Сезонная динамика параметров замедленной флуоресценции хлорофилла хвойных, произрастающих в районах с разным уровнем загрязнения воздуха

Размещено на http://www.allbest.ru/

24

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дипломная работа

Сезонная динамика параметров замедленной флуоресценции хлорофилла хвойных, произрастающих в районах с разным уровнем загрязнения воздуха

Введение

Загрязнение окружающей среды является острой экологической проблемой особенно в городских и промышленных районах. Воздействие токсикантов приводит к значительному ухудшению состояния и даже гибели лесов на обширных территориях. Поэтому актуальной задачей является поиск объективных и оперативных методов ранней диагностики техногенного загрязнения природной среды.

Проблема загрязнения окружающей среды чрезвычайно актуальна и для города Красноярска в связи с наличием в краевом центре крупных предприятий металлургической и химической промышленности.

Деятельность человека ведет к необратимым изменениям природной среды, к изменению естественных процессов в биосфере, регулирующих перераспределение и консервацию различных веществ, в том числе и вредных.

Непосредственному действию атмосферных загрязнителей подвергаются наземные органы растения. Из них более всего поражаются токсическими газами и аэрозолями листья, хвоя и другие зеленые побеги, которые осуществляют интенсивный газообмен [12].

Вокруг крупных промышленных районов среди функциональных нарушений растений часто упоминают резкое подавление деятельности ферментных систем, интенсивности фотосинтеза, повышения транспирации, усыхание и опадение листьев и хвои, повреждение почек и т.д. Подобные изменения могут привести к гибели отдельных растений или исчезновению вида из загрязненного района [58]. Различные исследователи наблюдали видимые изменения в фотосинтетических структурах: набухание и разрушение хлоропластов, утолщение и изменение формы тилакоидов, снижение содержания хлорофиллов, изменение отношения хлорофиллов a/b, другие биохимические изменения [26].

Токсические поллютанты оказывают разрушающее воздействие на фотосинтетический аппарат и деятельность устьиц, что является главной причиной ингибирования CO2 - газообмена [15].

В настоящее время в исследованиях фотосинтеза широко используются методы, основанные на измерении и анализе замедленной флуоресценции (ЗФ) хлорофилла. Большие перспективы развития данной области определяются интегральностью флуоресцентных показателей. Это позволяет использовать параметры флуоресценции для получения разнообразных данных о функционировании фотосинтетического аппарата растений и изучения действия на фотосинтез различных факторов [4].

В связи с этим целью данной работы было изучение сезонной динамики параметров замедленной флуоресценции хлорофилла хвойных, произрастающих в районах с разным уровнем загрязнения воздуха.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить влияние загрязнения воздуха и расположения в кроне на параметры ЗФ хвои сосны обыкновенной и ели сибирской;

2. Рассмотреть возможности использования сосны и ели в качестве биоиндикаторов в течение года;

3. Изучить влияние искусственного охлаждения побегов сосны в летнее время на параметрах ЗФ хвои.

Работа проводилась на кафедре Экотоксикологии и микробиологии Сибирского федерального университета под руководством к.б.н., доцента Н.В. Пахарьковой.

1. Обзор литературы

1.1 Биоиндикационные методы оценки окружающей среды

биоиндикатор загрязнение сосна воздух

Метод оценки абиотических и биотических факторов местообитания при помощи биологических систем называют биоиндикацией. Организмы или сообщества организмов, жизненные функции которых тесно коррелируют с определенными факторами среды, называют биоиндикаторами [1].

В настоящее время в использовании метода биоиндикации при решении экологических проблем накоплен большой положительный опыт. Метод широко применяется для оценки состояния и мониторинга как в природных, так и в нарушенных, в том числе техногенных экосистемах [57].

На сегодняшний день используют экспресс-методы биоиндикации, которые позволяют на измерении одной или нескольких функций живого объекта давать быструю и точную оценку по поводу состояния окружающей среды. В отличие от классических методов, экспресс-методы более перспективны и менее трудоемки. Преимущество биоиндикационных методов над физико-химическими заключается в том, что биоиндикация обращается к живому объекту, который реагирует на весь комплекс загрязняющих веществ. Виды-биоиндикаторы - датчики широкого спектра. Биоиндикационные методы дают представление о состоянии живых объектов. Благодаря поглотительной деятельности растений происходит очищение атмосферного воздуха. Однако, возможности этих систем ограничены. Растения очень чутко реагируют на загрязнение окружающей среды, что обуславливает использование их в качестве индикаторов загрязненности атмосферы [51].

Красноярскими предприятиями выбрасывается более полутора тысяч различных веществ, среди которых не маленькая доля ядовитых. Физико-химические методы не в состоянии регистрировать все влияние на живые системы.

1.2 Основные компоненты загрязнения атмосферного воздуха

Приземный слой воздуха обычно содержит, кроме свойственных ему компонентов, примесь различных газов, жидких и твердых частиц. Они поступают в воздух с земной поверхности в результате человеческой деятельности, стихийных сил и биологического оборота веществ в биосфере [12]. Многие газообразные соединения, появляющиеся в воздухе в виде примесей, пагубно действуют на растения. Рассмотрим некоторые из них.

Сернистый ангидрид. (SO2) образуется при переработке и горении органических веществ (каменный и бурый угли, нефть и нефтепродукты, древесина), обжиги и плавки серосодержащих руд, при изготовлении и применении в производственном процессе серной кислоты. Выбрасывают сернистый ангидрид в большом количестве тепловые электростанции, предприятия цветной и черной металлургии, коксохимические, цементные, синтетических волокон и аммиака, целлюлозные, сахароварения и др. [12].тепловая электростанция, сжигающая в сутки 4500 тонн каменного угля, содержащего 3% серы, выбрасывает в воздух 270 тонн сернистого ангидрида, а при выплавке меди из 2250 тонн концентрата руды, содержащего 30% серы, выделяет в атмосферу 1360 тонн сернистого ангидрида [13]. Сернистый ангидрид способен вступать во взаимодействие с содержащимися в воздухе водяным паром, капельками тумана или дождя и образовывать сернистую кислоту. Скорость растворения SO2 зависит от концентрации ангидрида в атмосферном воздухе [33].

Серный ангидрид обладает высокой гигроскопичностью и, соединяясь с водяным паром, образует аэрозоль серной кислоты, удерживающийся в воздухе в виде тумана. Серная кислота обладает сильными окислительными свойствами и активно присоединяет воду. Наличие а атмосферном воздухе совместно сернистого и серного ангидридов обусловливает их высокую токсичность для растений [47].

Сероводород (H2S) поступает в атмосферу вместе с другими загрязнителями в относительно не большом количестве по сравнению с сернистым ангидридом. Он постоянно находится в выбросах коксохимических предприятий, выделяется при изготовлении искусственного волокна, сахара, в каменноугольных шахтах, на нефтяных промыслах, нефтеперерабатывающих заводах и др. сероводород обладает сильными восстановительными свойствами и является токсичным для растений [47].

Окислы азота и аммиак выбрасывают предприятия, производящие туковые удобрения, азотистую кислоту и нитраты, анилиновые красители, нитросоединения, вискозный шелк, целлулоид, фотопленку, а так же выхлопные газы автотранспорта. Окислы азота (NO2, N2O3, N2O5) легко растворяются в воде, содержащейся а воздухе, образуя аэрозоль азотной и малоустойчивой азотистой кислот [47].

Аммиак (NH3) выделяется в атмосферу в небольших количествах при производстве аммонийных удобрений, мочевины, азотной кислоты, на сахарных, кожевенных и др. предприятиях. Аммиак обладает восстановительными свойствами со слабовыраженной токсичностью [47].

Фтористые соединения являются одними из наиболее вредных для растений. Фтор легко вступает в реакцию почти со всеми элементами. Поэтому в свободную атмосферу он поступает не в чистом виде, а в соединении с другими веществами в виде газа или пылевидных частиц. Источниками загрязнения воздуха фтористыми веществами являются алюминиевые и криолитовые заводы, предприятия, производящие фосфаты и фосфорные удобрения, эмалевые и керамические изделия и т.д. некоторое количество фтористых соединений выделяется из топок при сжигании угля и из флюсов, применяемых при выплавке чугуна. Газообразные или растворенные в воде соединения фтора проникают в растения через листья и корни. Фтористые соединения являются высокотоксичными для растений. Не редки случаи полной гибели листьев деревьев у заводов. Губительное действие фтора на растения усиливается при высокой влажности воздуха и моросящих осадках [47].

Соединения хлора являются высокореакционными окислителями. Загрязнение атмосферного воздуха хлористыми соединениями происходит от титано-магниевых заводов, химических предприятий, производящих инсектициды и гербициды, соляную кислоту, органические красители, цемент, суперфосфат, уксусную кислоту гидролизный спирт, хлорную известь, соду и др. хлористый водород и другие его соединения необходимы растениям в ограниченном количестве. В случае попадания в организм в высоких дозах хлор вызывает глубокие структурные и функциональные нарушения, нередко ведущие к гибели растений [47]

Окись углерода выделяется всюду при неполном сгорании веществ, содержащих углерод (каменный уголь, нефтепродукты, природный газ). Окись углерода является восстановителем. Она отрицательно влияет на растения при сравнительно высокой концентрации - свыше 1% [47].

Аэрозоли бывают твердые и жидкие. Под аэрозолями понимают содержащиеся в воздухе, как дисперсионной среде, мельчайшие твердые и капельно-жидкие частицы (диспергенты) во взвешенном состоянии. Совокупность твердых частиц проявляется в виде дыма, а жидких - тумана или облака. Размер частиц аэрозолей колеблется в широких пределах - от сотых долей микрона до десятков и сотен микрон. Частицы менее 5 мк могут длительное время находиться в воздухе в виде взвесей, а при достижении размера более 10 мк они быстро оседают. Основными источниками выброса твердых и жидких частиц в атмосферу являются тепловые электростанции, сжигающие бурый уголь, металлургические предприятия, цементные и сажевые заводы, а так же транспорт и другие. При изготовлении каждой тонны цемента завод теряет 240 кг продукции в виде пыли. Жидкие частицы аэрозоля образуются при конденсации паров кислот, оснований, фенолов, смол и иных веществ, а так же при химическом реагировании загрязнителей с водяным паром или капельками воды, содержащимися в атмосфере при тумане или дожде. Так, в насыщенном влагой воздухе образуются сернистая серная, азотная, соляная, фторидная и другие кислоты из соответствующих ангидридов, поступивших в атмосферу в виде газа [47].

Древесные растения, обладающие огромной листовой поверхностью, служат хорошим фильтром для очищения воздуха от аэрозолей. Твердые и жидкие частицы, соударяясь с листьями, оседают на них и смываются жидкими осадками [47].

Указанные вещества в момент поступления в атмосферу или в ночное время не оказывают повреждающего или раздражающего действия на живые организмы. Их токсичность резко возрастает после некоторого периода освещения солнечными лучами [47].

Ассимиляционные органы растений первыми и в наивысшей степени повреждаются токсическими веществами, содержащимися в воздухе промышленных районов и крупных городов. Это вызвано тем, что листья по своему строению функциональной роли приспособлены к более интенсивному газообмену по с равнению с другими органами растения. Появление внешне различимых признаков повреждения растения газами или аэрозолями свидетельствует о происшедших в организме глубоких, как правило, необратимых изменениях, заканчивающихся разрушением пигментов, клеточных и субклеточных структур [47].

Растения делят по степени противодействия организма повреждающему агенту на устойчивые, среднеустойчивые и нестойкие или по степени поражения - на нечувствительные, среднечувствительные и очень чувствительные [47].

1.3 Сосна обыкновенная как биоиндикатор загрязнения окружающей среды

Вредное влияние загрязненного воздуха на растения происходит как путем прямого действия газов на ассимиляционный аппарат, так и в результате косвенного влияния через почву. При чем прямое действие кислых газов приводит к отмиранию отдельных органов растений, ухудшение их роста и продуктивности. Трудно дать полную характеристику всех вредных поллютантов, так как их количество и удельный вес в загрязненном воздухе быстро изменяются. В результате взаимодействия веществ образуются новые соединения, нередко даже более токсичные, чем исходные компоненты [27].

При воздействии различных доз токсикантов на растения можно выделить четыре типа повреждений, отличающихся по характеру и глубине расстройства метаболизма: острая, капельно-ожоговая, кумулятивное и скрытое. Острые повреждения вызываются воздействием высоких концентраций поллютантов. Поражение развивается в течение нескольких часов (дней) и проявляются в виде хлороза с последующей некротизацией тканей. Кислый газ, поступая в клетку через устьица или кутикулу, в значительных количествах накапливается в хлоропластах и приводит к подавлению фотосинтеза [19].

Капельно-ожоговые в отличие от острого поражения, охватывающего всю хвоинку и возникающего по всей кроне или большей ее части, проявляется в виде некрозных точек и более крупных пятен, перепоясывающих хвоинки и постепенно расширяющихся, и чаще всего образуется при высокой влажности воздуха [8, 33].

Кумулятивное повреждение развивается при длительном действии низких концентраций токсикантов. Для этого типа повреждений характерно стойкое нарушение основных метаболических процессов, внешне выражающееся в уменьшении размеров и массы хвои, преждевременном их опадании, изреженности крон деревьев, депрессии роста, ранним старением. Кумулятивное повреждение со временем приводит к избыточному накоплению токсикантов ассимиляционных органах и проявлению некрозов. Выше перечисленные типы повреждений определяются визуально или с помощью морфологического анализа [8, 33].

Скрытые повреждения вызываются очень низкими концентрациями токсикантов, действующими постоянно или переодически. К таким повреждениям относятся нарушения физиолого-биохимических процессов (увеличение проницаемости мембран, изменение активности ряда ферментов, ингибирование фотосинтеза и так далее) накопление скрытых повреждений приводит к снижению роста и продуктивности растений, потере резистентности к климатическим факторам, патогенным микроорганизмам и насекомым. Именно на стадии скрытых повреждений необходимо наладить контроль за состоянием растений, подверженных к действию промышленного загрязнения воздуха, что может быть достигнуто с помощью методов флуоресцентного анализа [2, 4].

Повышенная чувствительность хвойных связана с длительными сроками жизни хвои и поглощения газа, слабым развитием запасающих тканей и, соответственно, недостаточными накоплениями резервных веществ, не высокой регенеративной способностью. Тем не менее, разные виды хвойных обладают различными биоиндикационными возможностями. Одна из наиболее важных характеристик - сезонный ритм ростовых процессов, в частности сроки начала и конца вегетации. Деревья и кустарники, рано начинающие и рано заканчивающие вегетационный цикл особенно сильно повреждаются в условиях загрязнения. Виды, начинающие вегетировать в более поздние сроки и поздно заканчивающие вегетацию, наиболее устойчивы к загрязнению.

Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris) - одна из важнейших лесообразующих пород, занимающая по численности треть хвойных. Своеобразие климата Сибири предполагает высокую адаптацию к температурным условиям [30].

Одним из преимуществ данного объекта исследования является возможность использования его в течении всего года. Сосна сохраняет фотосинтетическую активность при низких температурах, квантовый выход не меняется.

Для хвойных характерны сезонные изменения содержания и соотношения хлорофилла, а так же каротиноидов. От начала формирования молодой хвои, количество хлорофилла а, хлорофилла b и сумма каротиноидов в ней, плавно нарастает с достижением максимума в августе - сентябре. Следует отметить, что больше снижается содержание хлорофилла b, что приводит к увеличению отношения хлорофиллов a/b [54].

Отношение хлорофиллов a/b в течение большей части года изменяется в противофазе с содержанием хлорофилла b, и только в сентябре происходит одновременное снижение как содержание хлорофилла b, связанного с компонентами фотосистемы 1 (ФС 1) и фотосистемы 2 (ФС 2) значительно превышает такую же для хлорофилла светособирающего комплекса (ССК). Известно, что хлорофилл b сосредоточен преимущественно с ССК и ФС 2. скорость разрушения пигментов не одинакова в разные периоды года. Начинаясь осенью, процесс деградации хлорофилла развивается к зиме и затормаживается, не смотря на морозы, в январе - феврале. Процесс деградации у хвои протекает при установлении холодной и солнечной погоды зимой. В конце весны с началом нового вегетационного периода у хвои начинается активная регенерация фонда обоих компонентов хлорофилла, и как следствие, постепенное восстановление окраски хвои в июле [54].

Метод регистрации ЗФ хлорофилла у такой древесной породы, как сосна обыкновенная, обеспечивает надежное выявление начальных стадий повреждения растений при загрязнении атмосферы [6].

1.4 Ель сибирская как биоиндикатор загрязнения окружающей среды

Известна высокая чувствительность хвойных растений к различным видам загрязнений, что обуславливает их широкое использование в качестве биоиндикаторов при оценке качества окружающей среды [33].

Повышенная чувствительность хвойных связана с длительными сроками жизни хвои и поглощения газа, слабым развитием запасающих тканей и, соответственно, недостаточными накоплениями резервных веществ, не высокой регенеративной способностью. Тем не менее, разные виды хвойных обладают различными биоиндикационными возможностями. Одна из наиболее важных характеристик - сезонный ритм ростовых процессов, в частности сроки начала и конца вегетации. Деревья и кустарники, рано начинающие и рано заканчивающие вегетационный цикл особенно сильно повреждаются в условиях загрязнения. Виды, начинающие вегетировать в более поздние сроки и поздно заканчивающие вегетацию, наиболее устойчивы к загрязнению.

Ель сибирская (Picea obovata) - одна из важнейших лесообразующих пород, занимающая по численности треть хвойных. Своеобразие климата Сибири предполагает высокую адаптацию к температурным условиям [30].

Одним из преимуществ данного объекта исследования является возможность использования его в течении всего года. Ель сохраняет фотосинтетическую активность при низких температурах, квантовый выход не меняется.

Для хвойных характерны сезонные изменения содержания и соотношения хлорофилла, а так же каротиноидов. От начала формирования молодой хвои, количество хлорофилла а, хлорофилла b и сумма каротиноидов в ней, плавно нарастает с достижением максимума в августе - сентябре. Следует отметить, что больше снижается содержание хлорофилла b, что приводит к увеличению отношения хлорофиллов a/b [54].

Отношение хлорофиллов a/b в течение большей части года изменяется в противофазе с содержанием хлорофилла b, и только в сентябре происходит одновременное снижение как содержание хлорофилла b, связанного с компонентами фотосистемы 1 (ФС 1) и фотосистемы 2 (ФС 2) значительно превышает такую же для хлорофилла светособирающего комплекса (ССК). Известно, что хлорофилл b сосредоточен преимущественно с ССК и ФС 2. скорость разрушения пигментов не одинакова в разные периоды года. Начинаясь осенью, процесс деградации хлорофилла развивается к зиме и затормаживается, не смотря на морозы, в январе - феврале. Процесс деградации у хвои протекает при установлении холодной и солнечной погоды зимой. В конце весны с началом нового вегетационного периода у хвои начинается активная регенерация фонда обоих компонентов хлорофилла, и как следствие, постепенное восстановление окраски хвои в июле [54].

Ель сибирская занимает почти всю северную половину европейской части нашей страны. Ель теневыносливая и влаголюбивая порода. Ель очень чувствительна к весенним заморозкам. Пигментный состав фотосинтетического аппарата ели более чувствителен к действию загрязнителей, по сравнению с другими хвойными [30].

1.5 Состояние растений, произрастающих в районах с различной степенью техногенного загрязнения

По валовому выбору вредных веществ, Красноярский край прочно занимает первое место среди республик, краев и областей. Среди отраслей существенный вклад в загрязнение атмосферы воздуха вносит: цветная металлургия, химическая промышленность, электроэнергетика, жилищно-коммунальное хозяйство, целлюлозно-бумажный комбинат. Наиболее больший объем вредных веществ выбрасывает: АО «Красноярский алюминиевый завод», Красноярская ГРЭС-2, ТЭЦ-1, ТЭЦ-2. велика доля автотранспорта в суммарных выбросах в Красноярске [57].

Вокруг крупных промышленных районов среди функциональных нарушений растений часто упоминают резкое подавление деятельности ферментных систем, интенсивности фотосинтеза, повышения транспирации, усыхание и опадание листьев, повреждение почек и т.д. подобные изменения могут привести к гибели отдельных растений или исчезновение вида из загрязненного района. Испытания показали, что лиственные породы более устойчивы к загрязнению воздуха, чем хвойные, пылеулавливающая способность их выше [58].

Токсичные поллютанты оказывают разрушающее воздействие на фотосинтетический аппарат и деятельность устьиц, что является главной причиной ингибирования процесса СО2 - газообмена. В то же время деятельность воздушных загрязнителей приводит к деструкции корневой системы и существенным изменениям в структуре проводящей ксилемы, вследствие чего возникают нарушения в водном обмене деревьев. Усиливающийся водный стресс является дополнительной причиной значительного снижения фотосинтеза [15].

В районах, в которых в течение нескольких лет происходит выброс SO2 и HF, у деревьев поражает листья и изменяет режим роста. Эти фенотипические изменения приводят, в основном, к снижению нормальной скорости роста, вызывают деформацию ствола, веток и кроны деревьев. Первыми изменениями реакции растения на загрязненную среду является снижение морозоустойчивости деревьев, характеризуется краевым поражением. Наблюдается усиление повреждения хвойных зимой [35].

Изменение фотосинтетического аппарата под действием атмосферных загрязнений определяется высокой реакционной способностью ХБК и переносчиков электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) и стабильностью мембранных структур хлоропластов. Наблюдаемое при этом подавление фотосинтеза сопровождается трансформацией биохимических процессов и пигментного аппарата [56].

Загрязнение воздуха снижает содержание хлорофилла как в ССК, так и в комплексах ФС1 и ФС2, приводит к возрастанию внешнего максимума отношения хлорофилла a/b, что свидетельствует о большой чувствительности пораженной хвои к влиянию зимнего стресса. Загрязнение воздуха помимо непосредственного повреждения фотосинтетического аппарата может влиять на эффективность адаптации его к низким температурам в период покоя и снижает его устойчивость к повреждениям в зимний период [5].

Хвойные относительно устойчивы в раннем периоде роста и становятся очень чувствительными при пике роста древесины, при чем эта чувствительность сохраняется до ранней стадии зрелости [35].

Атмосферное загрязнение как фактор стресса в окружающей среде связано со многими другими факторами стресса. Загрязняющие вещества снижают устойчивость растений к морозу, зимним условиям, засухе. Фториды обычно вызывают краевые некрозы листьев или некрозы кончиков игл хвойных [35].

При рассмотрении растений с точки зрения концентрации загрязненных веществ в атмосфере, было отмечено, что растения более устойчивы зимой, чем в вегетационный период. Первыми изменениями реакции растений на окружающую среду является снижение морозоустойчивости растений, характеризуется краевым поражением. Наблюдается усиление повреждения хвойных зимой. Под действием загрязненного воздуха меняется состав сахаров в иглах [9].

Аккумуляция загрязняющих веществ на зеленую поверхность зимой вызывает ее разрушение. Быстрее всего этот процесс протекает в январе и феврале. Зимой хвойные обычно толерантны к более низким температурам, чем те, которые имеют место в действительности, а зимние повреждения могут быть связаны с зимней засухой или токсичными свойствами аккумулированных загрязняющих веществ, влияющих на мембраны фотосинтетического аппарата [61].

1.6 Состояние покоя у древесных растений

В течение годичного цикла у хвойных деревьев происходит обратимая структурная перестройка хлоропластов клеток мезофилла, заключающаяся в частичном распаде гран и уменьшении числа тилакоидов, накопление криопротекторов, таких как сахара и низкомолекулярные белки, повышение уровня абсцизовой кислоты и других фитогормонов [21], увеличение доли ненасыщенных липидов в мембранах хлоропластов [23].

Одно из приспособлений древних растений к переживанию неблагоприятных условий зимнего периода - их способность переходить в состояние зимнего покоя.

Физиологическое значение покоя заключается в приспособлении к неблагоприятным условиям, защите от обезвоживания (апексы побегов прекращают активный рост, покрываются чешуями, образуя зимние покоящиеся почки) [35].

У растительных организмов периоды вегетации, интенсивного роста чередуются с покоем. В состоянии глубокого покоя у растений резко заторможен обмен веществ и прекращается видимый рост.

Состояние зимнего покоя период интенсивной деятельности меристемы - образовательной ткани, как у вечнозеленых, так и у листопадных растений в это время закладываются зачатки листьев в вегетативных почках и элементов цветков - в цветочные. Без этого весной переход к активной жизнедеятельности был бы невозможен. Таким образом, покой - обязательное условие дальнейшего нормального роста а период вегетации [51].

Способность погружаться в состояние покоя, выработанная растениями в ходе эволюции - важное приспособление к периодическому наступлению неблагоприятных внешних условий. В состоянии вынужденного покоя растения находятся в конце зимы. Октябрь-ноябрь - глубокий покой, который не могут нарушить самые благоприятные для роста условия. Глубокий покой - необходимая фаза развития растений, сменяющая период вегетации [35].

Продолжительность периода покоя у разных деревьев и кустарников различна. Самый длительный покой у ели сибирской, сосны обыкновенной. В зимний период происходит ряд изменений в организации и функционировании фотосинтетического аппарата хвои. Наблюдается пожелтение хвои, обусловленное фотоокисление хлорофилла, при этом сначала происходит деградация фонда пигментов ССК, за счет более высокомолекулярных олигомеров соответствующих ХБК. У пожелтевшей хвои изменяется структура хлоропластов, снижается активность фотосинтетического аппарата, что проявляется в снижении активности ФС1 и ФС2, в замедлении переноса электронов на уровне пластохинона. Изменение активности фотосинтетического аппарата в зимний период обратимы, т.к. деревья хвойных пород приспособлены к переживанию морозов и сохраняют иглы в течение нескольких лет [20].

Подготовка фотосинтетического аппарата происходит осенью при переходе деревьев в состояние покоя. В этот период при положительных и небольших отрицательных температурах подавляется переменная флуоресценция хлорофилла в хвое сосны и изменяется температурная зависимость выхода флуоресценции на уровне F0 в хвое, а также в феллодерме коры у различных пород: max около +50°С подавляется, а появляется новый max около +80°С [3].

При нагревании хлорофиллсодержащих тканей выход постоянной флуоресценции возрастает при температуре около +45°С в следствие тепловой инактивации РЦ ФС2, после чего уменьшается из-за денатурации ССК. В результате на термограмме постоянной флуоресценции возникает max около +50°С, при более высокой температуре иногда обнаруживается второй max около +65°С, который связывают с тепловой инактивацией ХБК ФС2. переход растений в состояние покоя сопровождается изменением термограммы флуоресценции, max около +55°С исчезает и резко возрастает интенсивность флуоресценции при температуре выше +65°С. Подавление низкотемпературного max с усилением безизлучательного тушения возбуждения в ФС2, которое проявляется, например, при фотоингибировании фотосинтеза. При переходе растения в состояние покоя чувствительность их к фотоингибированию может вырасти, т.к. при подавлении синтеза белков замедляется восстановление активности фотоингибирующих РЦ ФС2. появление интенсивной флуоресценции при высокой температуре нельзя связывать с усилением флуоресценции ФС1, т.к. возрастание количества ФС1 в состоянии покоя представляется маловероятным. Появление высокотемпературной флуоресценции в покоящихся тканях, может быть обусловлено накоплениями в клетках веществ, способствующих такому переходу, либо изменении состояния самих тилакоидных мембран [53].

Причиной высокотемпературного max может быть «разгорание» флуоресценции более термостабильного ХБК ФС1 при инактивации ее РЦ.

Определенный вклад в появлении высокотемпературного пика может дать ХБК ФС2 при условии ее локализации в межгранных участках мембран тилакоидов и дефиците СХБК [5].

В настоящее время накоплено много данных о том, что состояние покоя контролируется с помощью гормонов. Вхождение в покой связано с увеличением содержания абсцизовой кислоты (АБК), а выход из покоя с появлением цитокининов и гиббереллинов [50].

АБК - тормозит рост проростков, подавляет открытие устьиц, активизирует отток метаболитов из листа и ингибирует процессы фотосинтеза, способствует развитию состояния покоя, тормозит синтез гидролитических ферментов (амилазы, протеиназы), необходимых для различных процессов вегетации растений [32].

Важную роль в переходе растения в состояние покоя играет и этилен, вызывающий старение листьев, определяющий пребывание почек в состоянии покоя. Одновременно в тканях растений уменьшается содержание естественных стимуляторов роста.

На переход растений в состояние покоя оказывает влияние и температура. Для некоторых видов понижение ночных температур - главный сигнал к покою. Также сигналом к покою служит уменьшение продолжительности светового дня [51].

Из литературных данных известно, что максимальная скорость фотосинтеза в интервале +20 - 25°С. Нижний предел температур, при котором еще наблюдается фотосинтез, колеблется от +15°С (сосна, ель) до +3°С, у большинства высших растений фотосинтез прекращается приблизительно при 0°С. Устойчивость растений к низким температурам создается благодаря внутриклеточным изменениям. Роль антифриза - веществ, которые снижают температуру замерзания растворов, находящихся в клеточных вакуолях, играют сахара: они накапливаются в клеточном соке во время подготовки растения к зиме. Они же предохраняют белки цитоплазмы от коагуляции при понижении температуры. Чем больше сахаров накапливает растение а своих тканях, тем лучше они противостоят действию низких температур [51].

Под действием загрязнения воздуха меняется состав сахаров в листьях и иглах, например, обнаружено осеннее снижение содержания глюкозы и сахара в загрязненной хвое ели европейской по сравнению с незагрязненной [59].

Нарушается транспирация: стадия полного покоя развивалась не полностью, загрязненные иглы были готовы к транспирации в январе [59].

При выходе растения из состояния покоя наблюдается появление при +45 - 55°С низкотемпературного пика, что связано с тепловым повреждением мембран тилакоидов на уровне ХБК ФС2 и СХБК, затрагивающим целостность РЦ и структурно функциональную связь между ФС2 и хлорофилл a/b белковым комплексом. Возрастание выхода флуоресценции при +70 - 80°С связано с выходом хлорофилла в липидную фазу при денатурации ХБК.

1.7 Замедленная флуоресценция и ее использование для оценки состояния растения

Флуоресценция хлорофилла

Фотосинтез зеленых растений очень чувствителен к различным изменениям факторов внешней среды. Сначала прошлого века его все чаще используют с помощью постоянно расширяющегося арсенала методов для определения реакции растений на стрессы, в особенности на загрязнение воздуха [1].

Фотосинтез - стабильное фундаментальное явление, поэтому, снижение его интенсивности свидетельствует об ухудшении состояния растения. Флуоресценция выступает как инструмент исследования фотосинтеза.

Характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток. Для понимания этой взаимосвязи достаточно напомнить, что поглощение кванта света переводит молекулу хлорофилла в электронное возбужденное состояние, энергия которого в растворе при отсутствии фотосинтеза переходит либо в тепло, либо в флуоресценцию. В фотосинтетической мембране энергия электронного возбуждения хлорофилла используется в реакционных центрах (РЦ) для генерации потока электронов в первичных стадиях фотосинтеза, необходимых для восстановления НАДФ и образования АТФ. Напомним, что первичные процессы фотосинтеза высших растений осуществляются при участии двух фотосистем, функционирующих последовательно. Фотосистема 2 разлагает воду с выделением свободного кислорода и отдает электрон через цепь переносчиков на фотосистему 1, которая уже восстанавливает НАДФ. В клетке в основном флуоресцирует хлорофилл, принадлежащий фотосистеме 2, и именно изменения его флуоресценции говорят о состоянии реакционных центров этой фотосистемы. При активном фотосинтезе, когда все РЦ находятся в открытом рабочем состоянии, в условиях слабого освещения почти вся поглощенная энергия света используется в процессе фотосинтеза. Поэтому интенсивность флуоресценции хлорофилла в клетке намного ниже, чем в растворе.

Однако и здесь небольшая часть энергии электронного возбуждения (не более 3%) переходит в энергию света флуоресценции в виде так называемой фоновой флуоресценции F₀. Как правило, в нормальных условиях величина F₀ мала, что говорит об активном использовании клетками энергии поглощенного света. Но если при каких-либо воздействиях нарушается состояние фотосинтетических мембран, то центры (РЦ) переходят в неактивное (закрытое) состояние, когда происходит прекращение потока электронов в первичных процессах фотосинтеза. В этих условиях поглощенная энергия света уже не может использоваться в фотосинтезе, поэтому и флуоресценция хлорофилла возрастает. Можно полностью вывести из рабочего состояния РЦ, например, при действии ингибитора потока электронов диурона. В этом случае флуоресценция сильно возрастает и приближается к своим максимальным значениям F_т. Заметим, что закрыть центры можно создавая также избыточную освещенность клеток, когда происходит световое насыщение фотосинтеза. Фотосинтетическая цепь переноса электрона как бы захлебывается от избытка поглощенной световой энергии, переводя все большую часть поглощенной энергии света в флуоресценцию.

Можно найти разницу между интенсивностями флуоресценции хлорофилла при закрытых и открытых РЦ (F_v = F_т - F₀), которую называют переменной флуоресценцией (F_v) хлорофилла в клетках. Как видно, величина F_v соответствует той части энергии света, которая используется открытыми реакционными центрами в фотосинтезе, то есть может характеризовать активность начальных стадий фотосинтеза. На практике оценивают отношение F_v./F_т, величина которого тесно связана с первичной продуктивностью фитопланктона в природных водоемах. Она хорошо коррелирует с фотосинтетической продукцией клеток, определенной классическими методами по восстановлению СО₂ с помощью радиоактивных изотопов ¹⁴С [36].

Удобным и перспективным биофизическим методом, несущим информацию о функционировании первичных реакций фотосинтеза является метод регистрации замедленной флуоресценции.

Явление замедленной флуоресценции наблюдается у всех видов фотосинтезирующих растений. Замедленная флуоресценция возникает при излучательной дезактивации первого синглетного возбужденного состояния хлорофилла и обусловлена вторичным возбуждением хлорофилла, а при обратных реакциях образования на свету фотопродуктов, в результате рекомбинации зарядов первичного акцептора электронов и хлорофилла реакционного центра фотосистемы 2 [4].

Замедленная флуоресценция зеленых растений возникает в основном в реакционном центре фотосистемы 2, однако, чрезвычайно слабая замедленная флуоресценция может наблюдаться в фотосистеме 1.

Интенсивность замедленной флуоресценции пропорциональна скорости реакции зарядов в реакционном центре фотосистемы 2, пропорционально концентрации центров с разделенными зарядами.

Концентрация последних зависит от скорости последующих стадий переносов электронов. Именно этим объясняется зависимость интенсивности и других параметров замедленной флуоресценции от изменения скорости электронного транспорта в хлоропластах при изменении внешних условий.

Использование замедленной флуоресценции для оценки состояния растений

Изменения параметров замедленной флуоресценции при действии факторов внешней среды можно использовать для определения устойчивости растений. Максимальная амплитуда неблагоприятного фактора, при которой еще нет существенных изменений параметров замедленной флуоресценции, будет характеризовать устойчивость фотосинтетического аппарата растений к этому фактору. Во многих случаях устойчивость фотосинтетического аппарата, регистрируемая методом замедленной флуоресценции, коррелирует с общей устойчивостью растительного организма к тому или иному фактору [24].

Преимущество флуоресцентных методов исследования заключается в том, что информацию о содержании хлорофилла, организации фотосинтетического аппарата и его активности можно получить за очень короткий отрезок времени, как при контактном, так и бесконтактном способах измерения, что очень важно для решения экологических проблем.

Методы, основанные на флуоресцентных параметрах, характеризуются высокой чувствительностью, возможности автоматизации полученной информации, проведения ранней диагностики [33]. Методы дают нам то, что ошибка в самом плохом случае не превышает 10%, в идеале она может быть равной 1%.

Таким образом, благодаря использованию метода замедленной флуоресценции мы можем с высокой оперативностью и чувствительностью получать многообразную информацию о фотосинтетическом аппарате, по которой можно судить о влиянии стрессовых факторов на исследуемый объект.

2. Материалы и методы

В качестве объектов исследований использовались деревья сосны обыкновенной (Pinus sylvestris) и ели сибирской (Picea obovata) в возрасте от 20 до 35 лет, входящих в состав искусственных насаждений г. Красноярска, на восьми пробных площадках.

Площадка №1 (Октябрьский район) - расположена в городе, вблизи Красноярского маргаринового завода. Поток автотранспорта средний. Деревья визуально не повреждены. Хвоя не запылена. Виды: ель, сосна.

Площадка №2 (Советский район) - расположена в городе, на пересечении улицы Краснодарская и проспекта Металлургов, испытывает сильный поток автотранспорта. Деревья визуально не повреждены. Хвоя запылена. Виды: ель.

Площадка №3 (Октябрьский район) - расположена в городе, на пересечении проспекта Свободный и проспекта Октябрьский (остановка ГорДк). Испытывает влияние большого потока автотранспорта и выбросов промышленных предприятий, котельных. Деревья визуально не повреждены. Хвоя запылена. Виды: ель.

Площадка №4 (Свердловский район) - заповедник «Столбы». Расположена за городом, в трех километрах от дороги. Деревья визуально не повреждены. Хвоя не запылена. Виды: ель, сосна.

Площадка №5 (Октябрьский район) - расположена в городе, в Академгородке недалеко от дороги. Испытывает влияние сильного потока автотранспорта. Деревья визуально не повреждены. Хвоя не запылена. Виды: ель, сосна.

Площадка №6 (Кировский район) - расположена в городе, вблизи завода СибТяжМаш по улице Мичурина. Деревья визуально не повреждены. Хвоя не запылена. Виды: ель, сосна.

Площадка №7 (Советский район) - расположена в городе, рядом со Школой милиции, испытывает влияние сильного потока автотранспорта. Деревья визуально не повреждены. Хвоя запылена. Виды: ель, сосна.

Площадка №8 (д. Погорелка) - расположена на расстоянии 35 километров от Красноярска. Деревья находятся в 1,5 км от трассы, визуально не повреждены, хвоя не запылена. Площадка является контрольной. Виды: ель, сосна.

Для исследования на каждой площадке было выбрано по три дерева, примерно одного возраста, визуально не поврежденных и в одинаковых условиях освещенности. От каждого дерева брали по 4 побега. Для исследований брали хвою первого и второго года жизни.

Измерения проводили сразу после сбора, после выведения растений из состояния покоя, а так же после экспозиции в лабораторных условиях. Для оценки низкотемпературного стресса, хвою с каждой площадки держали по одной неделе при комнатных условиях (+24є С), при отрицательных (- 16,2є и -2є С) температурах.

Регистрацию ЗФ проводили на флуориметрах «Фотон-9» и «Фотон-10», разработанных на кафедре экотоксикологии и микробиологии под руководством проф. Ю.С. Григорьева.

Рис. 1. Диаграмма работы прибора Фотон 9

Обозначения:

ДС - действующий (яркий, красный) свет, излучаемый светодиодами

ИС - измерительный (слабый, синий) свет, излучаемый светодиодами (зонд)

ЗФ - замедленная флуоресценция, регистрируемая после вспышек ДС

Ф - флуоресценция (быстрая), возбуждаемая ИС и регистрируемая в период его включения

ФЭУ - фотоэлектронный умножитель

Рабочий цикл включает два импульса ДС и два темновых промежутка между ними, в один из которых подается импульс ИС.

Функционирование обоих приборов сходно. В основу работы прибора положен принцип измерения послесвечения хлорофиллсодержащего растительного объекта, в промежутках между импульсами возбуждающего света (рис. 1).

По своей природе это свечение является фотохемилюминесценцией хлорофилла, которое благодаря идентичности спектру излучения быстрой флуоресценции (фотолюминесценции), получило название замедленной флуоресценции.

В приборе импульсы красного света миллисекундной длительности и интенсивности, способной запустить процесс фотосинтеза, подаются от двух мощных светодиодов. Они возбуждают ЗФ, которая регистрируется в виде кривых затухания в миллисекундные темновые промежутки. Время световых импульсов и промежутков между ними устанавливаются оператором перед началом работы. Быстрая флуоресценция, возбуждается от низкоинтенсивного светодиодного источника синего света, который включается в каждый второй темновой промежуток между импульсами красного света. Значение БФ вычисляется путем попарного вычитания из величины интенсивности свечения на момент подачи импульса синего света, величины свечения (ЗФ), регистрируемой в предыдущий темновой интервал. Для предотвращения «ослепления» фотоумножителя он автоматически «запирается» на период подачи каждого импульса красного света с помощью электронного модулятора. После окончания очередного светового импульса происходит «отпирание» ФЭУ для регистрации флуоресценции исследуемого растительного объекта.

Перед началом работы в приборе размещаются кюветы с образцами, устанавливается режим измерения БФ и ЗФ, и загружается программный модуль управления прибором. После этого производится его запуск. Измерение свечения образцов во всех кюветах выполняется в автоматическом режиме. Включив двигатель вращения кассеты с кюветами, прибор, ориентируясь на показания датчиков ее положения, находит т.н. «нулевую» кювету, а затем поочередно выполняет замеры свечения всех других загруженных кювет. Пустые ячейки кассеты пропускаются прибором. Снятые данные от очередной кюветы сразу передаются на управляющий компьютер и после обработки высвечиваются на экране. Для устранения свечения самой кюветы, а также темнового тока, из значения сигналов кювет вычитается сигнал «нулевой» кюветы. При работе с суспензиями водорослей или хлоропластов, в нее заливается такой же объем среды, а в случае анализа «сухих» образцов, она оставляется пустой.

Измерение свечения каждой кюветы проводится для двух заранее установленных световых и временных режимов, условно обозначенные как «высокий свет» и «низкий свет». В обоих режимах флуоресценция образцов регистрируется в виде заданного массива точек для каждой кривой затухания. В связи с большим объемом получаемой информации, характер затухания свечения представляется в виде двух усредненных точек - из начала и конца снятого массива для каждой кривой. При этом на «высоком» свету уровень свечения отображается начальными точками кривых затухания, а на «низком» - конечными.

Процесс измерения свечений на каждом свету включает три серии рабочих циклов (рис. 1): серия №1 - измерительный и действующий света не включены; серия №2 - включен только измерительный свет; серия №3 - включены оба источника света. Количество рабочих циклов в каждой серии задается оператором. После установки очередной кюветы сначала следуют серии замеров на «высоком» свету, затем, через 1 секунду, - на «низком» и производится перевод кюветы. Возможно проводить измерения свечения каждой кюветы многократно при работе в режиме нескольких «кругов» вращения кассеты с кюветами.

Снятые данные и параметры их замера могут быть сохранены в виде отдельных файлов на управляющем компьютере. При необходимости они могут быть загружены и просмотрены программой Foton или Microsoft Excel.

В качестве показателей ЗФ взяты значения амплитуд быстрой (миллисекундной) и медленной (секундной) компонент затухания послесвечения, а так же их отношение - относительный параметр замедленной флуоресценции [29].

Результаты статистически обработаны по стандартным методикам [22].

3. Результаты исследований

3.1 Зависимость ОПЗФ хвои ели сибирской от района произрастания растений

В период с января 2005 по апрель 2007 года нами были исследованы сезонные изменения флуоресцентных параметров хлорофилла хвои ели сибирской (Picea obovata) в районах с различным уровнем загрязнения воздуха.

Были проведены опыты, на их основании можно сделать следующие заключения. Сравнивая площадку №3 (на рисунках ГорДк) и площадку №2 (на рисунках Авиагородок), мы убеждаемся в их различии. Средние ОПЗФ на третьей площадке выше, чем средние ОПЗФ с площадки №2.

А.

БРис. 2. Зависимость показателей флуоресценции хвои ели от стороны света и места произрастания деревьев (март 2005).

А. - ОПЗФ; Б. - ЗФ_в.

А.

Б.

Рис. 3. Зависимость показателей флуоресценции хвои ели от стороны света и места произрастания деревьев (апрель 2005).

А. - ОПЗФ; Б. - ЗФ_в.

Вероятно, это объясняется различием атмосферного загрязнения районов. На первой площадке средние ОПЗФ так же ниже показаний с третьей площадки, это можно объяснить тем, что не далеко находится КМЗ, но средний поток автотранспорта, что облегчает экологическую обстановку данной площадки.

В целом, по трем площадкам, опираясь на собранную информацию, можно сделать вывод, что площадка в районе р. Бугача находится в более чистом районе, чем площадка в Академгородке, а на ГорДК деревья испытывают влияние самого большого атмосферного загрязнения.

А.

В.

Б.

Г.

Рис. 4. Зависимость параметров флуоресценции хвои ели от стороны света и места произрастания деревьев.

А. - ОПЗФ, январь 2005; Б. - ЗФ_в, январь 2005;

В. - ОПЗФ, февраль 2005; Г. - ЗФ_в, февраль 2005.

С июня по сентябрь 2005 дополнительно взяли еще одну площадку (д. Погорелка), неподверженную действию факторов, присутствующих в городской среде. Это позволяет более достоверно выявить степень угнетения хвойных на остальных площадках. Легко прослеживается (рис 5 - 6) подтверждение сделанного нами предположения, что в чистом районе, свободном от выхлопных газов, пыли и других веществ, являющихся следствием деятельности промышленных центров, растения чувствуют себя гораздо комфортнее. Их ритмы и циклы не нарушаются, в то время как, в городской среде, хвойные позже уходят в покой и раньше из него выходят.

А.

В.

Б.

Г.

Рис. 5. Зависимость параметров флуоресценции хвои ели от стороны света и места произрастания деревьев.

А. - ОПЗФ, июнь 2005; Б. - ЗФ_в, июнь 2005;

В. - ОПЗФ, июль 2005; Г. - ЗФ_в, июль 2005.

А.

В.

Б.

Г.

Рис. 6. Зависимость параметров флуоресценции хвои ели от стороны света и места произрастания деревьев.

А. - ОПЗФ, август 2005; Б. - ЗФ_в, август 2005;

В. - ОПЗФ, сентябрь 2005; Г. - ЗФ_в, сентябрь 2005.

3.2 Зависимость ОПЗФ хвои от стороны света

биоиндикатор загрязнение сосна воздух

Для изучения высокой вариабельности результатов опытов бала прослежена зависимость ОПЗФ хвои ели от стороны света.

Прослеживая зависимость ОПЗФ хвои от стороны света, видно, что на первой площадке показатели преимущественно выше с южной стороны. На второй площадке наиболее активна хвоя с западной стороны. Анализируя третью площадку, мы видим, что хвоя с северной стороны света уходит в менее глубокий зимний покой, чем хвоя с других сторон света.

Такие различия на всех трех площадках можно объяснить ветром, дующим с разных сторон света, и расположением промышленных предприятий.

На первой площадке источники, загрязняющие атмосферу, находились только с западной и южной стороны (КМЗ и движение автотранспорта), потому что площадка находится на окраине города и с северной и восточной сторон начинаются поля. Другие две площадки находились непосредственно в городе. На рисунках c 6 по 9 хорошо видно, что показатели второй площадки намного выше с западной стороны света, это можно объяснить тем, что с западной стороны находится крупный перекресток и три автобусные остановки, ветер постоянно западный. Подобная ситуация на третьей площадке (рис. 2 и 3), объясняется таким же близким расположением перекрестка и остановок с запада, автобусных остановок с севера, ветер северо-западный.