Почвенные и водные бактерии-деструкторы полигидроксиалканоатов
Экологически чистые материалы - решение проблемы утилизации полимерных отходов. Идентификация бактерий-деструкторов полигидроксиалканоатов, выделенных из пресной воды тропических искусственных водоемов и бактериальной микрофлоры почвы дендрария.
| Рубрика | Экология и охрана природы |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 11.12.2014 |
| Размер файла | 2,2 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
24
Содержание
- Введение
- Глава 1. Обзор литературы
- 1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов
- 1.2 Области применения полигидроксиалканоатов
- 1.3 Биодеградация полигидроксиалканоатов
- 1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов
- Глава 2. Объекты и методы исследования
- 2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде
- 2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве
- 2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария
- 2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны лиственницы
- 2.3 Определение способности бактерий к биодеградации
- 2.4 Методы идентификации микроорганизмов
- Глава 3. Результаты исследования
- 3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы
- 3.2 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксивалерата в пресной воде
- Заключение
- Список используемых источников
- Приложения
Введение
Одним из решений экологической проблемы утилизации и переработки полимерных отходов является получение биоразлагаемых материалов. Возможность получения полимеров, сохраняющих эксплуатационные характеристики в период потребления, а затем разлагающихся под воздействием природных факторов на углекислый газ, воду, гуминовые вещества и биомассу. Перспективными полимерами данного типа являются полигидроксиалканоаты (ПГА). Это группа полиэфиров, синтезируемых многими бактериями в качестве источника внутриклеточного углерода и запасаемого источника энергии [1,7].
Биологическая деградация ПГА осуществляется под воздействием ферментов-деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, которые используют растворимые продукты расщепления полимеров в качестве субстрата для роста. Выявлено, что факторами, наиболее воздействующими на биоразрушаемость данных полимеров, являются концентрация микроорганизмов-деструкторов, их видовой состав, физико-химические факторы среды, а также состав и свойства полимеров [3,4,24].
Среди эффективных деструкторов ПГА - разнообразные бактерии, относящиеся к широко распространенным почвенным и водным представителям (Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Streptomyces, Ilyobacter) [2,3].
Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. С ростом перспектив применения ПГА все большую актуальность приобретает исследование закономерностей разрушаемости ПГА в естественных природных условиях. Тем более что результаты по биоразрушаемости ПГА в лабораторных условиях с использованием чистых микробных культур, выделенных из природных источников, а также под воздействием деполимеризующих ферментов, не позволяют предвидеть картину разрушения данного биопластика в природной среде, в многокомпонентных и разнообразных естественных экосистемах [10,21].
В связи с этим цель настоящей работы - идентификация бактерий-деструкторов полигидроксиалканоатов, выделенных из пресной воды тропических искусственных водоемов и бактериальной микрофлоры почвы дендрария, участвующей в деструкции ПГА.
Были поставлены следующие задачи:
1. Определить общее микробное число и численность бактерий-деструкторов в почве.
2. Выявить биодеструктивные способности изолятов бактерий, доминирующих в пресноводных и почвенных микробиоценозах.
3. Изучить культуральные, морфологические, физиолого-биохимические свойства бактерий-биодеструкторов для их идентификации.
Работа выполнялась на базовой кафедре биотехнологии ИФБиБТ.
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов
Полигидроксиалканоаты (ПГА) являются запасными веществами в клетках бактерий. Они аккумулируются внутриклеточно в форме включений (гранул) и их масса может составлять до 90% от сухого веса клетки [4,5].
Мономерное строение полигидроксиалканоатов зависит от видовой специфики, условий роста и, особенно источника углерода в среде. Классифицируют ПГА по числу атомов углерода в мономере. Они могут быть короткоцепочечными (ПГАсцл, содержат 3-5 атомов углерода), среднецепочечными (ПГАмцл, 6-15 углеродных атомов) и длинноцепочечными (ПГАлцл, содержат более 15 атомов углерода). Многие бактерии могут одновременно синтезировать ПГАсцл и ПГАмцл, то есть являются гетерогенными [17].
Наиболее изученными из полигидроксиалканоатов являются полигидроксибутират и его сополимеры с оксивалериановой кислотой [4].
Полигидроксибутират (ПГБ) способны накапливать различные прокариотные микроорганизмы. Способность синтезировать данный полимер показана для бактерий родов: Azotobacter, Pseudomonas, Spirillum, Bacillus, Nocardia, Alcaligenes, Chloroflexus и других (всего известно около 100) [4, 15].
Накапливается полигидроксибутират в клетках в виде гранул, которые образованы плотно упакованными тяжами, ограниченными фосфолипидными оболочками с включенными в них белками. По физическим свойствам ПГБ близок к полипропилену. Однако чистый ПГБ характеризуется очень низким растяжением на разрыв, а так же более высокой температурой стеклования, чем полипропилен. Как и все полигидроксиалканоаты он устойчив к воздействию УФ излучения, но малоустойчив к растворителям, кислотам и щелочам. ПГБ нерастворим в воде и относительно устойчив к гидролитическому разложению, это отличает полигидроксибутират, как и прочие ПГА, от других биоразрушаемых пластиков, используемых в настоящее время. ПГБ подвергается растворению хлороформом и другими хлорпроизводными углеводородов [4, 5, 36].
Полигидроксибутират (ПГБ) - гомополимер D (-) - 3-в-оксимасляной кислоты. Он представляет собой изотактический полиэфир с регулярными, повторяющими единицами (C4H6O2). Его формула выглядит следующим образом:
Величина n определяется условиями синтеза полимера микробными клетками, а также методами его экстракции, молекулярный вес колеблется от 60000 до 250000 [7].
У полигидроксибутирата, аналогично многим полимерным материалам, температура, при которой происходит его деформация, ниже температуры кипения (температурной деградации), поэтому газовое состояние в полимерах не реализуется и основным видом фазового равновесия в них является конденсированное состояние - кристаллическое, стеклообразное, вязко-текучее и жидкое [4].
Субстратом для синтеза ПГБ могут служить сахара, спирты, ацетат, водород, органические кислоты. В настоящее время, с развитием технологий и увеличением объема наших знаний, появилась возможность получать полигидроксибутират и его сополимеры, используя широкий спектр исходных веществ, в том числе из промышленных отходов [4, 7].
Гетерополигидроксибутират (ПГБВ) - наиболее известный гетеро-полимерный ПГА, являющийся продуктом сополимеризации 3-оксимасляной и 3-оксивалериановой кислот. Он имеет следующую структурную формулу:
В зависимости от соотношения мономеров в полимере и их природы свойства полимерных материалов изменяются, в т. ч. механическая прочность, температура плавления, биоградируемость [4, 46,55].
Производство других полигидроксиалканоатов зависит от субстрата, на котором выращивали микроорганизмы и от специфичности синтетаз.
Биосинтез полимеров определяется тремя ключевыми ферментами: в-кетотиолаза, ацетоацетил-CoA-редуктаза и ПГА-синтаза кодируемые 25 генами, которые можно клонировать и, благодаря чему создавать новые виды или увеличивать количество необходимых [37,45].
Несмотря на то, что ПГА являются гидрофобными, частично кристаллизованными полимерами, они могут подвергаться деградации различными микроорганизмами, которые выделяют ПГА деполимеразы, разрушающие полимеры [22,26,51].
1.2 Области применения полигидроксиалканоатов
ПГА, как уже было отмечено ранее, по ряду физико-химических свойств сходны с широко применяемыми и выпускаемыми в огромных количествах и неразрушаемыми в природной среде синтетическими полимерами типа полипропилена. Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности и изменения прочности. При нагревании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов получать из этих полимеров разнообразные изделия. Масштабы применения ПГА в настоящее время сдерживаются достаточно высокой стоимостью, тем не менее сферы их применения постоянно расширяются. [18, 42]
Полигидроксибутират и его сополимеры с валератом используют для получения термоплавких адгезивных материалов, а длинноцепочечные ПГА используют в качестве адгезивов, устойчивых при прессовании. ПГА можно использовать также для замены нефтехимических полимеров в качестве тонеров и проявителей, а также ион-проводящих полимеров. [31, 50, 25, 48, 49]
Из ПГА возможно получение гибких пленок различной толщины, в том числе полупроницаемых мембран, нитей, нетканых материалов, различных полых форм (бутылки, контейнеры, коробки и пр.), а также гелей и клеев. Совокупность свойств, характерных для ПГА, делает их перспективными для применения в различных сферах - медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, радиоэлектронике и других сферах. ПГА активно исследуются с целью переработки в США, Скандинавии и Германии и Голландии. Большой интерес к биодеградируемым ПГА в настоящее время сформировался в США. [18, 42]
Безусловные перспективы и широкий рынок изделий из ПГА наметился в косметологии - это получаемые экструзией различной формы флаконы, банки, бутылки, контейнеры и коробки. Первой бутылкой из ПГА для шампуня стала использовать компания "Wella AG" в Германии. [57]
Отдельные типы ПГА образуют прочные гелии и латексы, поэтому на их основе возможно изготовление клеев, наполнителей, в том числе для стабилизации красителей. Ламинаты ПГА с бумагой и другими полимерами хорошо зарекомендовала себя для изготовления мешков и пакето для хранения разрушаемого мусора, а также одноразовой посуды. Помимо упаковочной тары, контейнеров для пищи и одноразовой посуды, ПГА используют также в качестве пищевых добавок, например, заменителя сливок, средств доставки ароматизаторов и отдушек. [58,59]
Данный материал исследуется и внедряется в различные сферы, включая необычные, например использование в условиях морской воды. Это направление возникло после того, как стало известно, что ПГА достаточно прочны, но при этом хорошо разрушаются не только в почве, но и в морской воде. Моножильные крученые нити из сополимерных ПГА используются для изготовления рыболовных сетей, крабовых ловушек, канатов, а также в практике морской аквакультуры. [28, 52]
Рынок существует и по отношению к продуктам деполимеризации и гидролиза ПГА. Из этих полимеров возможно получение спектра оптически чистых многофункциональных гидроксикислот. [34]
Новое открывающееся направление перспективности ПГА - это получение биотоплива. Недавно показано, что метиловые эфиры 3-гидроксибутирата и среднецепочечных ПГА, полученные этерификацией П3ГБ и среднецепочечных ПГА, могут быть использованы как биотопливо. Температура сгорания этих соединений порядка 20-30 кДж/г, что сопоставимо с температурой сгорания этанола (27кДж/г). По предварительным оценкам, стоимость биотоплива на основе ПГА может составить порядка 1200 дол. США за тонну. [43]
Сегодня существует рынок изделий из ПГА сельскохозяйственного назначения - это пленочная продукция для упаковки продуктов, удобрений, для тепличных хозяйств; горшечная продукция; сетки, канаты и др. В этой связи новым и экологически значимым направлением применения ПГА может стать его использование для депонирования и доставки сельскохозяйственных препаратов. Бурное развитие химии и переход сельского хозяйства на интенсивные технологии привели к появлению и применению огромного разнообразия химических веществ для борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями болезней культивируемых видов. Используемые в виде порошков, суспензий и эмульсий, пестициды зачастую не обеспечивают адресную доставку препаратов, что ведет к их рассеиванию и последующей аккумуляции в биосфере. Это вызывает необходимость поиска более эффективных средств и методов защиты полезной биоты, не оказывающих отрицательного воздействия на человека и окружающую среду в целом. [43, 11, 20]
Новым направлением исследований, ориентированных на снижение риска неконтролируемых распространения и аккумуляции ксенобиотиков в биосфере, является разработка экологически безопасных препаратов нового поколения с адресным и контролируемым выходом активного начала за счет использования специальных покрытий или матриксов из биоразрушаемых материалов. Описаны не многочисленные примеры использования полимерных носителей: этилцеллюлозы, полиуретана, альгината натрия, полимеров с памятью формы для депонирования отдельных ядохимикатов. [33, 11, 44, 53]
1.3 Биодеградация полигидроксиалканоатов
Способность ПГА к разложению в биологических средах до безвредных продуктов является одним из главных преимуществ, отличающий этот класс соединений от небиоразрушаемых пластиков. ПГА подвергаются биодеструкции как в экосистемах (в почве, водной среде), так и внутри организма. Скорость процесса может сильно варьировать, однако можно выделить несколько основных факторов, влияющих на биологическую деструкцию ПГА и их сополимеров:
· стереоконфигурация полимера (только эфирные соединения мономеров R-конфигурации гидролизуются микробными деполимеразами);
· степень кристалличности полимера (скорость деградации более кристалличных образцов ниже);
· молекулярная масса полимера (чем ниже молекулярная масса ПГА, тем быстрее происходит разложение);
· состав полимеров [24,27].
бактерия деструктор полигидроксиалканоат микрофлора
Наиболее изучаемым аспектом биодеградации ПГА является способность микроорганизмов использовать данные полимеры в качестве субстратов для роста [27]. ПГА могут разрушаться как внутриклеточно внутриклеточными деполимеразами в период аккумулятивной фазы при отсутствии стабильного источника углерода, так и внеклеточно под влиянием внеклеточных деполимераз. Бактерии, секретирующие полимер после его выделения в среду гибнут. Внутриклеточные ПГА деполимеразы не гидролизуют внеклеточные полигидроксиалканоаты, а внеклеточные деполимеразы не могут разрушать внутриклеточные гранулы, что определяется различиями в физической структуре внутриклеточных "нативных" и внеклеточных "денатурированных" гранул ПГА. Последние являются высоко кристаллизованными полимерами. ПГА нативных гранул полностью аморфны и имеют поверхностный слой, состоящий из протеинов и фосфолипидов. Поверхностный слой постепенно разрушается при выделении гранул или под действием других физических и химических факторов. Структуру и состав слоя изучают биохимически, с помощью молекулярной биологии и электронной микроскопии. Когда поверхностный слой гранул разрушен в течение процесса выделения, полимер агрегируется. Кристаллизованные ПГА не связываются с внутриклеточными ПГА-мобилизованными системами [4, 15,14,51].
В литературе изучена динамика разрушения сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата, с различной величиной включения последнего и установлено, что сополимерные образцы разрушаются быстрее [35].
Полигидроксиалканоаты могут разрушаться под воздействием высоких температур (свыше 300оС), в результате кислотного и щелочного гидролиза, а также биологическим путем.
При термальном разложении происходит случайное разделение полимера. Под влиянием кислот или щелочей полигидроксиалканоаты разлагаются, как обычные эфиры. В разбавленных растворах процесс химического гидролиза полигидроксиалканоатов протекает крайне медленно, но увеличивается при высоких температурах. Биологическая деградация ПГА происходит гидролитически под воздействием специфических ферментов - деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, а также ферментами крови и тканей высших животных [19].
В естественных условиях ПГА разрушаются до конечных продуктов - диоксида углерода и воды в аэробных условиях, метана в анаэробных, причем процесс происходит довольно быстро. ПГА главным образом разрушаются за счет деятельности микроорганизмов [27,21].
Разрушение полиоксибутирата и сополимера ПГБ/ПГВ (с 10 мол. % гидроксивалерата) изучено при различной температуре (от 15 до 40 оС) в почве. Скорость деградации полимера варьировала от 0,03% до 0,64 % в сутки в зависимости от типа почвы, химического состава полимера и температуры. В основном, с увеличением температуры скорость деструкции возрастала. При исследовании биодеградации ПГБ в почвенном компосте при температуре 24 и 46оС наилучшие показатели деградации зафиксированы при 46°С [23].
Области применения ПГА в связи с его уникальными свойствами различны. ПГА с успехом может быть применен в качестве матрицы для получения лекарственных форм пролонгированного действия. На основе ПГА существует возможность создания макромолекулярных терапевтических систем - матриц и резервуарных мембран и микросфер для контролируемой доставки лекарственных веществ в организм широкого спектра применения (диабетические средства, антагонисты наркотиков, антиалкогольные средства и противоопухолевые препараты) [3,4].
В число применений ПГА входят биоразлагаемые упаковочные материалы и формованные товары, нетканые материалы, одноразовые салфетки и предметы личной гигиены, пленки и волокна, связывающие вещества и покрытия, связующие материалы для металлических и керамических порошков, водоотталкивающие покрытия для бумаги и картона [7,8].
1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов
Важным вопросом, решение которого необходимо для понимания закономерностей и механизма биоразрушения ПГА, является выявление и идентификация микроорганизмов-деструкторов этих полимеров. Среди деструкторов ПГА описаны представители бактерий разных родов: Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Rhodococcus, Rhodocyclus, Syntrophomonas, Ilyobacter, Terrabacter, Terracoccus, Brevibacillus, Agrobacterium, Duganella, Ralstonia, Gracilibacillus, Enterobacter, Matsuebacter, Rhodoferax, Variovorax и Acinetobacter, Azospirillum, Mycobacterium и Streptomyces и др. [29,54,40,13,6].
При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства - характерные особенности бактерий на плотных и жидких питательных средах. Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию. Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем, присущих отдельным группам бактерий, а так же включений. Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их клеточных стенок. Изучение физиолого-биохимических свойств включает установление способа питания и типа энергетического метаболизма исследуемых культур. Важно определить такие признаки, как отношение бактерий к молекулярному кислороду, температуре, pH среды, солености, освещенности и другим факторам среды. В данную группу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов [12, 9].
Наиболее активными деструкторами ПГА признаны грибы, включая Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, Zygomycetes, Mixomycetes, Penicillium, Fusarium [38,16,32]. Более высокий деградационный потенциал грибов связывают с большей подвижностью грибных ПГА-деполимераз по сравнению с ПГА-деполимерами, экскретируемыми бактериями [47].
Авторы более ранних работ показали, что в изучаемых условиях в почве преобладают деструкторы короткоцепочечных ПГА, тогда как численность микроорганизмов, расщепляющих среднецепочечные ПГА невелика, от 0,8 до 18 % от обнаруженных деструкторов [41,54].
Следует отметить, что при выявлении деструкторов ПГА анализируют среды (почва, компост, вода), в которых экспонировали образцы полимеров, и микроорганизмы, выделенные из пленок обрастания на поверхности полимеров, высевая их на стандартные микробиологические среды. При этом среди анализируемых микроорганизмов могут присутствовать организмы-комменсалы, утилизирующие мономеры и другие продукты разрушения высокомолекулярных ПГА, которые появляются в среде благодаря жизнедеятельности первичных и истинных ПГА-деструкторов. Для выделения истинных деструкторов ПГА необходимо использовать метод прозрачных зон, который предусматривает высев проб на минеральный агар, содержащий в качестве единственного источника углерода ПГА. Рост на такой среде микроорганизмов, обладающих ПГА-деполимеразной активностью, сопровождается образованием вокруг колоний на поверхности агаризованной среды характерных прозрачных зон как результат разрушения полимера [39].
Среди морских микроорганизмов-деструкторов ПГА идентифицированы бактерии Pseudoalteromonas sp. NRRL B-30083, Marinobacter sp, NK-1, Alcaligenes faecalis AE122, актиномицеты Nocardiopsis aegyptia, Streptomyces sp. SNG9; доказана их способность секретировать экзодеполимеразы и утилизировать гомогенный П3ГБ и сополимеры П3ГБ/3ГВ. [30, 32, 54, 56]
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде
Объектом исследования в настоящей работе были пресноводные тропические бактерии, обладающие способностью к биодеградации ПГА.
Материалом для исследования служили образцы полигидроксиалканоатов (ПГА) двух типов - гомополимера 3гидроксимасляной кислоты (П3ГБ) и сополимера 3-гидроксимасляной и 3гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ), имеющие близкие физико-химические свойства. Образцы помещали в чехлы из мелкоячеистого мельничного газа и погружали на глубину 0,3-0,5 м в искусственный водоем на климатической испытательной станции (г. Нячанг, Вьетнам) (Рисунок 1).
Рисунок 1 - Размещение чехлов с образцами полимеровМорская научно-исследовательская и испытательная станция (МНИИС)"Дам Бай" расположена на острове Че в заливе Дам Бай (12є 14' с. ш., 109є 11' в. д.). Удалённость от моря ? 50 м. Является береговой и надводной станцией и занимает по площади 2 га на суше и 1,7 га морской акватории.
Таблица 1 - Гидропараметры пресной воды в бассейне с биополимерами
|
Дата |
Температура |
Кислород |
pH |
Соленость |
|
|
06.12.2011 |
24,3 |
1,6 |
7,9 |
5 |
|
|
16.12.2011 |
24,1 |
1,9 |
7,4 |
5 |
|
|
13.01.2012 |
23,4 |
2,4 |
7,5 |
3 |
|
|
06.02.2012 |
24,7 |
0,9 |
7,0 |
3 |
Образцы экспонировали в воде в течение 1 года (январь 2011 - февраль 2012 г.) Для выявления микроорганизмов-деструкторов ПГА высевали соскоб с поверхности полимеров на специализированную питательную среду. Посев производили в трехкратной повторности с использованием разведений 10 - 105. Чашки с посевами выдерживали при температуре 28-30°С, анализ посевов проводили на 5-7 сутки культивирования.
2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве
Материалом для исследования являлась почва, взятая из прикорневой зоны лиственницы (Larix sibirica L.), в которую размещали полимерные пленки из гомополимера (П3ГБ) и сополимера поли-3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (П3ГБ/3ГГ.). Объектом исследований служила микрофлора, выделенная из этой почвы. Эксперимент проводился на территории дендрария Института леса СО РАН им В.Н. Сукачева.
Для изучения процессов биодеструкции ПГА в почве, образцы полимеров в виде пленочных дисков массой 60±6.5 мг (диаметр 30 мм, толщина 80±7 мкм) в нейлоновых сетчатых контейнерах, размещали в почве на глубине 5 см в прикорневой зоне лиственницы (Larix sibirica L.) (рисунок 2).
Рисунок 2 - Полимерные образцы 3ГГ и 3ГБ заложенные в почву
Эксперимент проведен в течение полевого сезона 2012 года в период с 23 мая по 4 ноября. Выявление микроорганизмов-деструкторов ПГА проводили в четыре этапа через 1 месяц экспонирования. Для этого из биопленки, сформированной на поверхности полимера, методом соскоба были взяты микробиологические пробы, которые высевали на специализированную питательную среду. В работе использовали разведения 105 - 108. Чашки с посевами выдерживали при температуре 30°С. Эксперименты проводили в 3-х кратной повторности.
2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария
Биодеградацию ПГА исследовали в реальных природных условиях, в почве дендрария Института леса СО РАН. Сотрудниками Института леса СО РАН исследованы основные характеристики почвы дендрария и показано, что эта почва характерна для дерново-карбонатного типа. Этот тип почвы сформирован на известняках и других карбонатных почвообразующих породах под хвойными, лиственно-хвойными и широколиственными лесами. Профиль почвы состоит из гумусового горизонта мощностью от 10-15 до 30-40 см и подстилающей его карбонатной породы, окрашен в тёмно-серый цвет. Характерные свойства почвы дендрария - слабощелочная или близкая к нейтральной реакция гумусового горизонта (7,08±0,08), невысокое содержанием гумуса - (2,55±0,13%), полная насыщенность поглощающего комплекса основаниями (Са и Mg), отсутствие дифференциации профиля по механическому составу, водопрочная зернистая и ореховато-зернистая структура, высокая биологическая и микробиологическая активность, значительные запасы питательных веществ (фосфора, калия и азота). Органическое вещество хорошо минерализовано (С: N < 20). В составе поглощающего комплекса преобладает кальций - 20,1±0,5 м-экв/100 г. Перечисленные свойства почвы наиболее устойчивы, вариабильность их по площади участка не значительна: 3,6% по рН, 8,7% - Ca, 15,6% - гумус. Сильно варьирует карбонатность верхнего 40-сантиметрового слоя - коэффициент вариации составляет 52%. Мобильным является и содержание подвижных элементов питания: фосфора и азота. Для почвы питомника характерно повышенное содержание фосфора (58±4,93 мг на кг почвы) и калия (319±8,07 мг на кг почвы) при низкой обеспеченности азотом. Определение нитратного и аммиачного азота в сухих образцах показало, что при невысоком их содержании заметно преобладают аммиачные формы. Количество N-NH4 одинаково в слоях 0-20 и 20-40 см, тогда как более высокое содержание нитратов приурочено к более гумусированному верхнему слою почвы.
2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны лиственницы
Для проведения анализа взяли почву из прикорневой зоны лиственницы, просушили ее, затем взвесили 10 г.
Поместили почву в колбу емкостью 100 мл, налили 40 мл дистиллированной воды и хорошо перемешали, после чего раствор профильтровали.
Отстоявшуюся жидкость осторожно слили в небольшую колбочку и измерили рН данного раствора. рH = 7.5, 7.3.
2.3 Определение способности бактерий к биодеградации
Определение биодеструктивной способности микромицетов изучали на среде следующего состава (г/л):
ПГБ - 5,0; NaNO3 - 2,0; KH2PO4 - 1,0; KCl, MgSO4Ч7H2O - 0,5; FeSO4Ч7H2O - 0,01; Пептон - 0,1; Дрожжевой экстракт "Difco" - 0,1; Агар - 20,0. Среда содержала в качестве источника углерода 0,25% порошкообразного полимера (ПГБ).
Рост микроорганизмов, обладающих ПГА-деполимеразной активностью, сопровождался образованием вокруг колоний на поверхности агаризованной среды характерных прозрачных зон (Рисунок 3).
Рисунок 3 - Рост бактерий на среде с ПГА; 1 - деполимеразная активность
2.4 Методы идентификации микроорганизмов
Изучение фенотипических признаков микроорганизмов-деструкторов проводили стандартными микробиологическими методами [12,14]. При идентификации бактериальных изолятов проводили сравнительный анализ их морфологических, культуральных, биохимических свойств. Определяли морфологию вегетативных клеток, спорообразование, подвижность, окраску по Граму, каталазную, оксидазную, амилазную, липазную, лецитиназную, левансахаразную и протеиназную активность, образование кислоты из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы и маннита, восстановление нитратов и потребность в факторах роста.
Принадлежность изучаемых культур к группе грамположительных или грамотрицательных бактерий определяли экспресс-методом Грезерсона. Клетки культур помещали бактериологической петлей в каплю 3% -го раствора КОН на предметное стекло, размешивали круговыми движениями и через 5-6 секунд петлю резко поднимали. Суспензия грамотрицательных бактерий становилась вязкой и тянулась за петлей, образуя тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределялись в капле щелочи. Реакцию считали отрицательной, если образование слизистых тяжей не наблюдалось в течение 60 секунд.
При изучении физико-химических свойств культур, определяли их способность продуцировать каталазу. С помощью бактериологической петли клетки культур перенесли на предметное стекло. Поместили одну каплю 3% раствора пероксида водорода на материал на предметном стекле. Положительная реакция проявлялась быстрым появлением пузырьков газа. При отрицательной реакции в течение 20 секунд выделение газа не происходило.
Для выявления амилолитической активности использовали среду следующего состава (г/л): пептон - 10.0; КН2РО4 - 5.0; растворимый крахмал - 2.0; агар - 15.0; рН среды 6,8 - 7.0. Среду стерилизовали при температуре 121 єС 30 минут и разлили в стерильные чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 7 суток, при температуре 30єС. Гидролиз крахмала обнаруживали после обработки агаровой поверхности раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливали 3-5 мл раствора Люголя, после чего среда окрашивалась в синий цвет, а зоны гидролиза крахмала приобретали красно-бурую окраску (Рисунок 4).
Рисунок 4 - Тест на амилазную активность
Так же изучали протеолитическую активность у микроорганизмов. Для этого культуры высевали на мясопептонную желатину (МПЖ). К 100 мл мясопептонного бульона (МПБ) добавили 15 г желатины, оставили на 15 минут, чтобы она набухла, затем нагрели на водяной бане до полного растворения желатины и разлили в пробирки по 10 мл. Стерилизовали при температуре 121 єС 15 минут. Посев проводили уколом. Продолжительность культивирования составило 10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины отмечали визуально.
Для выявления липазной и лецитиназной активности использовали желточно-солевую среду следующего состава: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 60-70 єС стерильного МПА (pH 7,2), содержащего 10 г NaCl, добавляли 10-20 мл желточной взвеси, перемешивали и разливали в чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 3 суток, при температуре 27 єС. Визуально отмечали при лецитиназной активности помутнение снизу колоний, а при липазной активности блестящий налет сверху колоний.
Оксидазную активность выделенных изолятов бактерий определяли с помощью тест-полосок окситест (MIKRO-LA-TEST) (Рисунок 5).
Рисунок 5 - Оксидазная активность: а - отрицательная; б - положительная.
Способность исследуемых культур ферментировать углеводы изучали на универсальных средах Гисса. В состав этих сред входят: панкреатический гидролизат кильки, индикатор и различные углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, манит). Среду готовили следующим образом - 15 грамм препарата размешивали в 1 литре дистиллированной воды, кипятили до полного растворения. Разлили в стерильные пробирки. Засев проводили уколом, культивировали в течение 3 дней. Визуально отмечали образование газа и кислоты (Рисунок 6).
Рисунок 6 - Рост бактерий на средах Гисса
Потребность в факторах роста бактерий изучали на среде Фратера (г/л): (NH4) 2SO4 - 1.0; MgSO4?7H2O - 0.25; водопроводная вода, K2HPO4 - 0.1; глюкоза - 10.0; pH= 6.0-7.0. Среду разлить в пробирки по 5мл. Охарактеризовать рост: слабый, умеренный, обильный. Охарактеризовать пленку на поверхности пробирки, встряхнуть и через неделю опять посмотреть пленку, так как после посева с богатой среды идет адаптация к новым условиям.
Для образования левансахаразы изучается на среде с сахарозой и мелом. В состав среды входят дрожжевая вода, сахароза - 5%, агар - 2%, CaCO3 - 1%, pH = 6.8-7.0. Стерилизовать при 0.5 атм. Посев осуществляется штрихом на чашки Петри. Образующийся леван представляет собой сиропрастекающуюся массу.
Для восстановление нитратов используют среду Абдельмалека (%): МПБ, глюкоза - 1.0, агар - 0.3, KNO3 - 1.0, pH = 7.0. Растворить МПБ, глюкозу и KNO3, довести pH до 7.0 и внести агар. Все это расплавить и разлить в пробирки по 10-12 мл. Засев проводят уколом, после чего заливают голодным агаром. Посев описывают через 5-6 дней или даже позже. Отмечают наличие роста по уколу и наличие полостей между средой и столбиком голодного агара.
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы
Микробиологический анализ показал, что в контрольной почве количество бактерий на момент отбора образцов в июне и ноябре было значительно выше, чем в июле и октябре, что объясняется погодными условиями - лето было аномально жарким и сухим. Однако на поверхности полимерных пленок общая численность гетеротрофных бактерий варьировала незначительно (рисунок 7, приложение В).
Рисунок 7 - Общее количество почвенных бактерий (РПА)
По данным литературы полимер является субстратом для микроорганизмов, на нем формируются пленки обрастания, что приводит к увеличению численности микроорганизмов в пленках по сравнению с нативной почвой [3]. В наших исследованиях количество почвенных гетеротрофных бактерий в контрольной почве было выше, чем на поверхности образцов полимеров, или достоверно не отличалась. Однако, количество бактерий-деструкторов, растущих на питательной среде с полимером, к концу эксперимента (ноябрь) было достоверно выше, чем в контрольной почве (рисунок 8).
Рисунок 8 - Общее количество бактерий-деструкторов начальной и конечной точке экспозиции (среда с полимером)
В июне в образцах контрольной почвы и на поверхности полимеров количество бактерий-деструкторов составляло от 1,05 до 4,5Ч108 КОЕ в 1 г, тогда как в ноябре популяция деструкторов увеличилась на поверхности пленок в 5-20 раз по сравнению с исходной. Это связано с тем, что требуется время для индукции синтеза ферментов, гидролизующих ПГА, и развития микроорганизмов-деструкторов.
Из анализируемых групп микроорганизмов были выделены доминирующие бактерии, способные к гидролизу полимера. В результате скрининга было проверено более 33 изолятов бактерий из прикорневой зоны лиственницы и 13 изолятов актиномицетов. Из них 13 изолятов бактерий и 3 изолята актиномицетов, обладали гидролитической активностью по отношению к полимеру (образование прозрачных зон). Видовое разнообразие существенно различалось: количество штаммов-деструкторов в почве с полимером значительно превышало количество штаммов-деструкторов в контрольной почве.
В целом, по совокупности культуральных, морфологических и физиолого-биохимических признаков бактерии-биодеструкторы были отнесены к следующим родам: Nocardioides, Bacillus, Micrococcus, Acinetobacter, Rhizobium, Pseudomonas.
Изучение таксономического состава микрофлоры контрольных образцов почвы показало, что среди бактерий-деструкторов преобладали грамположительные спорообразующие бактерии рода Bacillus, составляющие около 60% идентифицированных видов. Кроме того, были выделены грамотрицательные бактерии Acinetobacter (20%) и Rhizobium (20%) (рисунок 9).
Рисунок 9 - Процентное соотношение бактерий-деструкторов в контрольной почве
В составе микробоценоза, сформировавшегося вокруг полимерных пленок в условиях прикорневой зоны лиственницы, также преобладали представители рода Bacillus (54,5%), на втором месте по численности - Nocardioides (27,3%). В небольшом количестве были представлены следующие бактерии: Micrococcus, Pseudomonas (9.1%) (рисунок 10).
Рисунок 10 - Процентное соотношение бактерий-деструкторов вокруг полимерных пленок
Род Nocardioides. Представители рода образуют плеоморфные элементы и разветвленный вегетативный мицелий. Вегетативный мицелий представлен обильно ветвящимися гифами, растущими на поверхности и проникающими внутрь агаризованной среды; гифы распадаются на фрагменты, которые могут быть неправильной, палочковидной или кокковидной формы.
Воздушный мицелий, если образуется, состоит из неправильных, редко и неправильно ветвящихся или неразветвленных гиф, которые распадаются на палочковидные фрагменты, от коротких до удлиненных. Фрагменты как первичного, так и воздушного мицелия дают новый мицелий.
Встречаются штаммы с подвижными и штаммы с неподвижными клетками. Обнаружены по всему земному шару в почвах, а также в травяном покрове (рисунок 11).
Рисунок 11 - Морфология бактерий рода Nocardioides
Род Bacillus. Этот род представлен грамположительными прямыми палочками, 0,5-2,5Ч1,2-10 мкм, с закругленными концами, часто в парах или цепочках. Подвижные за счет перитрихальных жгутиков. Эндоспоры овальные, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным воздействиям и образуется не боле одной споры в клетке. Аэробы и факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Обычно каталазоположительные. Обнаружены в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных (рисунок 12).
Рисунок 12 - Морфология бактерий рода Bacillus
Род Micrococcus. Представители рода грамположительные клетки сферической формы 0,5-2 мкм, в парах или тетрадах, но не в цепочках. Редко подвижные, неспорообразующие. Облигатные аэробы, хемоорганотрофы. Колонии обычно желтые или красные, растут на простых средах. Каталазоположительные и мало оксидазоположительные. Встречаются на коже млекопитающих и в почве, однако выделены в основном из пещевых продуктов и из воздуха (рисунок 13).
Рисунок 13 - Морфология бактерий рода Micrococcus
Род Acinetobacter. Бактерии рода грамотрицательные палочки диаметром 0,9-1,6 мкм и длинной 1,5-2,5 мкм в стационарной фазе роста становятся сферическими. Обычно в парах и цепочках, спор не образуют. Движение рывками, предположительно обусловленное наличием полярных фимбрий. Аэробы. Оксидазоотрицательные и каталазоположительные. Встречаются в почве, воде и сточных водах (рисунок 14).
Рисунок 14 - Морфология бактерий рода Acinetobacter
Род Rhizobium. Род представлен грамотрицательными палочками, 0,5-0,9Ч1,2-3,0 мкм. Для неблагоприятных для роста условиях обычно плеоморфные, содержащие гранулы поли-в-гидроксибутирата. Подвижные за счет единственного полярного или субполярного жгутика либо перитрихальных жгутиков. Аэробы и хемоорганотрофы. Колонии округлые, выпуклые, полупрозрачные, приподнятые, слизистые. Характерная особенность этих организмов - способность проникать в корневые волоски бобовых тропического пояса и вызывать образование корневых клубеньков, в которых бактерии присутствуют как симбионты (рисунок 15).
Рисунок 15 - Морфология бактерий рода Rhizobium
Род Pseudomonas. Представлен грамотрицательными прямыми или слегка изогнутыми палочками, 0,5-1,0Ч1,5-5,0 мкм. У многих видов накапливается в качестве запасного источника углерода поли-в-гидроксибутират, который виден как включения после окраски суданом. Подвижны за счет одного или нескольких полярных жгутиков; в отдельных случаях неподвижны. Аэробы, хемоорганотрофы. Большинство видов в органических факторах роста не нуждается. Оксидазоположительные или - отрицательные и каталазоположительные. Широко распространены в природе. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений (рисунок 16).
Рисунок 16 - Морфология бактерий рода Pseudomonas
Как показали комплексные исследования, проводимые сотрудниками Института биофизики СО РАН, разрушение полимеров обоих типов в почве под лиственницей в 2013 г. происходило очень медленно из-за недостатка влаги в почве (Приложение Б).
3.2 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксивалерата в пресной воде
Из анализируемых групп микроорганизмов были выделены доминирующие бактерии, способные к гидролизу полимера. Из пленочных образцов было выделено в чистые культуры 15 изолятов бактерий и актиномицетов, обладающих гидролитической активностью в отношении полимера. На основании сходных морфотипов были отобраны 14 штаммов, способных к биодеструкции ПГА, из них 7 штаммов бактерий и 7 штаммов актиномицетов, которые в последующем были идентифицированы по совокупности морфологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических признаков (Приложение А).
Изучение микробиоценоза образцов пресной воды показало, что среди микроорганизмов-деструкторов преобладали грамположительные бактерии: спорообразующие бактерии рода Bacillus, составляющие около 28,6% идентифицированных видов, а также были выделены актиномицеты из родов Streptomyces (28,6%) и Actinomyces (21,4%). Кроме того, были выделены грамотрицательные бактерии Pseudomonas sp (7,14%), Alcaligenes sp (7,14%) и Comamonas sp (7,14%) (рисунок 17).
Рисунок 17 - Процентное соотношение бактерий-деструкторов
Культуры штаммов БП/2, Б-17, Б-17 (б) и Б-19 на агаризованной среде формировали гладкие матовые колонии. Отличались способностью к образованию эндоспор. В нативных препаратах были представлены прямые палочки, подвижные. Грамположительные. Бактерии штаммов БП/2, Б-17, Б-17 (б) и Б-19 проявляли сходство и по другим признакам: каталазо - и оксидазоположительные, активно продуцировали протеазу. Амилазу не продуцируют. Проявляют липазную и лецитиназную активность. Глюкозу, мальтозу и сахарозу ферментировали с образованием кислоты. По совокупности признаков штаммы БП/2, Б-17, Б-17 (б) и Б-19 были отнесены к роду Bacillus (рисунок 18).
Рисунок 18 - Морфология бактерий рода Bacillus
Бактерии штамма БП/6 в нативных препаратах представляли собой прямые палочки. Подвижные, грамотрицательные. Неспорообразующие. Каталазоположительные и оксидазоположительные. Обладали амилолитической и протеолитической активностью. Липазную и лецитиназную активность не проявляют. Аэробные микроорганизмы. Ферментировали с образованием кислоты глюкозу и сахарозу. По совокупности признаков бактерии штамма БП/6 были отнесены к роду Pseudomonas sp. (рисунок 19).
Рисунок 19 - Морфология бактерий рода Pseudomonas sp.
На агаризованной среде бактерии штамма ГВ-10б формировали белые, блестящие колонии. Грамотрицательные кокки. Не образуют спор, не подвижны. Каталазоположительные и оксидазоположительные. Обладали амилолитической и липазной активностью. Протеазу и лецитиназу не продуцируют. Аэробы. Кислоту на средах Гисса не образовывают. По совокупности признаков бактерии штамма ГВ-10б были отнесены к роду Alcaligenes sp. (рисунок 20).
Рисунок 20 - Морфология бактерий рода Alcaligenes sp.
Бактерии штамма Б-18 формировали на РПА белые, блестящие колонии. Клетки в мазках были представлены как грамотрицательные, подвижные, бесспоровые палочки. Каталазоположительные и оксидазоположительные. Обладают амилолитической и протеолитической активностью. Липазной и лецитиназной активность не обладают. Лактозу слабо ферментатировали с образованием кислоты; глюкозу, мальтозу, сахарозу и манит, не усваивали. По совокупности признаков штамм Б-18 был отнесен к роду Comamonas sp. (рисунок 21).
Рисунок 21 - Морфология бактерий рода Comamonas sp.
Культуры штаммов БП/2 (А), БП/1 (А), БП/5 (А) и ГВ-9а формировали субстратный и воздушный мицелий и спирально изогнутые спорангии, образующие цепочки спор. Споры неподвижные. Колонии обособленные и лишайникоподобные, маслянистые. Образуют желтый и белый пигменты. Грамположительные. Аэробы. Каталазоположительные. По совокупности признаков штаммы БП/2 (А), БП/1 (А), БП/5 (А) и ГВ-9а были отнесены к роду Streptomyces (рисунок 22).
Рисунок 22 - Морфология актиномицетов рода Streptomyces.
Заключение
1. Определена общая численность почвенных бактерий в прикорневой зоне лиственницы, а также в почве с поверхности полимерных пленок. Показано, что в опытных образцах количество бактерий-деструкторов полигидроксиалканоатов увеличивалось к концу вегетационного периода в 5-20 раз, тогда как в контроле - лишь в 1,4 раза.
2. Из 16 изолятов почвенных бактерий, обладающих гидролитической активностью в отношении ПГА, идентифицированы представители родов Bacillus, Nocardioides, Micrococcus, Acinetobacter, Rhizobium и Pseudomonas.
3. Из 14 изолятов тропических пресноводных бактерий, обладающих гидролитической активностью в отношении ПГА, идентифицированы представители родов Bacillus, Alcaligenes, Comamonas, Streptomyces и Pseudomonas.
4. Среди микроорганизмов деструкторов преобладали представители рода Bacillus, доля которых составляла от 28,6 до 60 % от всех выделенных штаммов.
Список используемых источников
1. Волова Т.Г. Биотехнология. - Изд. 2-е, перераб. - Красноярск, 2002.
2. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты (ПГА) - биоразрушаемые полимеры для медицины. - Новосибирск: СО РАН, 2003. - 330с.
3. Волова Т.Г., Беляева О.Г., Калачева Г.С. Исследование разрушаемости микробных полимеров // Сибирский экологический журнал - 1997, № 5 - С.505-510.
4. Волова Т.Г., Калачева Г.С. Полиоксибутират - термопластичный биодеградируемый полимер (получение, свойства, применение). - Красноярск, 1990. - 47 с.
5. Волова Т.Г., Луковенко С.Г., Васильев А.Д. Получение и исследование физико-химических свойств микробных полиоксиалканоатов // Биотехнология - 1994. - С. 19-22.
6. Волова Т.Г., Бояндин А.Н., Васильев А.Д. [и др.]. Биодеградация поли-гидроксиалконатов (ПГА) в Восточном море и идентификация ПГА-деградирующих бактерий // Микробиология. - 2011. - Т.80,№2. - С.266-274.
7. Гоготов И.Н. Биоразлагаемые полимеры: свойства, практическое использование, утилизация // Экология и промышленность России. 2007, октябрь. С.16-19.
8. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: изд-во МГУ, 1990.303 с.
9. Мокеева В.Л., Чекунова Л.Н., Мышкина В.Л. [и др.] Биодеструкция поли-в-гидроксибутирата микроскопическими грибами: испытание грибостойкости и фунгицидных свойств полимера // Микология и фитопатология. - 2002. - Т.36, вып.5. - С.59-63.
10. Pandey J.K., Reddy K.R., Kumar A.P., Singh R.P. An overview on the degradability of polymer nanocomposites. // Polymer Degradation and Stability. - 2005. - V.88. - P.234-250.
11. Bahri Z., Taverdet J.L. Elaboration and characterization of microparticles loaded by pesticide model // Powder Technology. - 2006. - Vol.172. - P.31-41.
12. Kasuya K.I. [et al.] Biochemical and molecular characterization of the polyhydroxybutyrate depolyme-rase of Comamonas acidovorans YM1609, isolated from freshwater //. Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol.63, No.12. - P.4844-4852.
13. Bonartsev A.P., Zaikov G.E., Krylova L.P [et al.]. Biodegradation and medical application of microbial poly (3-hydroxybutyrate) // Biotechnology, Biodegradation Water and Foodstuffs. - Nova Science Publishers, Inc., 2009. - P.1-35.
14. Braunegg, G., Lefebvre G., Genzer K. F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (Rewiew article). - of Biotechnol, 1998. - N 65. - P.127-161.
15. Brandl, H.J., Knee E. Ability of phototrophic bacterium Rhodospirillum rubrum to produce various poly (B-hydroxyalkanoates) potencial sources for biodegradable polyesters. - Int. J. Biol. Macromol. - Vol 11. - Feb. - 1989. - P.49-56.
16. Brucato C., Wong S. Extracellular poly (3 - hydroxybutyrate) from Penicillum funiculosum: general charac-teristics and active // Arch. Biochem. Byophys. - 1991. - Vol.290. - P.497-502.
17. Chen G. - Q., Wua Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials // Biomaterials. - 2005.
18. Chen G.Q., Steinbuche Chen A. Plastics Completely Synthesized by Bacteria: Polyhydroxyalkanoates in Plastics from Bacteria-Natural Functions and Applications // New York. - 2010. - P.17-37.
19. Cheng M. - L. Change of structure and free volume properties of semi-crystalline poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) during thermal treatments by positron annihilation lifetime // Polymer. - 2009.
20. Damalas C.A., Eleftherohorinos I.G., Environ J. Pesticide Exposure, Safety Issues, and Risk Assessment Indicators // Int. Res. Public Health. - 2011. - Vol.8. - P.1402-1419.
21. Dawes, E.A. Novel biodegradable microbial polymers. Kluwer Academic, Dordrecht. - Netherlands, P. 1990. - 287.
22. Delafield, F.P., Doudoroff M., Palleroni N.J. Decomposition of poly-B-Hydroxybutyrate by Pseudomonas. - J. of Bacteriology, Vol.90, 1965 (5). - P.1455-1466.
23. Jendrossek D., Schimer A., Schlegel H. Biodegradation of polyhydroxyalkanoik acid. - Appl Microbiol Biotechnol, 1990. - p.451 - 463.
24. Do Young Kim, Hyung Woo Kim, Moon Gyu Chung, Young Ha Rhee. Biosynthesis, modification and biodegradation of bacterial medium-chain-length polyhydroxyalkanoates // The Journal of Microbiology. - 2007. - Vol.4, No.2. - P.87-97.
25. Fuller Clinton, R. Microbial inclusions with special reference to PHA inclusions and intracellular boundary envelpes // In. J. Biological Macromol. - 1999. - Vol.25. - P.21-29.
Подобные документы
Значение и функции воды. Водные ресурсы суши, их распределение на планете. Водообеспечение стран мира, решение данной проблемы, структура водопотребления. Минеральные, энергетические, биологические ресурсы Мирового океана. Причины недостатка пресной воды.
реферат [23,3 K], добавлен 25.08.2010Экологические проблемы в химии и технологии полимерных материалов. Классификация полимерных отходов. Методы утилизации и обезвреживания полимерных материалов. Основные принципы разработки безотходных технологий. Очистка сточных вод и газовых выбросов.
реферат [29,2 K], добавлен 19.11.2012Источники загрязнения внутренних водоемов. Методы очистки сточных вод. Электрохимическая активация как экологически чистые технологии настоящего и будущего, некоторые области ее эффективного применения. Технологический процесс очистки воды "Изумруд".
контрольная работа [36,1 K], добавлен 28.01.2012Мировые запасы пресной воды, темпы и причины их уменьшения. Источники загрязнения природной воды. Существующие в данной области и проблемы, направления и перспективы их преодоления. Перспективы применение подземных вод как основной источник пресной воды.
контрольная работа [38,4 K], добавлен 23.04.2015Оценка проблемы утилизации мусора в Казани. Анализ достоинств и недостатков существующих способов утилизации и переработки отходов. Способы утилизации твердых бытовых отходов в европейских странах и в России. Массовое сознание и пути решения проблемы.
контрольная работа [38,1 K], добавлен 21.11.2011Природопользование в историческом аспекте, изменение природных ландшафтов под влиянием деятельности человека. Проблема дефицита пресной воды, мировые водные ресурсы, доступные запасы пресной воды в мире. Современное состояние биологического разнообразия.
контрольная работа [890,9 K], добавлен 26.07.2010Характеристика и история возникновения основных проблем экологии. Пути решения задач по утилизации отходов. Потери лесных массивов, их гибель и вырубка, процессы опустынивания и эрозии. Особенности и причины загрязнения водоемов, атмосферы и почвы.
презентация [3,8 M], добавлен 27.02.2012Структура и свойства почвы. Почвенные округа Беларуси. Зоны Гофмана и качество водоносных горизонтов. Роль почвы и воды в возникновении эндемичных инфекционных и паразитарных заболеваний. Гигиенические требования к хозяйственно-питьевому водоснабжению.
реферат [27,6 K], добавлен 27.08.2011Актуальность проблемы утилизации бытовых отходов. Определение, разновидности, норма накопления бытовых отходов. Принципы комплексного управления отходами (КУО). Системы сбора и промежуточного хранения отходов. Виды переработки и утилизации мусора.
курсовая работа [62,7 K], добавлен 21.11.2009Источники искусственных аэрозольных загрязнений воздуха: ТЭС, фабрики, заводы. Глобальные проблемы: разрушение природной среды, загрязнение атмосферы, почвы, воды. Актуальные проблемы озонового слоя и кислотных осадков. Решение экологических проблем.
презентация [1013,3 K], добавлен 25.09.2011
