внешний вид продукта, появляться муть. Образующиеся токсины разрушаются только при кипячении более 10 мин. Токсины ботулинуса вызывают отравление, часто со смертельным исходом (до p5 %).

Порча плодоовощных консервов вызывается и другими термофильными бактериями, например Cl. soroqenes, Cl. jrasterianum, которые также выделяют много газа, но токсинов не образуют. Испорченные консервы приобретают запах прогорклого масла. Последние являются кислотоустойчивыми и могут вызывать порчу томатного сока и консервированных томатов.

Предупреждение порчи консервов указанными бактериями возможно путем соблюдения санитарно-гигиенического режима при производстве, а также подкислением консервов лимонной кислотой.

"Плоское скисание" вызывается термоустойчивыми бактериями, которые обусловливают микробиологическую порчу (брожение) продукта без газообразования и вздутия банок. Дефект можно обнаружить лишь после вскрытия банки. При этом наблюдается помутнение продукта, появление неприятных кислого запаха и вкуса, размягчение консистенции. Причинами порчи является медленное охлаждение после стерилизации, укладка в плотные штабели неохлаждаемых консервов, повышенные температуры транспортирования и хранения.

Микробиологическая порча консервов может также проявляться в виде плесневения, прогоркания, ослизнения продукта, выпадения осадка, коагуляции содержимого и других изменений продукта.

Консервы с химическим бомбажом, в которых обнаруживаются соли олова, железа, алюминия, придающие мясу металлический привкус и вызывающие изменение цвета продукта, органолептически определяют по наличию шероховатости на внутренней поверхности банки; они подлежат использованию по указанию саннадзора. Химический бомбаж отмечается в банках, имеющих внешнюю или внутреннюю коррозию. Отсутствие в этих местах защитных покрытий, контакт металла банок с продуктом приводят к взаимодействию кислот и металлов, выделению водорода. В продукте при этом накапливаются тяжелые металлы (олова и железа в банках из белой жести, хрома и железа -- из хромированной жести, алюминия -- из сплавов алюминия).

Физический бомбаж консервов является следствием вздутия банок в результате замораживания их содержимого, деформации корпуса или переполнения банок; такие консервы подлежат реализации по указанию саннадзора.

Физический бомбаж вызывается расширением продукта при замораживании, переполнении тары. В отличие от консервов с микробиологическим и химическим бомбажом, которые относятся к критическим дефектам и не разрешаются для реализации, консервы с физическим бомбажом реализуются с разрешения органов здравоохранения после соответствующей проверки.

Банки хлопуши и с вибрирующими концами относят к физическому, браку консервов. Хлопуши -- это консервы с постоянно вздувшимися концами, приобретающими нормальное положение при нажиме, за счет чего вздувается противоположный конец (крышка) и раздается характерный щелкающий звук. Банки с вибрирующими концами приобретают вздутие на противоположном конце лишь при нажиме на них. После снятия нажима банки возвращаются в исходное положение, а вздутие исчезает.

Кроме общих дефектов, консервы могут иметь и специфические, характерные только для отдельных групп или видов. К ним относят потемнение консервов вследствие меланоидинообразования, изменение цвета при взаимодействии фенольных соединений с металлами, сульфидных групп белков с металлами (мраморность тары у зеленого горошка), помутнение сиропа, заливки у натуральных консервов, компотов и маринадов за счет размягчения сырья и перехода твердых частиц в жидкую фракцию консервов (Рогачева,1953).

1.3.2 Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium

Ацетон и бутанол - единственные важные химические вещества, которые в больших количествах получают путем бактериального брожения.

Ацетоно-бутиловое брожение вызывают бактерии рода Сlostridium, а именно Сlostridium acetobutylicum и другие виды. Бутанол-изопропаноловое брожение вызывает Сl. butulicum, а масляно-уксуснокислое брожение - Сl. buturicum.

Продуценты. Почти все виды рода Сlostridium осуществляют ацетоно-бутанол-этанольную ферментацию. Но для получения растворителей используют два вида - это Сl. acetobutulicum McCoy et. al. и Сl. beijerinckii Donker. Недавно обнаружены новые виды, полезные для получения ацетона и бутанола: Сl. aurantibutyricum и Сl. tetanomorphum (группа Накамуры, Япония). Штамм Сl. tetanomorphum образует бутанол как главный продукт брожение при небольшом количестве этанола, уксусной и масляной кислоты, но не ацетона.

Споры клостридий широко распространены в почве. Большое число штаммов (240) выделено из жидкости рубца. Бактерии ферментируют глюкозу, целлобиозу, крахмал. Известны три штамма с целлюлазной активностью.

Сl. acetobutylicum - спорообразующий, облигатный анаэроб, имеет форму сигареты, размеры клеток 0,6 - 0,9 X 2,4 - 4,7 мкм. Грамположительные клетки, подвижные за счет перитрихиального жгутикования, делятся поперечной перегородкой, образуя цепочки. Хотя споры не образуют растворители, наиболее сильные спорообразователи синтезируют наибольшее количество растворителей. Сl. acetobutylicum при высеве на плотную среду образуют колонии 4 типов: I - с темным центром и свелым краем, после нескольких пассажей на богатой среде появляются колонии типа II - с коричневым центром и узкой зоной периферического роста, типа III - с коричневым центром без светлого края и типа IV - светло-коричневые без периферического роста. Способность к образованию растворителей снижается в ряду I > II > III. Колонии IV типа практически не образуют растворителей. Из колоний типа II и III реверсий к типу I не обнаруживается.

Оптимальная температура для роста 37°С, рН 6,5. Сl. acetobutylicum сбраживает крахмал, гексозы или пентозы с превращением их примерно на 30% в смесь растворителей, а остальное составляют газы Н₂ и СО₂ в соотношении 40 : 60. Смесь растворителей состоит из н-бутанола (60%), ацетона (30%) и около 5-10% приходится на этанол. Сl. beijerinckii сбраживает глюкозу и крахмал с образованием главным образом н-бутанола и в меньших количествах изопропанола и этанола. Необычный вариант Сl. saccharo-butyl-liquefaciens плохо сбраживает мелассы, но дает прекрасный выход продуктов в крахмальной среде и высокое образование бутанола; соотношение ацетон : бутанол : этанол равно 19 : 78 : 3. У Сl. toanum при росте в сахарной среде с добавлением обезжиренных рисовых отрубей выход растворителей составляет ~ 30%, а их соотношение как 52,9 (бутанол) : 42,5 (изопропанол) : 3,2 (этанол) : 1,4 (ацетон). Для производства бутанола в промышленности используют Сl. acetobutylicum. При росте, в фазе образования кислот и бутанола, одновременно из глюкозы и реассимилированного бутирата Сl. acetobutylicum образует внеклеточный полимер, который может реутилизироваться культурой как резервный источник углерода. Предположительно полимер представлен ацетилированным полисахаридом.

Обнаружено, что промышленный штамм в конце экспоненциальной фазы роста выделяет вещество аутобактериомицин, обладающий антибиотическим действием по отношению к продуценту, а также к четырем штаммам сем. Baciallaceae. Бактериологический эффект аутобактериомицина возрастает с возрастом клеток и концентрации бутанола. Это аутолизин. Аутобактериомицин оказывает влияние на концентрацию биомассы и образование растворителей. Причем установлено, что если аутолизин прикреплен к клеточной стенке, то он играет положительную роль для роста. Если он освобождается и выделяется в среду в конце экспоненциальной фазы, то он вызывает лизис клеток. Освобождение аутолизина происходит в связи с отсутствием дивалентных катионов в среде. Если в среду добавить Mg²⁺, то увеличивается устойчивость культуры к бутанолу. Тот же результат получают с помощью ультрафильтрации, которая позволяет термально денатурировать аутолизин в течение всей ферментации.

Ингибирование синтеза бутанола аутолизином служит первостепенным ограничением типичной ацетоно-бутаноловой ферментации. Поэтому ведутся исследования по получению Lyt-- штаммов, и один такой «без аутолизиновый» штамм получен.

Методом химического мутаногенеза нитрозогуанидином в присутствии бутанола получен мутант Сl. acetobutulicum штамм 77. У мутанта более высокая удельная скорость, в два раза больше накопление биомассы по сравнению с исходным типом. В процессе ферментации дикий штамм потребляет 65г глюкозы, образуя при этом 20 г·л ^-1 растворителей в течении 53 ч. Рост мутантного штамма менее подвержен ингибирующему действию бутанола.

Получение растворителей в промышленности. Для приготовления инокулята есть разные способы. Например, проводят тепловой шок, а затем последовательные пересевы для уничтожения вегетативных клеток, слабых спор, а также для индукции прорастания спор. Нагревание осуществляют по-разному: 100°С - 50 с, 100°С - 2 мин, 95°С - 30 мин, 80°С - 5 мин, 75°С - 2 мин и 70°С - 90 с. Считают, что увеличение времени теплового шока при каждом субкультивировании способствует отбору самых «сильных» спор и, возможно, самых активных бродильщиков. На производстве культура бактерий хранится в виде спор. Инокулят вносится в ничтожном количестве 1 : 3000, но его специальная подготовка имеет решающие значение для процесса. Замечено, что лучшими продуцентами нейтральных продуктов служат культуры, споры которых выдерживают наиболее высокую температуру. Считают, что клетки инокулята должны быть подвижными. С сильно подвижными клетками получают больше растворителей. Важно также последовательные манипуляции делать во время максимальной подвижности клеток и минимального значения рН. Если в качестве посевного материала используют клетки в стадии максимальной подвижности, то выход бутанола увеличивается 2,5 - 3 раза. Первую, вторую и третью генерации проводят в лаборатории. Для Сl. acetobutulicum первая генерация проводится в среде, приготовленной на 5% сухих злаков и без питательных добавок, при температуре 37°С в течении 24 ч. Содержимое пролбирки вносят в 300 мл мелассной или крахмальной среды с питательными добавками, налитой в колбу на 500 мл и инкубируют в течении 24 ч. Далее содержимое колбы вносят в 4-литровую колбу, содержащую 2900 мл той же среды. Одна из таких колб с культурой служит инокулятом для первого сосуда на заводе. Через колбы интенсивно продувают инертный газ и рН снижается до 3,9-4,5. Когда посевной материал переносят из колбы, количество углеводов должно быть наполовину потреблено.