Ионы цинка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оглавление

Введение

1. Цинк как тяжелый металл и супертоксикант

1.1 Понятие и основные черты супертоксикантов

1.2 Действие ионов и солей тяжелых металлов на микробные сообщества почв

1.3 Влияние тяжелых металлов на жизнедеятельность микроорганизмов

2. Объекты и методы исследования

3. Результаты эксперимента

Заключение

Библиографический список

Приложения



Введение

Человечество знакомо с загрязнениями почв тяжелыми металлами уже на протяжении длительного времени. Изучение поведения тяжелых металлов в почвах и в экологических системах, их обезвреживание было и остаётся на сегодняшний день актуальной задачей (Силков, 2010). Почва, загрязненная вредными веществами, токсикантами и их токсичными метаболитами - источник загрязнения грунтовых и поверхностных вод, а также растительных продуктов (Ковда, 1981). Тяжелые металлы и их соединения не являются исключением их этого списка, занимая лидирующие позиции среди токсикантов.

В естественных условиях области с высокой концентрацией тяжелых металлов локализованы, привязаны к месторождениям соответствующих руд и экранированы толстым слоем породы. Однако широкое применение тяжелых металлов в практической деятельности приводит к выносу их на поверхность и повсеместному распространению. В ряде случаев концентрация тяжелых металлов в воде и почве превышает установленные уровни ПДК. Таким образом, тяжелые металлы переходят в ранг химических загрязнителей биосферы (Калюжин, Калюжина, 2006). Загрязнение почвы, обусловленное химическими причинами, значительно превосходит по своему воздействию как в количественном, так и в качественном отношении все виды его физического изменения. Изменение химических параметров почвы отражается спустя короткий или длительный период на росте и продуктивности отдельных видов, их популяций или приводит к более сильным нарушениям (Вайнерт, 1988).

Большое значение занимают загрязнения тяжелыми металлами и их соединениями городских почв, не приуроченных к промышленным районам, т.к. промышленность является одним из наиболее известных источников загрязнения почв тяжелыми металлами. Развитие промышленности, проникновение индустриальных районов в другие районы городов, техногенез - все это способствует проникновению и накоплению тяжелых металлов в почве.

Однако, не смотря на большое количество исследований, многие вопросы остаются открытыми. Каково поведение тяжелых металлов и их соединений в почвах? Как тяжелые металлы влияют на микрофлору урбанизированных экосистемы? Недостаточно оценено значение микробных сообществ почвы и их роль при восстановлении почв после химических загрязнений, недостаточно ясны причины эволюционной устойчивости некоторых видов бактерий к загрязнениям тяжелыми металлами перед другими видами. В настоящее время в России, в том числе Калининградской области, чрезвычайно мало целенаправленных исследований по данной теме. Большая часть существующих публикаций касаются лишь отдельных фактов влияния тяжелых металлов на жизнедеятельность и физиологию бактерий, описывают активность отдельных видов в загрязненной почве.

Целью работы является практический анализ влияния ионов цинка на микрофлору почв урбанизированных экосистем (на примере города Калининграда).

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать влияние цинка на качественный и количественный состав микрофлоры в почве урбанизированных экосистем города Калининграда, проведя собственный эксперимент.

2. Выявить группы микроорганизмов, проявляющих устойчивость в высокой концентрации цинка.

цинк микрофлора экосистема калининград



1. Цинк как тяжелый металл и супертоксикант

1.1 Понятие и основные черты супертоксикантов

В научной литературе часто встречается термин "супертоксикант". Он используется для обозначения веществ-загрязнителей, в малых дозах обладающих сильным мутагенным и канцерогенным эффектами, отличающихся высокой кумулятивной способностью и токсичностью. Все без исключения супертоксиканты обладают широким спектром индуцирующих и ингибирующих свойств, могут вызывать у живых организмов повышение чувствительности к окружающим ксенобиотиками или некоторым природным веществам. Необходимо также отметить их природную стойкость, в том числе и к редукции, а так же отсутствие предела токсичность, т.е. способность к сверхкумуляции (Майстренко и др., 1996). Следовательно, практически для всех супертоксикантов контроль предельно допустимой концентрации теряет всяческий смысл. В тех или иных концентрациях они присутствуют во всех средах, циркулируют в них и через компоненты окружающей среды проявляют свое токсикологическое действие. Еще одно чрезвычайно важное свойство супертоксикантов - высочайшая подвижность в биосфере. Указанные характеристики определяют комплексный характер воздействия супертоксикантов на живые организмы, которое может вызвать мутагенный, тератогенный или канцерогенный эффекты (Майстренко и др., 1996).

Тяжелые металлы имеют прямое отношения к супертоксикантам, т.к. многие из них (ртуть, свинец, кадмий, цинк, медь и др.) обладают всеми вышеперечисленными характеристиками и проявляют высокие токсикологические свойства даже в следовых количествах, концентрируясь в живых организмах (Майстренко и др., 1996). Тяжелые металлы широко распространены в окружающей среде. К этой группе относятся все металлы, имеющие удельный вес более 4,5 г/см3 (Калюжин, Калюжина, 2006). В отличие от органических загрязняющих веществ, подвергающихся процессам разложения, тяжелые металлы способны лишь к перераспределению между природными средами. Судя по литературным данным (Зигель, 1993., Роева и др., 1996), число случаев токсикологического действия тяжелых металлов в составе загрязнения лишь увеличивается с каждым годом.

Но роль тяжелых металлов двойственна: с одной стороны, они необходимы для нормального протекания физиологических процессов, а с другой, токсичны при повышенных концентрациях. Кроме того, поведение тяжелых металлов в природных средах во много зависит от специфичности миграционных форм и вклада каждой из них в общую концентрацию отдельного метала в экосистеме. Наибольшую опасность представляют лабильные формы, т.к. они характеризуются высокой биохимической активностью и накапливаются в биосредах. Однако, следует учитывать, что единого порядка изменения чувствительности живых организмов к тяжелым металлам нет ни на видовом, ни на более высоких уровнях организации живого (Майстренко и др., 1996).

Тяжелые металлы проявляют широкое токсикологическое действие. Некоторые из них (например, свинец) имеют богатый набор биологических мишеней, другие (например, кобальт) имеют более ограниченную область токсикологического действия. Для каждого металла существует свой механизм воздействия, обусловленный конкуренцией между необходимыми и тяжелыми металлами за места связывания в белковых молекулах. Такие реакции связывания способны существенно изменять конформацию белковых молекул, следовательно, и их свойства (Майстренко и др., 1996). Но следует заметить, что живые организмы обладают физиологическими механизмами детоксикации в отношении тяжелых металлов. Однако, такие механизмы существенно теряют свою эффективность при концентрациях металла, превышающую предельно допустимую.

Поступление тяжелых металлов в окружающую среду имеет как естественное, так и техногенное происхождение (теплоэнергетика, городской транспорт, промышленное производство). Уровни содержания тяжелых металлов в почвах зависят от окислительно-восстановительных и кислотно-основных свойств последних, водно-теплового режима и геохимического фона территории. Обычно, с увеличением кислотности почв, подвижность элементов в ней возрастает. Так, при кислотности почвы ниже 7,7 ионная форма цинка в почве представлена гексааква-ионом, а при кислотности свыше 9,1 отмечается существование гидроксида цинка и тетрогидроксоцинката (Роева и др., 1996). Тяжелые металлы содержатся в почвах в водорастворимой, ионообменной и непрочно адсорбированной формах. Водорастворимые формы представлены солями, хлоридами, сульфатами и нитратами, а так же комплексными органическими соединениями. Кроме того, ионы тяжелых металлов могут в значительной мере содержатся в составе кристаллической решетки минералов. Таким образом большая часть почвенного цинка содержится в виде изоморфных соединений в слюдах, обманках и других минералах (Майстренко и др., 1996). Особенно высокие концентрации тяжелых металлов могут наблюдаться в районе рудников и автомагистралей. В ненаселенных районах наблюдается соответствие между концентрациями тяжелых металлов на поверхности почвы и в земной коре, что говорит об их относительно низкой подвижности в естественных условиях.

Органическое вещество почв способно связывать Zn в устойчивые формы, вследствие чего наблюдается накопление Zn в органических горизонтах почв и в торфе. Однако константы устойчивости Zn-органических соединений в почвах относительно низкие. Принято считать, что Zn более растворимый элемент в почвах, нежели другие тяжелые металлы. Концентрация его в почвенных растворах колеблется от 4 до 270 мкг/л в зависимости от свойств почвы.

Цинк наиболее подвижен и биологически доступен в кислых легких минеральных почвах. Фракция Zn, связанная с оксидами Fe и Mn, по-видимому, более доступна растениям. Кислотное выщелачивание особенно действенно для мобилизации Zn, поэтому наблюдается потеря этого металла определенными горизонтами, в частности в подзолах и бурых кислых почвах, развитых на песках. Растворимость и доступность Zn в почвах обнаруживают отрицательную корреляцию со степенью насыщенности кальцием и с содержанием соединений фосфора. Эти соотношения могут отражать как влияние адсорбции и осаждения, так и взаимодействие между этими элементами. Кроме того, в области высоких значений рН необходимо учитывать влияние на растворимость и доступность Zn образования растворимых Zn-органических комплексов и комплексных анионных форм Zn. Он также мобилизуется из основных карбонатов и оксидов веществами, образующимися при аэробном разложении растительных материалов.

Неподвижность Zn в богатых Са и Р почвах, в хорошо аэрируемых почвах, содержащих соединения серы, и в почвах, содержащих повышенные количества насыщенных кальцием минералов (аллофана, имоголита, монтмориллонита), а также водных оксидов, имеет важное практическое значение, определяя возникновение дефицита Zn для растений.

Антропогенные источники Zn -- это в первую очередь предприятия цветной металлургии и затем агротехническая деятельность. Наблюдения показывают, что происходящее в настоящее время загрязнение почв цинком привело в некоторых областях к крайне высокой аккумуляции его в верхнем слое почв.

Период полуудаления Zn из загрязненных почв: содержание Zn убывает довольно быстро, и в почве, содержащей цинка 2210 мг/кг, его концентрация понизится наполовину 10-11 лет. Однако эти результаты относятся к образцам с долгим периодом промывки. По данным других экспериментов период полуудаления Zn из загрязненных почв может быть гораздо больше. Восстановление качества загрязненных цинком почв обычно основано на ограничении его биологической доступности путем внесения извести и/или органического вещества. Растворимые Zn-органические комплексы, доля которых особенно велика в используемых для поливки коммунальных стоках, очень подвижны в почвах и поэтому легко доступны для растений. Загрязнение почв цинком может вырасти в важную проблему охраны окружающей среды.

1.2 Действие ионов и солей тяжелых металлов на микробные сообщества почв

Связующее звено между атмосферой, гидросферой, литосферой и живыми организмами - почва, в которой протекают жизненно важные процессы и создается уникальное свойство - плодородие. Почва - природный фильтр для техногенных загрязнителей, особенно тяжелых металлов, которые влияют на ее биологические свойства (цит. по: Костина и др., 2009). При этом наблюдается изменение общей численности почвенных микроорганизмов, сужение биоразнообразия, изменение структуры микробоценозов и снижение ферментативной активности. Присутствие тяжелых металлов изменяет и консервативные признаки почв: гумусное состояние, структуру, показатель кислотности, что приводит к частичной, а иногда и полной утрате плодородия (цит. по: Костина и др., 2009).

Содержание тяжелых металлов в верхних слоях почвы определяется близостью к локальным источникам загрязнения и переносом поллютантов нижними слоями атмосферы, что обусловливается региональными факторами, такими как климат, рельеф, а также растительный покров (цит. по: Костина и др., 2009). Тяжелые металлы сравнительно быстро накапливаются в почве и крайне медленно из нее выводятся: период удаления Zn - 500 лет (Добровольский, 1983). В предыдущей главе уже было упомянуто, что тяжелые металлы присутствуют в почве в водорастворимой, ионообменной и непрочно адсорбированной формах. Они обнаруживаются в нескольких пулах почвы: 1)растворенными в почвенном растворе; 2) занимающими сайты обмена на неорганических компонентах почвы; 3) прочно адсорбированными с почвенными частицами; 4) ассоциированными с нерастворимым органическим веществом почвы; 5) выпавшими в осадок в виде твердых частиц; 6) присутствующими в структуре вторичных минералов; 7) присутствующими в структуре первичных минералов. Характер взаимодействия тяжелых металлов с почвенными компонентами во многом обусловлен типом минералов (цит. по: Костина и др., 2009). Так, металлы, интродуцированные в окружающую среду в результате производственной деятельности человека, ассоциируются с первыми шестью пулами, тогда как "природные" металлы могут ассоциироваться с любым из пулов почвы в зависимости от геологической истории данного района (цит. по: Костина и др., 2009). Факторы, определяющие взаимодействие тяжелых металлов с почвенными компонентами, включают степень агрегации твердых фаз и характер порового пространства почвы. Следовательно, на перемещение тяжелых металлов оказывает влияние не только специфика поверхности твердых фаз (гумусность, гранулометрический состав, емкость поглощения), но и инфильтрационные характеристики почв (Орлов, 1992). Процесс трансформации поступивших в почву тяжелых металлов включает следующие стадии: 1) преобразование оксидов металла в гидроксиды (карбонаты, гидрокарбонаты); 2) растворение гидроксидов тяжелых металлов (карбонатов, гидрокарбонатов) и адсорбцию соответствующих катионов металла твердыми фазами почв; 3) образование фосфатов тяжелых металлов и их соединений с органическим веществом почвы (цит. по: Костина и др., 2009).

В настоящее время хорошо изучено распространение цинка в различных почвах, т.к. он широко применяются в сельском хозяйстве. Накопление тяжелых металлов в почве обусловлено влиянием ряда взаимосвязанных процессов, включающих круговороты органического и неорганического вещества, окислительно-восстановительные реакции, осаждение / растворение и адсорбцию / десорбцию. Металлы в почве находятся в виде свободных ионов и разнообразных растворимых комплексов с неорганическими или органическими лигандами (например, хлорид и сульфат цинка), а также ассоциированы с подвижным коллоидным материалом (цит. по: Костина и др., 2009).

Поглощение почвами металлов, поступающих в форме катионов, также может быть обусловлено осаждением труднорастворимых соединений из раствора и, в меньшей степени, специфической сорбцией, физической адсорбцией, а также биологическими процессами. Чем прочнее почва удерживает металлы, тем активнее они будут переходить из почвенного раствора в твердую фазу и, следовательно, тем выше буферная способность почвы (цит. по: Костина и др., 2009).

Содержание органического вещества играет значительную роль в накоплении тяжелых металлов в их различных формах и соединениях в почве, их просачивании в грунтовые воды, сорбционной способности, токсичности для растений и почвенных организмов. Знание механизмов закрепления тяжелых металлов на органическом веществе почвы и их поведения под воздействием естественных и антропогенных факторов важно для понимания процессов, воздействующих на степень подвижности и биоаккумулирования тяжелых металлов в почвах (цит. по: Костина и др., 2009). Помимо абиотических процессов на распространение и распределение тяжелых металлов в почве существенное влияние оказывают биотические факторы. Организмы низших трофических уровней - микроорганизмы - играют важную роль в процессах выведения тяжелых металлов из почвы. Живые организмы могут солюбилизовать соли тяжелых металлов, повышая их биодоступность, либо иммобилизировать, снижая степень биодоступности. Таким образом, степень распространения металлов в почвенной среде зависит от целого ряда взаимообусловленных физико-химических и биологических факторов, поэтому относительное распределение тяжелых металлов между абиотическими и биотическими компонентами почвы высоко динамично и вариабельно (Юшков и др., 2004).



1.3 Влияние тяжелых металлов на жизнедеятельность микроорганизмов

Чувствительность к тяжелым металлам различных представителей фауны неодинакова. Это позволяет предположить, что тяжелые металлы могут выступать в роли одного из факторов, влияющих на видовой состав природных сообществ. Одним из основных компонентов естественных сообществ, а также неотъемлемым компонентом почв, являются представители микрофлоры, поскольку от активности микроорганизмов и их видовой характеристики в значительной степени зависит состояние более высокоразвитых форм жизни (Калюжин, Калюжина, 2006).

Тяжелые металлы неблагоприятно действуют на почвенную микрофлору, тем самым тормозя процессы, происходящие в почве (нитрификация, аммонификация и т.д.). Чем выше в почве содержание подвижного азота и других элементов питания, тем активнее идет окисление целлюлозы. Целлюлозоразрушающие микроорганизмы, разлагая клетчатку, синтезируют и частично выделяют

в среду аминокислоты. Очень наглядно это показано на примере опыта с бумажными полотнами (Силков, 2010). При внесении в почву тяжелого металла (например, цинка) наблюдается значительное снижение эффективности разложения целлюлозы, как следствие токсического воздействия цинка на популяцию целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Особенно существенно различались результаты между дозами цинка, когда уже при концентрации 200 мг\кг почвы тканевое полотно разлагалось лишь на 47,7 процентов, тогда как в контрольном опыте тканевое полотно разлагалось практически полностью. (Силков, 2010).

Микроорганизмы по-разному реагируют на тяжелые металлы. Ряд микроорганизмов способны осуществлять активный транспорт тяжелых маталлов внутрь клеток (Буракаева и др., 1999). Проницаемость клеток служит ведущим фактором в проявлении токсичности металлов. В некоторых случаях возникают более толерантные к тяжелым металлам резистентные штаммы, т.е. такие, для воздействия на которые необходима более высокая концентрация токсичского вещества, чем для воздействия на родительские штаммы. Часто эта резистентность определяется образованием белковых или ферментативных систем в клетке, что обусловлено генетическими изменениями, связанными с хромосомами и внехромосомными элементами генетического аппарата - плазмидами и транспозонами. Плазмиды клеток микроорганизмов несут гены, которые определяют резистентность к различным тяжелым металлам. Иногда устойчивость обусловлена специфическим связыванием металла смежными остатками цистеина в молекуле металлотионинов, синтез которых может индуцироваться тяжелыми металлами либо стрессовыми факторами (Буракаева и др., 1999).

Помимо формирования резистентности, микроорганизмы также способны к биологической аккумуляции. Тяжелые металлы сорбируются клеточными стенками и накопливаются внутри клеток микроорганизмов (бактерий, мицелиальных грибов, дрожжей, водорослей). При этом набор сорбируемых ионов может быть чрезвычайно широким. Накопление металлов клетками микроорганизмов носит двухфазный характер (Калюжин, Калюжина, 2006):

а) начальная фаза не зависит от энергетического состояния клетки и обусловлена сорбцией металлов компонентами клеточной стенки, среди которых особенно активны как сорбенты хитин и хитозан.

б) последующая, более медленная фаза - энергозависимое внутриклеточное накопление, происходящее с участием мембранных переносчиков ионов.

Взаимодействие микроорганизмов с металлами или радионуклидами изучается уже достаточно давно, поэтому их механизм во многом известен, но интерес к ним по-прежнему не уменьшается (Мирошкина, Вербенко, 2008).

Живые бактерии, способны не только к адсорбции или образованию комплексов, но и к активной их трансформации. Например, множество микроорганизмов поглощают уран. Во многих случаях в реакциях тяжелыми металлами ферменты. Это очень важно, так как в этом случае микроорганизмы обеспечивают возникновение комплексов, которые легко осаждаются в илах и осадках, что делает их доступными для дальнейшей очистки, однако, необходимо учитывать максимально возможную предельную концентрацию тяжелых металлов, в которой микроорганизмы способны проявлять толерантность (Мирошкина, Вербенко, 2008).

Микроорганизмы занимают одно из самых важных мест в почвенных экосистемах. Они являются последней степенью в большинстве пищевых цепей, т. е. суть редуценты. Такие организмы, как плесневые грибки, используют в качестве пищи органические вещества остатков от растений и животных, минерализуя их, делая доступным для растений различные элементы. Тяжелые металлы могут сильно ингибировать их активность (Аванесян, 2006). По другим данным (Иванова, 2000), ионы тяжелых металлов в невысоких концентрациях могут стимулировать развитие тех или иных микроорганизмов, так являются для них необходимыми составляющими ряда ферментов. При увеличении концентрации начинает проявляться токсический эффект.

Так же следует заострить внимание на одном важном факте: биоразнообразие почвенной микробиоты является важным фактором устойчивости почвенной экосистемы к загрязнениям (как тяжелыми металлами, так и другими супертоксикантами), так же поддержанием её нормальной биофункциональности (Евдокимова, Мозгова, 1998).

Многолетние исследования микробного компонента почв в зоне воздействия медно-никелевого комбината "Североникель" (Мурманская обл.) показали (Евдокимова, Мозгова, 1998) что, микроэукариоты (грибы, дрожжи, водоросли) устойчивее к воздействию тяжелых металлов, чем прокариоты (бактерии, цианобактерии, стрептомицеты). В незагрязненной почве выявлено 28 видов грибов с частотой встречаемости 30-60%. В буферной зоне видовое разнообразие грибов не снизилось, в импактной зоне число видов уменьшилось до 19, а в эпицентре - до 15. В эпицентре загрязнения доминировали: Paecilomyces farinosus, Philophlora melinii, Penicillium simplicissimum, Trichoderma koningii, Tr. aureoviride, Mucor griseo-cyanus, Sterile mycelium (частота встречаемости > 60%). Из состава грибного компонента исчезли выявляемые ранее в незагрязненной почве представители родов: Chaetomium, Acremonium, Verticillium, Mortierella, Rhizopus. При содержании меди в почве 1600 - 3000 и никеля 3500 - 6000 мг/ кг абсолютными доминантами являются грибы рода Penicillium. Они обладают наиболее высокой устойчивостью к воздействию меди и никеля (Евдокимова, Мозгова, 1998).

Среди часто встречающихся водорослей в незагрязненной почве выявлено 27 видов, по мере приближения к комбинату число их снизилось до 9. Среди водорослей наибольшую устойчивость к загрязнению почвы металлами проявили одноклеточные зеленые особенно виды родов: Chlamydomonas, Chlorococcum, Bracteacoccus, Chlorhormidium. Образование этими водорослями слизи полисахаридной природы служит защитной реакцией на действие токсикантов. Сужение состава альгофлоры произошло за счет исчезновения синезеленых и желтозеленых водорослей (Евдокимова, Мозгова, 1998).

Из бактерий наиболее чувствительны к повышенным концентрациям меди и никеля в почве азотфиксирующие и нитрифицирующие бактерии - нейтрофилы. Из почв, подверженных воздействию выбросов комбината в течение нескольких десятков лет (40-50 лет), на расстоянии 7-10 км по розе ветров выпали целые физиологические группы бактерий: азотфиксирующие, нитрифицирующие, целлюлозолитические бактерии, цианобактерии. Повышенной чувствительностью обладают сапрофитные не спорообразующие бактерии. Они относятся к r-стратегам, обладающим слабой конкурентной способностью и высокой скоростью роста. Прокариоты, относящиеся к экологической группе L-стратегов: спорообразующие бактерии, стрептомицеты устойчивее к неблагоприятным факторам, в частности, в силу способности образовывать покоящихся формы (Евдокимова, Мозгова, 1998).

Изменения численности микроорганизмов отдельных наиболее чувствительных таксономических групп являются достоверными, если концентрация загрязняющих веществ на порядок превышает фоновый уровень. Численность наиболее устойчивых групп микроорганизмов снижается при концентрации загрязнителей, превышающей фоновую на два порядка. Изменение структуры микробных сообществ, сужение их видового разнообразия приводит к нарушению средорегулирующих функций микроорганизмов и питательного статуса почвы. В антропогенных экосистемах возрастает значимость каждого вида для поддержания устойчивого состояния экосистемы.

По некоторым литературным данным, из почвенных микроорганизмов наибольшей устойчивостью как к цинку, так и к большинству других тяжелых металлов, обладают почвенные грибки рода Aspergillus и бактерии рода Bacillus (Силков, 2010).

По данным исследований (2006) изучалось влияние тяжелых металлов, в том числе и цинка, на представителей почвенных спорообразующих грибов. Для сравнения проводили работы с дрожжами S. cerevisiae. В качестве действующего фактора использовались следующие соли тяжёлых металлов: сульфат хрома, сульфат марганца, нитрат циркония, сульфат железа, сульфат меди, нитрат никеля, сульфат цинка, нитрат свинца, нитрат кадмия, а также сульфат лития и хлорид натрия. В данных соединениях ионы были представлены катионами. В результате серии опытов были выделены культуры спорообразующих грибков, способных расти и размножаться при концентрации сульфата цинка, равной 0,25 М. Было установлено, что данные культуры также способны к активному росту при концентрации ионов: хрома, марганца, железа, меди, кобальта, никеля, кадмия, ванадия, молибдена и вольфрама, равной 0,25 М. Методом длительной селекции была выделена группа грибков, способных к росту на фоне перечисленных тяжелых металлов при концентрации их 0,5 М. Таким образом, была достигнута адаптация микроорганизмов не только к тяжелым металлам, но и к осмотическому фактору (Калюжин, Калюжина, 2006).

Микрофлора, растущая на фоне высокой концентрации тяжелых металлов, подвергается воздействию как осмотического фактора, так и самих ионов тяжелых металлов. Под влиянием данных факторов должны возрасти энергетические расходы на поддержание жизни, роста и размножения. В свою очередь, это должно сказаться на величине общего экономического коэффициента для веществ, являющихся источником углерода и энергии. На результате этой же серии опытов (2006) изучалось влияние на общий экономический коэффициент источника энергии хлорида натрия и сульфата цинка. Было выяснено, что растворы хлорида натрия в больше степени влияют на изучаемый показатель, чем сульфат цинка. Уже при содержании хлорида натрия в количестве 0,25 М значение показателя снижается в 2 раза в сравнении с контролем. При концентрации хлорида, равной 1 М, общий экономический коэффициент снижается в 3 раза, в то время как при той же концентрации сульфата цинка величина показателя уменьшается только в 1,3 раза. Очевидно, осмотический фактор в виде хлорида натрия в большей степени снижает эффективность биоэнергетических процессов, чем сульфат цинка (Калюжин, Калюжина, 2006). Причем последний является не только осмогенным фактором, но и источником ионов тяжелого металла цинка, что в значительной мере повышает токсичность этого соединения и его угнетающего влияния на культуру грибков (Калюжин, Калюжина, 2006).

В следующем этапе опытов (2006) было продолжено изучение сравнительного влияния сульфата цинка и хлорида натрия на скорость размножения грибков. Из представленных результатов следует, что растворы сульфата цинка в большей степени ингибируют размножение грибков, чем растворы хлорида натрия. Расхождение отмечается уже при концентрации 0,125 М (Калюжин, Калюжина, 2006).

Обращает на себя внимание то, что грибки, выросшие в насыщенных растворах хлорида натрия, сульфата меди и особенно в растворе сульфата цинка, тонут в них, т.е. их удельный вес превышает удельный вес растворов, величина которого составляла от 1,1 для хлорида натрия до 1,4 для сульфата. Культура, выросшая в контрольных опытах без тяжелых металлов, помещенная в насыщенные растворы, не тонет, так как удельный вес сырой биомассы в контроле составляет 1,05. Видимо, что культура, выросшая в насыщенных растворах, накапливает значительное количество тяжелого металла, что и приводит к увеличению ее удельного веса. Для проверки этого предположения была проведена работа по определению количества тяжелых металлов, заключенных в биомассе грибков. Для этой цели выращивали три группы культур: в 1 М растворе сульфата цинка, 1 М растворе сульфата меди и в 0,5 М - нитрате кобальта. Содержание тяжелых металлов определяли в активно растущих культурах. Полученные данные свидетельствовали о том, что культура способна аккумулировать большое количество тяжелых металлов. В пересчете на сырую биомассу с влажностью 75 процентов концентрация в среде и в клетке совпадает. Микроскопирование показало отсутствие кристаллических включений как на поверхности клеток, так и внутри них, в то время как ряд других видов микроорганизмов в целях защиты от тяжелых металлов переводят их в нерастворимую форму. Таким образом, механизм защиты от высоких концентраций солей тяжелых металлов обусловлен, очевидно, спецификой внутриклеточной организации, а не поддержанием градиента концентраций в системе среда - клетка. Вместе с тем в чистой среде поддерживается более высокий уровень активности, чем в присутствии тяжелых металлов (Калюжин, Калюжина, 2006).

Другая серия опытов, представляющих не менее важный интерес - исследование влияния тяжелых металлов на систему "микроорганизм-растение" (Колесников, 2012), т.к. в естественных условиях практически всегда растения находятся в непосредственном контакте с почвенными микроорганизмами, не редко осуществляя с ними симбиоз. Опыт заключался в наблюдении за воздействием колонизации загрязненного тяжелыми металлами грунта на колонизацию растения бактериями и почвенную микрофлору (Колесников, 2012). Объектами исследования представлялись почвенные бактерии вида R. planticolа, и несколько видов растения рода Овсянница (Festuca rubra, F. rubra commutata, F. Ovina). В качестве экспериментальных загрязнителей использовались: сульфат цинка, ацетат цинка. Полученные результаты свидетельствовали о повышенном содержании бактерий в тканях растений, которые культивировались на загрязненной цинком почве. Таким образом, загрязнение почвы тяжелыми металлами привело к заметному увеличению численности ассоциативных диазотрофов в тканях растений по сравнению с контрольными вариантами без загрязнения. Возможно, это объясняется тем, что загрязнение грунта тяжелыми металлами делает его менее благоприятным для развития почвенных микроорганизмов, что, в свою очередь, стимулирует их миграцию из почвы в растения (Колесников, 2012). Так же было выяснено, что внесение цинка в почву значительно снижает интенсивность дыхания почвенной микрофлоры, а инокуляция культивируемых растений R. planticola -- увеличивает. При этом инокуляция бактериями R. planticola положительно сказывается на росте и развитии растений, культивируемых на субстратах, загрязненных солями тяжелых металлов. У инокулированных растений по сравнению с неинокулированными увеличивается биомасса корней, проективное покрытие и, в отдельных случаях, длина листьев. При этом максимальное положительное воздействие инокуляция оказывает именно на корневую систему (ее масса может увеличиваться в разы), и именно в грунтах свнесенным тяжелым металлом, т.к. прирост биомассы превосходит таковой при инокуляции растений в незагрязненном грунте (Колесников, 2012).

В еще одном опыте (Мирошкина, Вербенко, 2008) с участием нескольких видов бактерий показывается губительное влияние сульфата цинка на развитие их колоний в лабораторных условиях. Объектами исследования были: Escherichiacoli AB1157 (кишечная палочка - дикий тип), Escherichiacoli KS0160 (кишечная палочка - радиоустойчивый мутант) и Deinococcus radiodurans - грамм-положительная бактерия, которая чрезвычайно устойчива и к воздействию перекисей, и к ионизирующей радиации. Использовались концентрации сульфата цинка в 5 mM, 10 mM и 100 mM. На среде с добавлением сульфата цинка выживают бактерии при концентрации не более 5 mM. При этом наиболее устойчивы к этому химическому соединению оказались клетки D. radiodurans. А концентрация сульфата цинка в 100 mM является абсолютно летальной для всех типов исследуемых бактерий.



2. Объекты и методы исследования

Для собственного исследования и практического подтверждения проанализированных литературных данных, было принято решение провести лабораторный эксперимент. Цель эксперимента - выявить влияние ионов цинка на почвенную микрофлору урбанизированных экосистем. На эту тему существуют лишь единичные исследования, касающиеся загрязнения почв тяжелыми металлами, их концентрации в растительных организмах. Данный эксперимент выделяет качественный подход: сравнение численных показателей микроорганизмов и выявление зависимости численности микроорганизмов от концентрации цинка в исследуемом почвогрунте.

По результатам исследований Ващейкина А. и др.: "Достаточно высоким оказалось загрязнение почвогрунтов урбоэкосистем Калининграда цинком" [Приложения, Рис. 2]. А так же: "Содержание цинка в контроле колебалось от 18 до 55 мг/кг и не превышало значение ПДК. В городских почвогрунтах содержание цинка было значительно выше и в среднем по зонам увеличивалось в ряду: относительно чистая -- слабо загрязненная -- умеренно загрязненная -- загрязненная -- грязная --очень грязная зоны. Следует отметить, что осенью 2011 г. в относительно чистой зоне содержание цинка составляет 57,6 мг/кг, то есть близкое к значению ПДК. Наибольшее значение по содержанию цинка -- 72,2 мг/кг зафиксировано в грязной зоне осенью 2012 г. с превышением значения ПДК почти в пять раз. В слабо загрязненной, умеренно зарязненной и очень грязной зонах наблюдается увеличение содержания цинка в период с лета 2008 до осени 2012 г" [4, c 89].

Объектом исследования служила зеленая зона поселка Прибрежный в городской черте Калининграда - сад на пришкольной территории. Ключевой участок с кодовым названием "Ж1" - слабо загрязненная почва (См. Приложение 1, Рис. 1) [4, с. 87] представлен полукультурным насаждением на ландшафте с антропогенно трансформированной почве с невысокой влажностью и pH сдвинутой в сторону щелочной реакции [4, с. 2- 6] и температурой около 19 градусов по шкале Цельсия. Отбор проб проводился в период с 06.2013 по 07.2013 по общепринятому принципу "конверта" [18]. Почва в месте взятия проб уже слабо загрязнена цинком [4]: содержание цинка в ней составляет около 61 мг\кг почвы, тогда как значение ПДК для почвенного цинка не должно превышать 55мг\кг. Контрольным значением служили взятые образцы без экспериментального внесения металла.

Определение "текущего" загрязнения, т.е. содержания металла во взятых пробах почвы осуществляли рентгенфлуорисцентным методом анализа на приборе "Спектроскан Макс G" производства ООО "НПО Спектрон". Пробы почвы, согласно общепринятой методике, сначала высушивали в сушильном шкафу при температуре 105 є С в течение четырех часов, после чего измельчали с помощью дискового истирателя ЛДИ-65 до размера частиц 71 мкм. Полученные таким образом пробы спрессовывали в виде таблеток диаметром 1 см и помещали в прибор "Спектроскан Макс G" для определения валового содержания цинка.

Для проведения эксперимента использовались 5 лабораторных бюксов, по которым равномерно распределялась почва из взятой пробы. Бюксы с почвой последовательно взвешивались, затем выдерживались в сушильном шкафу с последующим повторным взвешиванием. Это необходимо для определения сухой массы и последующего вычисления влагоемкости почвы, важно для корректного проведения эксперимента и внесения в неё тяжелого металла. В качестве него использовался водный раствор сульфата цинка.

Однократно в день, в течение недели бюксы увлажнялись водным раствором сульфата цинка (из расчета 60% полной влагоемкости почвы), таким образом почва в бюксах "загрязнялась" цинком сверх начального значения. Для эксперимента были взяты три значения: стократное значение ПДК, пятисоткратное значение ПДК и тысячекратное значение. Таким образом охватывался широкий диапазон концентраций металла в исследуемой почве. Экспериментальные значения ПДК вычислялись пропорциональным методом: ПДК металла, умноженное на молекулярную массу соединения (сульфат цинка) и разделенное на молекулярную массу тяжелого металла. Полученные значения умножались соответственно на 100, 500 и 1000. Важно, что значения ПДК для эксперимента переводились в соотношения 1 мг на 100 г почвы. После недельного полива почва подготавливалась для процедуры микробиологического посева - подготовка разведений почвенного раствора. В эксперименте использовались шесть микробиологических питательных сред: Са+МПА, среда Эшби, среда Чапека, КАА, среда Гетченсона, МПА. Таким образом, охватывался широкий видовой спектр микроорганизмов. Для разведений бралась навеска почвы в 10 грамм и дополнялась водой в количестве 90 мл.

Далее проводился микробиологический посев подготовленных почвенных разведений на шесть питательных сред в чашки Петри с последующей выдержкой в термостатах сроком до 12 дней. Эксперимент проводился в трех повторностях на каждой среде для каждой концентрации плюс контрольное значение. В конце проводился визуальный подсчет колоний на чашках Петри и вычисление общего микробного показателя для сравнения.



3. Анализ влияния ионов цинка на микрофлору почв урбанизированных экосистем

Результаты эксперимента представлены в виде индивидуальных таблиц для каждой питательной среды. Подсчет колоний проводился визуально для каждой чашки Петри. Обнаруженные колонии регистрировались отметкой маркером в виде точки, затем суммировались и сводились в таблицы с последующим подсчетом микробного показателя. Данные по микроорганизмам в таблицах представлены в колониеобразующих единицах (КОЕ). Результаты по каждой среде также сведены в графики для более наглядного отображения результатов.

1. Среда КАА (разведение 10^6) [См. Приложения, Таблица 1]

На данной среде наблюдается присутствие микроорганизмов на всех повторностях. На концентрации 100 ПДК регистрируется рост численности микроорганизмов: в 2,57 раз от контрольного значения. На концентрации 500 ПДК численность падает, но остается выше контрольного значения в 1,94 раза. На концентрации ПДК 1000 снова регистрируется рост численности: в 2,08 раза от контрольного значения. Присутствие актиномицетов регистрируется на всех повторностях за одним исключением и остается более-менее стабильным, хотя их численность и невысока. Микобактерии на концентрации 100 ПДК присутствуют с большей численностью, в отличие от контрольной пробы, однако их численность снижается с дальнейшим повышением концентрации, и исчезают полностью на концентрации 1000 ПДК. Общую динамику численности микроорганизмов на данной среде можно проследить на рис. 3.



Рис. 3. График зависимости КОЕ от ПДК на среде КАА

2. Среда Гетчинсона (разведение 10^2)

На концентрации 100 ПДК регистрируется рост численности - в 1,57 раз превосходящее контрольное значение. На концентрации 500 ПДК численность падает - в 1,2 раза меньше контрольного значения. На концентрации 100 ПДК рост численности возобновляется и приближается к значению на 100-кратной концентрации. Актиномицеты замечены на всех повторностях, отличных от контроля, причем максимальной численности они достигают на концентрации 100 ПДК, а минимальной численности на 500 ПДК. Похожая картина и с микромицетами. Доля пигментных бактерий незначительна. Общую динамику численности микроорганизмов на данной среде можно проследить на рис. 4.



Рис. 4. График зависимости КОЕ от ПДК на среде Гетчинсона

3. Среда МПА (разведение 10^5) [См. Приложения, Таблица 3]

На концентрации 100 ПДК упадок численности в 1,54 раза от контрольного значения, преобладают спорообразующие бактерии, а численность грибов минимальна. На концентрации 500 ПДК упадок численности в 3,64 раза от контрольного значения с преобладанием спорообразующих бактерий. Рост численности регистрируется лишь на значении 1000 ПДК, где численность микроорганизмов приближается к таковому значению на концентрации 100 ПДК. Несколько уменьшилась доля спорообразующих бактерий, а грибы отсутствуют лишь в одной повторности. Микроорганизмы присутствуют на всех концентрациях. Общую динамику численности микроорганизмов на данной среде можно проследить на рис. 5.



Рис. 5. График зависимости КОЕ от ПДК среде МПА

4. Среда МПА+СА (разведение 10^3) [См. Приложения, Таблица 4]

В 1,43 раза увеличивается численность на концентрации 100 ПДК в отличии от контрольного значения. На концентрации 500 ПДК численность практически возвращается к контрольному значению, тогда как на концентрации 100 ПДК замечен резкий рост численности микроорганизмов на всех повторностях - в 2,89 раза от контрольного значения. Микроорганизмы присутствуют на всех концентрациях, однако доля спорообразующих бактерий от общего числа микроорганизмов неуклонно растет с увеличением концентрации. Также с её увеличением замечен рост численности колоний в толще агара, на концентрации 100 ПДК превышающий значение контрольной пробы почти в 2 раза. Общую динамику численности микроорганизмов на данной среде можно проследить на рис. 6.



Рис. 6. График зависимости КОЕ от ПДК на среде МПА+СА

5. Среда Эшби (разведение 10^5) [См. Приложения, Таблица 5]

Замечено общее ингибирование активности микроорганизмов и снижение их численности: на концентрации 100, 500 и 1000 ПДК соответственно в 1,16, в 4,17, в 6,33 раза от контрольного значения. В каждой концентрации имеется незначительное количество грибов, однако их количество очень невелико. Неуклонно снижается численность всех групп микроорганизмов на данной среде. Незначительная доля олигофильных бактерий на среде практически исчезает к концентрации 1000 ПДК. Доля азотобактерий несколько больше и также снижается с повышением концентрации, однако не исчезает полностью на концентрации 1000 ПДК. Общую динамику численности микроорганизмов на данной среде можно проследить на рис. 7.



Рис. 7. График зависимости КОЕ от ПДК на среде Эшби

6. Среда Чапека (разведение 10^3) [См. Приложение, Таблица 6]

С увеличением концентрации общее количество микромицетов стремительно снижается. Они практически отсутствуют уже на концентрации 100 ПДК. Однако во всех повторностях они не обнаруживаются лишь на концентрации 1000 ПДК. Общую динамику численности микроорганизмов на данной среде можно проследить на рис. 8.

В качестве обобщения, можно сказать, что концентрация 100 ПДК цинка стимулирует рост численности микроорганизмов гораздо чаще, чем на других концентрациях ПДК, использованных в эксперименте. Несмотря на то, что цинк - тяжелый металл и супертоксикант, он так же является важным микроэлементом в биологическом обмене веществ. Вероятно, за счет этого более низкие концентрации ПДК стимулируют развитие микроорганизмов и рост численности как следствие этого.



Рис. 8. График зависимости КОЕ от ПДК на среде Чапека

Почти в половине случаев наблюдается общее угнетение численности. Оно тем интенсивнее, чем выше концентрация ПДК. Здесь имеет место быть токсическое действие цинка. Наконец, как видно на графике [Приложение, Рис. 6], в единичном случае зарегистрирован резкий рост численности на концентрации 1000 ПДК - на среде МПА+СА. Вероятно, это может быть связано с появлением новых, устойчивых к цинку штаммов микроорганизмов.

Важно отметить, что среди микроорганизмов наибольшую устойчивость к присутствию цинка демонстрируют группы спорообразующих бактерий, для которых не только остается стабильной с повышением концентрации ПДК, но и даже растет [Приложения, Таблица 4]. Следующими по устойчивости к цинку стоит отметить группу актиномицетов. Их устойчивость к повышенным концентрациям цинка может объясняться наличием внутренних эффективных механизмов биоаккумулирования. Микобактерии же исчезают на концентрации 1000 ПДК, а до этого рубежа их численность неуклонно падает. Численность целлюлозоразлагающих бактерий нестабильна. Доля численности азотобактерий и олигофильных бактерий также снижается с повышением концентрации - особой устойчивости к цинку у них не обнаруживается.

Есть вероятность, что подобная динамика численности может зависеть от типа и использованной в эксперименте питательной среды. Однако, точную зависимость численности, а так же видового разнообразия от концентрации цинка еще предстоит выяснить.



Заключение

Проанализировав литературные данные, а также опираясь на результаты собственного эксперимента можно сделать следующие выводы:

1. Цинк и его ионы на микрофлору почв влияют двояко: в одних случаях он выступает в роли мощного стимулятора с последующим ростом численности микроорганизмов, тогда как в других он является ингибитором активности и угнетает численность микроорганизмов в почвенных экосистемах.

2. В процессе исследования были выявлены группы организмов, обладающие устойчивостью к повышенным концентрациям цинка. К ним принадлежат: демонстрирующие наибольшую устойчивость спорообразующие бактерии и менее стойкие актиномицеты.



Библиографический список

1. Аванесян Н. М. Методические указания к практическим занятиям по "Основам токсикологии". - Ульяновск: Изд-во УлГТУ, Биохимия - 2006

2. Буракаева А. Д., Русанов А. М., Лантух В. П. Роль микроорганизмов в очистке сточных вод от тяжелых металлов: методическое пособие. - Оренбург: Изд-во ОГУ, Биология - 1999. - 53 с.

3. Вайнерт Э. и др. Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / пер. с нем.; под ред. Шуберта Р. - М.: 1988. - С. 231 - 248.

4. А. С. Ващейкин, П. В. Садовников, М. В. Куркина, В. П. Дедков. О содержании тяжелых металлов в почвогрунтах урбанизированных экосистем Калининграда. Калининград, БФУ - 2014. - С. 82 - 96.

5. Добровольский В. В. География микроэлементов: глобальное рассеяние / под ред. Добровольского В. В. - М.: Мысль - 1983. - 272 с.

6. Евдокимова Г. А., Мозгова Н. П. Биоразнообразие почвенной биоты, как фактор устойчивости почв к загрязнению // Тезисы Всероссийского совещания "Антропогенной воздействие на природу Севера и его экологические последствия" (Мурманская обл., 1998). - Мурманская обл., 1998 - С. 1 - 2.

7. Зигель Х., Зигель А. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / пер. с нем.; под ред. Зигель Х. - М.: Мир, 1993. - 386 с.

8. Иванова Е. Ю. Основы микробиологии и экологии бактерий. Методические указания. - Воронеж: Изд-во ВГУ, Геоэкология - 2000

9. Калюжин В.А., Калюжина О.В. Влияние концентрированных растворов солей тяжелых металлов на физиологические и кинетические показатели микроорганизмов. - Томск: Биологические науки - 2006.

10. Ковда В. А. Почвенный покров, его улучшение, использование и охрана. - М.: Наука - 1981. - С. 69 - 182.

11. Колесников О. В. Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему "микроорганизм-растение". Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора наук. - Москва: РГАУ-МСХА, каф-ра микробиологии и иммунологии. - 2012. - С. 5 - 22.

12. Костина Л. В., Куюкина М. С., Ившина И. Б. Методы очистки загрязненных тяжелыми металлами почв с использованием (био)сурфактантов (обзор) / Вестник Пермского Университета. Вып. 10 (36). - Пермь: Биология, 2009. - С. 96 - 105.

13. Майстренко В. Н., Хамитов Р. З., Будников Г. К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. - М.: Химия - 1996.

14. Мирошкина С. М., Вербенко В. Н. Микроорганизмы - индикаторы тяжелых металлов. - Гатчина. - 2008. - С 231 - 237.

15. Орлов Д. С. Химия почв: учебник / под ред. Орлова Д. С. - М.: Изд-во МГУ - 1992. - 400 с.

16. Роева Н. Н., Ровинский Ф. Л., Кононов Э. Я. Журнал аналитической химии. - 1996. - Т. 51, №4. - С. 384 - 397.

17. Силков С. И. Биологическая активность почв / Вестник ЧГАА. Том 56. - 2010. - С. 79.

18. Теппер Е. З., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. Практикум по микробиоло-

гии. М., 2004.

19. Юшков В. В., Юшкова Т. А., Стрелков В. В. Химия и экология 3d-элементов. - Екатеринбург: Изд-во УрО РАН - 2004. - 171 с.

20. White C. Microbial solubilization and immobilization of toxic metals: key biogeochemical processes for treatment of contamination / C. White, J. A. Sayer, G. M. Gadd // FEMS Microbiol. Rev. 1997. Vol. 20. P. 503-516.

21. White C. An integrated microbial process for the bioremediation of soil contaminated with toxic metals / C. White, A. K. Sharman, G. M. Gadd // Nat. Biotechnol. 1998. Vol. 16, № 6. P. 572-575



Приложения

Рис. 1. Расположение точки сбора почвенных проб [4, c 87].

Рис. 2. Содержание цинка в почвогрунтах урбанизированных экосистем Калининграда [4, с. 89]



Таблица 1 Количественный учет микроорганизмов на среде КАА (разведение 10^6)

Варианты опыта	Навеска почвы, г	Повторности	Общее кол-во	Сред.	Актиномицеты	Сред.	Микобактерии	Сред.
Контроль	10	1	3720000	2320000	60000	40000	60000	320000
		2	1500000		60000		660000
		3	1740000		-		240000
Zn 100 ПДК	10	1	8400000	5960000	60000	40000	600000	660000
		2	4320000		-		660000
		3	5160000		60000		720000
Zn 500 ПДК	10	1	4140000	4500000	180000	100000	480000	420000
		2	5160000		120000		300000
		3	4200000		-		480000
Zn 1000 ПДК	10	1	4380000	4820000	120000	80000	-	0
		2	4320000		120000		-
		3	5760000		-		-

Таблица 2 Количественный учет микроорганизмов на среде Гетчинсона (разведение 10^2)

Варианты опыта	Навеска почвы, г	Повторности	Общее кол-во	Сред.	Микромицеты, средн.	Актиномицеты, сред.	Целлюлозные бактерии, сред.	Пигментные бактерии, сред.
Контроль	10	1	108	84	27,6	-	24	-
		2	102
		3	42
Zn 100 Пдк	10	1	120	132	66	30	42	6
		2	156
		3	120
Zn 500 Пдк	10	1	96	70	42	6	24	-
		2	78
		3	36
Zn 1000 Пдк	10	1	84	116	66	18	36	6
		2	156
		3	108



Таблица 3 Количественный учет микроорганизмов на среде МПА (разведение 10^5)

Варианты опыта	Навеска почвы, г	Повторности	Общее кол-во	Сред.	Спорообразующие, сред.	Пигментные, сред.	Грибы, сред.
Контроль	10	1	2118000	18420000	1512000	276000	60000
		2	2238000
		3	1170000
Zn 100 Пдк	10	1	1224000	1146000	1080000	96000	60000
		2	978000
		3	1236000
Zn 500 Пдк	10	1	618000	486000	444000	6000	60000
		2	402000
		3	438000
Zn 1000 Пдк	10	1	1224000	1164000	1002000	30000	60000
		2	1938000
		3	336000

Таблица 4 Количественный учет микроорганизмов на среде МПА+СА (разведение 10^3)