Показано локалізацію рецепторів багатьох цитокінів в межах ЦНС або в первинних культурах клітин або лініях клітин, отриманих з мозкової тканини. Вони включають рецептори IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, інтерферонів, TNF, CSF, факторів росту і нейротофінів (таблиця 1).

IL-1, пептид, 17 kDa, є одним із основних прозапальних цитокінів, секреція якого значно посилюється при розвитку запальних процесів. Дослідження локалізації рецепторів IL-1 в мозку показали досить широке розповсюдження цих рецепторів. Високі рівні міченого радіоізотопом йоду I¹²⁵ IL-1beta були знайдені в судинному сплетенні, борознах, гіпокампі, мозочку і нюховій цибулині мозку щурів.

Таблиця 1. Цитокіни та їх рецептори у головному мозку

Також повідомлялося про специфічне зв'язування міченого радіоізотопом IL-1beta з тканинами гіпоталамуса щурів. Подальші дослідження підтвердили існування рецепторів IL-1 в ЦНС гризунів і була виявлена мРНК IL-1r1 і зв'язування IL-1 з нейронами, астроцитами, цереброваскулярним ендотелієм, клітинами нейробластоми і клітинами гліобластоми, але не мікроглії. Проте, локалізація в мозку щурів дещо відрізняється від особливостей розподілу рецепторів IL-1 в гіпоталамусі мишей.

Рис.5. Модель молекули IL-1 (зліва) та його комплексу з рецептором (справа).

В цілому, мозок миші має дуже низьку питому щільність рецепторів IL-1 як було оцінено по зв'язуванню міченого IL-1alpha, IL-1beta з IL-1ra. Однак, дуже високі рівні рецепторів IL-1 були знайдені в гіпокампі (зубчаста фасція), судинному сплетенні і мозковій оболонці. В межах зубчастої фасції, зв'язування IL-1 відбувається в основному з нейронами. Цікаво, що жодне з сучасних досліджень не повідомляє про істотне зв'язування IL-1 в гіпоталамусі. Гістохімічні дослідження мозку миші показали, що мРНК IL-1r1 експресується в зубчастій фасції, судинному сплетенні і в ендотеліальних клітинах, але не в гіпоталамусі.

Як і у мишей, у щурів, судинне сплетіння, але не гіпоталамус, демонструє істотне зв'язування IL-1. Однак, на відміну від зв'язування IL-1 в гіпокампі мишей, гіпокамп щурів не демонструє зв'язування з IL-1alpha, IL-1beta або IL-1ra. мРНК IL-1r1 в мозку щура в значній мірі обмежена не-нейронними клітинами, епендимними клітинами, які вистилають шлуночки мозку і спинномозкові канал, клітинами судинного сплетення, лептоменінкса і специфічними ендотеліальними/периваскулярними клітинами, які є головними ділянками експресії рецепторів IL-1. Кілька груп нейронів в мозку щура, проте, демонструють низькі рівні мРНК IL-1r1: базолатеральне ядро мигдалеподібного тіла, дугоподібне ядро гіпоталамуса, трійчасті і гіпоглоссальне моторні ядра і саме заднє поле (area postrema).

Методом RT-PCR виявилено транскрипти IL-1r1 і IL-1r2 в цілому мозку миші але показали, що лінія клітин нейробластоми C1300 експресує тільки мРНК IL-1r1, тобто IL-1r1 переважає в мозку. LPS або IL-1beta збільшують експресію мРНК IL - 1r1 і IL-1r2.

IL-6 (22-27 kDa) є другим за прозапальною активністю цитокіном. Проте в залежності від взаємодії з іншими цитокінами може діяти як протизапальний. Cпецифічні ділянки зв'язування з IL-6 були виявлені у астроцитоми та гліобластоми, а також в екстрактах бичачого гіпоталамуса. мРНК, що кодує субодиницю рецептора IL-6 (IL-6R alpha) також була виявлена у нейронах, мікроглії і астроцитах в нормальній мозкової тканині, первинних культурах клітин або пухлинних ліній клітин. мРНК IL-6Ralpha експресується в кількох областях мозку у щурів і найбільш широко представлена в регіонах CA1 і CA4 гіпокампа і в клітинах зубчастої фасції, а також була виявлена в гіпоталамусі, мозочку, гіпокампі, смугастому тілі і неокортексі. Специфічні сигнали гібридизації спостерігаються у гліальних клітинах латерального нюхового тракту, у епендимних клітинах нюхового і переднього латерального шлуночка і у нейронів піріформної кори.

Рис.6. Модель молекули IL-6 (зліва) та його комплекс з рецептором (справа).

Введення LPS помітно збільшує рівні мРНК IL-6Ralpha в декількох регіонах мозку щура (area postrema, ядро одиночного шляху (nucleus tractus solitarius), мигдалеподібне тіло, кора мозку, гіпокамп, піріформна кора, PVN, SFO і OVLT). Крім того LPS (інтраперитонеально) або IL-1beta (внутрішньовенно), стимулюють експресію мРНК IL-6Ralpha поблизу кровоносних судин в усьому мозку.

Крім IL-6Ralpha, сигнальна субодиниця IL-6R, білок gp130, також була виявлена в ЦНС щурів, зокрема у клітинах глії, нейронах, олігодендроцитах і епендимоцитах. Розподіл імунореактивності gp130 в мозку щура накладається на розподіл IL-6Ralpha, але є більш широким, що сумісно з його роллю по трансдукції сигналів для інших цитокінів сімейства IL-6. Дійсно, мРНК gp130 була виявлена у всьому мозку щура.

Ще одним прозапальним цитокіном, який відіграє важливу роль як при формуванні запального процесу так і в багатьох патологіях, є фактор некрозу пухлин (TNF, 17 kDa). В даний час є дуже мало даних щодо розподілу або фізіологічної ролі його рецепторів в межах ЦНС. Вивчення зв'язування радіоактивно міченого ліганда TNF-alpha з різними регіонами мозку миші продемонструвало слабке зв'язування по всій поверхні мозкової тканини. Дослідження гомогенату тканини показало специфічне зв'язування в стовбурі мозку миші, корі, таламусі, базальних гангліях і мозочку. Дослідження in vitro показали, що мРНК TNF-R1 і TNF-R2 експресуються в цереброваскулярному ендотелії мишей, а також мікроглією людини (астроцити і олігодендроцити).

Рис.6. Модель молекули TNF alpha (зліва) та його комплексу з рецептором (справа).

Недиференційовані та диференційовані клональні клітини нейробластоми (лінія N1E) експресують мРНК TNF-R1, але не мРНК TNF-R2. TNF-R1 також був виявлений у нейронах чорної речовини (substantia nigra) гіпокампу і смугастого тіла у людей. Однак, немає ніяких даних про локалізацію будь-якого типу рецепторів TNF-alpha в гіпоталамічній області, безпосередньо залученій в регулюванні секреторної активності гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової (ГГА) осі [7,8].

2.2 Експресія цитокінів у головному мозку

2.2.1 Базальна експресія

Багато цитокінів синтезуються в межах мозку (див. таблицю 1), хоча в більшості випадків їх експресія у здорових, не підданих стресу людей, низька. Тим не менше, багато досліджень повідомило про розподіл імунореактивності IL-1, IL-6 і TNF-alpha або їх мРНК в мозку нормальних нелікованих індивідуумів. У мозку людини, IL-1beta був знайдений в межах нейронних елементів гіпоталамуса, включаючи перивентрикулярні регіони. Цей розподіл пояснюється роллю IL-1beta як нейрорегулятора гостро-фазової відповіді і, зокрема, ГГА осі. Дослідження також виявили IL-1beta у нейронах щурів в подібних регіонах гіпоталамуса, та в гіпокампі. Біологічна активність IL-1 в мозку щура виявлена ??в стовбурі мозку, корі, проміжному мозку і гіпокампі. Проте, більшість досліджень виявили, що паренхіма мозку в нормі демонструє дуже слабку експресію мРНК IL-1beta. Аналогічно, більшість досліджень, що використовують нозерн-блот або RT-PCR, виявили надзвичайно низькі або не рівні IL-1beta або мРНК IL-1beta в мозку щурів або мишей.

мРНК гена ICE, що кодує фермент, відповідальний за частковий протеаліз Pro-IL-1beta до зрілого, активного IL-1beta, була виявлена в мікроглії мишей, гомогенатах гіпоталамуса і гіпокампу і кровоносних судинах (артеріоли і венули) в мозковій паренхімі. мРНК IL-1beta також була виявлена в мозку щурів, особливо в гіпоталамусі, гіпокампі, мозочку, судинному сплетенні і кровоносних судинах у всьому мозку.

Імуногістохімічно TNF-alpha був виявлений в гіпоталамусі і вентральній поверхні мозку у інтактних здорових мишей. На підставі морфологічних спостережень, найбільш сильне фарбування спостерігається у нейронів в двох основних регіонах: перивентрикулярному, в шлуночковій системі та регіоні, пов'язаному із середнім пучком переднього мозку. В межах гіпоталамуса, в PVN найбільш сильно забарвлені групи клітин знаходяться в опорному ядрі термінального тяжа.

Нарешті, мРНК IL-6 не була виявлена або була локалізована в невеликих кількостях разом з мРНК IL-6Ralpha в декількох регіонах мозку щура, включаючи гіпоталамус, мозочок, гіпокамп, смугасте тіло і неокортекс [9].

2.2.2 Індукована експресія цитокінів

Експресія безлічі цитокінів в межах ЦНС значно збільшується у відповідь на пошкодження клітин. Відповідно, місцеві концентрації IL-1beta, IL-6 і TNF-alpha збільшені протягом бактеріальних або вірусних інфекцій ЦНС, травми мозку, ішемії і конвульсій, нейродегенеративних процесах, інсульті. Так, їх експресія збільшена при безлічі хронічних хвороб ЦНС, таких як розсіяний склероз, синдром Дауна і хвороба Альцгеймер. Як правило, коли демонструється індукція синтезу цитокіну в межах мозку, клітини мікроглії є основним типом клітин, який синтезує інтерлейкіни, хемокіни, TNF та IFN, хоча клітини судин, астроцити і нейрони також вносять вклад у продукцію цитокінів.

Особливе значення для взаємодій між імунною і нервовою системою має гіпотеза, що синтез цитокінів в мозку може бути індукований стимулами, іншими ніж ті, що прямо впливають на ЦНС, і, отже, цитокіни можуть діяти як нейрорегулятори в межах мозку способом, схожим до класичних нейропептидів. Дійсно, у відповідь на периферичне введення LPS, експресія безлічі цитокінів в ЦНС збільшується (див. таблицю 1). У відповідь на великі дози LPS (0.4-4 мг/кг інтраперитонеально або внутрішньовенно), рівні мРНК, що кодує IL-1alpha, IL-1beta, IL-1ra, IL-6 і TNF-alpha збільшені в гомогенатах декількох регіонів мозку мишей при оцінці за допомогою RT-PCR і нозерн-блот. Це збільшення відбувалося в межах 1: 10 з піком приблизно через 6 годин після введення. Проте, важливою проблемою, пов'язаною з індукцією цитокінів у мозку, є питання, чи дійсно стимул, що викликає збільшення синтезу цитокінів, має периферичне походження, чи можуть великі дози LPS проникати через гематоенцефалічний бар'єр в достатній кількості, щоб безпосередньо стимулювати синтез цитокінів.

Дійсно, LPS - потужний стимулятор синтезу IL-1, IL-6 і TNF-alpha, потужний піроген поліклональний активатор для імунокомпетентних клітин. Після інтрацеребровентрикулярного введення він стимулює синтез цитокінів гліальними клітинами мозку. Крім того, великі дози LPS можуть руйнувати гематоенцефалічний бар'єр, таким чином дозволяючи проникнення периферичних клітин (наприклад, макрофагів), які можуть вносити вклад в синтез цитокінів. Більшість досліджень RT-PCR було виконано з використанням високих доз, і факт, що вони повністю не вирішили проблему можливого руйнування гематоенцефалічного бар'єру і контамінації зразків клітинами крові, не дозволяє зробити остаточний висновок про характер індукції синтезу цитокінів у головному мозку при системній стимуляції антигенами, зокрема LPS. Однак у деяких дослідженнях використовували напівкількісну RT-PCR, щоб виміряти продукцію цитокінів після введення LPS мишам в дозуванні 20 мg/kg інтраперитонеально, яка, як повідомлялося раніше, не впливає на цілісність гематоенцефалічного бар'єру. Важливо, що в цих роботах також кількісно визначили можливу контамінацію клітинами периферичної крові. Ці дослідження показали суттєву індукцію мРНК IL-1beta, IL-6, TNF-alpha і IFN-gamma в декількох регіонах мозку (кора, мозочок, таламус, смугасте тіло, гіпокамп, совбур мозку і гіпоталамус), з піком збільшення секреції через 2 - 4 години після введення LPS. Оскільки автори зробили висновок, що це збільшення не могло бути пояснено контамінацією клітинами периферичної крові, ясно, що ці цитокіни були індуковані в мозку дозами LPS, які не руйнують гематоенцефалічний бар'єр, а отже впливають на зміну секреції цитокінів у головному мозку по одному із механізмів, що були описані у розділі 1.

Безліч іммуноцітохімічних досліджень вивчали розподіл мРНК IL-1beta або IL-1beta після системного (внутрішньовенного або інтраперитонеального) введення LPS у щурів і кроликів і отримали подібні результати. Експрессія IL-beta після внутрішньовенного або інтраперитонеального введення LPS спостерігалася в навколошлуночковому органі (circumventricular - CVO) включаючи епіфіз, медіальне підвищення, субфорнікальний орган, субкоміссуральний орган, термінальну пластинку, невральну частина гіпофіза, а також у мозковій оболонці і судинному сплетенні. Клітини, що демонструють експресію IL-1beta в цих регіонах, включають макрофаги, мікроглію і периваскулярні клітини. Також спостерігається суттєва індукція IL-1beta в мікроглії у всьому мозку, але така тенденція була показана тільки при великих дозах LPS (> 2.5 мг/кг проти <1 мг/кг для CVO). Крім того, індукція IL-1beta в CVO відбувається швидше (1-2 години) ніж у мозковій паренхімі (пік через 6-8 годин). Інтраперитонеальне введення LPS збільшує концентрацію IL-1beta в межах гіпоталамуса щурів. Мінімальна доза LPS, необхідна для істотного збільшення концентрації гіпоталамічного IL-1beta, становила 0.15 - 1 мг/кг інтраперитонеально і збільшення концентрації було виявлено вже через 1 годину після введення LPS, з піком через 4-10 годин.

Топографічна, тимчасова і клітинна індукція мРНК TNF-alpha при введенні LPS у мишей, подібна, але не ідентична, описаному для IL-1beta. Спочатку (1.5 години), сигнали гібридизації найбільш поширені у периваскулярних і нейронних елементах навколошлуночкового органу і в мозковій паренхіми. Збільшення експресії в межах мозкової паренхіми не спостерігалося через 6 годин після введення LPS, з індукцією мРНК TNF-alpha в гіпоталамусі тільки на 9-18 годин після введення LPS. Збільшення концентрації TNF-alpha у щурів були виявлені вже через 0.5 години лише після введення величезної дози LPS (30 мг/кг внутрішньовенно) та істотне збільшення концентрації біоактивного TNF-alpha і IL-6 в передньому гіпоталамусі також були виявлені в межах 1-3 годин після введния LPS (20-50 мg/kg інтраперитонеально) у щурів або морських свинок.

Подібно до IL-1 і TNF-alpha, експресія мРНК IL-6 індукується в CVO і судинному сплетенні через 3-6 годин після інтраперитонеального введення LPS

Ефект дискретного, локального запалення на периферії на експресію цитокінів у мозку вивчений набагато менше. Так, наприклад, збільшення в мозку експресії мРНК IL-1beta, TNF-alpha або IL-6 при використанні RT-PCR не були виявлені при моделюванні локалізованого запального процесу (внутрішньом'язового введення скипидару).

Недавні дослідження показали, що синтез цитокінів у мозку також може бути індукований стрессорами, не пов'язаними з інфекцією або запаленням. Експресія мРНК IL-1beta в гіпоталамусі, мРНК IL-1ra і біоактивність IL-1 збільшувалися в межах 30 хвилин після іммобілізаційного стресу у щурів, а експресія мРНК IL-6 в середньому мозку зростала протягом 4-24 годин після стресу обмеження свободи. Подібні стресори спричинюють посилення експресії мРНК IFN-gamma, що було виявлено при дослідженні гомогенатів мозку мишей. Гострий або повторний іммобілізаційний стрес у щурів посилює експресію мРНК нейтрофінів в паравентрикулярному і латеральному гіпоталамусі, але зменшує їх експресію в гіпокампі [8, 9].

3. Стимуляція ГГА системи як доказ прямого впливу цитокінів на ЦНС