Применение полимерных микросфер для изучения кровеносного русла органов

Размещено на http://www.allbest.ru

102

Размещено на http://www.allbest.ru

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Ангиогенез. Строение сосудов

1.2 Вещества, препятствующие росту новых сосудов

1.3 Современные методы исследования строения кровеносных сосудов

1.4 Флуоресцентная конфокальная микроскопия

1.5 Сканирующая электронная микроскопия

1.6 Флуоресцентные метки

1.6.1 Полупроводниковые нанокристаллы или квантовые точки (КТ)

1.6.2 Получение биосовместимых водорастворимых полупроводниковых CdSe/ZnS КТ, покрытых полисилоксановой оболочкой

1.6.3 Свойства и преимущества применения полупроводниковых КТ в биологических целях

1.7 Методы окрашивания полимерных микросфер флуоресцентными красителями

1.8 Устойчивость суспензий полимерных микросфер как дисперсных систем

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Исходные вещества

2.2 Получение полистирольных микросфер диаметром 6 мкм с карбоксильными группами на поверхности

2.3 Получение ПММА микросфер диаметром 0,4 мкм с карбоксильными группами на поверхности

2.4 Определение размера частиц в суспензии

2.5 Определение сухого остатка суспензии

2.6 Подбор флуоресцентного красителя

2.7 Подбор концентрации красителя

2.8 Определение агрегативной устойчивости микросфер

2.9 Окраска ПММА и ПС микросфер

2.10 Перфузия

2.11 Просветление препаратов

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Исследование свойств суспензии полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер с карбоксильными группами на поверхности частиц

3.2 Окрашивание микросфер флуоресцентным красителем

3.3 Просветление препаратов

3.4 Исследование препаратов методом конфокальной лазерной микроскопии. Создание трехмерной модели сосудов

Глава 4. Охрана труда

4.1 Введение

4.2 Пожароопасные свойства горючих веществ и материалов и меры безопасности при работе с ними

4.3 Характеристика токсичных веществ и меры безопасности

4.4 Вопросы электробезопасности в соответствии с "Правилами устройства электроустановок" (ПУЭ)

4.5 Анализ потенциальных опасностей и вредностей при выполнении экспериментальных исследований

4.6 Санитарно-гигиенические условия в рабочем помещении

4.7 Освещение

4.8 Заключение

Глава 5. Экологическая безопасность

Глава 6. Экономическая часть

Расчет затрат на проведение эксперимента

6.1 Расчет затрат на сырье и материалы

6.2 Определение энергетических затрат на проведение исследования

6.3 Затраты на воду для технологических целей

6.4 Расчет затрат на стеклянную посуду

6.5 Расчет амортизации установок, приборов и оборудования

6.6 Расчет затрат на заработную плату

6.7 Накладные расходы

6.8 Суммарные затраты

Глава 7. Выводы

Список литературы

Введение

Проблема исследования васкуляризации тканей (степени развития в ней сосудистого и капиллярного русла) является очень актуальной.

После любого разрушительного воздействия на организм (ушиба, пореза, инсульта, ранения) необходимо восстановить кровоснабжение поврежденных тканей. В организме «запускается» естественный процесс формирования новых сосудов, называемый ангиогенезом. Во время ангиогенеза эндотелиальные клетки, из которых состоят внутренние стенки сосудов, начинают интенсивно размножаться, и образовавшиеся новые каппиляры прорастают в поврежденные ткани [1].

Исследование развития сосудов и капилляров используется для изучения восстановления термически-пораженных тканей (ожоги) [2], изучения восстановления кровоснабжения при инфарктах и ишемической болезни [3], диагностики заболевания сосудов при сахарном диабете [4] и многих других целей.

В последние десятилетия все большее и большее внимание уделяется проблемам лечения и ранней диагностики онкологических заболеваний. Рост опухолевых образований в организме человека напрямую связывают с прорастанием в ней сосудов. Для интенсивного размножения опухолевых клеток нужны кислород и питательные вещества. А значит, по мере развития раковая опухоль должна прорастать новыми кровеносными сосудами.

В 1971 году появилась статья американского хирурга Джуды Фолкмана, в которой впервые было высказано предположение, что рост опухолей, превышающих в диаметре несколько миллиметров, возможен только в случае формирования и прорастания в них мелких капилляров. В 1982 году американские ученые Ваупель, Калиновский и Окунев показали, что во всех злокачественных опухолях действительно идет интенсивное новообразование сосудов. Верно и обратное - если образование новых сосудов прекращается, то дальнейший рост опухоли становится невозможен.

В настоящее время наиболее эффективным методом исследования развития сосудистого русла - это флуоресцентные методы, заключающиеся во введении в сосуды флуоресцентных меток, использовании флуоресцентной конфокальной микроскопии, построении трехмерной модели сосудов и капилляров, а так же математическом анализе и количественной оценке полученных результатов.

В литературе имеются сведения об использовании в качестве флуоресцентных меток флуоресцирующих белков [5], полупроводниковых нанокристаллов [6], цианиновых красителей [7].

Возможность использования в качестве флуоресцентных меток наночастиц или квантовых точек (КТ) обсуждается в литературе [8], тогда как доставка в опухоль традиционных органических флуорофоров уже давно широко используется в клинике и лежит в основе флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии рака. Наиболее предпочтительны для флуоресцентной визуализации флуорофоры, имеющие интенсивное поглощение, и флуоресценцию в красной и ближней инфракрасной области спектра. Поскольку биологические ткани являются наиболее прозрачными для данного диапазона, это открывает возможность визуализации глубоко-локализованных опухолей [9].

Определенное преимущество флуоресцентных КТ в качестве флуоресцентных меток - это очень интенсивная флуоресценция, их нерастворимость в органических растворителях и воде. Но сейчас их стоимость крайне высока и не ведется их открытая продажа.

Таким образом, у нас возникла необходимость разработки полимерных микросфер, окрашенных люминесцентным красителем. Микросферы должны обладать высокой интенсивностью флуоресценции, не должны прилипать к стенкам сосудов и не конъюгировать друг с другом. Размер микросфер был выбран исходя из того, что средний размер сосудов составляет 4-5 мкм. Для исследования строения только артериального русла использовались полистирольные микросферы диаметром 6 мкм. При заполнении сосудистого русла микросферами диаметром 6 мкм, предположительно, суспензией окажется заполнено только лишь артериальное русло, при этом капилляры окажутся незаполненными, так как размер микросфер больше диаметра капилляра.

Для исследования строения сосудов, вен и капилляров было предложено использовать микросферы диаметром 0,4 мкм. Это обусловлено тем, что средний диаметр капилляров составляет 0,2-0,6 мкм. И в то же время диаметр микросфер не должен был быть меньше 0,1 мкм, так как объекты диаметром 0,05-0,1 мкм захватываются сосудистой мембраной и затем уносятся за пределы сосудистого русла. Вследствие чего наблюдалось бы размытие контуров сосудов при исследовании образцов методом конфокальной микроскопии.

Цель работы: Создание полимерных микросфер, окрашенных люминесцентным красителем для исследования архитектоники сосудистого русла.

Задачи:

1. Отработать методику синтеза микросфер диаметром 0,4 и 6 мкм.

2. Отработать методику окрашивания полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер флуоресцентным красителем.

4. Отработать методику заполнения сосудистого русла суспензией полимерных микросфер, окрашенных флуоресцентным красителем.

5. Приготовить и просветлить тканевые препараты.

6. Исследовать полученные тканевые препараты методом конфокальной лазерной микроскопии.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Ангиогенез. Строение сосудов

полимерная микросфера сосуд микроскопия

Некоторые ткани организма, да и сами быстрорастущие опухолевые клетки, вырабатывают белковые молекулы, стимулирующие прорастание кровеносных капилляров. Такие молекулы называют факторами роста. Самый важный из них - фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), более известный под английским названием «vascular endothelial growth factor (VEGF)», - выделил в 1989 году французский медик Наполеон Феррара. Сегодня специалистам известна структура гена, отвечающего за синтез этого вещества, а концентрация ФРЭС в опухоли служит одним из диагностических показателей скорости ее роста (злокачественности). За прошедшие с тех пор почти два десятка лет ученые открыли множество (около 20) сигнальных молекул, стимулирующих образование новых сосудов.

Молекулы факторов роста, в том числе и ФРЭС, связываются на поверхности эндотелиальных клеток, составляющих внутреннюю оболочку сосудов, со специальными белковыми структурами - рецепторами. Рецепторы образуются под влиянием веществ, которые вырабатывает злокачественная опухоль. На нормальных клетках эндотелия в здоровом организме таких рецепторов нет. Как только молекула ФРЭС связалась с рецептором, инициируется целый каскад биохимических событий: клетки эндотелия начинают интенсивно делиться и «запускают» синтез ферментов - металлопротеаз, которые расщепляют обволакивающий эндотелий внеклеточный матрикс и оболочку сосудов. В образовавшиеся «дырки» эндотелиальные клетки выходят наружу и мигрируют по направлению к опухоли.



Рис.1.1 Активированные ФРЭС эндотелиальные клетки производят специальные ферменты - металлопротеиназы, расщепляющие матрикс оболочки сосуда, «сделанный» из белков и полисахаридов. В результате эндотелиальные клетки получают возможность мигрировать и делиться.

Ферменты - металлопротеазы, расщепляющие белки, как бы «расплавляют» ткани перед прорастающими сосудами, помогая им продвигаться к цели. Как только кровеносный капилляр окончательно сформировался, активность протеаз падает и ткань вокруг нового сосуда снова «затвердевает». Особенность металлопротеаз состоит в том, что в их активном центре находится атом цинка. Этим опухолевые ферменты отличаются от большинства других природных ферментов, расщепляющих белки, например желудочного пепсина или трипсина поджелудочной железы. Таким образом, ФРЭС и другие факторы роста, взаимодействуя с рецепторами, стимулируют не только формирование, но и продвижение капилляров вглубь опухоли.

Факторы роста совершенно необходимы здоровому организму для восстановления кровотока при различных повреждениях, но их избыток может стать роковым для онкологического больного. Повышение синтеза ФРЭС стимулирует метастазирование опухолей - под воздействием этого вещества раковые клетки выходят в кровяное русло и распространяются по всему организму. С другой стороны, ФРЭС играет и положительную роль - прорастающие в опухоли сосуды формируют в ней своеобразный мягкий скелет, который удерживает клетки на месте, не давая им метастазировать.

При недостатке кислорода выработка ФРЭС и других факторов роста усиливается - ведь организму нужно компенсировать гипоксию увеличением кровотока. Отсюда можно сделать вывод об увеличении риска онкологических заболеваний при снижении концентрации кислорода в воздухе из-за уничтожения зеленых насаждений, загрязнения окружающей среды и т.д. Также доказано, что молекулы, вырабатывающиеся в организме человека при стрессе, одновременно стимулируют синтез ФРЭС. Этот факт наводит на мысли о пагубной роли нервного напряжения в возникновении раковых опухолей.

1.2 Вещества, препятствующие росту новых сосудов

Помимо молекул, способствующих прорастанию опухоли сосудами, в организме синтезируются и собственные факторы, препятствующие росту сосудов (ингибиторы). В здоровом организме существует баланс между активаторами и ингибиторами роста новых кровеносных сосудов. При многих серьезных заболеваниях организм как бы теряет контроль над поддержанием этого равновесия. Смещение равновесия в сторону избыточного формирования новых сосудов происходит при онкологических заболеваниях, диабете, ревматоидном артрите и т.д. При таких опасных недугах, как заболевания коронарных артерий, инсульт, напротив, скорость роста новых сосудов явно ниже нормы.

Рис.1.2 Процесс ангиогенеза начинается с разрушения сосудистой оболочки ферментами - протеазами, которые под действием молекул фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) вырабатывают активированные клетки эндотелия. После этого клетки могут делиться и мигрировать по направлению к опухоли.

Первым известным природным веществом, тормозящим рост новых сосудов, стал гликопротеин тромбоспондин, вырабатываемый различными клетками, в том числе и клетками стенок кровеносных сосудов. Тромбоспондин тормозит размножение эндотелиальных клеток, сдерживая таким путем рост капилляров.

Клиницистам-онкологам давно известно, что первичная опухоль сдерживает рост метастазов. Эффективное подавление или хирургическое удаление первичной опухоли ведет к бурному росту опухолей вторичных. Причина этого явления оставалась неизвестной, пока первооткрыватель роли ангиогенеза в опухолевом росте Фолкман не высказал предположение, что первичная опухоль выделяет какое-то вещество, сдерживающее прорастание сосудов в своих «детках», не давая метастазам расти. В 1994 году американец Майкл О'Рейли выделил из мочи мышей с привитой карциномой вещество, которое подавляло рост капилляров. Оно представляет собой фрагмент молекулы содержащегося в крови белка плазминогена. Соединение назвали «ангиостатином» (стабилизирующим сосуды). Оказалось, что при удалении первичной опухоли фактор, сдерживающий рост метастазов, исчезает. В результате вторичные опухоли начинают быстро прорастать новыми сосудами и развиваться. Механизм действия ангиостатина в настоящее время интенсивно изучается.

В 1997 году тот же О'Рейли при исследовании культуры клеток злокачественной опухоли гемангиоэндотелиомы выделил еще один мощный блокатор формирования кровеносных сосудов - эндостатин. Это вещество является частью молекулы коллагена. Эндостатин активирует программируемую гибель эндотелиальных клеток и, вероятно, тормозит процесс их активации, размножения и миграции.

Помимо тромбоспондина, ангиостатина и эндостатина в органах и тканях животных исследователи обнаружили множество веществ, которые подавляют рост капилляров. К таким веществам относятся некоторые гормоны, фрагменты гепарина и др. Из известных природных ингибиторов можно назвать интерфероны, которые, кстати, борются и с вирусами. Однако как названные вещества, так и многие другие свойственные организму продукты обмена веществ обладают многофункциональным действием и из-за побочных эффектов не могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов.

Рис.1.3 В настоящее время ученые проверяют возможность применения различных блокаторов ангиогенеза в лечении рака. Блокаторы (ангиостатики) подразделяются на разные категории в зависимости от механизма их действия.

Первыми противоопухолевыми средствами были природный алкалоид колхицин, выделенный из безвременника подснежного, меркаптопурин - производное пурина, одного из метаболитов нуклеиновых кислот, и эмбихин - полученный модификацией молекулы отравляющего газа иприта, которого в природе нет, и лучше бы и не было. При создании новых лекарственных препаратов ученые работают в трех направлениях: а) получение новых веществ на основе знания молекулярных процессов, в которые требуется вмешаться; б) создание аналогов природных веществ, уже зарекомендовавших себя в клинике; в) скрининг («просеивание через сито») множества веществ, которые просто завалялись на полке и вроде бы должны действовать. Примеры новых ангиостатиков хорошо иллюстрируют эту схему.

Рис.1.4 На фотографии показано, как природный ангиостатический препарат фумагиллин предотвращает развитие новых кровеносных сосудов на препарате ткани цыпленка (Б). А - контрольный образец

Первый класс веществ, которые сейчас испытываются в качестве противоопухолевых препаратов, - соединения, непосредственно блокирующие рост эндотелиальных клеток. К этой категории веществ относится уже упомянутый природный белок эндостатин. Его синтетический аналог комбрестатин А4 - химическая модификация соединения, содержащегося в древесине южноафриканского дерева Combretum caffrum, - проходит клинические испытания. Препарат также проявляет способность подавлять размножение клеток сосудов, стимулируя клеточный апоптоз. В настоящее время большое внимание уделяется созданию веществ, блокирующих размножение уже активированных клеток эндотелия. Из них наиболее удачным по активности и малой токсичности является синтетический препарат TNP-470, прошедший клинические испытания при раке почек, шейки матки и саркоме Капоши.

Рис.1.5 Продукт метаболизма грибковых микроорганизмов фумагиллин - один из наиболее сильных блокаторов роста сосудов. Его синтетический аналог TNP-470 стал первым ангиостатическим препаратом, прошедшим клинические испытания

Ко второй группе препаратов, тормозящих рост сосудов, относятся природные или синтетические вещества, так или иначе блокирующие передачу сигнала на рецепторы факторов роста. Как уже было сказано, ФРЭС взаимодействует с эндотелиальными клетками посредством специальных белковых структур - рецепторов. Клетки здорового организма к этим веществам - блокаторам рецепторов нечувствительны. На стадии клинических испытаний находится талидомид. Талидомид оказался эффективным при лечении больных миеломой, раком простаты и легких, саркомой и ганглиобластомой.

Рис.1.6 Классы блокаторов ангиогенеза

К третьей группе веществ, подавляющих прорастание сосудов, а, следовательно, и рост опухоли, относятся блокаторы (ингибиторы) активности опухолевых ферментов - металлопротеаз, которые разрушают внеклеточный матрикс и оболочку сосуда, давая клеткам эндотелия возможность мигрировать в сторону опухоли. Разработка препаратов такого типа действия - приномастата, маримастата и СOL-3 - находится на стадии клинических испытаний.

1.3 Современные методы исследования строения кровеносных сосудов

В настоящее время существует ряд методов исследования строения сосудов.

Наливка сосудистого русла смесью тушь-желатин

Это одна из первых методик исследования строения сосудистого русла. Методика заключается в следующем: сосуды промываются от крови, готовится раствор тушь-желатин и приготовленный теплый раствор вводится в сосудистую систему.

Приготовленные препараты изучаются с помощью светового микроскопа.

Недостатки методики:

1. Возможно изучение только тонких препаратов или тонких оболочек (капсула почек, брыжейка).

2. Невозможно реконструировать 3-ехмерную модель.

3. Толстые препараты необходимо нарезать, что влечет потерю препарата.

Окраска сосудистого русла азотнокислым серебром (AgNO3)

Повторение методики заполнения сосудистого русла раствором тушь-желатин, только контрастным веществом является AgNO3.

Недостатки методики:

1. Возможно изучение только тонких препаратов или тонких оболочек (капсула почек, брыжейка).

2. Невозможно реконструировать 3- мерную модель.

3. Толстые препараты необходимо нарезать, что влечет потерю препарата.

Растровая электронная микроскопия сосудистых слепков из пластмассы

Методика заключается во введении в отмытые от крови сосуды быстрополимеризующегося мономера, обычно метилметакрилата (ММА). После того, как мономер заполимеризовался в сосудах ткань вокруг полимера удаляют, подвергая препарат щелочному гидролизу (обработка щелочами NaOH или KOH). Полимерный слепок изучают на растровом электронном микроскопе.

Недостатки:

Сложная технология.

Толстые образцы сложно приготовить для электронной микроскопии (на их поверхности происходит накопление зарядов, что приводит к появлению дефектов изображения).

Поэтому возникла идея разработки нового метода исследования строения сосудистого русла, которая позволила бы преодолеть многие из недостатков.

Разработанная нами методика состоит в том, чтобы

а) заполнить сосудистое русло микросферами, окрашенными флуоресцентным красителем;

б) использовать флуоресцентную конфокальную микроскопию для исследования строения сосудов.

По нашему мнению, метод лишен недостатков перечисленных выше и обладает некоторыми достоинствами:

- возможность реконструировать 3-ехмерную модель сосудистого русла;

- препарат остается целым после исследования.

1.4 Флуоресцентная конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия и созданные на ее основе конфокальные лазерные сканирующие микроскопы (КЛСМ) - принципиально новое направление в световой микроскопии. С возникновением методов конфокальной сканирующей микроскопии появилась возможность путем послойного сканирования просматривать детали объемного препарата на некоторой его глубине, что не позволяет делать обычный, даже самый совершенный микроскоп из-за рассеяния и преломления света на оптически неоднородных фрагментах.

Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности - исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов исследования (т.е. клеточной активности) в четырех измерениях - высота, ширина, глубина и время. Для качества изображения и глубины исследования наиболее важную роль играет способность ткани к пропусканию света, иначе говоря, прозрачность ткани [10].

Большинство современных конфокальных микроскопов построено на базе люминесцентного (прямого или инвертированного) микроскопа. Следовательно, объекты исследований должны быть предварительно окрашены соответствующим люминесцентным красителем или обладать собственной люминесценцией. Иногда микроскоп имеет т.н. «детектор проходящего света», который позволяет наблюдать и неокрашенные объекты в режиме интерференционного контраста.

Способ конфокального сканирования трёхмерных микрообъектов был предложен ещё в 50-х годах прошлого столетия, но первые коммерческие 3D-микроскопы появились только к концу 80-х. В настоящее время наибольшее распространение получила лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM - Laser Scanning Confocal Microscopy). Объёмное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом (~ 50 мкм) отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе (рис. 1.7).



Рис. 1.7 Оптическая схема конфокальной сканирующей системы [11].

Устройство современных LSCM - микроскопов намного сложнее и включает лазерные модули, несколько фотоумножителей (PMT), акустооптические туннельные фильтры (AOTF), светоделительные пластинки, сканерный модуль и многое другое.

Подобное усложнение обеспечивает широкий выбор спектральных линий когерентного освещения и возможность параллельной регистрации флуоресценции с различными длинами волн. Скорость сканирования зависит от разрешения и у микроскопа LCM 510 при разрешении 512х512 составляет примерно 1/5 секунды на слой [11]. При максимальном разрешении 2048х2048 сканирование каждого слоя занимает более секунды, и считывание объёмного изображения может продолжаться десятки минут.

Максимальная глубина сканирования при использовании объективов с минимальным увеличением и водной иммерсией достигает 3…4 мм, что вполне приемлемо для не слишком толстых образцов, но для сканирования крупных объектов с высоким разрешением необходима панорамная съёмка объёмных блоков с последующей компьютерной стыковкой нескольких десятков или сотен трёхмерных изображений. Даже при минимальном разрешении микроскопа продолжительность такого сканирования будет измеряться часами, что неприемлемо для большинства биологических объектов.

Значительно более высокая скорость сканирования характерна для SDCM (Spinning Disk Confocal Microscopy). [12] В микроскопах подобного типа используется вращающийся диск с тысячами отверстий. Его прототипом стало датируемое ещё 1884 годом изобретение германского учёного, обеспечивающее передачу изображений на расстояние. Принцип такой передачи показан на рис. 1.8.

Рис. 1.8 Принцип передачи изображения на расстоянии при помощи Nipkow-диска [12]

Современный аналог Nipkow-диска содержит 20 тысяч расположенных по спирали отверстий, причём лазерный луч фокусируется на них при помощи дополнительного диска с 20 тысячами микролинз. При вращении такого двойного диска объект сканируется сразу множеством (~1000) световых фокусов, обеспечивая считывание 360 кадров (плоскостей) в секунду [13] или даже 1 кадр за миллисекунду. [14] Схема этого устройства показана на рис. 1.9.

Рис. 1.9 Схема устройства дисковой системы CSU10 [15]

Каждый оптический фокус, образуемый парой микролинза-отверстие и объективом, при вращении диска перемещается по слегка искривлённой (дуговой) траектории. Линзы и отверстия расположены на диске по спирали, поэтому траектория каждого следующего фокуса немного смещена и вращение диска обеспечивает сканирование всей фокальной плоскости объекта. Регистрирующим устройством в такой системе служит камера с CCD-матрицей, на которой конфокальная оптика формирует изображение перемещающихся фокусов.

Дисковым сканирующим микроскопам присущи два основных недостатка. Первый связан с необходимостью точной синхронизации скорости вращения диска (1800 об./мин. у CSU10) и частоты считывания сигнала CCD. Без такой синхронизации на изображении появляются многочисленные полосы. В последней модели дисковой системы корпорации Yokogawa (CSU22) предусмотрена возможность варьирования скорости вращения диска, упрощающая настройку микроскопа. [16]

Вторая проблема заключается в недостаточной чувствительности обычных CCD при высоких скоростях сканирования и необходимости применения ICCD (Intensified CCD), имеющих встроенный фотоумножитель, или EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device), способных работать в режиме счётчика фотонов. Это существенно повышает стоимость регистрирующей системы.

Общим недостатком сканирующих микроскопов типа LSCM и SDCM является заметная фоновая флуоресценция объектов, находящихся не в фокусе лазерного луча. Более контрастные объёмные изображения можно получить при помощи сканирующей двухфотонной или мультифотонной (MPE - MultiPhoton Exitation) микроскопии. Нелинейность зависимости MPE от интенсивности освещения обеспечивает максимальную флуоресценцию центральной части светового фокуса и повышает разрешающую способность микроскопов этого типа и контрастность изображения (рис. 1.10).



Рис. 1.10 Трёхмерные изображения поверхности гранул пыльцы [14]

а) мультифотонная сканирующая микроскопия;

б) обычная конфокальная сканирующая микроскопия.

Благодаря отсутствию внефокусной флуоресценции MPE-микроскопы могут работать без обычного для LSCM фильтрования света через микроотверстие. В мультифокусных системах сканирования (SDCM) при мультифотонном возбуждении флуорофоров диск с отверстиями тоже излишен. Достаточно одного диска с микролинзами

Современные 3D-микроскопы, как правило, способны работать и в обычном, и в MPE режимах. Кроме того, в них сохраняется возможность визуального наблюдения сканируемых объектов. Следствием является непомерная (для России) стоимость приборов данного типа.

Получаемые с помощью сканирующих микроскопов виртуальные трёхмерные изображения высокого разрешения позволяют заглянуть в микромир и по информативности несопоставимы с обычными двухмерными картинками.

На рисунке 1.12 показан конфокальный микроскоп Nikon

Рис.1.12 а) блок лазеров (аргоновый л=488 нм; геленеоновый л=596 нм); б) слева - система управления сканированием лазеров в микроскопе; в центре - блок питания ртутной лампы; справа (вверху) - блок питания лампы накаливания; справа (внизу) - блок детекторов; в) микроскоп.

1.5 Сканирующая электронная микроскопия

В последнее время сканирующие электронные микроскопы (СЭМ) заняли прочное место среди исследовательских приборов универсального применения. Исследователи, работающие на современных моделях СЭМ, отмечают такие качества этих приборов, как большую наглядность, легкую интерпретируемость изображений, высокую разрешающую способность, хорошую информативность сканирующей электронной микроскопии. К этому можно добавить относительную простоту приготовления образцов для СЭ микроскопии в сравнении с методами подготовки препаратов для просвечивающей электронной микроскопии.

В основу СЭМ положен принцип формирования изображений на экране электронно-лучевой трубки (ЭЛТ) с помощью развертки, синхронной с разверткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого объекта. При этом яркость каждой точки экрана ЭЛТ соответствует интенсивности одного из вторичных излучений, возникающих при взаимодействии электронного луча с веществом объекта в определенной точке его поверхности.

Выбор вторичного излучения, несущего информацию о поверхности, производится путем подключения нужного детектора к входу видеоусилителя. Естественно, что для регистрации каждого вида вторичного излучения требуется свой детектор, чувствительность которого к данному излучению максимальна. Количество детекторов, имеющихся в СЭМ, зависит от класса прибора (чем выше класс, тем их больше).

Любой современный научный прибор, дающий информацию об объекте исследования в форме изображения, снабжается блоком фиксирования этой информации. Только в этом случае возможна объективная оценка и последующая обработка полученных данных. СЭМ в этом смысле весьма удобен, так как позволяет представить визуальную информацию в удобной для фотографирования форме.

Для получения высококачественных микрофотографий используют медленные развертки с числом строк не менее 2000 и вертикальной скоростью не менее 50 с на кадр, повышая, таким образом, плотность электронного облучения поверхности и улучшая отношение сигнал/шум.

С помощью СЭМ можно получать стереомикрофотографии (стереопары). Для этого делают 2 снимка с одного и того же участка образца, причем для второго снимка его наклоняют на 5-10° по отношению к первоначальному положению, сохраняя при этом центральную деталь поля зрения в центре экрана. Полученные фотоотпечатки монтируют на одном листе бумаги с соблюдением взаимного расположения правого и левого снимков и рассматривают в стереоскоп. Существуют специальные стереометрические устройства, позволяющие рассчитывать по стереопарам истинные расстояния между точками изображенной поверхности и восстанавливать взаимное расположение структур в пространстве.

Если биологический объект обладает низкой электропроводностью и (или) неплотно прилегает к поверхности держателя, то при сканировании электронным зондом объект будет заряжаться. Для достижения высокой степени разрешения приходится прибегать к специальным мерам обеспечения электропроводности. Главной мерой является покрытие объекта слоем металла.

Покрытие металлом предотвращает образование электрических зарядов на поверхности объекта, способствует отведению тепла, генерируемого взаимодействием электронов зонда с объектом (перегревание объекта в процессе СЭ микроскопии может вызвать смещение и повреждение объекта), способствует достижению более высокой разрешающей способности и механически стабилизирует поверхность объекта.

Для создания покрытия используют тяжелые металлы и их сплавы: Au, Pt, Ag, Au/Pd, Pt/Pd.

Покрытие объекта производится в специальной вакуумной камере и может быть осуществлено двумя способами: путем испарения нагреваемого металла и путем «выбивания» атомов металла, бомбардируемого ионами инертного газа.

1.6 Флуоресцентные метки

Полупроводниковые нанокристаллы или квантовые точки (КТ)

Использование полупроводниковых нанокристаллов в качестве флуоресцентных меток позволяет получать многоцветные изображения биологических сред, таких как, например, живые ткани. Наиболее распространены водорастворимые КТ из селенида кадмия-сульфида цинка. КТ имеют полосу поглощения в разы большую, чем соответствующая у других типов меток, используемых для мультифотонной микроскопии. Метки визуализировались динамически через кожу на глубине сотен микрометров. КТ - яркие, фотостабильные флуорофоры. КТ учитывают фактор многоцветности биологических образцов [17], поэтому они особенно полезны для флуоресцентного изображения живых тканей, где сигналы могут быть искажены рассеянием. Мультифотонная микроскопия дает возможность получать изображения различных биологических объектов на большой глубине без каких-либо размытостей, какие имеются, например при широкопольной или конфокальной микроскопии, и сейчас мультифотонная микроскопия стала основным методом флуоресцентного исследования толстых образцов [18,19].

Было разработано несколько методик синтеза КТ, таких как функционализация поверхности водорастворимыми лигандами [20,21], силанизация поверхности [22,23] и инкапсуляция в мицеллы блок-сополимеров [24]. Исследовались фотофизические свойства водорастворимых CdSe-ZnS нанокристаллов, полученных методом энкапсуляции нанокристаллов в амфифильный полимер [25]. Размер КТ подходит для ангиографических исследований, и является аналогом общепринятых для использования в этих целях флуоресцентных декстранов [26]. Были исследованы изображения 2-х типов тканей - кожи и жировой ткани. При исследовании здоровой кожи, толщина дермы у мышей составляла 900 нм, были обнаружены четко видимые сосуды, содержащие КТ (рис. 1.13 В). Концентрация КТ в крови составляла примерно 1 мкмоль/л при этом полученные изображения имели яркость в 5 раз более высокую (рис. 1.13 А), чем при исследовании образца, заполненного FITC-декстраном (флуоресцеина диизоционатом) с концентрацией в крови примерно 40 мкмоль/л (предел растворения декстрана в крови) (рис. 1.13 D).

Рис. 1.13 In vivo изображения сосудов, помеченных водорастворимыми КТ (длина волны 550 нм). A - капилляры, содержащие КТ концентрацией 1 мкмоль/л хорошо видны через кожу (на глубине ~100 мкм). Голубой фон - это флуоресценция коллагена. Пунктирной линией показано положение среза B. B - Скорость сканирования (13,7 мс/линия). Диаметр капилляра 5 мкм. C - увеличенное изображение с рисунка B. D - сравнительное изображение той же области, что и на A, но полученное при заполнении сосудов FITC-декстраном, с концентрацией равной его пределу растворимости в крови. E - Изображение жировой ткани (голубой цвет - аутофлуоресценция жировой ткани, желтый цвет - 20 нм КТ). F - Проекция капиллярной структуры в препарате глубиной 250 мкм (жировая ткань, 50 изображений, срезы через 5 мкм).

Получение биосовместимых водорастворимых полупроводниковых CdSe/ZnS КТ, покрытых полисилоксановой оболочкой

Гидрофобные нанокристаллы CdSe/ZnS типа ядро-оболочка с размером ядра 2-5 нм помещались в полисилоксановую оболочку и функционализировались меркапто- или аминогруппами. Полученная полисилоксановая оболочка имела толщину 1-5 нм, в итоге полученные частицы имели размер 6-17 нм, в зависимости от размера затравочных частиц CdSe. Покрытие КТ полисилоксановой оболочкой значительно не измененяет оптических свойств нанокристаллов. Их длина волны флуоресцентного излучения составляла 32-35 нм - полная ширина кривой испускания на уровне полумаксимума и КТ могли быть настроены на цвета от голубого до красного с квантовым выходом более 18%. КТ покрытые полисилоксановой оболочкой демонстрируют большую фотохимическую стабильность по сравнению с другими органическими флуорофорами. Они также показывают высокую стабильность в буферах при физиологических условиях (<150 ммоль/л NaCl). Введение функциональных групп на поверхность полисилоксановой оболочки может обеспечить возможность конъюгации нанокристаллов для биологического применения.

CdSe/ZnS ядро/оболочка нанокристаллы были получены в триоктилфосфиноксиде (TOPO) согласно процедуре описанной в статьях [27,28-30]. Нанокристаллы хранились при комнатной температуре в смеси бутанол/TOPO (1/2 по объему) с концентрацией CdSe ядер 5-10 мг в 1 мл раствора и были стабильны в течение месяца. Для последующего оксидирования ядер не проводилось никакой специальной подготовки.

Типовой синтез нанокристаллов, покрытых полисилоксановой оболочкой, изображен на рис.1.14 Количества исходных веществ могут быть легко померены и рассчитаны для получения нанокристаллов с любым размером в интервале 2-8 нм. 1 мл нанокристаллов в смеси бутанол/TOPO (оптическая плотность нанокристаллов примерно 2) осаждались, используя дегидрированный метанол. Влажный осадок разбавлялся 50 мкл меркаптопропилтриметоксисилана (MPS, HS(CH2)3Si(OCH3)3). После взбалтывания добавляли 5 мкл раствора гидроксида тетраметиламмония (TMAH) в метаноле и раствор становился оптически прозрачным. Эта смесь разбавлялась 120 мл дегидрированного метанола, доведенного до pH=10, путем добавления 750 мкл TMAH, и выдерживалась под азотом в трехгорлой колбе. После одного часа медленного размешивания раствор нагревали до 60°С в течение 30 минут. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 90 мл метанола, 10 мл воды, 600 мкл 3-(тригидроксисилил)пропилметилфосфоната ((OH)3Si-(CH2)3-PO3-Na+) и 20 мкл меркаптопропилтриметоксисилана, размешивали 2 часа, затем нагревали до 60°С менее чем за 5 минут и охлаждали до 30єС. Оставшиеся гидроксильные группы сшивались после добавления 20 мл метанола и 2 мл хлортриметилсилана и раствор снова размешивали в течение 2 часов. Раствор нагревали до 60єС в течение 30 минут и оставляли при комнатной температуре на 2-4 дня, перемешивая его в атмосфере азота. На следующей стадии раствор концентрировали в 2-5 раз в РПИ (роторно-пленочном испарителе) и снова оставляли на 24 часа. Затем проводили диализ раствора в трубке, отсекающей фракцию с молекулярной массой 10000 метанолом в течение 1 дня с последующей фильтрацией через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Избыток непрореагировавшего хлортриметилсилана удаляли с помощью устройства для фильтрования при центрифугировании. Объем раствора после этого уменьшался до 2 мл. Раствор нанокристаллов, покрытых полисилоксановой оболочкой в метаноле оставляли на 12 часов перед тем, как пропустить его через экстракционную колонку. Использовали колонки длиной 20 см с диаметром 0,7 см заполненные раствором примерно 5 г Sephadex G25 (сшитый гель декстрана), уравновешенного 10 ммолярным фосфатным буфером до pH=7. Объем вытесненного раствора (элюата) составлял примерно 3 мл. Экстракция продолжалась в течение нескольких часов, и затем элюат фильтровали через ацетатный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Дополнительно проводили еще один диализ этого раствора дистиллированной водой в течение 1-4 дней, пропускали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и концентрировали до нужной концентрации в вакуумном концентраторе при 60єС. На последней стадии раствор центрифугировали при 20000g в течение 30 минут и осадок удаляли. А супернатант хранили до использования при н.у.

Рис.1.14 Описание метода инкапсуляции CdSe/ZnS нанокристаллов типа ядро-оболочка в полисилоксановую оболочку. Частицы CdSe/ZnS типа ядро/оболочка помещали в чистый меркаптопропилтриметоксисилан и получали их гидролизованную форму, как изображено на рисунке. После повышения pH меркаптопропилтриметоксисилан замещал TOPO (триоктилфосфиноксид) молекулы на поверхности нанокристаллов. Метоксисиланольные группы (Si-OCH3) гидролизовались в силанольные группы (Si-OH) и образовывали первичный полимерный слой. При нагревании свободные гидроксильные группы взаимодействовали, образуя силоксановые связи и выделяя молекулы воды. Затем добавляли 3-(тригидроксисилил)пропилметилфосфонат, который соединялся с оболочкой и фунционализировал поверхность нанокристаллов. На последней стадии (не показана) оставшиеся гидроксильные группы превращали в метокси-группы; эта последняя стадия предотвращала дальнейший рост кремнийорганической оболочки.

Свойства и преимущества применения полупроводниковых КТ в биологических целях

Полупроводниковые нанокристаллы полученные в качестве флуоресцентных проб для биологического окрашивания и диагностики по сравнению с обычными флуорофорами имеют узкий, настраиваемый и симметричный спектр излучения и они фотохимически стабильны. Преимущества широкого непрерывного спектра возбуждения были показаны в эксперименте на мышиных фибробластах.

Флуоресценция это широко используемый в биологических целях инструмент. Стремление к измерению большего числа биологических индикаторов одновременно налагает новые требования к флуорофорам, используемым в этих экспериментах. К примеру, восьмицветовая, трехлазерная система используется для измерения 10 параметров клеточных антигенов при проточной цитометрии [31] и в цитогенетике, комбинированное меченье используется для генерирования 24-ех окрашенных проб [32]. Молекулы общепринятых красителей налагают строгие требования к оптической системе, используемой для измерений; их узкий спектр возбуждения одновременно затрудняет возбуждение во многих случаях.

В полупроводниковых нанокристаллах оптическая плотность и максимум испускания сдвигаются к более высокой энергии с уменьшением размера [33]. Отслеживание спектров возбуждения и поглощения привело к выводу, что это настраиваемые флуорофоры, которые могут возбуждаться при любой длине волны короче максимума испускания, при этом испуская с одинаковым спектром (узким, симметричным) рис.1.15 В. Изменение материала, используемого для получения нанокристаллов, и изменение их размеров приводит к сдвигу пика испускания в спектральном диапазоне от 400 нм до 2 мкм (рис.1.16), с типичной шириной пика 20-30 нм (ширина пика при половинном максим (FWHM)) в видимой области спектра и большими коэффициентами гашения в видимой и УФ областях (примерно 105 моль-1см-1). Поэтому нанокристаллы различных размеров могут возбуждаться одноволновым источником света, что приводит к различным цветам испускания, которые можно детектировать одновременно.

Рис.1.15 Спектры возбуждения (пунктирная линия) и флуоресценции (жирная линия) флуоресцеина (А) и типичных КТ в фосфатном буфере (В). Флуоресцеин возбуждается при 476 нм и КТ при 355 нм. Спектр возбуждения регистрировался при 550 нм для флуоресцеина и при 533 нм для КТ из-за различия их спектров излучения. КТ имеют более узкий спектр излучения (32 нм против 45 нм при половинном максимуме и 67 нм против 100 нм при 10% от максимума у флуоресцеина), не имеют хвоста в красной области и имеют широкий непрерывный спектр возбуждения.

Нанокристаллы, помещенные в полисилоксановую оболочку, широко использовались в биологических экспериментах [34,35]. Использование КТ в биологических целях на самом деле более проблематично из-за большой площади поверхности КТ, что может приводить к тушению люминесценции и фотохимическому распаду. Помещая ядро нанокристалла из одного материала в оболочку из другого, ограничивается возбуждения ядра, ликвидируются безизлучательные переходы, и предотвращается фотохимический распад КТ. Синтез КТ и наращивание оболочки, методами, описанными в литературе, дает на выходе граммовые количества КТ с узким распределением по размерам (5%), покрытых ПАВом, но растворимых только в неполярных растворителях [36].

Биологическое применение требует, чтобы КТ были водорастворимы. Для этого на КТ типа ядро/оболочка наносят третий слой - полисилоксановый, что делает КТ водорастворимыми. Модификация полисилоксановой оболочки различными функциональными группами может использоваться для контроля взаимодействия с биологическими образцами. КТ типа ядро/оболочка, полученные таким методом, растворимы и стабильны в воде или буферных растворах, и они сохраняют большой четкий квантовый выход (до 20 %, по сравнению с общепринятыми красителями у которых он составляет от 14 до 71% [37] (рис.1.16 В). Ожидается, что дальнейшее развитие возможностей КТ приведет к более высокому квантовому выходу и увеличению других иммиссионных свойств [38]. Эту методику применили к ряду КТ типа ядро/оболочка различных размеров, образовав спектрально настроенный набор образцов, каждый из которых подвергся одинаковой модификации поверхности (в отличие от органических красителей, химия которых обычно специфична в каждом случае).

Чтобы установить полезность КТ для биологического применения помечали 3Т3 мышиные фибробласты, используя СdSe/CdS КТ типа ядро/оболочка 2-х различных размеров. Меньшие КТ (ядро 2 нм) имели зеленую флуоресценцию (максимум 550 нм, квантовый выход 15%), большие (ядро 4 нм) имели красную флуоресценцию (максимум 630 нм, квантовый выход 6%). Поверхность КТ может быть функционализирована таким образом, чтобы КТ связывались с биологическим образцом посредством ковалентных связей, электростатического взаимодействия или водородных связей.

Рис.1.16 (А) - спектры нескольких наборов КТ различных размеров, покрытых полисилоксановой оболочкой. Синяя серия - КТ CdSe [39] с диаметрами 2,1; 2,4; 3,1; 3,6 и 4,6 нм (слева направо). Зеленая серия - КТ InP [40] с диаметрами 3,0; 3,5 и 4,6 нм. Красная серия - КТ InAs [39] с диаметрами 2,8; 3,6; 4,6 и 6,0 нм.

(В) - фотография серии нанокристаллов, покрытых полисилоксановой оболочкой, с ядром CdSe и оболочкой ZnS или CdS в водном буфере, все одновременно облучались переносной УФ-лампой.

1.7 Методы окрашивания полимерных микросфер флуоресцентными красителями

Известно большое количество люминесцентных веществ, способных придавать яркий цвет ряду пластиков, таких как полистирол и полиметилметакрилат. Одним из важных параметров, которые необходимо учитывать при выборе красителя, является стоксов сдвиг (разница между длинами волн пиков возбуждения и эмиссии) [41-43]. В том случае, когда длина света возбуждения близка к длине волны пика эмиссии, требуется использовать специальные фильтры для разделения и оценки интерферирующих волн. Применение таких фильтров уменьшает интенсивность флуоресцентного сигнала. Поэтому желательно применять красители, которые обладали бы широким стоксовым сдвигом, так как он увеличивает доступность считываемости флуоресцентного сигнала [44].

Другим плюсом применения красителей с широким стоксовым сдвигом является возможность детектирования ими окрашенных материалов в присутствии других флуоресцентно окрашенных материалов. Это особенно важно при применении этих красителей в биотехнологии для создания материалов, вводимых в живые организмы. Желательно, чтобы в этом случае флуоресцентный сигнал вводимого материала излучал при длине волны, на которой флуоресценция фона минимальна [45-48].

Третьим преимуществом применения флуоресцентных красителей с широким стоксовым сдвигом является возможность детектирования смеси анализируемых веществ в одном объеме при действии волны возбуждения одной длины. Используя два или более различных флуоресцентных красителей, каждый из которых может возбуждаться при одной и той же длине волны, пики их эмиссии можно детектировать при различных длинах волн, где каждый спектр эмиссии является характеристикой одного из анализируемых веществ. При этом пики эмиссий флуоресцентных меток хорошо разделимы друг от друга, и, следовательно, факторы корреляции между различными красителями минимальными.

Флуоресцентные красители с широким стоксовым сдвигом могут быть использованы в сочетании с флуоресцентными красителями с меньшим значением этого параметра, при этом оба материала могут возбуждаться при одной и той же длине волны, а излучать при разных, давая несколько сигналов, разделимых на оптическом фильтре монохроматора [49].

Отметим, что важным параметром при выборе красителей также является стабильность флуоресцентной метки.

Все методы окрашивания микросфер можно разделить на три группы: (а) окрашивание путем ковалентного присоединения красителя к поверхности частицы, (б) окрашивание путем введения красителя на стадии полимеризации частиц, (в) окрашивание уже заполимеризованных частиц путем диффузии молекул красителя в их объем.

В первом случае флуоресцентно окрашенные микросферы получают путем ковалентного присоединения функциональных групп молекул одного или нескольких красителей к функциональным группам полимера, расположенным на поверхности частиц [50-52]. Недостатком данного метода является то, что молекулы красителя располагаются на поверхности частиц, не проникая при этом в объем микросфер, что ограничивает применение данного метода.

Равномерного окрашивания по объему частицы можно добиться при добавлении флуоресцентного красителя во время процесса полимеризации. Некоторые исследователи предлагали проводить полимеризацию мономеров в присутствии красителя, некоторые - использовать красители, способные участвовать в процессе полимеризации [53]. Однако, первая группа исследователей столкнулась с проблемой, связанной с тем, что при действии на частицы, окрашенные двумя флуоресцентными красителями, светом одной длины волны, они получали один ответный сигнал [54]. А значит, такие частицы являются непригодными для многокомпонентного анализа особенно в проточных цитометрах с одним источником возбуждения.

Во втором случае молекула красителя должна быть способна к полимеризации. Но в этом случае можно ожидать, что флуоресцентный краситель будет ингибировать процесс полимеризации или что произойдет обесцвечивание красителя под действием одного из веществ реакции.

В статье [55] описан метод флуоресцентного окрашивания при проведении затравочной полимеризации. Один или несколько гидрофобных флуоресцентных красителей растворяют в растворе, содержащем мономер и инициатор, а затем этот раствор добавляют к частицам затравки. Авторы отмечают, что этим методом можно окрасить частицы тремя красителями. Однако этот метод также имеет все выше перечисленные недостатки.

Кумачева и др. предложили метод получения окрашенных частиц типа ядро-оболочка. На первом этапе проводили полимеризацию смеси двух мономеров и флуоресцентного красителя. А затем на частицах затравочной суспензии создавали оболочку путем сополимеризации метакрилата и бутилметакрилата в присутствии додецилмеркаптана. Таким способом были получены монолитные микросферы [56].

Другие ученые на последнем этапе полимеризации при создании оболочки к полимеризуемой смеси добавляли мономер с функциональными группами на поверхности, способными ковалентно связываться с объектами дальнейшего исследования. Весь процесс состоял из трех этапов: приготовление флуоресцентно окрашенного ядра частицы, инкапсулирование оксида метала в полистирольную оболочку, покрывающую окрашенное ядро, путем радикальной полимеризации в отсутствие эмульгатора, но с избытком инициатора, и обволакивание магнитной флуоресцентной частицы слоем функционального полимера. Таким образом, были получены частицы с карбоксильными, амино-, гидрокси- и сульфоновыми группами на поверхности.

Третий метод окрашивания полимерных микросфер основан на использовании в качестве начального материала готовых полимерных микросфер [57]. Окрашивание частиц происходит путем диффузии молекул красителя внутрь частицы. Жирорастворимый или гидрофобный краситель добавляют к растворителю или смеси растворителей, содержащих микросферы и набухают их в течение некоторого времени. В этом методе используют гидрофобные микросферы, так как это позволяет провести их набухание в неполярных растворителях, содержащих гидрофобные красители. В этом случае степень набухания частиц красителем зависит от степени сшивания полимера в частицах и регулируется временем набухания, природой и количеством растворителя (ей), а также количеством добавленного красителя. Изменяя эти параметры, можно получить частицы либо окрашенные равномерно по всему своему внутреннему объему, либо частицы, содержащие флуоресцентно окрашенные слои или сферические зоны желаемого размера и формы. Удаление растворителя останавливает процесс окрашивания. Микросферы, окрашенные таким способом, не «кровоточат» красителем в водных растворах или в присутствии анионных, неионных, катионных, амфотерных и цвиттерионных ПАВ. Частицы, окрашенные этим методом стабильны и однородны. Однако, во многих случаях, в зависимости от выбора системы растворителей, требуется большой избыток красителей для получения желаемой интенсивности окраски, что приводит к значительной потере дорогостоящего красителя [58].