Применение полимерных микросфер для изучения кровеносного русла органов

Zlhiag et at. [59] получили микросферы, окрашенные двумя красителями. Эти микросферы состояли из флуоресцентного сферического диска и флуоресцентного кольца. Однако их микросферы, используемые для калибровки цитометров, не могли применяться для комплексного анализа, так как метод не давал возможность варьировать интенсивности красителя.

1.8 Устойчивость суспензий полимерных микросфер как дисперсных систем

Наиболее общее и важное свойство суспензий - их устойчивость. Вопрос о стабильности дисперсных систем широко обсуждается в литературе, однако и в настоящее время эта проблема далека от окончательного решения и является дискуссионной.

Полимерные суспензии, как и эмульсии, представляют собой неустойчивые системы [60, 61]. Наличие развитой поверхности раздела обеспечивает значительный избыток энергии Гиббса, которая всегда положительна. Все самопроизвольные процессы в таких системах протекают в одном направлении и приводят к сокращению межфазной поверхности раздела, т. е. к коагуляции частиц и, в конечном счёте,-- к коалесценции, т.е. разделению системы на две фазы, с минимальной поверхностью раздела. Однако, практически полимерные суспензии довольно стабильны, что обусловлено наличием потенциального энергетического барьера, препятствующего слиянию глобул. Как и в эмульсиях, различают две составляющие этого барьера -- электростатическое взаимодействие заряженных коллоидных частиц и создание вокруг них структурно -- механического барьера, реологические свойства которого препятствуют сближению и, соответственно, слиянию частиц.

Агрегативная устойчивость полимерных суспензий, то есть способность сохранять во времени первоначальный размер частиц, является, основным показателем качества этих суспензий [62]. Агрегативная устойчивость полимерных суспензий обусловлена наличием на поверхности частиц межфазного адсорбционного слоя поверхностно-активных веществ, создающих защитный потенциальный барьер, препятствующий наступлению коагуляции. От состояния и свойств этого слоя зависят условия взаимодействия полимерных частиц друг с другом.

Элементарный акт коагуляции, т. е. соединение частиц при столкновении, возможен в том случае, когда этот барьер либо снят тем или иным способом, либо преодолен вследствие, например, быстрого сближения частиц, обладающих достаточным уровнем кинетической энергии.

Коагуляцию полимерных суспензий можно вызвать различными способами (введением электролитов, механическим перемешиванием, замораживанием), но во всех случаях она связана со снятием или преодолением защитного барьера. В этом смысле можно говорить о единой физической природе агрегативной устойчивости полимерных суспензий.

Имеющиеся литературные данные [63-65] показывают, что устойчивость полимерных суспензий определяется совместным действием нескольких различных факторов, обусловливающих в своей совокупности единство стабилизующего действия создаваемого ими потенциального барьера.

В качестве главного фактора, ответственного за стабильность коллоидных частиц, многие авторы выдвигают силы электростатического отталкивания, противостоящие вандерваальсовым силам притяжения, т. е. привлекают количественную теорию устойчивости дисперсных систем, сформулированную Дерягиным, Ландау, Фервеем и Овербеком (ДЛФО) [66-68].

При контакте раствора электролита с твердой фазой (в случае стабилизации латексов ионогенными эмульгаторами) между фазами возникает разность потенциалов; поверхность приобретает заряд, а в растворе у поверхности образуется слой раствора, обогащенный ионами противоположного знака, - возникает двойной электрический слой. Такое пространственное разделение заряда обуславливает ряд характерных свойств дисперсных систем, в частности возникновение в них электрокинетических явлений.

Теория электрокинетических явлений связывает их интенсивность -- скорость взаимного смещения фаз или величину возникновения токов и потенциалов -- с так называемым электрокинетическим, или дзета (о) -- потенциалом, который определяется как потенциал некоторой границы скольжения, отделяющий связанный с поверхностью силами адгезии слой дисперсионной среды от её остального, свободного объёма. В большинстве случаев о--потенциал рассматривается как критерий устойчивости частиц. Роль электростатической составляющей расклинивающего давления в устойчивости дисперсных систем, в том числе и латексов, подробно рассмотрена в монографиях [61,69].

Однако теория ДЛФО не учитывает стерические препятствия при сближении частиц, окружённых адсорбционно-гидратными слоями. Авторы этой теории не принимают во внимание то обстоятельство, что коагуляция полимерной суспензии протекает через стадию образования агрегатов, внутри которых взаимодействуют не пары, а большее число частиц. Наконец, теория ДЛФО рассматривает устойчивость коллоидных систем лишь по отношению к электролитам.

В теории ДЛФО не учитывается также структура межфазных адсорбционных слоев на поверхности частиц. Величина этого слоя может быть большой протяжённости и плотности особенно в присутствии длинноцепочечных ПАВ, несущих собственные сольватные оболочки (структурно-механический барьер).

Явления сольватации или гидратации (в водных системах) обусловлены взаимодействием растворённых или коллоидно-диспергированных веществ и твёрдообразных макроповерхностей с молекулами окружающей жидкой среды, например воды в латексах.

Многочисленными исследованиями [70] установлено, что жидкость в граничных сольватных или гидратных прослойках обладает особой структурой, и вследствие этого свойствами, отличающими её от обычной жидкости в объёме. Так, вода в граничных гидратных слоях имеет повышенную вязкость, упругость на сдвиг. Изменяются и другие её свойства: плотность, растворяющая способность, температура замерзания и т. д.

Существование гидратных слоев с их особой структурой и свойствами приводит к возникновению между коллоидными частицами или макроповерхностями при их сближении в жидкой среде отталкиваний неэлектростатической природы.

Неэлектростатические факторы стабилизации полимерных суспензий [71-75], синтезированных в присутствии ионогенных эмульгаторов, объясняют гидратацией и структурированием адсорбционных слоев на поверхности частиц. Эти факторы усиливаются по мере уплотнения и насыщения адсорбционных слоев эмульгатора, что, в частности приводит к коагуляции полимерных суспензий электролитами. Возникновение граничных гидратных прослоек на поверхности полимерных частиц было обнаружено различными методами [76].

Многочисленные исследования свойств межфазных адсорбционных слоев, проводившиеся Ребиндером и его школой [71-75, 77,78], показали, что такие слои образуют структурно-механический барьер, препятствующий контакту частиц.

Поверхностно-активные вещества различной природы, являющиеся эффективными стабилизаторами дисперсных систем, образуют на легкоподвижных границах раздела фаз плёнки различной толщины. В зависимости от условий эксперимента на соответствующих границах могут формироваться монослои, межфазные адсорбционные слои (толщина которых может заметно превышать толщину монослоя), а также двусторонние тонкие плёнки. Тонкие плёнки ПАВ проявляют специфические реологические свойства, что позволяет их рассматривать как тело или материал, несмотря на малость одного из линейных параметров -- толщины и характеризовать их макроскопическими параметрами (вязкость, упругость и др.).

Именно эти макрореологические свойства межфазных адсорбционных слоев определяют в ряде случаев как устойчивость самих слоев и фазовые переходы в них, так и стабилизацию ими разнообразных дисперсных систем. Они обусловливают возникновение структурно-механического фактора устойчивости. Повторим, что по Ребиндеру, структурно-механический барьер возникает при адсорбции молекул ПАВ, которые могут быть не сильно поверхностно-активными для данной границы раздела фаз, но способны к образованию гелеобразного структурированного слоя на межфазной границе. Этот слой подобен трёхмерной структуре -- гелю, который может возникать в растворах ряда веществ при достаточной их концентрации. Коагуляция частиц предотвращается тем, что адсорбционный слой, являющийся механическим препятствием, не позволяет частицам приближаться друг к другу на близкие расстояния. Их встреча в результате теплового движения приводит лишь к упругому столкновению адсорбционных слоев, а образовавшаяся в системе структурная сетка ограничивает движение частиц [79].

Согласно П. А. Ребиндеру [71-75], для понимания механизма стабилизации дисперсий, прежде всего, необходимо изучение закономерностей адсорбции ПАВ на границах раздела фаз и измерение структурно-реологических характеристик их поверхностных и межфазных слоев ПАВ.

Имеется ряд исследований [80-83], проведенных в последние годы и подтверждающих определяющую роль структурно-механического барьера в стабилизации. Изучая свободные эмульсионные пленки, стабилизированные белками, авторы [69] установили взаимосвязь между устойчивостью пленок и реологическими свойствами структурированных межфазных адсорбционных слоев.

В результате адсорбции высокомолекулярных поверхностно-активных веществ (ПАВ) на легкоподвижных границах раздела фаз образуются межфазные слои, характеризующиеся определенной прочностью, причина которой объяснена резким увеличением поверхностной концентрации вещества и выделением вследствие этого, в соответствии с фазовой диаграммой новой фазы с образованием контактов сцепления между элементами структуры.

Научная основа для описания реологического поведения структурированных дисперсных систем на базе измерений полных реологических кривых, позволяющих рассчитывать модули эластичности, вязкости и предельные сдвиговые напряжения была создана П.А. Ребиндером. Разработанный подход использовался как при изучении объемного, так и поверхностного структурообразования В.Н. Измайловой с сотр. [78]. Схемы кривых течения и изменения эффективной вязкости различных систем приведены на рис. 1.17.

Рис. 1.17 Кривые течения и изменения эффективной вязкости жидкообразных (1) и твердообразных (2) межфазных адсорбционных слоев, формирующих структурно-механический барьер:

Pm - напряжение сдвига, при котором достигается полное разрушение структуры; зm - вязкость системы с полностью разрушенной структурой; - структурная вязкость; - поверхностная бингамовская вязкость; - вязкость неразрушенной структуры; Pk1 и Pk2 - пределы текучести.

Кривые течения адсорбционных слоев вещества имеют упруго пластичные области до предела текучести Рк1; здесь деформации межфазных слоев полностью обратимы и механические свойства характеризуются модулем эластичности Es, типичной для тела Гука. Обратимы также условно-мгновенные деформации до Рk1 причем обратимость деформаций является следствием изменения энтропии, связанной с изменением ориентации элементов структуры межфазного слоя. В этих условиях межфазный слой характеризуется термодинамической обратимостью. Структурно-механический барьер может выступать как термодинамический фактор устойчивости при рассмотрении баланса энергий притяжения или отталкивания.

При значениях напряжениях сдвига, больших Рk1 регистрируется участок медленной (шведовской) ползучести с постоянной пластической вязкостью з0. В этой области происходят незначительные разрушения связей в квазидвумерной структуре межфазного слоя, которые при малых скоростях не успевают восстановиться. При определенном напряжении сдвига структурная сетка не выдерживает стационарного течения и разрушается. Это напряжение соответствует переходу кривой течения в область пластического течения. Выше бингамовского предела текучести Рk2 -напряжения межфазный адсорбционный слой течет с минимальной пластической вязкостью з*. Здесь проявляется кинетический фактор структурно-механического барьера.

Следует отметить некоторые признаки структурно-механического барьера, вытекающие из структурных особенностей адсорбционных слоев, существенные для разработки термодинамического фактора устойчивости при проявлении структурно-механического барьера, которые подробно описаны в монографии [77]. Адсорбционные слои ПАВ снижают поверхностную энергию на границе раздела фаз. Значение сложной константы Гамакера А* близко к значению, соответствующему притяжению тех же фаз через прослойку дисперсионной среды, например воды (А*~10-20ч10-21 Дж). В общем случае межфазный адсорбционный слой ПАВ имеет константу Гамакера, отличную от константы Гамакера внутренней части дисперсной фазы и дисперсионной среды. Если константа Гамакера межфазного слоя близка к константе Гамакера дисперсионной среды, межфазный слой действует как барьер, препятствующий контакту диспергированных частиц; частицы удерживаются на таком расстоянии друг от друга, при котором ван-дер-ваальсовые силы становятся незначительными. Процесс образования плоского контакта между двумя окруженными структурированными слоями каплями жидкости или газовыми пузырьками состоит из нескольких стадий. На больших расстояниях между частицами действуют ван-дер-ваальсовые силы притяжения.

При сближении частиц происходит вытекание дисперсионной среды из зазора между ними, затем деформирование, уплощение сближающихся поверхностей и изменение их радиусов кривизны. На этом этапе притяжение поверхностей вызывается молекулярной составляющей расклинивающего давления и капиллярным давлением :

;

А* - сложная константа Гамакера; Н - расстояние между сближающимися поверхностями; у - поверхностное натяжение на границе раствора ПАВ с воздухом или неполярной жидкостью.

По мере дальнейшего сближения поверхностей происходит контакт адсорбционных слоев. При непосредственном соприкосновении межфазных слоев в зоне плоского контакта молекулярное притяжение способствует утончению пленки (расстояние Н между поверхностями сокращается). Величине молекулярного притяжения противодействует сила упругого отталкивания структурированных (гелеобразных или кристаллоподобных) слоев толщиной d.

Принимая предположение о равномерном характере распределения деформации по толщине адсорбционного слоя, упругую составляющую структурно-механического барьера рупр можно выразить по закону Гука:

E1 - модуль упругости на сжатие (растяжение) адсорбционного слоя; х - абсолютная упругая деформация одного адсорбционного слоя, т.к. H=2(d-x), то x=d-H/2.

Тогда:

Для плоского контакта двух адсорбционных слоев, покрывающих поверхности капель или пузырьков в водных растворах высокомолекулярных ПАВ, суммарное расклинивающее давление рУ можно выразить как:

Исследование структурно-реологических свойств межфазных слоев ПАВ стало возможным благодаря созданию Ребиндером и Трапезниковым уникального прибора [84, 85]. Несмотря на то, что в последние годы разработаны новые приборы и установки для исследования реологических свойств адсорбционных слоев различных ПАВ [86, 87], прибор Ребиндера и Трапезникова не потерял актуальности.

Образование прочных межфазных слоев ПАВ на легкоподвижных границах раздела фаз является сложным процессом и включает стадии адсорбции, ориентации, латерального взаимодействия, конформационных изменений (особенно для гибких цепей), двумерного фазового разделения, распределения компонентов между фазами. В зависимости от вкладов различных стадии в процессе формирования межфазного слоя и от конформационного состояния ПАВ в растворе были выделены два типа межфазных слоев: гелеобразные или квазикристаллические (жидкокристаллические). Модели адсорбционных слоев соответствуют структурам с коагуляционными или кристаллизационно-конденсационными контактами, определяющими, согласно П.А. Ребиндеру [71-74], структурообразование в дисперсных системах. Результаты этих исследований необходимы для понимания механизма формирования межфазных адсорбционных слоев ПАВ на поверхности полимерных частиц.

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Исходные вещества

Стирол - технический продукт, очищали от стабилизатора 5%-ным водным раствором едкого натра, промывали водой до нейтральной реакции, сушили над прокаленным хлористым кальцием и дважды перегоняли в вакууме. Использовали фракцию, кипящую при t = 41 єC (10 мм.рт.ст.) d420=0,906г/см3, nd20=1,5450.

Додецилсульфат натрия (ДСН) - эмульгатор ионогенного типа, использовали марки "чда".

Этиловый спирт - продукт марки “ч”

Поливинилпирролидон, стабилизатор, применяли тип с молекулярной массой 40000.

Метилметакрилат (ММА) - продукт марки «ч» дважды перегоняли и использовали мономер со следующими константами: Tкип=33єС (55 мм.рт.ст.), d420=0,936г/см3, nd20=1,413.

Персульфат калия (ПК) (Sigma Aldrich) - K2S2O8, применяли продукт марки «хч», содержащий 99,9% активного вещества.

Динитрилазоизомасляной кислоты (ДАК), очищали перекристаллизацией из метанола.

Кремнийорганическое соединение:

(б,щ-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан) (КС2) общей формулы:

	, где Me = CH3-

Синтезирован в ГНИХТЭОС, имеет ММ=2728 г/моль, % COOHпракт = 3.60 %; з25є=132 сСт;

Вода - бидистиллят;

Ацетон - Ткип = 56,2оС;

Этанол - Ткип = 78,40С;

Флуоресцеин (водный раствор 0,3 моль/л);

Магдаловый красный (спиртовой раствор 0,3 моль/л);

PBS - буфер - рН=7,4, продукт фирмы «Sigma»;

D-фруктоза - марки «чда»;

Сахароза - марки «чда»

2.2 Получение полистирольных микросфер диаметром 6 мкм с карбоксильными группами на поверхности

Затравочную полимеризацию проводили в стеклянном реакторе (рис.2.1) объемом 100 мл, снабженным теплообменной рубашкой, двухрядной стеклянной пропеллерной мешалкой и системой для продувки инертного газа (азота или аргона). Для поддержания необходимой температуры полимеризации через теплообменную рубашку реактора с помощью термостата прокачивалась вода, температура которой поддерживалась на уровне 60 ± 0.5°С.



Рис. 2.1 Схема реактора.

В реактор загружают затравочную полистирольную суспензию, в которой растворены водорастворимые компоненты и проводят дегазацию в течение 15-20 минут. В смеси мономеров растворяют ДАК и вводят смесь в реактор. Дегазацию ведут еще в течение 2-3 минут. Сначала идет процесс набухания исходной полистирольной суспензии в смеси мономеров при комнатной температуре в течение 24 часов. После этого реактор подключают к термостату, доводят температуру до 60,0±0,5єС и отмечают время начала полимеризации. При необходимости через 2 часа после начала самой полимеризации вводят раствор персульфата калия [88].

2.3 Получение ПММА микросфер диаметром 0,4 мкм с карбоксильными группами на поверхности.

Для полимеризации метилметакрилата использовали стеклянный разборный дилатометр на шлифовом соединении, заполняли его на вакуумной установке (рис. 2.2). Подготовку опытов проводили следующим образом: в реторту (4) заливали рассчитанное количество метилметакрилата, в реторту (5) заливали воду. Инициатор (ПК) и ПАВ взвешивали в широкую часть дилатометра (1). Проводили дегазацию мономера и раствора эмульгатора посредством трёх циклов замораживание - откачивание - размораживание. Установку откачивали до остаточного давления р = 10-3ч10-4 мм. рт. ст. После удаления растворенного воздуха мономер через поворотные шлифы (7,8) сливали в дилатометр, в мономере растворяли ПАВ, а затем сливали воду. Дилатометр отделяли от установки в токе азота и помещали в термостат, в котором поддерживали постоянную температуру 80єС. Колебания температуры в термостате не должны превышать ± 0,1єС.

Перемешивание эмульсии в дилатометре осуществляли с помощью магнитной мешалки (3). Термостатировали дилатометр в течение 5 минут, открывали пробку и пипеткой отбирали избыток жидкости из дилатометра, так чтобы её уровень находился непосредственно в капилляре. После этого начинали измерение уровня жидкости в капилляре, замеряя его через определенные промежутки времени в зависимости от скорости опускания столба жидкости. Глубину полимеризации, то есть отношение количества заполимеризовавшегося мономера к исходному количеству, рассчитывали по формуле:

P= (ДH/ДHmax)*100%, где:

P - степень полимеризации (%); ДH - текущее изменение уровня в капилляре дилатометра (см); ДHmax - изменение уровня в капилляре дилатометра, соответствующее 100%-ной конверсии, см, рассчитанное по формуле:

Hmax=Vm*(сn-сm)/(S*сn), где

Vm - объем мономера (см3); сm - плотность мономера (г/см3); сn - плотность полимера (г/см3); S - площадь сечения капилляра (см2).



Рис.2.2 Вакуумная установка для загрузки дилатометра: 1 - широкая часть дилатометра, 2 - капилляр, 3 - мешалка, 4, 5 - реторты, 6 - ловушка, 7, 8 - шлифы, 9, 10, 11 - краны; 12 - вакуумметр.

2.4 Определение размера частиц в суспензии

Размер частиц в суспензиях определяли методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Каплю разбавленной полимерной суспензии наносили на предметный столик микроскопа, который предварительно подвергали гидрофилизации для равномерного распределения суспензии по поверхности. Суспензию высушивали в течение 20 минут на воздухе при нормальных условиях (н.у.). Столик помещали в вакуумную камеру ионного напылителя IB-3, EIKO ENGINEERING (производство Япония), где при силе ионного тока - 6 мА, напряжении на электродах - 900 В и вакууме 0,05 торр образец напыляли золотом. Образец изучали с помощью электронного микроскопа S-570 "Hitachi" (производство Япония) и определяли средний размер частиц суспензии путём их измерения на соответствующих микрофотографиях.

Анализ фотографий был осуществлен с помощью программы ImageJ. Обсчет характеристик проводился по следующим формулам:

Средневесовой диаметр:

Dw = , где ni -число частиц, имеющих диаметр Di

Среднечисловой диаметр:

Dn =

Коэффициент распределения (полидисперсности): К = Dw / Dn

Среднеквадратичное отклонение:

=

Коэффициент вариации: Кв = / D *100 %.

2.5 Определение сухого остатка суспензии

Сухой остаток суспензии определяли следующим образом: взвешивали чистую фарфоровую чашечку на аналитических весах. В чашечку брали навеску около 1г полимерной суспензии и еще раз взвешивают на аналитических весах. Определяют точный вес навески полимерной суспензии. Далее чашечку ставили в инфракрасный испаритель и выпаривали жидкость. Затем чашечку с образовавшейся пленкой полимера остужали и снова взвешивали. Вычисляли массовую долю полимера (сухой остаток) в % массовых по отношению к взятому количеству полимерной суспензии по следующей формуле:

,

где mс, mв, mч - масса чашечки с суспензией, после выпаривания и чистой, соответственно.

2.6 Подбор флуоресцентного красителя

Подбор красителя осуществлялся исходя из следующих параметров:

- максимум поглощения красителя лежит в области длин волн л = 488±10 нм, это необходимо для исследований, так как ряд конфокальных микроскопов в частности находящийся в нашем распоряжении конфокальный лазерный сканирующий микроскоп имеет блок лазеров, генерирующий волны с л=488 нм

- нерастворим или плохо растворим в воде

- хорошо растворим в ацетоне

Были выбраны 2 красителя:

Флуоресцеина динатриевая соль (уранин)

Магдаловый красный

Флуоресцеин.

Жёлтые кристаллы, плохорастворимые в воде, лучше - в спирте и водных щелочах, температура плавления 314-316°С (с разложением). В водных растворах существует в виде смеси (1: 1) бензоидной и хиноидной форм и обладает сильной жёлто-зелёной флуоресценцией (отсюда и название). Имеет максимум поглощения 494 нм и люминесценции 521 нм (водного раствора). Получают флуоресцеин конденсацией фталевого ангидрида с резорцином:



Уранин

Перекристализованный из метилового спирта флуоресцеин высушивают при 140-150°С для удаления кристаллизованного метанола. При этом он переходит в темно-красную модификацию. Затем чистый флуоресцеин и чистый карбонат натрия в эквимолярном соотношении растворяют в воде и упаривают раствор на водяной бане. Полученный светло-оранжевый препарат - динатриевая соль флуоресцеина.

Магдаловый красный

Образуется при сплавлении 1-аминоазонафталина с уксуснокислым б-нафтиламином и состоит из смеси моноамино- и диаминонафтилнафтазониевых солей. Очень плохо растворим в воде, лучше в спирте и ацетоне. Максимум поглощения 482 нм и люминесценции 508 нм.

2.7 Подбор концентрации красителя

1. Первая серия экспериментов

Первая серия экспериментов по подбору концентрации красителя выполнялась для того, чтобы выбрать наиболее подходящий диапазон концентрации красителя, при которой флуоресценция микросфер была бы максимальна. И не наблюдалось бы концентрационное гашение флуоресценции.

Полистирольные микросферы.

Сухие ПС микросферы диаметром 6 мкм (сшитые ДВБ) диспергировались в этиловом спирте. Готовилась суспензия с с.о.=1%. Микросферы осаждали, отбирали супернатант и переводили микросферы в ацетон (диметилкетон, чда).

Далее для подбора концентрации красителя готовили 8 суспензий (4 с флуоресцеином и 4 с магдаловым красным) с концентрациями красителей в конечных суспензиях: 0,2; 0.02; 0,002 и 0,0002%

Полученные суспензии инкубировались в термостате при 37°С в течение 3 суток. После чего подвергались десятикратной промывке дистиллированной водой.

Полиметилметакрилатные микросферы.

Исходную суспензию ПММА микросфер в воде (с.о.=14%) разбавляли водой для получения суспензии с с.о.=1%. Затем переводили суспензию в 30%-ый раствор ацетона в воде.

Готовили 8 суспензий (4 с флуоресцеином и 4 с магдаловым красным) с концентрациями красителей в конечных суспензиях: 0,2; 0,02; 0,002 и 0,0002%

Полученные суспензии инкубировались в термостате при 37°С в течение 3 суток.

После чего подвергались двукратной промывке 30%-ым раствором ацетона в воде и восьмикратной промывке дистиллированной водой.

Полученные таким образом суспензии окрашенных ПС и ПММА микросфер раскапывались на предметные стекла. После чего образцы изучались с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, для оценки равномерности окрашивания микросфер по диаметру и интенсивности флуоресценции.

2. Вторая серия экспериментов.

Вторая серия экспериментов по подбору концентрации красителя выполнялась для того, чтобы выбрать наиболее подходящую концентрацию красителя из выбранного в первой серии экспериментов диапазона, при которой флуоресценция микросфер была бы максимальна. А так же для проверки фиксации красителя в микросферах (не будет ли диффундировать краситель из частиц в раствор, в котором затем просветляли препараты) для чего образцы заключались в раствор фруктозы.

Полистирольные микросферы.

Сухие ПС микросферы диаметром 6 мкм (сшитые ДВБ) диспергировались в этиловом спирте. Готовилась суспензия с с.о.=1%. Микросферы осаждали, отбирали супернатант и переводили микросферы в ацетон (диметилкетон, чда).

Далее для подбора концентрации красителя готовили 3 суспензии с магдаловым красным с концентрацией красителя в конечных суспензиях: 0,05; 0,1; 0,2%

Полученные суспензии инкубировались при комнатной температуре в течение 2 суток. После чего подвергались восьмикратной промывке дистиллированной водой.

Полиметилметакрилатные микросферы.

Исходную суспензию ПММА микросфер в воде (с.о.=14%) разбавляли дистиллированной водой для получения суспензии с с.о.=1%. Затем переводили суспензию в 50%-ый раствор ацетона в воде.

Готовили 3 суспензии с магдаловым красным с концентрацией красителя в конечных суспензиях: 0,05; 0,1; и 0,2%

Полученные суспензии инкубировались при комнатной температуре в течение 2 суток.

После чего подвергались восьмикратной промывке дистиллированной водой.

Суспензии ПММА после инкубирования были разбавлены в 10 раз.

Полученные таким образом суспензии окрашенных ПС и ПММА микросфер раскапывались на предметные стекла. После чего образцы изучались с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, для оценки равномерности окрашивания микросфер по диаметру и интенсивности флуоресценции.

2.8 Определение агрегативной устойчивости микросфер

Определение агрегативной устойчивости ПС и ПММА микросфер проводили визуально.

На стекло наносили капли среды, объемом 10 мкл и 10 мкл суспензии микросфер с сухим остатком 1% (масс.). Капли перемешивали и выдерживали в течение 10 минут при н.у. В качестве контрольного образца использовали каплю водной суспензии микросфер объемом 20 мкл с сухим остатком 0,5% (масс.). Образование агрегатов контролировали визуально. В случае агрегативной неустойчивости микросфер наблюдалось просветление капли суспензии и образование крупных агрегатов частиц.

Была проверена устойчивость микросфер в следующих средах:

Раствор NaCl 0,15 моль/л;

Раствор NaCl 0,075 моль/л;

Поливидон (ММ = 25000 г/моль);

Стабизол (гидроксиэтилкрахмал + NaCl);

Раствор сахарозы 2,6% (масс.);

Раствор фруктозы 2,6% (масс.).

2.9 Окраска ПММА и ПС микросфер

Микросферы были окрашены жирорастворимым красителем, магдаловым красным, методом диффузии красителя из раствора в объем частицы.

Для окраски ПММА и ПС микросферы из дистиллированной воды переводились в 30% раствор ацетона в воде. Для чего суспензии микросфер в воде осаждали центрифугированием, отбирали супернатант и добавляли аликвотное забранному супернатанту количество 30% раствора ацетона в воде. Затем суспензии разделяли по пробиркам объемом 5 мл, для удобства работы с большими объемами суспензий, заливая в каждую 4,5 мл суспензии и добавляя в каждую 500 мкл магдалового красного с концентрацией 0,5%. Таким образом, было приготовлено 20 мл суспензии ПС микросфер и 20 мл суспензии ПММА микросфер с концентрацией магдалового красного в конечных суспензиях 0,05% (об.) и сухим остатком 5% (масс.).

Данные суспензии выдерживались в течение 24 часов в темноте, при комнатной температуре. После чего процесс окраски считали завершенным.

Окрашенные ПС и ПММА микросферы необходимо было отмыть от красителя, не диффундировавшего внутрь частиц. Для чего проводилось 6 промывок каждой суспензии. 1-ая промывка проводилась 10% раствором ацетона в воде, промывки 2-5 дистиллированной водой и заключительная 6-ая промывка проводилась 2,6% водным раствором сахарозы. После последней промывки микросферы переводились в 2,6% водный раствор сахарозы. Отмывку суспензии окрашенных микросфер проводили следующим образом: микросферы осаждали, отбирали супернатант, добавляли аликвотное количество раствора для промывки и ресуспендировали суспензию, давали ей отстояться в течение 10 минут, затем операцию отмывки повторяли.

Отмытые и переведенные в раствор сахарозы микросферы были готовы к перфузии.

2.10 Перфузия

Исследование проводилось на лабораторных белых крысах линии Вистар. Крысы под хлороформным наркозом фиксировались на операционном столике. После этого вскрывалась грудная клетка.

Схема перфузии представлена на рисунке 2.3.

Рис. 2.3 Схема перфузионной системы.

Игла, соединенная с перфузионной системой вводилась в аорту через левый желудочек и закреплялась лигатурой. Для обеспечения оттока перерезалось правое предсердие.

Первоначально проводили перфузию 2,6% изотоническим раствором сахарозы с добавлением гепарина (в качестве антикоагулянта, предотвращая свертывания крови) для того чтобы вымыть кровь из сосудов и капилляров. Перфузировали около 250 мл раствора для очистки сосудов от крови. Контролировали отмывку сосудов от крови визуально, наблюдая за сосудами в брыжейке, т.к. она практически прозрачна и в ней хорошо видно сосуды.

Затем перфузировали 20 мл 5% суспензии микросфер. Заполнение сосудов микросферами так же контролировали визуально, наблюдая за заполнением сосудов брыжейки.

После перфузии у крысы изымали следующие органы: мозг и брыжейку.

Фрагменты мозга и брыжейки заключали в пластиковые кассеты.

2.11 Просветление препаратов

Существует несколько методик, с помощью которых можно сделать ткани оптически прозрачными.

Нами была выбрана методика просветления, основанная на плавном переводе препаратов через серию водных растворов фруктозы с восходящей концентрацией. Эта методика была выбрана, поскольку используемый в работе краситель практически нерастворим в воде.

Методика основана на пропитывании тканевых препаратов фруктозой с показателем преломления 80% раствора n=1,49, который близок к показателю преломления неокрашенных тканей.

Для этого было приготовлено 6 растворов фруктозы, объемом по 100 мл с концентрациями 25%, 50%, 75%, 90%, и 2 раствора 98% (масс.). 98% раствор готовили, взвешивая 100г фруктозы и добавляя по каплям дистиллированную воду, непрерывно перемешивая, доводя объем раствора до 100 мл.

Кассеты с препаратами помещались сначала в 25% раствор фруктозы и выдерживались в нем в течение 3 часов, после чего кассеты перемещали на 3 часа в 50% раствор фруктозы и затем на 18 часов в 75% раствор. Далее по такой же схеме препараты проводили через растворы фруктозы с концентрациями 90% и 2-ух растворов по 98%.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Исследование свойств суспензии полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер с карбоксильными группами на поверхности частиц

На первом этапе создания микросфер, пригодных для исследования строения сосудистого русла осуществлялся синтез полимерных суспензий с узким распределением частиц по размеру, устойчивых в физиологических растворах и при хранении.

В этом случае полимерные частицы должны характеризоваться узким распределением по размерам и иметь диаметр частиц 0,4 и 6,0 мкм, быть устойчивыми в физиологических растворах, в которых они используются.

При создании микросфер для исследования сосудистого русла важным вопросом является диаметр частиц полимерной суспензии.

Для исследования строения сосудистого русла были выбраны полистирольные микросферы диаметром 6 мкм и полиметилметакрилатные микросферы диаметром 0,4 мкм, исходя из того, что средний диаметр сосудов составляет 4-5 мкм. Предполагали, что при заполнении сосудистого русла микросферами диаметром 6 мкм суспензией окажется заполнено только лишь артериальное русло, при этом капилляры окажутся незаполненными. Однако возможно появление микросфер диаметром 6 мкм и в венозном русле, из-за наличия артерио-венозных анастомоз (сосудов, соединяющих артериальную и венозную части сосудистого русла, минуя капилляры), размер которых достаточен для прохождения через них микросфер диаметром 6 мкм.

Для обеспечения прохождения флуоресцентных носителей в капилляры их диаметр принимаем на порядок ниже, чем диаметр сосудов, то есть 0,2-0,6 мкм. Так же ограничили нижний предел размера микросфер, их диаметр не должен превышать 0,1 мкм, так как объекты с диаметрами порядка 0,05-0,1 мкм захватываются сосудистой мембраной и затем уносятся за пределы сосудистого русла, вследствие чего возможно размытие контуров сосудов. Поэтому для выявления структуры артериального, венозного и капиллярного русла было предложено использовать полиметилметакрилатные микросферы с диаметром 0,4 мкм.

В качестве затравочных частиц при полимеризации стирола использовали полистирольные микросферы диаметром 5 мкм. Рецептура получения полистирольной суспензии 6мкм представлена в таблице 3.1.

Таблица 3.1 Рецептура проведения затравочной полимеризации на основе полимерной суспензии 5 мкм.

Наименование компонента	Массовые части
Полимерная суспензия 5 мкм	100
Стирол	10
Вода	2400
ДАК	2*10-4
ДСН	2.4
ПВП	1
ПК	0.31
StSNa	1
Si-орг	2,5

В результате на основе полимерной суспензии 5 мкм были получены полимерные микросферы диаметром 6,0 мкм. Основные коллоидно-химические свойства полученных полистирольных суспензий представлены в таблице 3.2.

Таблица 3.2 Коллоидно-химические свойства полимерной суспензии 6мкм Si-орг.

Наименование полимерной суспензии	Средний диаметр, мкм	Кв, %	Кполидисп-и	ж-потенциал	Агрегативная устойчивость, Молярность (М) раствора NaCl
6мкм Si-орг	6,0	37,58	1,014	-31,6	0,20

Как видно из результатов, представленных в таблице 3.2, синтезированные полистирольные частицы с карбоксильными группами на поверхности сохраняют устойчивость в растворе электролита с концентрацией не менее 0,15 М.

Полученные полимерные суспензии имеют узкое распределение частиц по размерам, о чем свидетельствуют данные микроскопического исследования частиц, приведенные на рис. 3.1, 3.2.

Рис. 3.1 Микрофотография частиц полимерной суспензии 6мкм Si-орг.

Рис. 3.2 Распределение частиц полимерной суспензии 6мкм Si-орг по размерам.

Полиметилметакрилатные микросферы получали методом полимеризации в дилатометре. Рецептура получения представлена в таблице 3.3.

Таблица 3.3 Рецептура проведения полимеризации метилметакрилата.

Наименование компонента	Количество
Соотношение фаз вода: ММА	1:9
ПК	1%(масс.)
Si-орг	1%(масс.)

В результате были получены полимерные микросферы диаметром 0,4 мкм. Основные коллоидно-химические свойства полученных полиметилметакрилатных суспензий представлены в таблице 3.4.

Таблица 3.4 Коллоидно-химические свойства полимерной суспензии 0,4 мкм Si-орг.

Наименование полимерной суспензии	Средний диаметр, мкм	Кв, %	Кполидисп-и	ж-потенциал	Аггрегативная устойчивость, Молярность (М) раствора NaCl
0,4 мкм Si-орг	0,4	52,4	1,024	-	0,075

Как видно из результатов, представленных в таблице 3.4, синтезированные полиметилметакрилатные частицы с карбоксильными группами на поверхности сохраняют устойчивость в растворе электролита с концентрацией 0,075 моль/л.

Полученные полимерные суспензии имеют узкое распределение частиц по размерам, о чем свидетельствуют данные микроскопического исследования частиц, приведенные на рис. 3.3, 3.4.

Рис. 3.3 Микрофотография частиц полимерной суспензии 0,4 мкм Si-орг.

Рис. 3.4 Распределение частиц полимерной суспензии 0,4 мкм Si-орг по размерам.

Очень важно было изучить агрегативную устойчивость полимерной суспензии в физиологических средах, для того чтобы исключить агрегацию микросфер и как следствие закупорку сосудов агрегатами при перфузии. Для применения были пригодны полимерные микросферы, устойчивые в растворе электролита (NaCl) с концентрацией не менее 0,15 М.

Многочисленные литературные и патентные данные по синтезу монодисперсных полимерных суспензий показывают, что узкое распределение частиц по размерам в процессе затравочной полимеризации стирола сохраняется при использовании кремнийорганических ПАВ, содержащих функциональные группы (-C00H,-C0H,-0H,-NH2 и др.).

Результаты исследования агрегативной устойчивости ПС и ПММА микросфер представлены в таблице 3.5.

Таблица 3.5 Агрегативная устойчивость микросфер.

	NaCl 0,15 М	NaCl 0,075 М	Поливидон	Стабизол	Фруктоза (10%р-р)	Сахароза (2,6%р-р)
ПС	+	+	+	-	+	+
ПММА	-	+	+	-	+	+

Примечание: Знак «+» означает, что система была агрегативно устойчива и коагуляция микросфер не наблюдалась. «-» - наблюдалась коагуляция микросфер.

В связи с неустойчивостью суспензии ПММА микросфер в физиологическом растворе, было решено использовать в качестве физиологической среды изотонический раствор сахарозы (2,6% водный раствор сахарозы в воде).

3.2 Окрашивание микросфер флуоресцентным красителем

По результатам патентного поиска была предложена методика получения окрашенных флуоресцентным красителем полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер. В качестве исходного материала использовали готовые суспензии полистирольных микросфер диаметром 6 мкм с карбоксильными группами на поверхности. Окрашивание проводили флуоресцентным красителем магдаловым красным.

В основе методики лежит принцип окрашивания полимерных микросфер путем их набухания в растворителе, содержащем краситель требуемой концентрации. Этот растворитель должен неограниченно смешиваться со средой, в которой суспендированы микросферы. В качестве такого растворителя для полистирольных микросфер был выбран ацетон, в котором растворяли магдаловый красный.

Исследование интенсивности флуоресценции окрашенных полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер проводили при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon. Результаты приведены в таблице 3.6.

Таблица 3.6 Величина, обратная интенсивности флуоресценции (усиление на ФЭУ, у.е.) окрашенных ПС и ПММА микросфер.

	Заключены во фруктозу	Без заключения
№	Суспензия	л=488 нм (зеленый)	л=596 нм (красный)	л=488 нм (зеленый)	л= 596 нм (красный)
1.	1-0,05	100	115	95	100
2.	1-0,1	105	110	90	100
3.	1-0,2	110	110	85	95
4.	2-0,05	110	110	105	105
5.	2-0,1	110	105	100	100
6.	2-0,2	105	110	100	105

Примечание: 1-ПММА микросферы; 2 - ПС микросферы; 0,05; 0,1; 0,2 - концентрация красителя в суспензии микросфер, % (об).

3.3 Просветление препаратов

Препараты просветлялись по методике основанной на их плавном переводе через серию водных растворов фруктозы с восходящей концентрацией. Эта методика была выбрана поскольку используемый в работе краситель, магдаловый красный практически не растворим в воде.

Методика основана на пропитывании препаратов фруктозой с показателем преломления 80% раствора n=1,49, который близок к показателю преломления неокрашенных тканей.

Фотографии были выполнены на световом микроскопе. Результаты просветления показаны на рисунке 3.5.

На микрофотографии 3.5 А представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 6 мкм, окрашенными магдаловым красным. Четко видны микросферы и хорошо видно, что микрососуд (1) имеет несколько ветвей (2,3,4), 2 из которых (2 и 4) находятся не в фокусе и выглядят размытыми. Видно, что в сосуде (1) по диаметру расположены 3 микросферы диаметром 6 мкм, следовательно, диаметр сосуда 18 мкм. В сечении сосуда может располагаться 9 микросфер диаметром 6 мкм. Ветвь (3) сосуда, очевидно, имеет диаметр 6 мкм и заполнена не полностью, что говорит об уменьшении диаметра сосуда, микросферы не смогли пройти дальше. Размытые линии (5) на

Рис. 3.5 Фотографии со светового микроскопа образцов заполненных микросферами диаметром 6 мкм, увеличение х40 (А) и микросферами диаметром 0,4 мкм, увеличение х10 (Б).

Видно, что полимерные микросферы плотно заполнили сосудистое русло. Так же видно, что микросферы останавливаются в том месте, где диаметр сосуда становится меньше диаметра микросфер и понятно, что микросферы диаметром 6 мкм не могут заполнить капиллярное русло. Следовательно, данный подход позволяет анализировать артериальную часть сосудистого русла. Как говорилось выше, в строении артериального русла существуют «шунты», позволяющие крови, минуя капилляры попадать в венозное русло, и диаметр которых сопоставим с диаметром артерий. Поэтому не исключается возможность попадания микросфер диаметром 6 мкм в венозное русло. Однако, в тех участках, где мы проводили исследования, вен, заполненных микросферами, обнаружено не было. Но это необходимо принимать во внимание при дальнейших исследованиях.

На микрофотографии 3.5 Б представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым красным. Четко виден сосуд диаметром около 30 мкм (1) имеющий 2 ответвления (2 и 3). Хорошо видно, что сосуд заполнен окрашенными микросферами, красный цвет. И вена (4) диаметром около 100 мкм, незаполненная микросферами.

3.4 Исследование препаратов методом конфокальной лазерной микроскопии. Создание трехмерной модели сосудов

Просветленные препараты, заполненные 0,4 мкм полиметилметакрилатными и 6 мкм полистирольными микросферами, окрашенными флуоресцентным красителем, магдаловым красным, исследовались на конфокальном микроскопе Nikon Eclipse C1 plus.

На микрофотографии 3.6 А представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 6 мкм, окрашенными магдаловым красным. Четко видны микросферы и видно, что микрососуд (1) имеет диаметр 6 мкм, в сечении сосуда лежит одна микросфера.

На микрофотографии 3.6 Б представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым красным. Виден раздваивающийся сосуд (1), диаметром около 6 мкм, плотно заполненный микросферами. И вена (2), диаметром около 40 мкм, заполненная микросферами лишь частично.

На микрофотографии 3.6 В видна артериола (1) диаметром около 30 мкм, от которой вправо и влево отходят 4 ветви (2,3) диаметром около 20 мкм. Ветви (2) и (3) делятся на капилляры со средним диаметром 4 мкм. Интенсивность флуоресценции артериолы (1) в левом верхнем углу фотографии меньше, чем по всей длине артериолы, что говорит о том, что эта часть артериолы находится выше или ниже плоскости оптического среза (4).

Рис. 3.6 А - капилляр, заполненный латексом 6 мкм, увеличение х40; Б - артерия и вена, заполненные латексом 0,4 мкм, увеличение х40; В - разветвленный сосуд, латекс 0,4 мкм, увеличение х10.

Основным преимуществом исследования сосудов методом конфокальной лазерной микроскопии является возможность построения 3-х мерной модели, что дает возможность проанализировать плотность (количество) сосудов в объеме препарата, а так же определить их пространственное положение.

На первом этапе была выполнена серия оптических срезов (ОС) препарата, заполненного полиметилметакрилатными микросферами диаметром 0,4 мкм. Оптические срезы были сделаны при увеличении 10х, и через каждые 5 мкм по глубине препарата (от поверхности до основания). Исследуемый препарат имел толщину 250 мкм.

На рисунке 3.7 показана серия оптических срезов, сделанных на расстоянии 25 мкм друг от друга по глубине препарата.

Рис. 3.7 Серия оптических срезов, сделанных на расстоянии 25 мкм друг от друга по глубине препарата.

На втором этапе проводилась компьютерная обработка изображений с помощью программы ImageJ, для решения следующих задач:

1. Определение плотности (количества) сосудов в объеме препарата.

2. Построение 3-х мерной модели препарата.

Для определения плотности (количества) сосудов в объеме препарата в программе ImageJ была сделана проекция всех ОС на основании препарата. По схеме, приведенной на рис. 3.8. Из полученного изображения, рис. 3.9, возможно определить площадь сосудов в препарате. И, зная толщину препарата, представляется возможным рассчитать количество сосудов в его объеме.

Рис. 3.8 Схема получения проекции всех оптических срезов препарата.

Рис. 3.9 Проекция оптических срезов препарата, на плоскость параллельную основанию препарата.

Глава 4. Охрана труда

4.1 Введение

Создание безопасных, благоприятных условий труда, проведение мероприятий по охране труда являются важным условием для повышения эффективности научных исследований;

Под охраной труда понимают систему законодательных и нормативных актов РФ, экономических, организационных, технических, гигиенических и лечебно-профилактических мероприятий и средств, обеспечивающих безопасность, сохранение здоровья и работоспособности человека в процессе труда [60].

Предметом охраны труда является разработка и внедрение способов и средств создания условий труда для работающего, полной безопасности и безвредности при обеспечении максимальной производительности.

Цель охраны труда - исключить воздействие на человека опасных и производственных факторов. В научных исследованиях вопросы безопасности приобретают особое значение. В связи с этим разработка раздела охраны труда дает возможность обеспечить благоприятные и безопасные условия труда в процессе проведения исследования.

Цель разработки данного раздела - это определение потенциально опасных и вредных факторов при выполнении экспериментальных исследований, а также выбор средств защиты экспериментатора при возможных неполадках и способов их устранения.

Работа выполнялась в отделении морфологии НИИФХМ.

4.2 Пожароопасные свойства горючих веществ и материалов и меры безопасности при работе с ними

Пожарная безопасность - это состояние защищенности населения, объектов национальной экономики иного назначения, а также окружающей природной среды от опасных факторов и воздействий пожаров [61]. Из пожаровзрывоопасных веществ в работе использовался только ацетон (диметилкетон). Справочные данные:

1. Агрегатное состояние: жидкость

2. Плотность пара по воздуху: 0,79 г/см3

3. Температуры:

-вспышки: -18 єС

-самовоспламенения: 535 єС

- воспламенения: 500 єС

4. Предел воспламенения:

-концентрационный: 2,91 % (об.)

-температурный: -18 єС

5. Средства пожаротушения: распыленная вода, все виды пен.

В соответствии с документом «Определение категорий помещений и зданий по взрывопожарной и пожарной опасности. НПБ 105-03», существуют следующие категории производственных помещений: А,Б,В1-В4, Г и Д.

Лаборатория, в которой проводилась работа, относится к категории В4.

Для отнесения лаборатории, в которой выполнялась дипломная работа, к одной из категорий производственных помещений было определено избыточное давление взрыва.

Избыточное давление взрыва ДP рассчитывалось по формуле:

,

где Рmax - максимальное давление взрыва стехиометрической газовоздушной или паровоздушной смеси в замкнутом объеме, кПа; допускается принимать Рmах = 900 кПа;

Р0 - начальное давление, соответствующее атмосферному, кПа; для Москвы можно принять Р0 = 100 кПа;

m - масса паров легковоспламеняющихся (ЛВЖ) и горючих жидкостей (ГЖ), вышедших в результате расчетной аварии в помещение, соответствует массе жидкости, испарившейся с поверхности разлива, кг; m=0,2 кг

Интенсивность испарения W, кг/(с*м2) допускается определять по формуле:

,где

з - коэффициент, зависящий от температуры и скорости воздушного потока над поверхностью испарения, при скорости воздушного потока 0,2 м/с и температуре в помещении 20єС, з = 3,5

Pнас - давление насыщенного пара при расчетной температуре жидкости, определяется по формуле:

lg Рнас = 7,06542 - 2123,057/(272,988+tвсп)

lg Рнас = 7,06542 - 2123,057/(272,988-18)= -1,26

Рнас = 10-1,26 =0,06 кПа

кг/(с*м2)

Fи - площадь испарения принимается из расчета что 1 л вещества разливается на 1 м2 пола, Fи = 40 м2, и T - время испарения - 3600с

кг

z - коэффициент участия горючего во взрыве, допускается принимать его значение по табл. п.1.2; z=0,3

сг - плотность газа или пара при расчетной температуре tp, кг/м3, вычисляемая по формуле:

,где

М - молярная масса, кг/кмоль; V0 - мольный объем, равный 22,4 м3/кмоль; tp - расчетная температура, єС, допускается принимать ее равной температуре вспышки;

ССТ - стехиометрическая концентрация паров ЛВЖ и ГЖ, %(об.), вычисляемая по формуле:

ССТ = 100/ (1 + 4,84 в) = 100/ (1 +4,84*2,6) = 7,36

в = nс + (nн- nх) / 4 - nо/ 2 = 3+ (6-0) / 4 -0,5 = 2,6, где

в - стехиометрический коэффициент кислорода в реакции сгорания; nс, nн, nх, nо - число атомов углерода, водорода, галоидов и кислорода в молекуле горючего; КН - коэффициент, учитывающий негерметичность помещения и неадиабатичность процесса горения; допускается принимать КН = 3.

Избыточное давление взрыва:

Так как, рассчитанное ДP <5 кПа, то лаборатория относится к категории В1-В4,

Производили уточняющий расчет.

Определение пожароопасной категории помещения осуществляется путем сравнения рассчитанного значения удельной пожарной нагрузки (далее по тексту - пожарная нагрузка) с величиной удельной пожарной нагрузки, приведенной в табл. 4.1.

Данные для определения помещений категории «В»

Таблица 4.1 Величина пожарной нагрузки.

Категории	Удельная пожарная нагрузка q на участке, МДж/м2
В1	более 2200
В2	1401 - 2200
В3	181 - 1400
В4	1-180

Пожарная нагрузка Q (МДж) определялась из соотношения:

,где

Gi - количество i-ro материала пожарной нагрузки, кг; QPн i - низшая теплота сгорания i-ro материала пожарной нагрузки, МДж/кг.

Определение теплоты сгорания ацетона.

Низшая теплота может быть определена по следующему уравнению:

,где

[C],[H],[O],[S] и W - содержание в горючем веществе углерода, водорода, кислорода, горючей серы и влаги, %.