Часто шифт-реагенты используются для обнаружения в структуре соединений:

1. гидроксильных групп с наиболее выраженными кислотными свойствами (7-ОН, 4'-ОН);

2. хелатообразующего фрагмента, т. е. сочетания 4-оксогруппы с 3-ОН- и/или 5-ОН-группами.

Гидроксильные группы различаются по кислотности и располагаются в следующий ряд: 7-ОН > 4'-ОН > 3'-ОН > 5-ОН. Для доказательства наличия в структуре свободной наиболее кислой 7-ОН-группы служит слабощелочной шифт-реагент - ацетат натрия (таблица 1.5). Несколько миллиграммов плавленого ацетата натрия добавляют к аликвоте исходного метанольного раствора исследуемого вещества, снимают спектр и сравнивают со спектром исходного раствора.

Таблица 1.5 - Шифт-проба с ацетатом натрия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный признак
Флавоны	I	+ (5-20)	Свободная 7-ОН-группа
Флавонолы
Изофлавоны
Флаваноны	II	+ (30-60)	Свободная 7-ОН-группа
Флаванонолы

Для доказательства свободной 4'-ОН-группы (одновременно с 7-ОН-группой) используется более сильный щелочной реагент -- метоксид натрия (таблица 1.6). При этом к аликвоте метанольного раствора исследуемого соединения добавляют 2-3 капли шифт-реагента; снимают спектр сразу и еще после 3-5 минут стояния.

Для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) на рисунке 1.15 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

Таблица 1.6 - Шифт-проба с метоксидом натрия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный признак
Флавоны Флавонолы	I	+ (45-65) (без изменения интенсивности)	Свободная 4'-ОН-группа
		Снижение интенсивности со сдвигом или без сдвига	Замещенная группа 4'-OR
		Снижение интенсивности и деградация через 3-5 мин.	Свободная 3',4'-дигидрокси- или тригидроксигруппировка
		Появление новой слабоинтенсивной полосы 320-335 нм	Свободная 7-ОН-группа
Флавононы Флавононолы	II	Сдвиг с 280 до 325 нм	Свободная 7-ОН-группа
		Отсутствие сдвига	Замещенная 7-OR-группа
Халконы Ауроны	II	Появление красного или оранжевого окрашивания и сдвиг на 50 нм с возрастанием интенсивности	Свободная 4-ОН-группа (халконы)
			Свободная 6-ОН-и/или 4'-ОН-группы (ауроны)

Рисунок 1.14 - Химическая структура дигидрокемпферола

Рисунок 1.15 - УФ-спектр дигидрокемферола с использованием шифт-агентов

Для рамнетина (рисунок 1.16) на рисунке 1.17 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

Рисунок 1.16 - Химическая структура рамнетина

Рисунок 1.17 - УФ-спектр рамнетина с использованием шифт-агентов

Для атеметина (рисунок 1.18) на рисунке 1.19 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

Рисунок 1.18 - Химическая структура артеметина

Рисунок 1.19 - УФ-спектр артеметина с использованием шифт-агента

Для дигидрофизетина (рисунок 1.20) и физетина (рисунок 1.21) на рисунке 1.22 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов [13].



Рисунок 1.20 - Химическая структура дигидрофизетина

Рисунок 1.21 - Химическая структура физетина

Шифт-проба с ацетатом натрия для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) приводит к батохромному сдвигу полосы II на 36 нм, что соответствует наличию 7-ОН-группы во флаванонолах (см. табл. 6). В то же время артеметин, в структуре которого присутствуют замещенные (метилированные) гидроксильные группы в положениях 7 и 4', не дает положительной шифт-пробы с ацетатом натрия (отсутствует батохромный сдвиг полосы 1) (рисунок 1.19).

Широко используемой является реакция взаимодействия флавоноидов с хлоридом алюминия. Флавоноиды способны образовывать комплексные соединения с включением ионов А1³⁺. Считается, что в образовании комплекса с ионами металлов могут участвовать три центра в структуре молекулы флавоноида (рисунок 1.23).



Рисунок 1.22 - УФ-спект дигидрофизетина и физетина с добавлением шифт-агента

Рисунок 1.23 - Возможные центры хелатирования флавоноидами ионов металлов

В результате комплексообразования в УФ-спектрах поглощения наблюдается сильный батохромный сдвиг полос поглощения I или II в зависимости от типа флавоноидного соединения (таблица 1.7). Для определения центров комплексообразования - снимают спектр (1) метанольного раствора исследуемого раствора исследуемого вещества. К аликвоте метанольного раствора исследуемого вещества добавляют 2-3 капли 5%-го метанольного раствора А1С1₃ и снимают спектр (2). Спектры (1) и (2) сравнивают между собой [13].

Например, в УФ-спектре кверцетина максимум полосы I сдвигается с 375 до 435 нм (батохромный сдвиг) и соответственно раствор приобретает яркое желтое окрашивание. На этом основано использование спиртового раствора AlCl₃ в качестве проявляющего реагента в ТСХ флавоноидов.

Для рамнетина, в молекуле которого в комплексообразовании могут участвовать три центра, шифт-проба с AlCl₃ приводит к батохромному сдвигу полосы I на 80 нм (рисунок 1.17), а в артеметине, где возможность комплексообразования ограничена одним центром, поскольку имеется только одна свободная ОН-группа в положении 5, батохромный сдвиг в результате шифт-пробы с А1С1₃ составляет 32 нм (рисунок 1.15). Отсутствие в молекуле 5-ОН-группы и возможность участия в комплексообразовании только двух других центров, как это показано на рисунке 1.22 на примере физетина, приводит тем не менее к довольно большому батохромному сдвигу - на 96 нм.

Таблица 1.7 - Шифт-проба с хлоридом алюминия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный признак
Флавоны Флавонолы	I	35-70 Нет сдвига	Свободные 5-ОН-и/или 3-ОН-группы Отсутствуют или амещены 3-ОН-и/или 5-ОН-группы
Флаваноны Флаванонолы Изофлавоны	II	10-25	Свободная 5-ОН-группа
Халконы Ауроны	I I	40-64 60-70	Свободная 2'-ОН-группа Свободная 4-ОН-группа

Для дигидрофлавонолов в целом шифт-пробы с А1С1₃ характеризуются меньшими бахромными сдвигами. Например, в случае дигидрокемферола бахромный сдвиг равен 25 нм (рисунок 1.15), а дигидрофизетина - 31 нм (рисунок 1.22).

Наибольший батохромный сдвиг соответствует комплексообразованию с одновременным участием всех трех потенциальных центров молекулы (рисунок 23). При этом более прочными считаются комплексы, образованные с участием карбонильной группы и 5-ОН- и/или 3-ОН-группами. Комплекс с 3',4'-дигидроксигруппировкой в кольце В нестабилен, легко разрушается в слабокислой среде и соответственно при этом уменьшается батохромный сдвиг, что, в свою очередь, служит тестом для обнаружения этой дигидроксигруппировки в молекуле. Так, для рамнетина шифт-проба с А1С1₃ + НС1 приводит к уменьшению батохромного сдвига на 28 нм по сравнению с шифт-пробой с А1С1₃ (рисунок 1.17).

Проблема состава комплексов флавоноидов с ионами металлов является предметом многочисленных научных исследований и нельзя сказать, что она решена и в настоящее время. Доказано, что хелатирование кверцетина с А1³⁺ происходит только по двум центрам: во-первых, с участием 4-оксогруппы и 3-ОН-группы и, во-вторых, с участием 3',4'-дигидрокси - группировки (рисунок 1.24 и 1.25) [13].

Рисунок 1.24 - Центры хелатирования комплексов кверцетина с хлоридом алюминия



1 - кверцетин; 2 - кверцетин-А1С1₃ (2:1, моль); 3 - кверцетин-А1С1₃ (0,1:1, моль)

Рисунок 1.25 - УФ-спектр комплексов кверцетина с хлоридом алюминия:

Гидроксильная группа в положении 5 не участвует в хелатировании в силу своей низкой кислотности. Образование хелата с участием 5-ОН- и 4-оксогруппы стерически затруднено из-за возникновения в молекуле соседнего хелата.

В настоящее время происходит смена «приоритетов» и зачастую сложные структурные вопросы решаются уже более «коротким», но более технически оснащенным путем за счет высокоразрешающих современных физико-химических методов [13].

1.3.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов

Широкое распространение в анализе получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определением площади пятна па хроматограмме [10].

1.3.4.1 Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов

Хроматомасспектрометрия - метод анализа смесей, преимущественно органических веществ, и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго - идентификацию и определение строения вещества, количественного анализа. Известны два варианта хроматомасспетрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с ВЭЖХ.

При сочетании ГЖХ и масс-спектрометрии совместимость этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое вещество находится в газовой фазе, рабочие температурные интервалы одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки. Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10^-5 - 10^-6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 10⁵ Па. Для понижения давления используют молекулярный сепаратор, который одним концом соединен с выходом хроматографической колонки, а другим - с ионным источником масс-спектрометра. Молекулярный сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. При этом давление на выходе колонки понижается до рабочего давления в масс-спектрометре.

Принцип действия молекулярных сепараторов основан либо на различии подвижности молекул газа-носителя и анализируемого вещества, либо на их различной проницаемости через полупроницаемую мембрану. Чаще всего применяют энжекторные сепараторы, работающие по первому принципу. Одностадийные сепараторы этого типа содержат две форсунки с отверстиями небольшого диаметра, которые установлены точно напротив друг друга. В объеме между форсунками создается давление 1.33 Па. Газовый поток из хроматографической колонки через первую форсунку со сверхзвуковой скоростью попадает в область вакуума, где молекулы распространяются со скоростями, обратно пропорциональными их массе. В результате более легкие и быстрые молекулы газа-носителя откачиваются насосом, а более медленные молекулы органического вещества попадают в отверстие второй форсунки, а затем в ионный источник масс-спектрометра. Некоторые приборы снабжены двухстадийным молекулярным сепаратором, снабженным еще одним подобным блоком форсунок. В объеме между ними создается высокий вакуум. Чем легче молекулы газа-носителя, тем эффективнее они удаляются из газового потока и тем выше обогащение органическим веществом.

Наиболее удобный для хроматомасспектрометрии газ-носитель - гелий. Эффективность работы сепаратора, то есть отношение количества органического вещества в газовом потоке, выходящем из колонки, к его количеству, поступающему в масс-спектрометр, в значительной степени зависит от расхода газа-носителя, попадающего в сепаратор. При оптимальном расходе 20-30 мл/мин удаляется до 93% газа-носителя, а в масс-спектрометр поступает более 60% анализируемого вещества. Такой расход газа-носителя типичен для насадочных колонок. В случае использования капиллярной хроматографической колонки расход газа-носителя не превышает 2-3 мл/мин, поэтому на ее выходе в газовый поток добавляют дополнительное количество газа-носителя, чтобы скорость потока, поступающего в молярный сепаратор, достигла 20-30 мл/мин. Тем самым обеспечивается наилучшая эффективность молекулярного сепаратора. Гибкие кварцевые капиллярные колонки могут вводиться непосредственно в ионный источник. В этом случае ионный источник должен быть обеспечен мощной откачивающей системой, поддерживающей высокий вакуум.

В масспектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества.

Анализируемое вещество (обычно в растворе) вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а пары в смеси с газом-носителем под давлением поступают в колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент в токе газа-носителя по мере элюирования из колонки поступает в молекулярный сепаратор. В сепараторе газ-носитель в основном удаляется и обогащенный органическим веществом газовый поток поступает в ионный источник масс-спектрометра, где молекулы ионизируются. Число образующихся при этом ионов пропорционально количеству поступающего вещества. С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества [16,20].

Важное условие работы прибора - быстрая запись масс-спектра, который должен регистрироваться за время, гораздо меньшее, чем время выхода хроматографического пика. Медленная запись масс-спектра может исказить соотношение интенсивностей пиков в нем. Скорость регистрации масс-спектра (скорость сканирования) определяется масс-анализатором. Наименьшее время сканирования полного масс-спектра (несколько миллисекунд) обеспечивает квадрупольный анализатор. В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс - время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы. Как описано выше, может быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочих температур колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя. Если вещества не удовлетворяют этим требованиям, их можно химически модифицировать, например силилированием, алкилированием или ацилированием гидрокси-, карбокси-, меркапто-, аминогрупп.

Чувствительность хроматомасспетрометрии (обычно 10^-6-10^-9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10^-12-10^-15 г) разновидность хроматомасспетрометрии - массфрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хроматомасспетрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия). Осуществляют масс-фрагментографию на хромато-масс-спектрометрах с использованием специального устройства - многоионного детектора либо с помощью ЭВМ, которая может строить хроматограммы по одному или нескольким ионам. Такая хроматограмма, в отличие от обычной, содержит пики лишь тех компонентов, в масс-спектрах которых есть такие ионы. Анализ проводят с применением внутреннего стандарта, в качестве которого часто используют аналог искомого вещества, меченный стабильными изотопами (²Н, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁸O).

Другой вариант хроматомасспетрометрии заключается в сочетании ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖХ. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0.5-5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически.

В ряде промышленных приборов реализован принцип ленточного транспортера. Элюат из колонки попадает на движущуюся ленту, которая проходит через обогреваемую ИК излучением камеру, где испаряется растворитель. Затем лента с веществом проходит через область, обогреваемую другим нагревателем, где испаряется анализируемое вещество, после чего оно поступает в ионный источник и ионизируется. Более эффективный способ сочетания высокоэффективного газо-жидкостного хроматографа и масс-спектрометра основан на электро- и термораспылении. В этом случае элюат пропускают через капилляр, нагретый до 150 °С, и распыляют в вакуумную камеру. Ионы буфера, присутствующие в растворе, участвуют в ионоооразовании. Образовавшиеся капли несут положительный, или отрицательный заряд. Вдоль капли из-за малого ее диаметра создается высокий градиент электрического поля, причем по мере распада капель этот градиент возрастает. При этом происходит десорбция из капель протонированных молекулярных ионов или кластеров (молекула вещества + катион буфера).

Метод хроматомасспетрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и других областях [16,20].

2. Специальная часть

2.1 Выбор объекта исследования

В комплексной дипломной работе были проанализированы литературные данные, на основании которых было выбрано сырье, содержащее наибольшее количество исследуемых флавоноидов (рутина и кверцетина): цветки календулы, трава пустырника, плоды боярышника.

2.1.1 Характеристика исследуемого сырья

2.1.1.1 Цветки календулы

Календула лекарственная (Calendula officinalis) или ноготки - однолетнее растение, род растений семейства сложноцветных. Полукустарники, многолетние или однолетние травы с ветвистыми стеблями и цельными листьями. Соцветия - корзинки на длинных цветоносах, одиночные; язычковые цветки многочисленные - жёлтые, пестичные и плодущие; трубчатые - обоеполые, но бесплодные; семянки изогнутые (до кольцевидных), наружные по форме отличаются от средних и внутренних.

В медицинских целях используют цветки и листья, без нижних частей стебля. Собирают цельные цветочные корзинки или одни цветки. Собранное сырье сушат, раскладывая на бумаге в помещениях или на воздухе под навесом.

Помимо флавоноидов, календула содержит эфирное масло, горькие вещества, фитонциды, сапонины, слизи, большое количество каротина, органические кислоты, следы алколоидов.

Календула успокаивает нервную систему, несколько снижает артериальное давление, усиливает работу сердечной мышцы, замедляет сердечный ритм, уменьшает отеки. При применении внутрь препараты календулы проявляют свою противовоспалительную активность, способствуют восстановлению слизистой оболочки желудка и кишечника, заживлению язв и эрозий.

Настой календулы применяется при неврозах, гипертонии, болях в сердце (стенокардии), атеросклерозе и в климактерическом периоде.

Календула также используется при лечении мочекаменной болезни и циститах. Но особенно широко календула применяется наружно при заболеваниях ротовой полости и глотки, при ранениях, ссадинах и трофических язвах, для спринцевания в гинекологической практике, для лечения воспалительных глазных заболеваний [21].

2.1.1.2 Трава пустырника

Пустырник обыкновенный (Leonurus cardiaca) - многолетнее травянистое растение семейства губоцветных. Стебель прямостоячий четырехгранный, высотой от 30 до 120 см. Листья супротивные, нижние округлые; средние - продолговатые или ланцетные, трехраздельные; верхние - узкие, цельные. Цветки розово-фиолетовые, собраны густыми мутовками в пазухах верхних листьев, образуя длинное прерывистое колосовидное соцветие на конце стебля.

По химическому составу в пустырнике обыкновенном содержится монурин (горькое вещество), эфирное масло, дубильные вещества, группа алкалоидов (стахидрин, бетоницин, турицин, леондрин), флавоноиды, холин, гликозид, органические кислоты, аскорбиновая кислота, жирное масло.

Препараты пустырника обладают успокаивающим и антиконвульсионным действием на центральную нервную систему и применяются при неврозах. Настои используются при лечении в климактерический период и как вспомогательное средство при лечении базедовой болезни. Применение препаратов пустырника успокаивает работу сердца, увеличивает силу сердечных сокращений, снижает артериальное давление благодаря чему они применяются при гипертонии, сердечных неврозах, стенокардии, микрокардиопатии, кардиосклерозе [21].

2.1.1.3 Плоды боярышника

Боярышник кроваво-красный (обыкновенный) (Crataegus oxyacantha) относится к семейству розоцветных.

Плоды боярышника яблокообразные, от шаровидной до эллипсоидальной формы, твердые, морщинистые, длиной 6-14 мм, шириной 5-11 мм, сверху с кольцевой оторочкой, образованной ссохшимися чашелистиками. Цвет плодов от желто-оранжевого и буровато-красного до темно-бурого или черного, иногда с беловатым налетом выкристаллизовавшегося сахара. Запах отсутствует. Вкус сладковатый.

По химическому составу плоды боярышника содержат флавоноиды, органические кислоты (лимонная, олеаноловая, урсоловая, кратегусовая, кофейная, хлорогеновая), каротиноиды, дубильные вещества, жирные масла, пектины, тритерпеновые и флавоновые гликозиды, в-ситостерин, холин, сахара, витамины и другие соединения.

Препараты на основе боярышника тонизируют работу сердца, усиливают сердечные сокращения, нормализуют артериальное давление, обладают спазмолитическим и успокаивающим действием, нормализуют работу сердца. При их употреблении наступает глубокий и спокойный сон. Усиление и ослабление действия препаратов зависит от их дозировки. Любые производные боярышника не токсичны и не вызывают побочных явлений. Чаще всего их используют при коронарной недостаточности с симптомами стенокардии, а также гипертонической болезни, атеросклерозе, повышенной возбудимости, потере сознания, острой форме суставного ревматизма. Настои цветков и плодов помогают при климактерических неврозах [21].

2.2 Методики экспериментов и анализов

2.2.1 Методы отбора проб

Метод отбора проб цветков календулы лекарственной, травы пустырника обыкновенного и плодов боярышника кроваво-красного производится согласно ГОСТ 24027.0-80 «Правила приемки и методы отбора проб».

1) Подготовка к отбору проб.

Попавшие в выборку единицы продукции вскрывают и, путем внешнего осмотра, определяют:

- однородность сырья по способу подготовки (цельное, измельченное, прессованное и т.д.), цвету, запаху и засоренности;

- наличие плесени, гнили, устойчивого постороннего запаха, не исчезающего при проветривании; засоренность ядовитыми растениями и посторонними примесями (камни, стекло, помет грызунов и птиц и т.д.).

2) Измельчение.

Сырье измельчают в фарфоровой ступке до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

3) Отбор аналитических проб для определения влажности и содержания флавоноидов.

Аналитические пробы определяют методом квартования. Для этого сырье помещают на гладкую, чистую, ровную поверхность, перемешивают, разравнивают, по возможности тонким, равномерным по толщине слоем в виде квадрата, и по диагонали делят на четыре треугольника. Два противоположных треугольника удаляют, а два оставшихся соединяют, осторожно перемешивают, разравнивают в виде квадрата, вновь делят по диагонали и удаляют следующие два треугольника. Так повторяют до тех пор, пока в двух противоположных треугольниках не останется количество сырья, соответствующее массе аналитической пробы (5 г).

Аналитические пробы должны быть отобраны с погрешностью не более 0.01г [22].

2.2.2 Метод определения влажности лекарственного растительного сырья

Определение влажности растительного сырья производится согласно ГОСТ 24027.2-80 «Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных веществ, эфирного масла». Основан данный метод на определении потери в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ при высушивании сырья до абсолютно сухого состояния [23].

Оборудование, материалы и реактивы:

- шкаф сушильный лабораторный;

- весы лабораторные;

- весы аналитические;

- эксикатор;

- тигли;

- щипцы тигельные;

- вазелин технический;

- концентрированная серная кислота.

1) Подготовка к испытанию.

Берут две навески (аналитические пробы) сырья массой по 3-5 г (точная навеска), взвешенные с погрешностью не более 0.01 г. Каждую навеску помещают в предварительно взвешенный и пронумерованный тигель.

2) Проведение анализа.

В сушильный шкаф, нагретый до 100-105 °С, быстро помещают подготовленные тигли с навесками. При этом температура в шкафу падает. Время, в течение которого сырье должно сушиться, отсчитывается с момента, когда температура в шкафу достигает 100-105 °С. Высушивание проводят до постоянной массы.

Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями после 30 мин высушивания и 30 мин охлаждения в эксикаторе не превышает 0.01 г.

Первое взвешивание семян и плодов проводят через 3 часа, а трав и цветков - через 2 часа. Тигли с навесками вынимают из шкафа тигельными щипцами и помещают на 30 мин для охлаждения в эксикатор, на дне которого находится концентрированная серная кислота. Охлажденные тигли взвешивают[23].

Проводят два параллельных определения.

Влажность сырья (Х) в процентах вычисляют по формуле (2.1).

	(2.1)

где, m - масса сырья до высушивания, г;

m₁ - масса сырья после высушивания, г.

Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0.5%.

2.2.3 Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом

При оценке качества растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, наибольшее распространение получил спектрофотометрический метод анализа, основанный на использовании реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Фотометрический метод определения без предварительного разделения компонентов основан на аддитивности значений оптической плотности всех компонентов смеси при одной длине волны. Метод достаточно прост в исполнении, является высокочувствительным и относительно недорогим, что делает его предпочтительным для использования в контрольно-аналитических лабораториях. Использование такого метода позволяет определить сумму флавоноидов в присутствии других полифенольных соединений, не образующих комплекса с алюминием хлорида в среде 30-96% спирта [24].

В качестве стандарта используется тот флавоноид (рутин, кверцетин, гесперетин и т.д.), максимум поглощения комплекса которого наиболее соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия исследуемого образца.

В дипломной работе в качестве стандарта использовался ГСО рутина и ГСО кверцетина, так как максимумы поглощения комплексов с хлоридом алюминия рутина/кверцетина и экстрактов боярышника, пустырника и календулы наблюдаются при наиболее близких значениях длин волн.

Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре ПЭ-5300В в интервале длин волн 408-616 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Оборудование, материалы и реактивы:

- мерная колба объемом 100 см³ - 1 шт.;

- мерные колбы объёмом 25 см³ - 6 шт.;

- пипетки объёмом 1 см³- 3 шт.;

- пипетки объёмом 5 см³ - 1 шт.;

- мерный цилиндр объемом 100 см³;

- часы;

- кюветы на 10 мм;

- спектрофотометр ПЭ-5300В;

- экстракт пустырника;

- экстракт боярышника;

- экстракт календулы;

- алюминия хлорид 5%;

- спирт этиловый 70%;

- спирт этиловый 95%.

Подготовка к анализу

1) Приготовление 5%-го раствора алюминия хлорида

5 г алюминия хлорида х.ч. или ч.д.а. (ГОСТ 3759-75) растворяют в 50 мл 95% спирта в мерной колбе на 100 мл, доводят объём раствора этим же спиртом до метки и перемешивают.

Срок годности раствора 3 месяца.

Для анализа было приготовлено 250 мл 5% раствора алюминия хлорида в 70% спирте.

2) Приготовление 70%-го этилового спирта

Для приготовления 1л 70% этилового спирта смешивают 675 г этилового спирта 95% и 325 г воды. В объемных единицах 95% этилового спирта - 855 см³, воды - 325 см³. После приготовления раствора проверяют его плотность или объемную долю спирта ареометром (ГОСТ 3639-79).

3) Приготовление экстрактов

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0.5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% спирта этилового. Колбу взвешивают с погрешностью ±0.01 г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают в термостате при температуре 60 °С в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы 70% спиртом этиловым. Содержимое колбы фильтруют через воронку диаметром 7 см с вложенным ватным тампоном, отбрасывая первые 20 мл фильтрата [21].

Проведение спектрофотометрического анализа

В мерную колбу вместимостью 25 мл, предварительно взвешенную, переносят с помощью пипетки аликвоту анализируемого экстракта, равную 1 мл, и вновь взвешивают. В колбу с помощью пипетки добавляют 4 мл 5% раствора хлорида алюминия. Для приготовления раствора сравнения во вторую колбу вместимостью 25 мл с помощью пипетки переносят аликвоту (1 мл) анализируемого экстракта, после чего объем обеих колб доводят до метки 70% спиртом и оставляют на 30 мин. В случае помутнения растворов их фильтруют через бумажные фильтры в чистые стаканы.

Оптическую плотность измеряют в интервале 408-616 нм на длине волны максимума поглощения в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм, в рабочую кювету помещают раствор с добавленным хлоридом алюминия, в кювету сравнения - раствор сравнения. Если максимум поглощения расположен в области 408-420 нм, в качестве стандарта используют ГСО рутина. Если максимум поглощения расположен в области 421-435 нм, в качестве стандарта используют ГСО кверцетина [24].

Массовую долю суммы Р-активных флавоноидов в исследуемых экстрактах в пересчете на рутин в мг/ 100г (Х) вычисляют по формуле:

	(2.2)

где, с - количество рутина в анализируемой аликвоте экстракта, соответствующее измеренной оптической плотности по калибровочному графику, г/25 см³;

F_р - фактор разбавления;

10⁵ - коэффициент пересчета в мг/100г;

М - масса экстракта, г.

2.2.4 Количественное определение рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Применимость и аналитические качества масс-спектрометрии в области количественного определения природных флавоноидов в значительной мере определяются возможностью ее комбинации с другим методом, таким как жидкостная хроматография. Соединение жидкостного хроматографа и массспектрометра осуществляется с помощью интерфейса, обеспечивающего удаление большей части жидкой фазы из пробы перед поступлением ее в массспектрометр.

В настоящее время предложено много различных типов интерфейсов, но применяются преимущественно устройства с электрораспылением и ионизацией при атмосферном давлении, которые выполняют функции удаления жидкой фазы и ионизации молекул анализируемых веществ. Анализ данных хромато-масс-спектрометрии производится двумя способами. По первому способу осуществляется анализ масс-спектров, зарегистрированных в различных точках масс-хроматограммы, путем сравнения с масс-спектрами эталонов, собранными в базе данных (библиотечный поиск), или же структурные фрагменты молекулы определяются с использованием спектро-структурных корреляций. По второму способу регистрируются и анализируются масс-хроматограммы по полному ионному току, по отдельным ионам или группам ионов. Такие ионные масс-хроматограммы позволяют обнаруживать и подтверждать структуру компонентов смеси и применимы для количественного определения флавоноидов.

Оборудование, материалы и реактивы:

- Жидкостной хроматограф Dionex UltiMate3000 для решения различных аналитических задач;

- Масс-спектрометр API 2000 производства Applied Biosystems для высокопроизводительных рутинных исследований;

- ГСО рутина;

- ГСО кверцетина;

- мерные колбы объёмом 25 см³ - 2 шт.;

- мерная колба объемом 50 мл - 2 шт.;

- виалки с пробой - 12 шт.;

- экстракт пустырника

- экстракт боярышника

- экстракт календулы

- спирт этиловый 70%

Подготовка к анализу

1) Приготовление раствора ГСО рутина: около 0.05 (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 часов, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в 40 мл 70 % водного спирта при нагревании на водяной бане. После растворения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70 % спиртом до метки [25].

2) Приготовление раствора ГСО кверцетина проводилось по методике аналогичной методике приготовления ГСО рутина (см. выше).

3) Методика приготовления экстрактов из растительного сырья

Приготовление экстрактов из цветков календулы, плодов боярышника и травы пустырника проводилось аналогично методике, описанной в п. 2.2.3.

Проведение количественного анализа биофлавоноидов в растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Анализ проб экстрактов проводился с использованием жидкостного хроматографа Dionex UltiMate 3000, оснащенного трехквадрупольным масс-спектрометром API 2000 c ионизацией электростатическим распылением при атмосферном давлении (API-ES). Регистрация и обработка данных проведена с использованием программного комплекса «Analyst 1.5».

Хроматографическое разделение флавоноидов осуществлялось на хроматографической колонке Luna C18 длиной 300 мм и внутренним диаметром 2 мм, в изократическом режиме при следующих условиях:

Подвижная фаза:компонент А - вода (0.37 % раствор муравьиной кислоты);

компонент В - ацетонитрил (0.33 % раствор муравьиной кислоты).

Скорость подачи подвижной фазы:0.250 мл/мин.

Объем вводимой пробы:100 мкл.

Давление на входе колонки:80 атм.

Температура термостата колонки:50?С.

Время анализа:15 мин.

Состав подвижной фазы на выходе из хроматографической колонки регистрировался масс-спектрометрически. В ходе масс-спектрометрического анализа регистрировались хроматограммы по ионному току, обусловленные положительно-заряженными ионами 303 и 610 m/z, соответствующие молекулярным ионам кверцетина и рутина соответственно. Пример хроматограммы представлен на рисунке 2.1.

Рисунок 2.1 - Хроматограмма рутина и кверцетина

Ионизация потока элюэнта проводилась при следующих условиях:

температура в источнике ионов - 180?С;

давление в распылителе:атмосферное (азот);

напряжение на капилляре: 4500 В;

газ 1 (обдув капилляра) - 40 мл/мин;

газ 2 (на входе в источник) - 50 мл/мин;

газ 3 (в источнике) - 90 мл/мин.

Проведение анализа осуществлялось в день приготовления экстрактов для предотвращения окисления флавоноидов.

2.2.5 Использованные реагенты

Сведения об использованных реактивах представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1 - Список использованных реактивов

№ п/п	Наименование, формула	Производитель, марка
1.	Трава пустырника	ОАО «Здоровье», серия 40845
2.	Плоды боярышника	ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика», серия 70807
3.	Цветки календулы	ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика», серия 50507
4.	Алюминия хлорид АlCl3	ГОСТ 3759-75, ч.д.а.
5.	Кверцетин C15H10O7	ООО «Фитопанацея», ТУ 2638-012-80884467-10, 99.57
6.	Рутин C27H30O16	ООО «Фитопанацея», ТУ 2638-011-80884467-10, 98.59.
7.	Спирт этиловый 95%; C2H5OH	ООО «Реактив», х.ч.
8	Серная кислота, концентрированная H2SO4	Пр-во ОАО «Реактив», Санкт-Петербург, ч.д.а.

2.3 Результаты и обсуждение

В ходе работы проводилось исследование лекарственного растительного сырья на количественное содержание биофлавоноидов (рутина и кверцетина).

Производителями анализируемого сырья являются «Тверская фармацевтическая фабрика» и ОАО «Здоровье».

Для объективной оценки были выбраны три образца лекарственного растительного сырья, представленных в таблице 2.2.

Таблица 2.2 - Наименование и производители лекарственного растительного сырья

№ пробы	Наименование растительного сырья	Производитель
Проба 1	Трава пустырника сердечного	«Здоровье»
Проба 2	Цветки календулы лекарственной	«Тверская фармацевтическая фабрика»
Проба 3	Плоды боярышника кроваво-красного	«Тверская фармацевтическая фабрика»

2.3.1 Определение влажности

Для определения влажности проводили два параллельных определения на содержание влаги в растительном сырье по методике, указанной в п. 2.2.2. Для этого берут по две точные навески (около 5 г) каждой пробы. Отбор проб производился согласно ГОСТ 24027.0-80 «Правила приемки и метода отбора проб». В сушильном шкафу при температуре 100-105⁰С навески были доведены до постоянной массы. После проведения испытаний и расчетов, указанных в п. 2.2.2 получены следующие результаты, приведенные в таблице 2.3.

Таблица 2.3 - Содержание влаги в пробах лекарственного растительного сырья

№ пробы	Масса пробы до высушивания	Масса пробы после высушивания	Содержание влаги, %	Среднее значение содержания влаги, %
Проба 1 Навеска 1 Навеска 2	5.0137 5.0073	4.5976 4.5817	8.30 8.50	8.40
Проба 2 Навеска 1 Навеска 2	5.0203 5.0508	4.4329 4.4498	11.70 11.90	11.8
Проба 3 Навеска 1 Навеска 2	5.0196 5.0068	4.4925 4.4661	10.50 10.80	10.70

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что во всех пробах лекарственного растительного сырья содержание влаги соответствует ГФ 11 (содержание влаги для травы пустырника должно быть не более 13%, а для цветков календулы и плодов боярышника - не более 14%).

2.3.2 Количественное определение суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом при оптимальных условиях экстрагирования

В ходе исследования было выявлено, что наиболее полное извлечение определяемых веществ достигалось с использованием 70%-го спирта этилового, временем экстрагирования 2 ч и при температуре проведения эксперимента 60 °С. При определении количественного содержания флавоноидов лекарственного растительного сырья в пересчете на рутин, были получены данные, представленные в таблице 2.4. Эксперимент проводился согласно методике, представленной в п. 2.2.3.

Таблица 2.4 - Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в растительном сырье

Наименование экстракта	Содержание флавоноидов в пересчете на рутин, мг/мл
Экстракт травы пустырника	0.0055
Экстракт цветков календулы	0.0053
Экстракт плодов боярышника	0.0015

2.3.3 Количественное определение флавоноидов в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Метод количественного анализа основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго - идентификацию и количественный анализ. Перед количественным определением содержания кверцетина и рутина в исследуемых образцах экстрактов растительного сырья, необходимо построение градуировочного графика с использованием ГСО анализируемых биофлавоноидов. Градуировочный график в координатах площадь пика - концентрация должен быть линеен и прямая должна проходить через начало координат. Для построения такого графика достаточно, вообще одной экспериментальной усредненной точки. Однако градуировочный график обычно строят не менее чем по 3-8 средним точкам, полученным в результате 3-х последовательных измерений, что повышает точность и надежность определений. Для построения калибровочного графика используют аликвоты растворов рутина и кверцетина равные 0.2 см³. Далее путем последовательного разбавления 70% этиловым спиртом получают растворы с концентрацией, указанной в таблице 2.5, 2.6 для рутина и кверцетина, соответственно.

Для построения калибровочной кривой методом последовательного разбавления была приготовлена серия растворов каждого исследуемого биофлавоноида. Затем анализируемые образцы помещали в виалки и последовательно располагали в автоматическом пробоотборнике. Далее с использованием программного обеспечения прибора задавали условия проведения анализа, указанные в п. 2.2.4.

Данные для построения калибровочных кривых для рутина и кверцетина, представлены в таблице 2.5, 2.6, соответсвенно:

Таблица 2.5 - Данные для построения калибровочных кривых для рутина и кверцетина

Концентрация раствора, мг/мл	Площадь пика.10-6 (рутин), импульсы	Площадь пика.10-6 (кверцетин), импульсы
0.0001	0.0664	0.808
0.0002	0.0657	1.060
0.0005	0.4150	3.890
0.001	2.3200	17.10
0.002	0.5690	6.090
0.02	2.1900	25.800
0.05	6.2500	56.600
0.1	7.0000	97.500

На основании полученных данных были построены калибровочные графики, на которых показана зависимость площади пика от концентрации рутина и кверцетина. Построение графика производилось с помощью программы SigmaPlot 11. Полученные зависимости приведены на рисунке 2.2 для рутина и на рисунке 2.3 для кверцетина.

Рисунок 2.2 - График зависимости площади пика от концентрации рутина

Следует отметить, что кривая, описывающая зависимость площади пика от концентрации рутина имеет область линейности и область полного насыщения детектора. Отклонение от линейности связано с увеличением концентрации анализируемого вещества.



Рисунок 2.3 - График зависимости площади пика от концентрации кверцетина

По разработанной методике, указанной в п. 2.2.3 раздела подготовка к анализу, получены экстракты травы пустырника сердечного, цветков календулы и плодов боярышника. Далее был проведен хроматомасспектрометрический анализ биофлавоноидов (рутина и кверцетина) в исследуемых образцах. Результаты, полученные в ходе анализа представлены в таблице 2.7 для рутина и в таблице 2.8 для кверцетина.

Таблица 2.7 - Площадь пика для рутина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Площадь пика.10-6, импульс	Средняя площадь пика 10-6, импульсы
1	2	3
Экстракт травы пустырника	0.0784	0.07790
	0.0771
	0.0783
Экстракт цветков календулы	0.0359	0.03590
	0.0360
	0.0358
Экстракт плодов боярышника	0.00260	0.00264
	0.00268
	0.00264

Таблица 2.8 - Площадь пика для кверцетина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Площадь пика.10-6, импульс	Средняя площадь пика 10-6, импульсы
Экстракт травы пустырника	0.00546	0.00546
	0.00544
	0.00547
Экстракт цветков календулы	0.00192	0.00193
	0.00199
	0.00188
Экстракт плодов боярышника	0.0172	0.01540
	0.0121
	0.0168

На основании полученных данных, с использованием градуировочных графиков для рутина (рисунок 2.1) и кверцетина (рисунок 2.2), определи количественное содержание исследуемых биофлавоноидов в экстрактах растительного сырья. Результаты количественного содержания рутина и кверцетина представлены в таблице 2.9 и 2.10, соответственно. Для расчетов использовали данные средних площадей пиков для рутина и кверцетина в анализируемых экстрактах.

Таблица 2.9 - Содержание рутина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Содержание рутина.10-3, мг/мл
Экстракт травы пустырника	0.1900
Экстракт цветков календулы	0.0353
Экстракт плодов боярышника	0.0097

Таблица 2.10 - Содержание кверцетина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Содержание кверцетина.10-3, мг/мл
Экстракт травы пустырника	0.0051
Экстракт цветков календулы	0.0014
Экстракт плодов боярышника	0.0140

На основании полученных данных (таблица 2.4 и 2.9) было проведено сравнение количественного содержания рутина в анализируемых экстрактах. На рисунке 2.3 представлено сравнение содержания рутина в экстрактах растительного сырья по данным, полученным на основании спектрофотометрического и хроматомасспектрометрического анализа.

Рисунок 2.4 - Сравнение спектрофотометрического и хроматомасспектрометического методов

Из представленных данных очевидно, что спектрофотометрический метод определения биофлавоноидов показывает завышенное содержание рутина по сравнению с результатами хроматомасспектрометрического анализа. Это связано с тем, что спектрофотометрический метод позволяет оценить только суммарное содержание флавоноидов в экстрактах, так как максимумы поглощения родственных соединений располагаются в одной области (например, 408-420 нм для рутина, морин, кемпферол, гиперазид и др.). Поэтому данные спектрофотометрического анализа всегда пересчитывается на тот или иной флавоноид (чаще всего рутин).

Таким образом, спектрофотометрия не дает возможности проводить, наряду с количественным, качественный анализ биофлавоноидов и оценить реальное содержание исследуемого флавоноида в лекарственном растительном сырье. Этот недостаток устраняется при использовании хроматомасспектрометрического метода анализа, который позволяет идентифицировать отдельные флавоноиды независимо от присутствия посторонних и/или родственных соединений.

3. Экономическая часть

Введение

Фармацевтический рынок является одним из прибыльных и быстро растущих секторов экономики развитых стран. Это обусловлено тем, что создание, производство и применение лекарств тесно связаны с такой общечеловеческой ценностью как здоровье. Для изготовления лекарственных препаратов, наряду использования синтетических компонентов, используют лекарственное растительное сырье.

В начале прошлого века бурный прогресс в области создания лекарств синтетического происхождения стал теснить лекарственные растения, как в лечебной, так и в профилактической практике. Однако в последние десятилетия интерес к лечебно-профилактическим средствам природного происхождения (фитопрепаратам) возродился и развивается с нарастающим темпом. Основным фактором повышения интереса к лечебным свойствам лекарственных растений явилось то, что значительной части синтетических сильнодействующих препаратов присущи различные нежелательные, даже опасные побочные эффекты. Особенно чувствительны к нежелательным эффектам синтетических лекарств люди пожилого возраста, больные хроническими заболеваниями и дети.

Наиболее привлекательными чертами фитопрепаратов являются: возможность длительного применения, высокая безопасность при достаточной эффективности, простота приготовления и применения. По мнению экспертов, одним из основных факторов, сдерживающих развитие фитотерапии и ее внедрение в практику, выступает недостаточный уровень образования, информированности об этом методе врачей и провизоров.

Для российского рынка лекарственных трав и сборов в настоящее время характерна тенденция к росту. Однако объем рынка и его доля в общем объеме рынка фармпрепаратов на сегодняшний день выглядят довольно скромно, составляя 11-12 млн. долларов США или 0.5-1.5%. В странах же Евросоюза аналогичная продукция занимает до 10% от общего объема лекарственного рынка (рисунок 4.1).

Оценивая современные тенденции развития российского рынка лекарственных средств и сборов, эксперты полагают, что, несмотря на довольно скромные объемы, он представляет весьма перспективный сегмент российского фармацевтического рынка. В настоящее время интерес к фитопрепаратам проявляет целый ряд компаний. Со стороны потенциальных производителей интерес к лекарственным травам во многом стимулируется относительно небольшими размерами необходимых инвестиций. Так, при организации производства по переработке лекарственных трав и сборов основная часть средств требуется на фасовочное оборудование и составляет порядка 10 тыс. долларов США. Помимо этого для производства фитопродукции требуется разрешение Министерства здравоохранения и помещение для его размещения. В технологическом плане производство лекарственных трав и сборов является несложным, продукция не облагается НДС и налогом на прибыль.

Рисунок 4.1 - Доля лекарственных трав и сборов в общем объеме рынка лекарственных средств в России и странах Евросоюза, %

В настоящее время на российском рынке представлено около 100 производителей лекарственных трав и сборов. Большинство производителей имеет статус региональных, осуществляя реализацию продукции лишь в пределах своих областей, около 20% российских производителей работают в национальном масштабе [26].

Производство лекарственных трав и сборов осложнено рядом факторов, в связи с чем, несмотря на активный рост спроса на лекарственные травы и сборы, хозяйств, которые занимаются их производством, в России немного. Новые хозяйства практически не появляются.

Во многом перспективы развития российского рынка лекарственных трав и сборов связаны со способностью и заинтересованностью государства в создании условий для повышения привлекательности этого вида бизнеса, как для отечественных производителей, так и для кредитно-инвестиционных структур. На сегодняшний же день можно наблюдать тенденцию к тому, что все чаще России, обладающей уникальным по своим характеристикам естественным лекарственным богатством, приходится импортировать растительное сырье из Индии, Китая, Польши и других стран. Несмотря на относительно малую численность российских производителей лекарственных трав и сборов, ими выпускается 80% лекарственных растительных средств, занесенных в Государственный реестр лекарственных средств (рисунок 4.2) - это высокий показатель.

Рисунок 4.2 - Доля лекарственных растительных средств из числа занесенных в Государственный реестр, выпускаемых российскими производителями, %

Россия является крупнейшим экспортером лекарственных трав. Согласно официальной статистике, по объемам экспорта лекарственных трав на европейском рынке лидирует Германия. Но преимущественную часть лекарственного растительного сырья Германия закупает в Болгарии. В связи с этим фактом реальным лидером по объемам экспорта лекарственных трав и сборов оказывается Россия. Примечательно, что на европейском рынке лекарственные травы, произведенные в России, считаются, продукцией высшего класса - благодаря сочетанию ряда климатических и географических факторов отечественные лекарственные травы насыщены высококачественными биоактивными веществами. Вместе с тем, необходимо заметить, что крупнейшие отечественные производители лекарственных трав и сборов значительную часть своей продукции изготавливают из импортного сырья, поставки осуществляются преимущественно из Польши, Болгарии, а также Египта и некоторых других стран [27].