Разработка технологии иммобилизации B-галктозидазы и оценка её биологического действия на молоко и некоторые молочные продукты

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова»

Биотехнологический факультет

Кафедра биотехнологии, органической и биологической химии

Специальность 240 901 - «Биотехнология»

ДИПЛОМНЫЙ ПРОЕКТ по теме:

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ в?ГАЛКТОЗИДАЗЫ

И ОЦЕНКА ЕЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА МОЛОКО И НЕКОТОРЫЕ МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Саратов 2007

Введение

По своему содержанию, целям и задачам биотехнология становится важнейшей составной частью экономики мира, в том числе и агропромышленного производства. Большое внимание уделено разработке и освоению новейших биотехнологий в растениеводстве, животноводстве, ветеринарной медицине, хранении, транспортировке и переработке сельскохозяйственной продукции, получению и использованию биологически активных веществ, кормовых добавок и др. В биотехнологии видят одно из средств для преодоления продовольственных, энергетических, сырьевых и экологических проблем.

Для пищевой, кондитерской и медицинской промышленности большое экономическое значение имеет биотехнология производства и использования ферментных препаратов.

Биологическим объектом для изучения в данном дипломном проекте является фермент микробиологического происхождения в-галактозидаза; его иммобилизация и использование в молоке и молочных продуктах. Интерес представляет использование иммобилизованной лактазы в производстве вареного сгущенного молока “Семь гномов”, выпускаемого на ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”.

Инженерная часть дипломного проекта, а также разделы “Безопасность жизнедеятельности” и “Экология” выполнялись на базе предприятия ООО “Маслосырбаза “Энгельсская”. Научно-исследовательская работа проводилась в научной лаборатории кафедры биотехнологии, органической и биологической химии СГАУ им. Н.И. Вавилова.

На основании изложенного можно сформулировать цель и задачи дипломного проекта.

Цель проекта: разработка технологии иммобилизации в?галактозидазы.

Задачи:

- оценить действие нативного фермента на снижение концентрации лактозы в молочных продуктах;

- оценить активность и продолжительность действия иммобилизованного фермента;

- ввести иммобилизованную в-галактозидазу в молоко цельное, сухое и сгущенное и оценить действие фермента на степень снижения в них содержания лактозы;

- на базе разработки технологии иммобилизации фермента усовершенствовать технологическую линию производства вареного сгущенного молока “Семь гномов”;

- просчитать экономическую эффективность проектируемого продукта и целесообразность его производства.

Молочные продукты, обладающие лечебно-профилактическими свойствами и качественным сырьевым составом, пользуются большим спросом у населения. Применение иммобилизованных ферментов в производстве таких продуктов является актуальным в современной пищевой биотехнологии. Поэтому поставленные цель и задачи дипломного проекта можно считать важными и необходимыми для выполнения.

Раздел 1. Литературный обзор

1.1 Молочные консервы

Производство молочных консервов в России непрерывно растет. Стойкие и транспортабельные, они дают возможность потреблять молоко в тех регионах, в которых отсутствует молочное скотоводство. Для туристов и экипажей кораблей эти продукты просто незаменимы. Все более широкое применение они находят в домашнем применении.

Спрос на продукцию увеличивается как со стороны прямых потребителей - населения, так и со стороны кондитерской промышленности, предприятия которой также наращивают объемы производства.

За 2006 г. производство молочных консервов в целом по России выросло на 7,1% по сравнению с предыдущим 2005 г. На долю Центрального, Сибирского и Уральского федеральных округов приходится 88,5% от общероссийского производства молочных консервов [12, 14].

Рисунок 1.1 - Основные регионы - производители молочных консервов в 2005 г.

Долгое время многие специалисты считали данный рынок недостаточно перспективным, т.к. по оценкам некоторых экспертов, значительная доля (до 40%) приходилась на заказ со стороны силовых структур государства. На сегодняшний день к одним из основных потребителей сгущенного молока относят различных производителей других пищевых продуктов. Его используют в кондитерской промышленности для производства ириса, молочных (типа «Коровки»), сбивных, помадных и ликёрных конфет, ассорти, начинок для конфет; в производстве мороженого; в хлебопекарной промышленности - для производства тортов, пирожных, рулетов, кремов.

Что же касается непосредственно населения, то по данным исследований, сгущённое молоко как особый вид сладкого продукта потребляют около 45% россиян с периодичностью от одного до нескольких раз в месяц в зависимости от исследуемой местности.

По оценкам различных экспертов 50 - 70% рынка сгущённого молока заняты консервами, изготовленными не по ГОСТу, а в соответствии с ТУ - с добавлением в продукт растительных жиров [26].

Резкое ухудшение экологической обстановки во всём мире, связанное с техническим прогрессом, а также недостаток или избыток отдельных компонентов пищи привели к появлению новых и резкому увеличению числа известных болезней, связанных с неправильным питанием.

Для сохранения здоровья человека продукты питания должны обеспечивать улучшение обмена веществ, повышение сопротивляемости организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды. В связи с этим актуальной является разработка специализированных продуктов сбалансированного состава, обладающих лечебно-профилактическим действием с учётом физиологических потребностей различных возрастных групп населения.

Создание продуктов «здорового» питания, имеющих сбалансированный состав, может быть реализовано за счёт их многокомпонентности, в частности путём комбинирования сырья животного растительного происхождения. Использование сухого молочного сырья и растительных жиров при производстве сгущённого молока с сахаром также решает такие проблемы, как дефицит молочного сырья и снижение себестоимости продукта.

Сухое молоко, жиры и специальные смеси, используемые в качестве ингредиентов при производстве рекомбинированных молочных консервов, должны быть хорошего качества и обладать необходимыми функциональными характеристиками, обеспечивающими готовый продукт определёнными свойствами.

Сухое молоко выбирают с учётом его состава, физических и химических и микробиологических характеристик. Наиболее важной характеристикой СОМ является его способность придавать продукту нужную вязкость. Важно знать условия производства, поскольку и тепловая обработка и гомогенизация могут повлиять на вязкость вырабатываемого сгущённого молока с сахаром [31].

Наиболее распространенным пороком вареного сгущенного молока является неконтролируемый рост крупных кристаллов лактозы при хранении. На завершающей стадии производства молока вареного сгущенного с сахаром продукт охлаждается от температуры 85-90°С до 20°С. Охлаждение продукта сопровождается увеличением вязкости в десятки раз и переходом до 50 % лактозы из раствора в кристаллическое состояние. Если в сгущенном молоке с сахаром путем направленной кристаллизации удается избежать роста крупных кристаллов, то в вареном сгущенном молоке направленную кристаллизацию лактозы по целому ряду причин осуществить не представляется возможным. Как следствие образование крупных кристаллов лактозы размером более 25 мкм и значительное снижение качества готового продукта.

Одним из путей выхода из создавшегося положения является перевод кристаллизуемой части лактозы в растворенное состояние путем ферментативного гидролиза до глюкозы и галактозы, растворимость которых значительно выше.

Процесс ферментативного гидролиза лактозы находит все более широкое применение в странах с развитой молочной промышленностью. Актуальность использования препаратов лактазы при переработке цельного молока и молочной сыворотки обусловлена следующими факторами:

- получение продуктов цельномолочного производства функционального назначения для людей с лактозной интолерантностью;

- сокращение сроков сквашивания при производстве кисломолочных напитков из молока, предварительно обработанного препаратом лактазы;

- производство концентратов молочной сыворотки с регулируемыми функционально-технологическими показателями и пребиотическими свойствами;

- получение сахарозаменителей (глюкозо-галактозных сиропов) более дешевых и сладких по сравнению с сахарозой для производства мороженого, хлебобулочных, кондитерских изделий и других продуктов [7].

Использование в-галактозидазы отлично себя зарекомендовало в производстве вареного сгущенного молока из традиционного сгущенного молока с сахаром. Ранее этот вкусный продукт получали примитивным способом в домашних условиях (кипятили длительное время банки с продуктом). Сегодня разработана промышленная технология нового вида консервов, пользующихся большим спросом.

Фермент в?галактозидаза осуществляет гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы, которые имеют более высокую биологическую ценность, чем исходный дисахарид лактоза. Лактоза является ценным углеводом, но сахар этот плохо растворим, несладкий, часто не усваивается животными организмами, не сбраживается дрожжами. Полученная в процессе гидролиза смесь имеет сладкий вкус, хорошо растворяется в воде, глюкоза усваивается, как животными, так и микроорганизмами.



Рисунок 1.2 - Дисахарид лактоза

Фермент в-галактозидаза - типичный фермент катаболитного пути обмена, относится к карбогидразам, гликозидазам.

Фермент осуществляет гидролиз в-В-галактозидных связей, отщепляя галактозидные остатки с невосстанавливающегося конца галактозидов: олигосахаридов, полисахаридов, гликолипидов, гликопептидов, гликопротеинов, мукополисахаридов. Активными продуцентами в-галактозидазы являются бактерии, дрожжи, плесени. В отличие от бактерий и дрожжей, плесени синтезируют внутри- и внеклеточный фермент. Свойства внеклеточных в-галактозидаз, продуцируемых микроскопическими грибами, резко отличаются от свойств внутриклеточных ферментов бактерий и дрожжей. Известны генномодифицированные штаммы микроорганизмов, обладающих способностью к сверхсинтезу в-галактозидазы.

Обработка молока препаратами в?галактозидазы позволяет обеспечить часть населения, страдай лактазной недостаточностью, молочными продуктами с пониженным содержанием лактозы [13].

1.2 Лактазная недостаточность

Лактазная недостаточность (ЛН) - врожденное или приобретенное состояние, характеризующееся снижением активности расщепляющего молочный сахар фермента лактазы в тонкой кишке и протекающее скрыто или манифестно.

Непереносимость лактозы - клинически проявляющаяся врожденная или приобретенная неспособность расщеплять лактозу. Эквивалентом термина «непереносимость лактозы» является «интолерантность к лактозе».

В целом можно считать, что непереносимсоть лактозы является клиническим проявлением лактазной недостаточности. Непереносимость лактозы является широко распространенным состоянием. Наибольшую значимость проблема имеет для детей раннего возраста, так как в этот возрастной период молочные продукты составляют значительную долю в диете, а на первом году жизни являются основным продуктом питания.

Распространенность лактазной недостаточности у взрослых в различных регионах различна: Швеция, Дания - 3%, Финляндия, Швейцария - 16%, Англия - 20-30%, Франция - 42%, страны Юго-Восточной Азии, афро-американцы США - 80-100%, Европейская часть России - 16 - 18%.

Лактоза является дисахаридом, состоящим из глюкозы и галактозы. Расщепление лактозы на моносахара происходит в пристеночном слое тонкой кишки под действием фермента лактазо-флоризин гидролазы, на глюкозу и галактозу.

Если активность лактазы недостаточна для переваривания всей поступившей в тонкую кишку лактозы, последняя поступает в толстую кишку, где становится питательным субстратом для микроорганизмов, которые ферментируют ее до короткоцепочных жирных кислот, молочной кислоты, углекислого газа, метана, водорода и воды.

Избыточное поступление лактозы в толстую кишку приводит к количественному и качественому изменению состава микрофлоры и повышению осмотического давления в просвете толстой кишки с развитием клинических проявлений непереносимости лактозы.

Основные проявления лактазной недостаточности.

- осмотическая («бродильная») диарея после приёма молока или содержащих лактозу молочных продуктов (частый, жидкий, пенистый с кислым запахом стул, ухудшение самочувствия.

- повышенное газообразование в кишечнике (метеоризм, вздутие кишечника, боли в животе).

- у детей раннего возраста возможно развитие симптомов дегидратации и/или недостаточная прибавка массы тела.

- формирование дисбиотических изменений микрофлоры кишечника.

Следует отметить, что ни у взрослых, ни у детей не обнаружено корреляции между уровнем активности лактазы и выраженностью клинических симптомов. Иными словами, при одной и той же степени недостаточности фермента наблюдается большая вариабельность симптоматики (в т.ч. в выраженности диареи, метеоризма и болевого синдрома). Однако у каждого конкретного больного наблюдается дозозависимый эффект от количества лактозы в диете: увеличение нагрузки лактозой ведет к более ярким клиническим проявлениям.

Лактазная недостаточность относится к заболеваниям, с которыми можно бороться только с помощью правильно подобранной диеты. При подтверждении диагноза следует снизить употребление лактозы в пищу, в том числе в виде сгущенных молочных консервов [16, 29].

1.3 Иммобилизованные ферменты

Ферменты и ферментативные системы традиционно применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе и т.д. Тем не мене развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной или полным отсутствием на мировой рынке нужных ферментов, особенно их чистых препаратов.

Возможности применения ферментов осложнены и по другим причинам. Во-первых, ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции.

Принципиально новые перспективы открылись в результате создания иммобилизованных ферментов. Иммобилизация - ограничение подвижности молекул ферментов, их конформационных перестроек - основана на физико-химических принципах, позволяющих закрепить структуру фермента таким образом, чтобы активный центр его молекулы сохранял свою работоспособность в течение длительного времени, не подвергаясь структурным изменениям, приводящим к нарушению его конфигурации.

Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками:

- гетерогенный катализатор легко отделить от реакционный среды, что дает возможность:

а) остановить в нужный момент реакцию;

б) использовать катализатор повторно;

в) получать продукт, не загрязненный ферментом (это особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств);

- использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например в проточных колонных, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукции путем изменения скорости потока;

- иммобилизация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, аго стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям;

- иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов (свет или звук).

Успех практического использования препаратов иммобилизованных ферментов значительной степени определяется подготовительным этапом работы - выбором подходящего носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термодинамических особенностей катализа иммобилизованных ферментов.

Носители для иммобилизованных ферментов

Для получения иммобилизованных ферментов используется огромное число носителей, как органических, так и неорганических. Основные требования, предъявляемые к материалам, следующие:

- высокая химическая и биологическая стойкость;

- высокая механическая прочность;

- достаточная проницаемость для ферментов и субстратов, большая удельная поверхность, высокая вместимость, пористость;

- возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.);

- легкое переведение в реакционноспособную форму (активация);

- высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде;

- невысокая стоимость.

Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. На основании этого все существующие методы физической иммобилизации (т.е. при которой фермент не соединен с носителем ковалентными связями) можно разделить на четыре группы:

адсорбция на нерастворимых носителях;

включение в поры геля;

пространственное отделение фермента от остального объема реакционной среды с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);

включение в двухфазную реакционную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Рисунок 1.3 - Способы физической иммобилизации ферментов: а) адсорбция на нерастворимых носителях; б) включение в поры геля; в) отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны; г) использование двухфазной реакционной среды

Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих сейчас способов иммобилизации ферментов. В настоящее время является наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных препаратов промышленного значения.

Носители для адсорбционной иммобилизации

Носители для адсорбционной иммобилизации можно разделить на два основных класса - неорганические (кремнезем, оксиды алюминия, титана, различные природные алюмосиликаты, пористое стекло, керамика, активированный уголь и пр.) и органические (различные полисахариды и полимерные ионообменные смолы, коллаген).

Обычно носители применяются в виде порошков, мелких шариков и гранул.

Методика адсорбционной иммобилизации

Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося фермента препарат иммобилизованного биокатализатора готов к использованию. На практике применяются следующие методы:

Статический способ наиболее прост и состоит в том, что носитель вносят в водный раствор фермента и полученную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. Недостатком метода является то, что для получения препарата с высоким содержанием адсорбированного фермента и равномерного заполнения поверхности носителя последний приходится выдерживать в контакте с раствором фермента в течение длительного времени (несколько суток).

В лабораторной практике чаще всего применяется способ с перемешиванием, при котором носитель суспендируется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной мешалки или на лабораторной качалке. Этот способ гораздо эффективнее статического и обеспечивает более полное равномерное заполнение поверхности носителя адсорбированным ферментом.

Для технологического использования наиболее удобен метод нанесения в колонке. Через колонку, заполненную носителем, с помощью насоса прокачивают раствор фермента в режиме непрерывной циркуляции. Преимущество метода в том, что он позволяет проводить нанесение фермента, промывку, а затем и сам ферментативный процесс в одной и той же колонке без дополнительных манипуляций с носителем.

Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовских взаимодействий, электростатических взаимодействий, водородных связей и гидрофобных связей между носителем и поверхностными группами белка.

Преимущества и недостатки адсорбционной иммобилизации

К числу основных преимуществ метода адсорбционной иммобилизации относят:

- доступность и дешевизну сорбентов, которым можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость.

- простота применяемых методик;

- часто одновременное решение проблемы очистки фермента

Применение метода ограничивается:

- недостаточно высокой прочностью связывания фермента с носителем

- отсутствие общих рекомендаций, позволяющих заранее сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий проведения иммобилизации конкретного фермента.

Химическая иммобилизация ферментов.

Принципиальным является то, что путем химического воздействия на структуру фермента, в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем, Такие препараты обладают двумя свойствами:

ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность конъюгата;

существенно изменяется субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность фермента.

В настоящее время используются следующие основные приемы химической иммобилизации:

- реакция образования амидной связи. Здесь часто применяют реакцию ацилирования аминогрупп фермента, используя ангидриды.

- реакция образования карбамидных связей;

- тиол-диоловое взаимодействие [3, 19].

Более редкое применение химической иммобилизации связано с тем, то существенно изменяются многие кинетические характеристики ферментов.

Из вышеизложенного обзора литературы можно сформулировать следующие выводы. Молочные сгущенные консервы пользуются высоким спросом как среди населения, так и у предприятий кондитерской промышленности. Применение фермента в?галактозидазы в производстве вареного сгущенного молока позволяет избежать кристаллизации продукта при его охлаждении и хранении, приводящей к ухудшению качества продукта. В то же время с помощью в?галактозидазы осуществляется ферментативный гидролиз лактозы, и использования такого продукта рекомендовано людям с интолерантостью к лактозе в организме. Иммобилизованный фермент можно многократно использовать в производственном цикле, что повышает экономическую эффективность технологического процесса.

Раздел 2. Специальная часть

2.1 Общая характеристика предприятия

Общие сведения о предприятии.

Наименование: ООО “Маслосырбаза Энгельсская”.

Почтовый адрес: г. Энгельс, ул. Томская, 50.

И.О. директора: Мухитдинов Евгений Шарифович.

Количество транспортных средств - 10 единиц (электрогрузчики для межцеховых перевозок).

Автотранспорта на балансе предприятия нет. Завоз сырья и вывоз готовой продукции осуществляется поставщиками и покупателями. Вывоз отходов осуществляется транспортом специальных организаций.

Общая площадь предприятия равна 3384 м2:

- под зданиями и сооружениями 3384 м2;

- дороги, площадки - 5512 м2;

- территории, не несущие интенсивных производственных нагрузок - 10889 м2;

- резервные территории 743 м2;

Численность работающих на предприятии - 237 человек.

Подразделения предприятия:

- плавцех

- цех дозревания сыров

- маслоцех

- кондитерский цех

- цех зарядки кар

- компрессорная

- механический участок

- склады

- административный корпус

- проходная

- теплопункт

Отопление осуществляется от городских тепловых сетей. Собственной котельной предприятие не имеет.

СОЖ для охлаждения станков не требуется.

Сточные воды сбрасываются в городской канализационный коллектор. Очистных сооружений по очистке сбросов и выбросов нет.

Объектов социальной сферы предприятие не имеет. Установок по переработке отходов, собственных полигонов и хранилищ отходов на балансе нет.

Опилки для копчения сыра приобретаются у сторонних предприятий.

Генеральный план предприятия представлен на чертеже СГАУ БТ Д ГП 1202.002 ТС.

2.2 Характеристика вареного сгущенного молока “Семь гномов”

Молочные продукты сгущенные, вареные, вырабатывают из молочного сырья: сливочного масла, сухого молока, ферментов, наполнителей путем составления смеси согласно рецептурам, ее тепловой обработке в аппаратах специальной конструкции. Продукт предназначен для непосредственного употребления в пищу [37].

По микробиологическим показателям продукт должен соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.1:

Таблица 2.1 - Микробиологические показатели продукта

Индекс, группа продуктов	КМАФанМ, КОЕ/г, не более	Масса продукта(г/см3), в которой не допускается
		Патогенные, в БГКП (колиформы) том числе сальмонеллы
1.2.3.2. Сгущенка, сгущенка с наполнителями, "Семь гномов" в потребительской таре	2-104	1,0	2,5

Содержание токсичных элементов должно соответствовать требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01.

По физико-химическим показателям продукт должен

соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.2:

Таблица 2.2 - Физико-химические показатели продукта

Наименование показателя	Содержание в %
Массовая доля влаги, %, не более	23
Массовая доля сахарозы, %, не более	45
Общая массовая доля сухих веществ, %, не менее В том числе жира, %, не менее	77 6
Кислотность, ° Т, не более	48
допускаемые размеры кристаллов молочного сахара, мкм, не более	15

Таблица 2.3 - Рецептура и расход сырья, тары, основных материалов на производство 1 тонны сгущенного вареного молока “Семь гномов”

Наименование сырья	Содержание, кг
Молоко коровье сухое обезжиренное	230
Масло крестьянское, с массовой долей сухого вещества 75%, жира -72,5%	81
Сахар-песок	450
Вода питьевая	240
Фермент в-галактозидаза	0,2
Итого	1000

2.3 Сырье для производства вареного сгущенного молока “Семь гномов”

Сырье, а также пищевые, вкусовые материалы, полуфабрикаты, наполнители, используемые в производстве продукта, должны быть разрешены к применению Госсанэпиднадзором РФ. Качество сырья, пищевых веществ и материалов должно соответствовать требованиям действующих нормативных документов и "Гигиеническим требованиям к качеству и безопасности сырья и пищевых продуктов", СанПиН 2.3.2.1078-01. Допускается использование импортного сырью, разрешенного к применению органами и учреждениями санитарно-эпидемиологической службы РФ и не изменяющего природу продукта [32, 34]. Для выработки продукта применяются следующие виды сырья и основных материалов:

- молоко коровье по ГОСТ 37;

- масло сливочное "Бутербродное" по ТУ 9221-135-04610209;

- масло сливочное, не содержащее жиров немолочного происхождения, закупленного по импорту;

- жир молочный по ТУ 9221-111-04610209;

- сливки сухие по ГОСТ 4495;

- молоко коровье обезжиренное, полученное путем сепарирования молока коровьего, заготовляемого, отвечающего требованиям ГОСТ Р 52054;

- молоко сухое обезжиренное по ГОСТ 10970;

- сироп глюкозо-галактозо-лактозный "Глюколакт" по ТУ 9229-036-04610209.

Допускаются к переработке молоко и другие молочные продукты с отклонением от установленных норм по внешнему виду, консистенции и вкусу, а также по массовой доле влаги, жира, учитываемые при расчете рецептур:

- кальций углекислый (Е170) по ГОСТ 4530;

- кислота лимонная пищевая (Е330) по ГОСТ 908;

- сахарный песок по ГОСТ 21;

- агар пищевой (Е406) по ГОСТ 16280;

- кислота сорбиновая (Е200) по ТУ 6-22-5800146-358;

- низин (Е234) по ТУ 9291-008-0047997;

- какао-порошек по ГОСТ 108;

- кофе натуральный растворимый по ГОСТ 6805;

- цикорий растворимый по ТУ 10.04Л8-157;

- красители пищевые (тартразин, сансет, року и другие) по ОСТ

10 093 или другим действующим техническим документам.

Сырье, пищевые добавки, ароматизаторы, красители, используемые для изготовления сгущенки, должны соответствовать гигиеническим требованиям к качеству продовольственного сырья и пищевых добавок (СанПиН 2.3.2.1078 и СанПиН 2.3.2.1293).

Сырье животного происхождения должно соответствовать ветеринарным требованиям [39].

2.4. Технологическая схема производства вареного сгущенного молока “Семь гномов” в соответствии с ТУ 9227-002-51427585-2004

Технологический процесс производства вареного сгущенного молока “Семь гномов” состоит из следующих операций:

- приемка и хранение сырья;

- подготовка сырья и восстановление смеси;

- сгущение смеси;

- ферментативный гидролиз смеси;

- внесение наполнителей;

- розлив, охлаждение, упаковка, маркировка, транспортирование, хранение готовой продукции.

Для приготовления продукта рекомендуется использовать следующее оборудование:

- танк вертикальный Я 10ОСВ1 или

- заквасочник РЗ-ОЗУЩ 3,5;

- насос-диспергатор Я9-ОРП, РПА-15050;

- фасовочный автомат АЛУР-1500см.

Приемка и хранение сырья.

Молочное и другое сырье принимают по массе и качеству, установленному лабораторией предприятия. Допускается хранение сырья в транспортной таре. Срок хранения исчисляется со дня выработки этих продуктов и устанавливается в зависимости от режимов хранения.

Подготовка сырья и восстановление смеси.

Питьевую воду подают в резервуар, нагревают до температуры (10±5)°С. Рассчитанную массу сухого молока растворяют в питьевой воде и выдерживают при этой температуре с целью набухания белков, устранения "водяного" привкуса, улучшения консистенции восстановленного молока. Восстановленную смесь нагревают до температуры (70±5)°С вносят масло сладкосливочное, эмульгируют и пастеризуют при (95±5)°С. Требуемое количество сахара вносится в твердом виде. Смесь тщательно вымешивается. %. После этого проводят сгущение смеси до массовой доли влаги 25-26% при температуре (95±5)°С. Сгущенную вареную смесь охлаждают до температуры ферментации (38±2)°С, вносят 0,02% фермента в-галактозидаза при рН смеси 6,0-6,5; проводят ферментативный гидролиз, перемешивая непрерывно в течение 3-х часов. Затем смесь нагревают до температуры (95±5)°С, выдерживают в течение 60-120мин до получения требуемой окраски.

Продукт должен храниться при температуре не более +10°С. Срок годности продукта не более 8 месяцев с момента окончания технологического процесса.

Транспортирование и хранение.

Транспортирование продуктов должно производиться всеми видами транспорта в соответствии с установленными Правилами перевозок скоропортящихся грузов и с соблюдением гигиенических требований, а в пакетированном виде - по ГОСТ 24597, ГОСТ 26663, а также в соответствии с требованиями по транспортированию молочных продуктов транспортными пакетами.

Автотранспорт должен иметь санитарный паспорт.

Продукты должны храниться упакованными в ящики, уложенными штабелями по высоте не более 2м (для картонных ящиков - не более 1,3м). Укладка ящиков в штабели должна производиться с отступом от стен и от охлаждаемых батарей на 0,4м. Между сложенными штабелями оставляют проход шириной 0,8-1,0м. Нижние ящики должны укладываться на деревянные поддоны и решетки.

Хранение продукта совместно с другими пищевыми продуктами (со специфическим запахом) в одной камере не допускается.

Хранение продукта должно производиться при температуре от 0 до 10°С и относительной влажности воздуха не более 85%.

Срок годности продукта должен соответствовать требованиям, указанным в таблице 2.4:

Таблица 2.4 - Срок годности сгущенного молока “Семь гномов”

Наименование продукта	Вид упаковки	Срок годности, не более (мес)
“Семь гномов”	Стаканчики и коробочки из полимерных материалов (термичная упаковка)	8

Энергетическая ценность 100г продукта, содержание пищевых веществ указаны в таблице 2.5:

Таблица 2.5 - Энергетическая ценность сгущенного молока “Семь гномов”

Наименование продукта	Жир, г	Белок, г	Углеводы, г	Энергетическая ценность, ккал
“Семь гномов”	6	22	45	313

2.5 Собственные исследования

2.5.1 Материалы и методы исследования

Научно-исследовательская работа дипломного проекта была выполнена на базе лаборатории кафедры биотехнологии, органической и биологической химии СГАУ им. Н.И. Вавилова. Материалом исследования являлся биообъект - фермент микробиологического происхождения в?галактозидаза. В ходе выполнения работы было проведено две серии экспериментов. Во время первой серии экспериментов были выполнены следующие опыты: добавление фермента в-галактозидазы в концентрации 0,01%; 0,02% и 0,03% в свежее и сухое молоко, вареное и невареное сгущенное молоко; определение концентрации лактозы в молочных продуктах после ферментативного гидролиза.

Главным направлением второй серии экспериментов стала иммобилизация фермента в-галактозидазы и использование иммобилизованного фермента для ферментативного гидролиза лактозы в молочных продуктах. На основании этого можно выделись основные пункты задания:

Подготовка носителей для иммобилизации.

Оценка активности иммобилизованного фермента. Выявление неэффективных носителей.

Оценка продолжительности действия иммобилизованного фермента на снижение концентрации лактозы.

Определить снижение содержание лактозы после ферментативного гидролиза иммобилизованным ферментом в 2-х концентрациях:

а) для цельного молока;

б) для сухого молока.

5. Внесение иммобилизованной в-галактозидазы в сгущенное молоко:

а) на стадии полуфабриката внести иммобилизованный фермент; провести ферментативный гидролиз и определить содержание лактозы в вареном сгущенном молоке;

б) определить концентрацию лактозы в вареном сгущенном молоке, приготовленном на молоке с гидролизованной лактозой.

Для определения концентрации лактозы в молоке и продуктах был выбран фотоколориметрический и рефрактометрический методы [5].

Определение концентрации лактозы фотоколориметрическим методом

1 мл молока или кисломолочного продукта смешивают в колбе с 25мл дистиллированной воды. Добавляют 2 мл 1н раствора гидроксида натрия и помещают в мерную колбу на 100 мл. Перемешивают до растворения белков и доводят объем дистиллированной воды до метки. Раствор фильтруют, 1мл фильтрата смешивают с 1 мл 5% раствора фенола и 5 мл концентрированной серной кислоты. Определяют оптическую плотность на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре (л =490 нм), используя для сравнения контрольную колбу. Контрольной колбой является смесь 1 мл воды с 1 мл 5% раствора фенола ж 5 мл концентрированной серной кислоты.

Массовую долю лактозы в продукте рассчитывают по градуировочному графику, затем пересчитывают на 100 г продукта по формуле: Л=С/100, где

Л - массовая доля лактозы в исследуемом продукте, %,

С - концентрация лактозы в растворе для анализа по градуировочному графику, мкг/мл.

Для того, чтобы построить график, из 2% раствора лактозы готовят 0,2% раствор (реактив А). Из полученного раствора готовят следующие разведения:

Таблица 2.6 - Концентрация лактозы и объем разведения

Объем, мл	Концентрация лактозы, %
Реактив А	Дистиллированная вода
1	99	20
2	98	40
3	97	60
4	96	80
5	95	100
10	90	200
15	85	300
20	80	400
25	75	500
30	70	600
35	65	700
40	60	800

Для фотометрирования брали 1мл каждого разведения, смешивали с 1 мл 5% раствора фенола и 5мл концентрированной серной кислоты. Определяли оптическую плотность и строили градуировочный график.

Каждое измерение выполняли в 6 повторах. Для каждого опыта проводится статистическая обработка результатов анализа. Результаты приводятся в следующем виде: M±m, где

M=,

m=,

К - средняя квадратичная ошибка,

n - число измерений.

Методика измерения оптической плотности на фотоэлектроколориметре

Колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2 предназначен для измерения коэффициентов пропускания и оптической плотности жидкостных растворов и твердых тел, а также для определения концентрации веществ в растворах методом построения градуировочного графика.

Измерение оптической плотности

В световой пучок поместить кювету с растворителем или контрольным раствором, по отношению к которому производятся измерения.

Закрыть крышку кюветного отделения.

Установить отсчет 100 по шкале. Поворотом ручки кювету с контрольным раствором заменить кюветой с исследуемым раствором.

Снять отсчет по шкале Д в единицах оптической плотности.

Измерение провести 3-5 раз и определить окончательное значение как среднее арифметическое этих измерений.

Рефрактометрический метод.

Основан на способности молочной сыворотки по-разному преломлять проходящий через нее свет в зависимости от концентрации лактозы. Показатель преломления молочной сыворотки устанавливают по углу отклонения светового луча сывороткой, заключенной между призмами рефрактометра.

Предварительно готовят молочную сыворотку. В пробирку отмеривают 5мл свежего молока и добавляют 5 капель 4% хлорида кальция. Пробирку плотно закрывают пробкой и для полного осаждения белков ставят ее на кипящую водяную баню. Через 10мин пробирку вынимают из бани и охлаждают. Затем берут пипетку с ватным тампонов в нижней части и набирают сыворотку, фильтруя ее, таким образом, через вату.

Далее каплю прозрачной сыворотки наносят на поверхность нижней призмы рефрактометра. Производят отсчет и находят процентное содержание лактозы.

2.5.2 Результаты собственных исследований

Первая серия экспериментов.

1. Цельное молоко.

Для проведения опыта брали свежее коровье молоко 2,5% жирности. Добавляли фермент в-галактозидазу в 3-х концентрациях: 0,01; 0,02 и 0,03% и отмечали изменение концентрации лактозы через 3, 6 и 24 часа. Данные результатов исследования занесли в таблицу:

Таблица 2.7 - Изменение содержания лактозы в коровьем молоке под влиянием в-галактозидазы

Группа	Время измерения, ч
	1	3	6	24
Контроль % % Р Р	4,87±0,18 100 100	4,72±0,13 100 96,91 >0,05	4,56±0,11 100 93,63 >0,05	4,49±0,09 100 92,19 <0,001
1 % % Р Р	4,31±0,05 88,50 100 <0,05	3,97±0,17 84,11 92,11 <0,05 >0,05	3,57±0,13 78,29 82,83 <0,01 <0,001	3,39±0,17 77,22 78,65 <0,001 <0,001
2 % % Р Р	4,06±0,13 83,73 100 <0,01	3,86±0,13 81,77 95,07 <0,01 >0,05	3,39±0,18 74,34 83,49 <0,001 >0,05	3,18±0,13 72,43 78,32 <0,001 <0,001
3 % % Р Р	3,76±0,17 77,20 100 <0,001	3,57±0,12 75,63 94,95 <0,001 >0,05	3,13±0,13 68,64 83,24 <0,001 <0,05	2,97±0,13 67,65 78,98 <0,001 <0,01

Примечания:

Контроль - концентрация лактозы в коровьем молоке.

1 - концентрация лактозы в коровьем молоке с 0,01%-ной в-галактозидазой.

2 - концентрация лактозы в коровьем молоке с 0,02%-ной в-галактозидазой.

3 - концентрация лактозы в коровьем молоке с 0,03%-ной в-галактозидазой.

Р - достоверность относительно контроля

Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.

% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.

% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.

Выводы. Концентрация лактозы в коровьем молоке находится в пределах норм. В контрольной группе - коровьем молоке свежем без добавления фермента - изменение содержания лактозы с течением времени незначительное (4,87±0,18-4,49±0,09). При добавлении минимальной концентрации фермента (0,01%) через сутки концентрация лактозы снизилась до 3,39±0,17 и составила 78,65% от первоначальной. По сравнению с контролем процент падения равен 88,50% в начале опыта и 77,22% через сутки.

При добавлении 0,02% в-галактозидазы по сравнению с контролем процент падения увеличился (72,43% после окончания опыта), т.е. эта концентрация фермента более эффективна, чем 0,01%.

При добавлении 0,03% в-галактозидазы содержание лактозы резко падает по сравнению с контрольной группой (77,20% в начале опыта и 67,65% через 24 часа).

Можно сказать, что наиболее эффективная концентрация лактозы в коровьем молоке - 0,03%, с ее введением удалось добиться снижения концентрации лактозы на 32,35%.

2. Сухое молоко

Количество сухих веществ в коровьем молоке составляет 10-14%. Необходимо определить, в каком соотношении разводить сухое молоко, чтобы добиться консистенции коровьего.

а) берем 3 тигля, нумеруем и взвешиваем.

Масса тигля № 1 = 17,8г.

Масса тигля №2 = 18,4г.

Масса тигля №3 = 17,1г.

б) прибавляем в тигли по 10г сухого молока:

Масса тигля №1 = 27,8г.

Масса тигля №2 = 28,4г.

Масса тигля №3 = 27,1г.

в) ставим тигли в термостат (100-110єC) и высушиваем до постоянной массы. После охлаждения в эксикаторе проводим повторное взвешивание:

Масса тигля №1 после сушки = 27,0г.

Масса тигля №2 после сушки = 27,5г.

Масса тигля №3 после сушки = 26,4г.

г) определим постоянную массу сухого молока (разность массы тигля после сушки и массы пустого тигля):

Тигель №1 = 9,2г.

Тигель №2 = 9,1г.

Тигель №3 = 9,3г.

Масса сухого молока = 9,2г.

Количество сухих веществ в сухом молоке чуть меньше, чем в свежем коровьем. Для разведения брали 15г сухого молока и 85мл дистиллированной воды.

Повторили все операции пункта 1 для сухого молока. Данные результатов исследования занесли в таблицу.

Таблица 2.8 - Изменение содержания лактозы в сухом молоке под влиянием в-галактозидазы

Группа	Время измерения, ч
	1	3	6	24
Контроль % % Р Р	4,69±0,12 100 100	4,48±0,04 100 95,52 >0,05	4,35±0,14 100 92,75 >0,05	4,22±0,21 100 89,97 >0,05
1 % % Р Р	4,65±0,17 99,14 100 <0,05	4,19±0,13 93,52 90,10 <0,05 <0,001	3,69±0,08 84,82 79,35 <0,001 <0,001	3,32±0,04 78,67 71,39 <0,01 <0,01
2 % % Р Р	4,03±0,21 85,92 100 <0,05	3,72±0,11 83,03 92,30 <0,001 <0,001	3,32±0,04 76,32 82,38 <0,001 <0,01	2,59±0,11 61,37 64,26 <0,001 <0,001
3 % % Р Р	3,72±0,12 79,31 100 <0,001	3,49±0,12 77,90 93,81 <0,001 >0,05	2,93±0,17 67,35 78,76 <0,001 <0,01	2,29±0,08 54,26 61,56 <0,001 <0,001

Примечания:

Контроль - концентрация лактозы в коровьем молоке.

1 - концентрация лактозы в сухом молоке с 0,01%-ной в-галактозидазой.

2 - концентрация лактозы в сухом молоке с 0,02%-ной в-галактозидазой.

3 - концентрация лактозы в сухом молоке с 0,03%-ной в-галактозидазой.

Р - достоверность относительно контроля

Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.

% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.

% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.

Выводы: В контрольной группе - сухом молоке - изменение содержания лактозы не столь значительно (за 24 часа упала с 4,69% до 4,22%).

При внесении в сухое молоко 0,01% концентрации в-галактозидазы содержание лактозы падает более значительно (с 4,65 до 3,32%) и по окончании опыта составляет 71,39% от первоначального.

При добавлении 0,02% концентрации в-галактозидазы содержание лактозы в сухом молоке снизилось еще более значительно ( за сутки с 4,03 до 2,59%) и составляет 64,26% от начального значения. По отношению к контролю процент падения за сутки равен 61,37.

Максимального результата удалось добиться при внесении в-галактозидазы в концентрации 0,03%. За сутки концентрация лактозы снизилась с 3,72 до 2,29%. По отношению к контрольной группе после окончания опыта содержание лактозы составило 54,56%, т.е. уменьшилось почти вдвое. Итак, 0,03%-я концентрация в-галактозидазы наиболее эффективна для снижения содержания лактозы в сухом молоке.

3. Сравнение содержания лактозы в сгущенном молоке вареном с ферментом и без фермента.

Для исследования брали вареное сгущенное молоко по ГОСТ 2903-78, определяли изменение концентрации лактозы в течение суток. Затем прибавляли в-гактозидазу в концентрациях 0,01%; 0,02% и 0,03% и проводили измерения, аналогичные предыдущим опытам. Результаты измерений представлены в таблице 2.9.

Таблица 2.9 - Изменение содержания лактозы в вареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78

Группа	Время измерения, ч
	1	3	6	24
Контроль % % Р Р	4,60±0,17 100 100	4,58±0,11 100 99,56 <0,05	4,57±0,01 100 99,34 >0,05	4,55±0,19 100 98,91 >0,05
1 % % Р Р	4,10±0,03 89,13 100 <0,05	3,79±0,13 82,53 92,44 <0,001 <0,05	3,27±0,07 71,55 79,76 <0,001 <0,001	2,81±0,13 61,76 68,54 <0,001 <0,001
2 % % Р Р	3,90±0,03 84,78 100 <0,01	3,63±0,03 79,25 93,08 <0,001 <0,001	3,07±0,13 67,18 78,72 <0,001 <0,001	2,67±0,08 56,68 68,46 <0,001 <0,001
3 % % Р Р	3,71±0,13 80,65 100 <0,01	3,33±0,13 72,70 89,76 <0,001 >0,05	2,85±0,07 62,63 78,62 <0,001 <0,001	2?53±0,11 55,60 68,19 <0,001 <0,001

Примечания:

Контроль - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 .

1 - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 с 0,01%-ной в-галактозидазой.

2 - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,02%-ной в-галактозидазой.

3 - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,03%-ной в-галактозидазой.

Р - достоверность относительно контроля

Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.

% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.

% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.

Выводы: Содержание молочного сахара в сгущенном молоке вареном по ГОСТ 2903-78 находится в пределах норм и с течением времени изменяется незначительно (с 4,60% до 4,55%). При добавлении в-галактозидазы в концентрациях 0,01; 0,02 и 0,03% отмечается снижение содержания лактозы как с увеличением концентрации, так и с течением времени. При добавлении 0,01% фермента концентрация составила 89,13% от контрольной, а при 0,03% - уже 80,65%. Через 24 часа эта разница стала еще более отчетливо выраженной: при добавлении 0,01% фермента концентрация лактозы составила 61,76% от контрольной, а при 0,03% - 55,60%. Наиболее эффективной является концентрация в-галактозидазы 0,03%, при ней максимальное количество лактозы переходит в смесь моносахаров.

4. Невареное сгущенное молоко

Для исследования брали невареное сгущенное молоко по ГОСТ 2903-78, добавляли фермент в-галактазидазу в трех концентрациях и определяли изменение содержания лактозы через 3, 6 и 24 часа.

Результаты исследования представлены в таблице.

Таблица 2.10 - Изменение содержания лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78

Группа	Время измерения, ч
	1	3	6	24
Контроль % % Р Р	4,91±0,17 100 100	4,73±0,09 100 96,33 >0,05	4,48±0,12 100 91,24 >0,05	4,23±0,09 100 86,15 <0,01
1 % % Р Р	4,87±0,11 99,18 100 >0,05	4,69±0,21 99,15 96,30 >0,05 >0,05	4,09±0,08 91,29 83,98 <0,005 <0,001	3,68±0,08 86,99 75,56 <0,01 <0,001
2 % % Р Р	4,81±0,12 97,96 100 >0,05	4,44±0,13 93,86 92,30 >0,05 >0,05	3,72±0,12 83,03 77,34 <0,01 <0,001	3,37±0,08 79,67 70,06 <0,001 <0,001
3 % % Р Р	3,65±0,18 74,33 100 <0,001	3,35±0,09 70,82 91,78 <0,001 >0,05	3,05±0,09 68,08 83,56 <0,001 <0,001	2,48±0,12 68,08 67,94 <0,001 <0,001

Примечания:

Контроль - концентрация лактозы в сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 .

1 - концентрация лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78 с 0,01%-ной в-галактозидазой.

2 - концентрация лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,02%-ной в-галактозидазой.

3 - концентрация лактозы в невареном сгущенном молоке по ГОСТ 2903-78с 0,03%-ной в-галактозидазой.

Р - достоверность относительно контроля

Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.

% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.

% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.

Выводы: В невареном сгущенном молоке изменение содержания лактозы после 24 часов с начала опыта выражено более значительно (с 4,91±0,17 упала до 4,23±0,09) и составила 86,15% от первоначального. Это может быть объяснено тем, что произошло образование кристаллов лактозы крупных размеров.

При внесении 0,01%-ного раствора в?галактзидазы содержание лактозы снизилось с 4,87±0,11 до 3,68±0,08 за сутки с составило 76,56% от начальной концентрации.

0,02%-ный раствор в?галактозидазы является более эффективным, чем 0,01%. При внесении 0,02%-ного раствора фермента содержание лактозы через сутки с начала опыта составило 70,06% от первоначального (с 4,8±0,12 снизилась до 3,37±0,08).

При добавлении 0,03% раствора в?галактозидазы процент падения содержания лактозы в невареном сгущенном молоке наибольший и через сутки составляет 67,94% с начала опыта. Таким образом, удалось добиться снижения концентрации лактозы в невареном сгущенном молоке на 31,92% при внесении максимальной концентрации фермента.

5. Добавить в исследуемое вареное сгущенное молоко “Семь гномов ” раствора фермента в?галактозидазы в 3-х концентрациях и определить изменение содержания лактозы через 3, 6 и 24 часа. Данные результатов исследования заносим в таблицу.

Таблица 2.11 - Изменение содержания лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” под влиянием в?галактозидазы

Группа	Время измерения, ч
	1	3	6	24
Контроль % % Р Р	4,00±0,13 100 100	3,93±0,11 100 98,25 >0,05	3,86±0,08 100 96,51 >0,05	3,78±0,06 100 94,50 >0,05
1 % % Р Р	2,31±0,09 57,75 100 <0,001	2,14±0,06 54,45 92,64 <0,001 >0,05	1,88±0,09 48,71 81,39 <0,05 <0,01	1,71±0,10 45,24 74,03 <0,001 <0,01
2 % % Р Р	2,10±0,11 52,51 100 <0,01	1,87±0,01 47,59 89,05 <0,001 >0,05	1,67±0,10 43,25 79,52 <0,05 <0,05	1,28±0,06 33,86 60,96 <0,001 <0,001
3 % % Р Р	1,90±0,18 45,79 100 <0,001	1,62±0,11 41,22 85,26 <0,001 >0,05	1,325±0,07 34,20 69,47 <0,01 <0,05	1,14±0,24 30,16 60,00 <0,001 <0,05

Примечания:

Контроль - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов”.

1 - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” с 0,01%-ной в-галактозидазой.

2 - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” с 0,02%-ной в-галактозидазой.

3 - концентрация лактозы в сгущенном молоке “Семь гномов” с 0,03%-ной в-галактозидазой.

Р - достоверность относительно контроля

Р - достоверность относительно первого часа наблюдения.

% - процент падения лактозы относительно контрольной пробы.

% - процент падения лактозы относительно первого часа наблюдения.

Выводы: Содержание лактозы в исследуемом продукте - сгущенном вареном молоке “Семь гномов” находится в пределах норм и с течением времени практически не изменяется. За сутки показатели изменились с 4,00±0,13 до 3,78±0,06, что составляет 94,5% от первоначального. При внесении же фермента содержание лактозы резко уменьшается как с течением времени, так и с увеличением концентрации. При добавлении 0,01%-го раствора в?галактозидазы через сутки содержание лактозы упало с 2,31±0,09 до 1,71±0,10, и составила 45,24% от концентрации лактозы в сгущенном молоке без фермента. Наиболее заметных результатов удалось достигнуть, прибавляя 0,03%-й раствор в?галактозидазы. Через 24 часа после внесения фермента содержание лактозы снизилось с 1,90±0,18 до 1,14±0,24. Таким образом, концентрация лактозы в этой группе составила 30,16% от контрольной, а с течением времени снизилась на 40%.

Очевидно, что 0,01% и 0,02%-ные растворы в?галактозидазы менее эффективны, чем 0,03%-й раствор. Однако все три концентрации фермента дают значительное снижение содержания лактозы по сравнению со сгущенным молоком без внесенного фермента.

Вторая серия экспериментов.

Подготовка носителей для иммобилизации.

Первоначально для иммобилизации в-галактозидазы были выбраны следующие носители: силикагель, акриламид, крахмал, асбестовое волокно, лавсановое волокно, древесные опилки.

Акриламид широко используется для иммобилизации. Однако из-за отсутсвия N,N'-метиленбисакриламида (или бис-акриламида), который в полиакриламидном геле отвечает за образование поперечных сшивок, использование его в данном случае невозможно.