Хроматографическое разделение углеводов

4

4

“Хроматографическое разделение углеводов”

ВВЕДЕНИЕ: ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную.

Историческая справка. Метод разработан в 1903 М. Цветом, который показал, что при пропускании смеси растительных пигментов через слой бесцветного сорбента индивидуальные вещества располагаются в виде отдельных окрашенных зон. Полученный таким образом послойно окрашенный столбик сорбента Цвет назвал хроматограммой, а метод - хроматографией. Впоследствии термин "хроматограмма" стали относить к разным способам фиксации результатов многих видов хроматографии. Однако вплоть до 40-х гг. хроматография не получила должного развития. Лишь в 1941 А. Мартин и Р. Синг открыли метод распределительной хроматографии и показали его широкие возможности для исследования белков и углеводов. В 50-е гг. Мартин и американский учёный А.Джеймс разработали метод газо-жидкостной хроматографии.

ПУТИ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА И ВОЗМОЖНОСТИ КЛАССИФИКАЦИИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

За последние годы в развитии теории и практики хроматографии имеются определенные успехи. Теория хроматографии получила успешное развитие в работах советских ученых С.Е. Бреслера, А.А. Жуховицкого, В.В. Рачинского, С.3. Рогинского, Г.В. Самсонова, О.М. Тодеса и Н.Н. Туницкого.

Однако теория хроматографии нуждается в дальнейшем углубленном развитии, в особенности в направлении предсказания оптимальных условий разделения сложных смесей в отдельных конкретных случаях, а также и в отношении учета особенностей сорбентов и носителей. Для решения сложных дифференциальных уравнений в настоящее время можно применять компьютерные методы, что позволяет значительно продвинуться в области теории хроматографии, освобождая исследователей от необходимости примене-ния приближенных методов решения. Недостаточно развивается также теория зависимости адсорбции и распределения веществ от их химиче-ского строения. В этом направлении были достигнуты успехи в работах А.В. Киселева, акад. П.А. Ребиндера.

П.А. Ребиндер вывел также правило уравнивания полярностей, имеющее важное значение для хроматографии. Хроматографические процессы на колонках и в толще бумаги в известной степени примыкают к области физико-механических процессов фильтрации истинных и коллоидных растворов, фильтрации и сорбции макромолекул, мицелл, эмульсий и суспензий.

Метод хроматографического анализа представляет собой один из видов физико-химического анализа, который отличается от других видов анализа в той же мере, в какой, например, весовой анализ от объемного.

Характерной чертой хроматографического метода является распреде-ление разделяемых веществ между двумя несмешивающимися фазами, приводящее к разделению компонентов данной смеси. При этом одна фаза может быть твердой, а другая газообразной или жидкой, или же обе фазы могут быть жидкими и помещенными на какой-либо носитель.

Вещества, заключающиеся в разделяемой смеси, в процессе хрома-тографического разделения перемещаются из одной фазы в другую.

Процесс хроматографического разделения смеси веществ состоит в пространственно-различном распределении каждого компонента данной смеси между двумя фазами, с последующим полным разделением смеси путем применения операции вымывания или вытеснения выделяемого вещества или получения осадка. Причиной такого разделения являются различия во взаимодействии каждого из компонентов данной смеси веществ, находящихся в первой фазе (растворитель), со второй фазой, называемой сорбентом (твердым или жидким), или с осадителем, помещенным на носителе.

Теоретически можно ожидать двух способов осуществления хроматографического процесса:

жидкая или газообразная фаза проходит через неподвижную твердую фазу (через колонку или мембрану);

твердый сорбент в виде зерен или мембраны перемещается в не-подвижной жидкой или газовой фазе, подвергаемой разделению.

Таким образом, нужно учитывать не только движение жидкости или газа через колонку сорбента или носителя, но и возможность движения сорбента или носителя через неподвижную жидкость или газ. Вероятно, могут быть предложены еще некоторые варианты хроматографических разделений, не укладывающиеся в эти типы разделений.

В основном хроматография является методом количественного раз-деления и определения компонентов сложной смеси. Это ее целевое на-значение. Поэтому усилия теории хроматографии должны быть направлены на достижение наибольших успехов в решении этой задачи, путем выяснения оптимальных условий разделения.

Формулировка особенностей хроматографического процесса должна предусматривать не только первоначальное распределение, но и последу-ющее промывание хроматограммы («проявление» по терминологии М. С. Цвета), обеспечивающее наиболее полное разделение компонентов данной смеси. Предложенная формулировка общих особенностей хрома-тографического процесса обращает внимание не только на причину разделения, но и учитывает характерные различия процессов разделения.

В реальном процессе хроматографии часто сочетаются различные виды сорбции, например молекулярная и ионообменная.

Первая существенная особенность хроматографических процессов -- это многократное повторение актов сорбции -- десорбции, ионного обмена или распределения между фазами и динамический характер этих процессов.

Вторая особенность -- наличие большой поверхности сорбента и большой поглотительной емкости.

Адсорбционной хроматографии применяется или промывание или вытеснение, в распределительной хроматографии -- только промывание, в ионообменной -- только вытеснение. Необходимо указать, что непосредственное получение зон чистых веществ в осадочной хроматографии объясняется тем, что операция проявления или вытеснения заменяется процессом выделения вещества в осадок, т. е. образованием новой, отдифференцированной фазы; пока не закончится выделение осадка одного состава, не начнется выделения осадка другого состава (Пример: две различные кристаллические модификации иодида ртути образуются на осадочных хроматограммах раздельно, так как они имеют различную растворимость).

На практике трудно осуществить в чистом виде только молекулярную, только полярную или только гомеополярную сорбции. Они всегда сочетаются в реальном хроматографическом процессе. Нужно принимать во внимание особенности сорбентов и носителей, учитывая, что не существует несорбирующих носителей, и что различные механизмы хроматографического процесса протекают одновременно и параллельно.

В свете высказанных соображений очень интересна работа В. И, Па-рамоновой с сотрудниками, предложившей изучать состояние вещества в растворе методом выходных кривых. Этим методом удалось доказать одновременное существование в растворе исследуемого химического эле-мента -- катионов, анионов, коллоидных частиц и нейтральных молекул. При этом применялись также и другие методы исследования, как, например, ультрафильтрование, диализ, электродиализ.

В работе В.А. Алесковского описан метод тонущих частиц, при-меняемый для анализа весьма разбавленных растворов и представляю-щих пример движения сорбента через толщу раствора.

Различные приемы хроматографии в настоящее время получают все большее применение, как методы химического анализа. В особенности ценно то, что хроматография открывает новые возможности системати-ческого или дробного бессероводородного метода анализа.

Различные виды хроматографических процессов могут быть сопо-ставлены на следующей схеме (табл. 1).

Вид хроматографии	Адсорбционная	Ионообменная	Распределительная	Осадочная Окислительно-восстановительная Комплексообразовательная
Действующие силы	Молекулярные	Молекулярные	Ионные	Ионные Переход электронов Гомеополярные связи
Агрегатное состояние сорбирующей фазы	Твердая	Жидкая	Твердая	Жидкая

В 1951 г. Стрейн предложил различать четыре вида хроматогра-фии (табл. 2).

Неподвижная хроматографи-рующая фаза	Поверхностно-активная твердая фаза	Ионообменная смола или пермутит	Связанные гели или жидкости	Химически реакционно-способные в-ва
Вид хроматографии	Адсорбционная хроматография	Ионография, радиоионография	Распредели-тельная хроматография	Хемихроматография

Наряду с этим Стрейн дал также классификацию подвижной жидкой фазы, применяемой в различных видах хроматографических процессов (табл. 3).

Вид растворителя жидкой подвижной фазы	Аполярные растворители (неионизирубщие)	Ионизирующие полярные растворители	Растворители, имеющие сродство к сорбенту	Растворители, реагирующие с растворенным веществом
Вид хроматографии	Хроматография аполярных растворенных в-в	Ионой обмен и электромиграция	Анализ вытеснением	Образование новых соединений с различными коэффициентами распределения и зарядами, путем комплексообразования

Методы распределительной и ионообменной хроматографии целесооб-разно сопоставить с другими методами анализа, например с такими, как микрокристаллоскопический, капельный, дробный и др.

Деление хроматографии на молекулярную, ионообменную, распреде-лительную, осадочную и другие ее виды можно сравнить с подразде-лением количественного объемного анализа на методы нейтрализации, окисления-восстановления, осаждения и комплексообразования. Совре-менная хроматография оказалась применимой как для качественных, так и для количественных определений./1/

Термины и определения

СОРБЕНТ -- твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и используемые в хроматографии в качестве неподвижной фазы.

АДСОРБЕНТ -- твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества. Адсорбентом заполнена хроматографическая колонка, в которой, в свою очередь, происходит разделение смеси веществ на отдельные компоненты.

СОРБАТ -- компонент анализируемой смеси, внесенной в хроматографическую колонку.

ЭЛЮЕНТ -- растворитель или смесь растворителей, предназначенная для прокачки анализируемой смеси через хроматографическую колонку (подвижная фаза).

ЭЛЮАТ -- раствор, выходящий из хроматографической колонки.

ХРОМАТОГРАММА -- графический результат хроматографического процесса. Хроматограммой (с точки зрения аппаратурного оформления) можно назвать зависимость отклика детектора хроматографа от времени при прохождении элюата через ячейку детектора. Хромато грамма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы (рис.2). Площадь или высота пика должна быть пропорциональна концентрации компонента в элюате.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из хроматографической колонки, заполненной определенным адсорбентом, через которую при определенной температуре прокачивается элюент определенного состава. ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ВЕЩЕСТВА -- время пребывания исследуемого вещества в хроматографе. На практике время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора. Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания.

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ НЕСОРБИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА-- время удерживания вещества, которое не адсорбируется (не удерживается) адсорбентом.

Рис. 1 Хроматограмма.

А -- амплитуда отклика детектора,

Т -- время, мин.,

tRi -- времена удерживания хроматографических пиков,

t'R1-- исправленные времена удерживания,

tM -- время удерживания несорбируемого вещества.

Углеводы

Углеводы - один из основных компонентов клеток и тканей живых организмов, обеспечивают все живые клетки энергией (глюкоза и ее запасные формы - крахмал, гликоген), участвуют в защитных реакциях организма (иммунитет). Из пищевых продуктов наиболее богаты углеводами овощи, фрукты, мучные изделия (крупы, овощи, фрукты и бобовые). Пища человека состоит примерно на 70% из углеводов. Углеводы используются в качестве лекарств (гепарин, сердечные гликозиды, некоторые антибиотики). Повышенное содержание некоторых углеводов в крови и моче служит важным диагностическим признаком отдельных заболеваний (сахарный диабет). Суточная потребность человека в углеводах составляет 400-450 г.

Углеводы входят в состав клеток и тканей всех растительных и животных организмов и по массе составляют основную часть органического вещества на Земле. На долю углеводов приходится около 80% сухого вещества растений и около 20% животных. Растения синтезируют углеводы из неорганических соединений - углекислого газа и воды. Углеводы являются очень распространенными природными соединениями, входят в состав растений и живых организмов. В растениях они образуются в результате фотосинтеза:

Углеводы относятся к той группе органических соединений, важнейшими представителями которой являются сахариды, крахмал, целлюлоза и камеди (гумми). Углеводы являются основным источником энергии для поддержания всех функций организма, в особенности деятельности мозга, и необходимы для метаболизма всех остальных питательных веществ. Углеводы синтезируются всеми зелеными растениями, и в организме человека либо усваиваются напрямую, либо откладываются в виде гликогена. Кроме того, углеводы могут формироваться в самом организме из некоторых аминокислот и глицероловой составляющей жиров./2/

Углеводы - органические соединения, состав которых обычно выражается общей формулой Сn(Н2О)m (n и m > 4)./2/

Известны также соединения, относящиеся к углеводам, состав которых не соответствует общей формуле, например сахар рамноза С6Н1205.

Углеводы обычно подразделяют на моносахариды, олигосахариды (продукты конденсации двух или нескольких молекул моносахаридов) и полисахариды. Среди олигосахаридов наибольшее значение имеют дисахариды (диозы) - продукты конденсации двух молекул моносахаридов./2/

Моносахариды

Моносахариды - твердые вещества, легко растворимые в воде, плохо - в спирте и совсем нерастворимые в эфире. Водные растворы имеют нейтральную реакцию на лакмус. Большинство моносахаридов обладают сладким вкусом, однако меньшим, чем свекловичный сахар. Моносахариды проявляют свойства спиртов и карбонильных соединений.(Примеры: глюкоза, фруктоза)./2/

Дисахариды

Дисахариды (биозы) при гидролизе образуют два одинаковых или разных моносахарида. Для установления строения дисахаридов необходимо знать: из каких моносахаридов он построен, какова конфигурация аномерных центров у этих моносахаридов (?- или ?-), каковы размеры цикла (фураноза или пираноза) и с участием каких гидроксилов связаны две молекулы моносахарида. Дисахариды подразделяются на две группы: восстанавливающие (мальтоза) и невосстанавливающие (сахароза)./2/

Полисахариды

Полисахаридами, или полиозами, называются углеводы, молекула которых при гидролизе распадается с образованием молекул моносахаридов (как известно, неспособных гидролизоваться). Таким образом, схематически полисахариды можно представить как ангидридоподобные соединения, образующиеся при выделении воды из нескольких молекул моносахаридов:

п молекул моносахаридов--(n--1)Н2О 1 молекула полисахарида

В зависимости от молекулярной массы и свойств полисахариды делят на две группы:

1. Олигосахариды (от греческого слова олигос -- немногий) -- низкомолекулярные полисахариды, молекула которых при гидролизе образует небольшое число молекул моносахаридов. Они растворимы в воде, способны кристаллизоваться, часто обладают, подобно моносахаридам, сладким вкусом.

2. Высшие полисахариды -- высокомолекулярные вещества, мало растворимые или совсем нерастворимыев воде, в большинстве случаев не кристаллизуются и не обладают сладким вкусом. Четкой границы между олигосахаридами и высшими полиозами не существует -- все они представляют собой непрерывный ряд полимерогомологов с постепенно увеличивающейся степенью полимеризации. Обычно к олигосахаридам относят полисахариды со степенью полимеризации до 8--10.

Разделение полисахаридов на группы олигосахаридов и высших полиоз оправдано не только с позиций оценки их молекулярной массы и указанных различий свойств, но и с позиции техники их исследования. Если при изучении олигосахаридов применяются обычные классические методы органической химии, то при исследовании высших полиоз помимо названных методов используются и приемы работы с высокополимерами. (Примеры: крахмал, целлюлоза). /3/

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА УГЛЕВОДОВ /3/

Выделение и очистка высших полиоз и углеводсодержащих биополимеров представляет собой исключительно трудную задачу. В природных условиях эти соединения находятся в виде сложных смесей с низкомолекулярными веществами, молекулами неуглеводной природы, наконец, с другими высокополимерными углеводами. Трудности возрастают в связи с тем, что, будучи весьма лабильными веществами, полисахариды под влиянием даже слабых воздействий легко подвергаются различным изменениям: часто происходят их деполимеризация, окисление и другие изменения. Факторами, вызывающими такие изменения, помимо применяемых реагентов (обычно щелочной или кислой природы) являются кислород воздуха (в связи с этим иногда выделение приходится вести в атмосфере азота), ферменты, находящиеся в клетке, часто связанные с самими полисахаридами (как, например, фэсфорилаза и амилаза, связанные с гранулами крахмала).

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ /4/

Основные принципы физического разделения

С разделением веществ приходится сталкиваться при каждом химическом синтезе, и оно является обычной стадией анализа. Как правило, разделение должно предшествовать идентификации вещества.

Разделение относительно просто, если отдельные компоненты смеси находятся в различных фазах. В этом случае оно может быть достигнуто фильтрацией, осаждением, центрифугированием и т. д. Напротив, если несколько веществ находятся в одной фазе, то нужно добиваться либо образования новой фазы путем химического превращения (например, перевода в осадок), либо применять физические методы разделения.

Физические методы разделения основаны на использовании кинетических явлений или фазовых равновесий. Фазовые равновесия лежат в основе таких методов разделения, как дистилляция, сублимация, кристаллизация, экстракция и адсорбция из газообразной или жидкой фазы. В этих процессах молекулы разделяемых веществ переходят через границу раздела фаз в обоих направлениях, причем они стремятся к такому состоянию распределения, при котором, несмотря на продолжающееся молекулярное движение через границу, в каждой из фаз устанавливается постоянная концентрация составляющих веществ.

В других методах разделения, где используются кинетические явления (например, при молекулярной дистилляции или диализе), напротив, происходит перенос вещества через поверхность раздела фаз по меньшей мере за счет одного сорта молекул и только в одном направлении, потому что перешедшие через границу молекулы удаляются от нее. Такие методы разделения имеют незначительную эффективность.

Если разделяемые компоненты мало различаются в отношении свойств, решающих для выбранного метода (например, давление пара, растворимость, адсорбируемость или размер молекул), то концентрирования вещества практически не происходит. В этом случае достаточного разделения можно достигнуть путем многократного использования элементарного акта разделения. Наглядным примером такого процесса может служить многократная экстракция. При дистилляции в ректификационной колонне с насадкой или тарелками также осуществляется ряд последовательных равновесных состояний между жидкостью и паром. Увеличение числа элементарных актов разделения ограничивается требованиями, которые предъявляются ко времени разделения, размерам аппаратуры и соответственно к расходу веществ. Кроме того, высокого обогащения одной из равновесных фаз желательным компонентом достигают только для простых (не выше тройных) систем. В случае многокомпонентных смесей наряду с чистыми веществами всегда получаются смешанные фракции.

Основной принцип хроматографического разделения

Значительное повышение степени разделения возможно, если эффект, вызванный повторным установлением фазовых равновесий, налагается на разделяющий эффект, обусловленный кинетическими явлениями. В данном случае улавливание и удаление молекул, выходящих с поверхности раздела фаз (из неподвижной фазы), осуществляется благодаря постоянному движению одной из фаз (а именно подвижной фазы). Выходящие из неподвижной фазы молекулы, как и при фазовом равновесии, попадают в нее снова, однако при достаточно быстром движении подвижной фазы они не достигают прежнего элемента объема неподвижной фазы, а попадают в ближайший элемент объема в направлении потока.

Высокая эффективность разделения может быть достигнута только благодаря частым фазовым переходам, поэтому неподвижная и подвижная фазы должны иметь большую поверхность соприкосновения, а внешние условия должны быть выбраны так, чтобы молекулы разделяемых веществ были способны к быстрому обмену между двумя фазами. Так как эффективность разделения снижается вследствие диффузионных явлений, то обе фазы всюду должны иметь небольшую толщину слоя, а поток подвижной фазы должен быть ламинарным.

Эти требования в первом приближении проще всего осуществляются, например, если подвижная фаза протекает под действием перепада давления в трубке, наполненной мелко раздробленным сорбентом в качестве неподвижной фазы. Такая трубка, наполненная сорбентом, называется хроматографической колонкой (подобно ректификационной колонке в случае дистилляции). Подлежащая разделению смесь вводится в подвижную фазу и вместе с ней поступает в колонку. Там каждый из компонентов смеси стремится распределиться между подвижной фазой и сорбентом в определенном отношении, соответствующем его адсорбируемости. Однако еще до того, как такое распределение успеет произойти, некоторая часть компонента в подвижной фазе продвинется дальше и на другом элементе поверхности неподвижной фазы должно возникнуть уже новое соотношение концентрации. Истинное равновесие между двумя фазами достигается в тем меньшей степени, чем больше скорость подвижной фазы. Так как компоненты смеси, погло-щенные в данный момент сорбентом, не участвуют в движении подвижной фазы, то каждому из них для прохождения колонки в общем требуется больше времени, чем для любой из молекул подвижной фазы. Разделение смеси достигается, если компоненты смеси обладают различными коэффициентами распределения между обеими фазами, т. е. если неподвижная фаза по-разному препятствует их прохождению по колонке.

Разделение веществ, основанное на этом принципе, называют хроматографией (что при буквальном переводе на русский означает «цветописание»). Первое хроматографическое разделение провел русский ботаник Цвет (1903 г.), который разделил этим способом хлорофилл на отдельные окрашенные компоненты.

В настоящее время хроматография применяется со многими методическими изменениями, которые имеют одну общую основу: разделение происходит вследствие частого перехода молекул отдельных компонентов смеси между двумя фазами, из которых одна является неподвижной фазой с развитой поверхностью, а вторая фаза (подвижная) перемещается относительно нее. Благодаря различному распределению разделяемых веществ между неподвижной и подвижной фазами они испытывают разное замедление в своем движении вдоль колонки.

РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

Подвижная и неподвижная фазы могут быть образованы различными веществами. В зависимости от их свойств и вида воздействия на разделяемые вещества различаются и виды хроматографии. Подвижная фаза, естественно, должна быть образована только веществами малой вязкости -- газами или маловязкими жидкостями, причем хроматография с газообразной или жидкой подвижными фазами имеет совершенно разное экспериментальное оформление и различается по элементарным процессам.

С этим обстоятельством связано разделение хроматографии на два основных вида. По агрегатному состоянию подвижной фазы различают газовую хромато-графию и жидкостную хроматографию.

Жидкая подвижная фаза в вертикальной колонке может протекать под действием собственного веса. Поскольку скорость диффузии разделяемых веществ в жидкости невелика по сравнению со скоростью диффузии в газе, то жидкую подвижную фазу необходимо пропускать через колонку медленно. Это влечет за собой увеличение продолжительности анализа, но позволяет также увеличить диаметр колонки и количество пробы без потери эффективности разделения. Напротив высокая скорость диффузии в случае газообразной подвижной фазы позволяет увеличить скорость потока этой фазы (можно работать с колонками с длиной более 10м) и уменьшить количество пробы и диаметр колонки. В этих условиях может быть достигнута значительно более высокая эффективность разделения, чем в случае жидкой подвижной фазы, так называемой разделяющей жидкости. Это явление аналогично экстракции, при которой также осуществляется распределительное равновесие.

Преимущество распределительной хроматографии состоит, во-первых, в том, что жидких неподвижных фаз с различными свойствами намного больше, чем адсорбентов, и, во-вторых, в том, что в данном случае неподвижная фаза обладает гомогенной поверхностью, тогда как поверхность даже самых лучших адсорбентов содержит различные центры повышенной адсорбционной способности. Эта неоднородность поверхности адсорбента препятствует равномерной адсорбции или десорбции, снижая тем самым эффективность разделения колонки и, кроме того, делая почти невозможным разделение сильно адсорбируемых веществ. В случае жидкой неподвижной фазы, напротив, сильно адсорбируемые вещества могут быть разделены без труда. Так как имеются неподвижные фазы самой различной полярности, то в настоящее время хроматография может быть применена практически ко всем веществам, поскольку они в какой-то степени растворимы и летучи. Чтобы осуществить хроматографическое разделение пары веществ, доста-точно иметь подходящую неподвижную фазу, в которой данные компоненты имели бы различную растворимость.Хотя распределительная хроматография была открыта как метод жидкостной хроматографии, преимущества ее полностью проявились только при использовании в газовой хроматографии, для которой характерны высокая разделяющая способность, малая величина проб и широкая область температур. Идея распределительной хроматографии с газообразной подвижной фазой была высказана еще Мартином и Сингом в 1941 г., но эксперимен-тально развита только Джеймсом и Мартином в 1952 г.

Для специальных целей разделения представляет интерес такой вид распределительной хроматографии, при котором используется различная способность компонентов к обратимому комплексообразованию с неподвижной фазой или с добавленным к ней веществом. Этот вид хроматографии (хроматография, основанная на комплексообразовании) делает возможным селективное разделение индивидуальных веществ или классов соединений.

Как показали Кремер и Мюллер (1951г), при применении адсорбентов в качестве неподвижной фазы в некоторых случаях переход вещества про-исходит не между подвижной фазой и адсорбентом, а между подвижной фазой и адсорбционным слоем, покрывающим адсорбент (хроматография с использованием адсорбционных слоев). Розелиус (1957) добился разделения инертных газов на адсорбционном слое из двуокиси углерода. Следовательно, неподвижной фазой в данном случае был газ.

Описанные виды хроматографии почти все экспериментально осуще-ствлены как с газообразной, так и с жидкой подвижными фазами. Целесооб-разно принять следующие их названия: распределительная газовая хроматография, газоадсорбционная хроматография на молекулярных ситах, адсорбционно-жидкостная хроматография, обменно-жидкостная хроматография.

На практике наблюдаются многочисленные промежуточные виды хро-матографии. Хроматография, основанная на комплексообразовании, всегда связывается с распределительной хроматографией, потому что комплексообразователь находится в жидкости. Между адсорбционной и распределительной хроматографиями не существует резкого разграничения. С одной стороны, на поверхности носителя, как покрытой, так и не покрытой жидкостью, может иметь место адсорбция, с другой -- адсорбционную хроматографию можно частично приблизить к распределительной путем модификации адсорбентов. Примером этого может служить хроматография на адсорбционных слоях. Наконец, при низких температурах колонок может проявиться адсорбция на поверхности жидкой неподвижной фазы.

Четкое разграничение отдельных видов хроматографии, очевидно, невозможно. Дести (1957) предложил в связи с этим классификацию только на основе агрегатного состояния обеих фаз:

хроматография газ -- жидкость (ГЖХ),

хроматография газ -- твердое тело (ГТХ),

хроматография жидкость -- жидкость (ЖЖХ),

хроматография жидкость -- твердое тело (ЖТХ).

Принцип действия жидкостного хроматографа

Рис. 2 Схема жидкостного хроматографа.

Любой жидкостной хроматограф состоит из следующих частей:

1 -- насос;

2 -- узел ввода пробы;

3 -- хроматографическая колонка;

4 -- детектор;

5 -- регистратор (самописец, интегратор или компьютер);

6 -- термостат колонок;

7 -- узел подготовки элюента с емкостями для элюента;

8 -- слив элюата или коллектор фракций.

Принцип действия хроматографа заключается в следующем: раствор анализируемой смеси с помощью УЗЛА ВВОДА ПРОБЫ вводится в верхнюю часть хроматографической КОЛОНКИ. С помощь НАСОСА анализируемая смесь прокачивается элюентом через хромотографическую КОЛОНКУ, в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки ЭЛЮАТ, содержащий отдельные компоненты анализируемой смеси, детектируется ДЕТЕКТОРОМ, показания которого регистрируются РЕГИСТРАТОРОМ.

Рис.3. Схема газохроматографической установки.

1 -- баллон со сжатым газом-носителем; 2 -- вентиль; 3 -- регулятор и измеритель скорости газа-носителя; 4 -- дозатор; ,5 -- проба; 6 -- хроматографическая колонка; 7 -- детектор; 8 -- выход газа; 9 -- питание детектора; 10 -- преобразователь сигналов; 11 -- ленточный самописец; 12 -- терморегулятор; 13 -- термостат.

ПРИМЕРЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ

1. Хроматография на колонках с углем/5/

Колоночная хроматография на угле была впервые описана в 1950 г.Уистлером и Дерсо. Они использовали этот метод для разделения углеводов на классы в зависимости от степени их полимеризации, т. е. моносахариды, дисахариды, трисахариды и т. д.

Согласно работе, разделение проводилось как ступенчатое элюирование углеводов водным спиртом из колонки, содержащей смесь угля с целитом. Этот метод получил распространение и особенно широко применялся для разделения серии гомологичных олигосахаридов. Однако разделения более сложных смесей, например олигосахаридов одного и того же класса, необходимо градиентное элюирование.

Хроматография на колонках с углем пригодна не только для разделения олигосахаридов, она также применялась для разделения кислых углеводов, многоатомных спиртов и их ацетатов, олигосахаридов, содержащих аминосахара, и метиловых эфиров сахаров. В каждом случае хроматография на угольных колонках, по-видимому, превосходит все другие методы, так как позволяет добиться желаемого разделения; однако, если нужно разделить сложную смесь, обычно необходимо предварительное градиентное элюирование. Новый метод разделения дисахаридов был опубликован в 1955 г.; он основан на способности некоторых дисахаридов образовывать в мягких условиях метилфуранозиды. Эти метилглюкозиды абсорбируются сильнее свободных сахаров.

Хроматография на угольной колонке удобна еще и тем, что угольная колонка обладает высокой емкостью, а это позволяет количественно выделить компоненты и разделить большие количества материала. На эффективность разделения не влияет присутствие неорганических солей или степень разведения раствора сахара. В лабораториях некоторых исследователей для дезактивации угля применялась концентрированная соляная кислота. Элм, Вильямс и Тизелиус насыщали уголь стеариновой кислотой (1% кислоты в 96%-ном спирте). Предварительная дезактивация или насыщение увеличивает возврат введенных в колонку веществ почти до 100%, позволяет элюировать сильно адсорбирующиеся высшие олигосахариды и улучшает разрешение зон. Чтобы исключить малое количество растворенного неорганического вещества, вносимое с наполнителем, указанные авторы часто считали удобным готовить колонки без целита. Если исключить целит проведение операций значительно упрощается в том случае, когда вместе целита применяют уголь двух степеней измельчения: смесь крупнозернистого угля и обычного дарко G-60.

МЕТОДИКА. (описано применение колонки, содержащей только уголь.). Равные весовые части угля дарко G-60 и целита № 535 смешивают в сухом виде, к смеси прибавляют воду и полученную жидкую пасту помещают в стеклянную хроматографическую колонку, закрытую снизу стеклянной ватой. Через колонку медленно, по каплям пропускают концентрированную соляную кислоту, чтобы дезактивировать уголь и отмыть следы железа и золы. После этого через колонку пропускают дистиллированную воду до получения нейтрального элюата. Для уменьшения длительности операций на этой и всех последующих стадиях можно применять отсасывание.

Сахара вводят в колонку в виде водного обычно 1--10%-ного раствора. Для эффективного разделения на каждый грамм смеси сахаров берут 150 мл смеси угля и целита. Разделение сахаров можно проводить как ступенчатым, так и градиентным элюированием. Например, смесь, содержащая по 1 г d-глюкозы, мальтозы и рафинозы, была разделена в колонке 3,4 X 17,0 см последовательным элюированием 800 мл воды, 1500 мл 5%-ного спирта и 700 мл 15%-ного спирта.

Для того чтобы избавиться от растворенного неорганического вещества, которое неизбежно сопутствует в целите, обычно применяют два метода. Так как неорганическое вещество становится относительно мало растворимым, после того как оно было высушено, исследуемый образец выпаривают досуха, смешивают с небольшим количеством воды и фильтруют. Такую операцию повторяют трижды, и этого обычно достаточно для удаления неорганического вещества. Другой способ заключается в следующем: к водному раствору прибавляют метиловый или этиловый спирт, смесь нагревают до 60° и выпавший хлопьевидный осадок удаляют фильтрованием.

2. Хроматография на колонке с целлюлозой/5/

Распределительная хроматография была впервые применена для разделения углеводов в 1949 г. С тех пор этот метод широко исполь-зуется в препаративной химии углеводов. Область применения этого метода в химии углеводов настолько обширна, что нет необходимости рассматривать частные примеры его использования.

МЕТОДИКА. В качестве колонок можно использовать обычные хроматографические трубки. Успех всякого разделения на распределительной колонке с целлюлозой зависит от четкости границ зон и объемного разделения между зонами. Четкость границ возрастает, если диаметр колонки уменьшается. Объемное разделение между зонами улучшается при возрастании высоты колонки. Но по мере того как высота колонки возрастает и уменьшается ее диаметр, уменьшается и количество материала, которое можно разделить на колонке, возрастает капиллярное сопротивление и уменьшается скорость потока жидкости, орошающей колонку. Эмпирически найдено, что соотношение высоты и диаметра колонки должно быть равно 9:1. Количество вещества, которое можно ввести в колонку, зависит от легкости разделения компонентов. Загрузка для каждого индивидуального компонента приблизительно пропорциональна величине его.

Наполнение колонки является наиболее важной при проведении хроматографии на целлюлозе. На фарфоровый фильтровальный диск, который служит дном обычной хроматографической колонки, вначале помещают либо кусочки фильтровальной бумаги, либо стеклянное волокно. После этого в колонку загружают промытый водой и высушенный стандартный порошок целлюлозы. Для заполнения колонки можно применять сухой порошок целлюлозы, суспензию целлюлозы. Для приготовления суспензии обычно используют ацетон. Порошок целлюлозы смешивают с ацетоном в гомогонизаторе Уоринга до тех пор, пока не получится однородная суспензия средней консистенции. Полученную суспензию переносят в стеклянную трубку. Ацетон стекает через дно трубки, а суспензию медленно перемешивают стеклянной палочкой как раз над линией оседания для равномерного заполнения трубки и чтобы предупредить образование трещин. Хроматографическая трубка все время должна быть почти доверху заполнена суспензией. Когда колонка заполнена на нужную высоту, ацетону дают стечь, тщательно следят за тем, чтобы не обнажалась поверхность целлюлозы. Сверху на слой целлюлозы помещают кусочек пористой фильтровальной бумаги. После этого колонку в течение нескольких дней тщательно промывают растворителем, который будет применяться для орошения колонки при хроматографировании. Колонка должна быть всегда заполнена жидкостью, так как, если она стечет или испарится, объем целлюлозы может уменьшиться и у стенок трубки могут образоваться зазоры. Когда растворитель проходит через колонку, частички целлюлозы поглощают воду и разбухают, образуя плотный слой. Плотность заполнения определяется консистенцией применяемой суспензии. Если суспензия слишком жидкая, набивка будет слишком плотной и возможно частичное фракционирование целлюлозы по размерам частиц.

Если нужно приготовить колонку для хроматографирования с большей скоростью потока, при заполнении ее вместо ацетона можно применить более вязкий растворитель н-бутанол. Для колонок с менее плотной набивкой некоторые исследователи предпочитают готовить суспензию на том же растворителе, который будет применяться для колонки при хроматографировании.

При работе с препаративными колонками, в частности с колонками значительной высоты, в тех случаях, когда желательно увеличить скорость тока раствора, лучше применять избыточное давление. Применение вакуума в последнем случае часто приводит к уменьшению количества растворителя в нижней части колонки и последующему нарушению разделения в этой зоне.

Равномерность заполнения колонки можно проверить, пропуская через нее раствор красителя, например метилрота, в растворителе, который будет применяться. Для этого растворителю дают стечь с верха колонки, после чего добавляют из медицинской капельницы приготовленный раствор красителя, равномерно распределяя его по поверхности целлюлозы, а затем вымывают растворителем, возвращая на место резервуар с растворителем, как только окрашенная зона начнет двигаться вниз вдоль колонки. Если краситель движется вдоль колонки как горизон-тальная окрашенная зона, колонка заполнена равномерно и годна к употреблению. Если окрашенная зона движется неровно, колонка заполнена неправильно и ее нужно заполнить снова.

Наиболее удобные растворители для колонки определяются посредством хроматографии на бумаге. Большинство растворителей, применяемых в хроматографии на бумаге, можно использовать для колонки при хроматографировании на целлюлозе. Однако муравьиная кислота, если ее применять в течение длительного времени для колонки с целлюлозой, вызывает деструкцию целлюлозы и колонка становится неприемлемой для дальнейшей работы. Кроме того, муравьиную кислоту трудно удалить из элюата, поэтому применения ее следует избегать.

Если используемый растворитель содержит кислоту (например, уксусную) или основание (например, пиридин), их следует удалить из илюата, прежде чем начать упаривание последнего, чтобы избежать изменений выделяемых сахаров или их производных. С этой целью элюат обычно встряхивают в делительной воронке с равным объемом воды, а затем водный слой экстрагируют эфиром в течение нескольких часов в экстракторе. Эта методика не применима к таким производ-ным сахаров, как, например, метиловые эфиры, и в этих случаях для удаления кислот и оснований нужны особые методы.

Все органические растворители, которые применяются для колонок при хроматографировании на целлюлозе, перед употреблением следует перегнать, чтобы избежать появления масел и смол при последующем концентрировании фракций.

Колонку следует помещать в комнате с постоянной температурой -- обычно 20--25°, хотя иногда необходима и более высокая температура, так как при этом возрастает скорость потока и можно использовать более высокие концентрации реагентов. Необходимо избегать колебаний температуры, так как понижение температуры может привести к выделении воды из раствора и нарушить разделение. Это обстоятельство особенно существенно при применении в качестве растворителя н-бутанола, насыщенного водой.

Образец, свободный от неорганических солеобразных веществ растворяют в минимальном количестве воды (фиксируя ее объем). К раствору добавляют сухой порошок целлюлозы в таком количестве, чтобы порошок был увлажнен, и к полученной смеси прибавляют дополнительное количество органических компонентов элюента. Полученную суспензию помещают в колонку поверх слоя целлюлозы. После того как образец немного осядет, поверх него осторожно помещают слой сухого порошка целлюлозы толщиной 2,5 см, накрывают кружком из пористой фильтровальной бумаги и начинают пропускать растворитель для колонки.

Отбор фракций производится с помощью различных автоматически коллекторов; они работают по принципу измерения веса, объема фракций или времени элюирования.

Компоненты можно определить с помощью различных общих цветных реакций. Гарделл применял построение концентрационных кривых элюата и сравнивал их с аналогичными кривыми, полученными для стандартных растворов сахара в том же самом растворителе.

Наиболее простой качественной пробой, по-видимому, является капельная проба: на фильтровальную бумагу помещают каплю элюата и обрабатывают бумагу щелочным раствором нитрата серебра.

Во многих случаях желательно помещать капли вытекающего элюата на хроматографическую бумагу и проявлять ее обычным способом.

3. Тонкослойная хроматография /6/

3.1. КАЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ САХАРОВ

Качественный анализ смесей методом ТСХ позволяет определить

а) число компонентов в анализируемом образце

б) подвижность каждого компонента относительно фронта растворителя.

При качественной тонкослойной хроматографии необходимо учитывать следующие положения:

- При повышении температуры разделение, как правило, ухудшается. Влияние температуры не настолько велико, как в бумажной хроматографии, но, если проявляющая смесь содержит легколетучие растворители, состав ее может измениться.

- Оптимальная толщина слоя сорбента равна примерно 0,25 мм.

- Небольшое содержание воды в сорбенте играет большую роль только при разделении производных углеводов в неполярных растворителях.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) в том виде, в каком она известна сейчас впервые была описана Шталем 1958 г., а в 1961 г. появилось первое сообщение о применении ТСХ для разделения углеводов. Начиная с этого времени ТСХ широко используется для идентификации углеводов, в том числе незамещенных моно- и олигосахаридов и различных производных сахаров и сложных эфиров, циклических ацеталей и других производных. Тонкослойная хроматография имеет ряд преимуществ перед бумажной хроматографией:

1. Анализ занимает настолько мало времени, что результат становится известным уже через несколько минут, это делает ТСХ удобным методом при слежении за ходом реакции.

2. ТСХ можно использовать для разделения как свободных сахаров, так и их производных. 3.Метод характеризуется высокой разрешающей способностью, например позволяет разделить производный аномеров с молекулярным весом вплоть до 1500.

4. Для обнаружения пятен можно использовать различные реагенты, так как применяемые неорганические сорбенты намного прочнее бумаги.

5. Для анализа можно брать большие количества веществ, что облегчает обнаружение минорных компонентов смеси.

МЕТОДИКА (общие принципы)

Чаще всего для разделения углеводов используют силикагель G, силикагель Н, окись алюминия, кизельгур G и целлюлозу. Слабокислый силикагель обычно применяется при изучении производных сахаров. Если на силикагеле не удается достичь хорошего разрешения основных или нейтральных сахаров и их производных, используют окись алюминия -- более активный, чем силикагель, сорбент, обладающий основными свойствами. Кизельгур и целлюлозу, являющихся нейтральными носителями, целесообразно применять, для анализа свободных сахаров.

Размер используемых пластинок зависит от цели анализа. Если ТСХ используется для контроля за ходом химической реакции, удобны предметные стекла микроскопа. Однако для качественного анализа лучше всего пользоваться пластинками размер ром 20X20X0,3 см. Перед нанесением слоя пластинки тщательно моют со стиральным порошком, споласкивают дистиллированной водой; и протирают насухо тканью, не оставляющей ворсинок. Если пластинки покрыты жиром, необходимо предварительно обработать их хромпиком или каким-нибудь горячим моющим средством.

Известно несколько способов нанесения слоя: намазывание, поливка, погружение и опрыскивание. Наиболее употребимых методы:

Опрыскивание. На три подставки (25x30 см) помещают 120 предметных стекол. Суспензию 20 г силикагеля G в 50 мл дистиллированной воды тщательно встряхивают в течение 1 мин, выливают в круглодонную колбу емкостью 250 мл и при помощи пульверизатора при медленном токе воздуха наносят слой на пластинки. Пластинки с нанесенным слоем сушат 10 мин на воздухе, затем досушивают и активируют, выдерживая 30 мин при 130 °С. Готовые к употреблению пластинки хранят на подставке в эксикаторе.

Намазывание. Суспензию 30 г силикагеля Н в 80 мл дистиллированной воды наносят на пять (20x20X0,3 см) чистых стеклянных пластинок слоем толщиной 0,25 мм; если размер пластинок меньше, их берут соответственно больше. В некоторых типах аппаратов для нанесения слоя (аппликаторы) пластинки прижимаются к нижней поверхности направляющих рельсов надутой камерой. Поэтому можно пользоваться пластинками из обычного оконного стекла двойной толщины, так как даже на стеклах разной толщины слой будет одинаковым. Пластинки с нанесенным слоем выдерживают при комнатной температуре 2 ч, после чего активируют 2 ч при 130 °С. Активность сорбента определяется температурой и временем активации-- при снижении температуры или уменьшении длительности активации активность понижается. Края пластинки выравнивают шпателем. В связи с тем что влажный воздух комнаты снижает активность сорбента, пластинки либо хранят в эксикаторе, либо перед употреблением прогревают 30 мин при 130°С и сразу же охлаждают.

Специальные добавки к сорбентам (импрегнирование) улучшают разделение смесей углеводов. В ряде случаев целесообразно вместо дистиллированной воды применять растворы ацетата натрия, борной кислоты или двузамещенного фосфата натрия.

Для нанесения образца на пластинку, как правило, используют микропипетки, микрошприцы или капилляры. На пластинки большего размера накладывают шаблон из прозрачной пластмассы с прорезанными отверстиями и 1--3 пятна 1%-ного раствора наносят с интервалом в 1,5 см на расстоянии 1,5 см от нижнего края и 3,0 см от боковых краев пластинки. Для хорошего разделения необходимо, чтобы диаметр пятна был как можно меньше (<3 мм), поэтому используемые растворители должны быть легколетучими.

Смеси, состоящие из двух или трех растворителей различной полярности, часто дают лучшую картину разделения, чем чистые растворители. Выбор проявителя зависит от полярности исследуемых сахаров. Так, для незамещенных углеводов хорошим проявителем является смесь н-бутанол -- уксусная кислота -- эфир -- вода (9:6:3:1 по объему), а для производных углеводов -- смеси петролейного эфира (30--60 °С) и ацетона (в различных соотношениях). Чтобы воспроизводимость результатов была достаточно хорошей, рекомендуется брать перегнанные растворители и свежеприготовленные системы проявителей.

Проявление. В хроматографическую камеру наливают соответствующий проявитель слоем толщиной 0,5--1,0 см. Через него пропускают полосу фильтровальной бумаги ватман № 1, которую прикрепляют к боковым стенкам камеры. Камеру герметически закрывают крышкой с зажимами и оставляют на 30 мин для насыщения. Полное насыщение камеры парами проявителя необходимо для получения воспроизводимых результатов. Если в системе содержится легколетучий растворитель, камеру можно поместить в баню со льдом. Когда фронт растворителя на пластинке достигнет высоты 10--15 см, крышку снимают и отмечают положение фронта и лишь после этого вынимают пластинку. В некоторых случаях, чтобы улучшить разделение компонентов, продолжительность проявления увеличивают или проводят двукратное или трехкратное проявление с высушиванием пластинки между ними или двукратное проявление в перпендикулярных направлениях (двумерная хроматография). Длительность проявления определяется характером растворителя: для проявления пластинки размером 20x20 см неполярными растворителями достаточно 20--30 мин, тогда как при проявлении полярными растворителями, содержащими воду, необходимо 1--2 ч.

После высушивания пластинки можно приступать к обнаружению пятен.

Методы обнаружения, не вызывающие деструкции анализируемых веществ.

Если компоненты- смеси окрашены (что, как правило, нехарактерно для углеводов), их легко обнаружить визуально. Некоторые производные сахаров обнаруживают по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Если сами вещества не флуоресцируют, к сорбенту можно добавить флуоресцентный индикатор, например смесь силиката и сульфида цинка, или воспользоваться коммерческим сорбентом, уже содержащим индикатор -- смесь марганца и активирован-ного силиката цинка. В этом случае сахара проявляются в УФ-свете в виде темных пятен на светящемся фоне. Иод, родамин В, бромтимоловый синий, 2',7'-дихлорфлуоресцеин, вода -- реагенты, позволяющие обнаружить сахара, не разрушая их.

Методы обнаружения, вызывающие деструкцию анализируемых веществ.

Все реагенты, используемые для обнаружения компонентов сахаров на бумажных хроматограммах (кроме реагентов, требующих промывки хроматограмм), пригодны и для тонкослойной хроматографии.

Кроме того, в ТСХ можно использовать и такие реагенты, как концентрированная серная кислота. При прокаливании пластинки, опрысканной кислотой, сахара обугливаются. Как правило, пластинку слабо опрыскивают 5--50%-ным раствором серной кислоты в воде или спирте и нагревают 10 мин при 130°С. При подобной обработке цвет сорбента не изменяется.

Для обнаружения углеводов используются также реагенты, дающие цветные реакции с сахарами и их производными: