Трансформация люизита в объектах окружающей среды

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство обороны Российской Федерации

Военная академия войск радиационной, химической и

биологической защиты и инженерных войск

Кафедра № 5

Дипломная работа

ТРАНСФОРМАЦИЯ ЛЮИЗИТА В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Исполнитель курсант Лапшинский Денис Валерьевич

Руководитель (и) к.х.н. старший преподаватель

подполковник___________КолесниковП.Н.

Кострома 2010

Список сокращений и условных обозначений

БАЛ Британский антилюизит

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

ИУК Инд о лил-3-уксусная кислота

0В Отравляющее вещество

ОС Окружающая среда

ПВКЛ Поли-М-винилкапролактам

ПДК Предельно-допустимая концентрация

Трп Триптофан

LD5o Среднесмертельная токсодоза

OD Оптическая плотность

Содержание

реакция люизит почва окружающая среда

Введение

1. Литературный обзор

2. Обсуждение результатов

2.1 Изучение трансформации люизита и 2-хлорвиниларсиноксида в реакциях с химическими соединениями, моделирующими активные компоненты окружающей среды

2.2 Оценка воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост семян подсолнечника и пшеницы

2.3 Оценка воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост культуры Azospirillum brasilense Sp 245 и бактериальную продукцию индолил-3-уксусной кислоты

3. Экспериметально-методическая часть

3.1 Синтез 2-хлорвиниларсиноксида

3.2 Физико-химический анализ продуктов реакции 2-хлорвиниларсиноксида с химическими соединениями, моделирующими активные компоненты окружающей среды

3.3 Методика проращивания семян подсолнечника и пшеницы в присутствии 2-хлорвиниларсиноксида

3.4 Методика культивирования бактерии Azospirillum

brasilense Sp 245 в присутствии 2-хлорвиниларсиноксида

Выводы

Литература

Приложение 1

Приложение 2

Приложение 3

Введение

Для организации и проведения мониторинга состояния окружающей среды в районах хранения и уничтожения химического оружия, а также для прогнозирования развития возможных критических экотоксикологических ситуаций чрезвычайно важное значение имеет информация о путях и механизмах миграции и трансформации отравляющих веществ (ОВ) в природных средах, основных продуктах трансформации, о длительности их сохранения в объектах окружающей среды и о других характеристиках поведения ОВ.

Такие сведения в научной литературе весьма ограничены и относятся лишь к исходным табельным ОВ, в частности, люизиту [1,2]. Данные о поведении токсичных продуктов трансформации люизита практически полностью отсутствуют. Между тем, исходя из физико-химических свойств люизита, следует ожидать, что в природных средах могут образовываться продукты трансформации, по токсичности не уступающие исходному ОВ.

В условиях комплексного воздействия на люизит факторов окружающей среды необходимо, на наш взгляд, проведение анализа имеющейся информации, связанной с его поведением в воде и почве.

Почвы являются основной депонирующей средой, куда загрязнители поступают с выпадениями из атмосферы, лиственным спадом, отмершими частями растений и т.д. Состояние почв - интегральный индикатор многолетнего процесса загрязнения всей окружающей среды, дающий представление о качестве жизнеобеспечивающих сред - атмосферного воздуха и вод. Кроме того, загрязненные почвы сами являются источником вторичного загрязнения приземного слоя воздуха, поверхностных и грунтовых вод. Таким образом, почвы представляют тройной интерес, как начальное звено пищевой цепи, как источник вторичного загрязнения атмосферы и как интегральный показатель экологического состояния окружающей среды.

Бактерии осуществляют детоксикацию токсичных химикатов, а растение и его корневая система являются депо для микроорганизмов. Корневые выделения растений поддерживают высокую активность микрофлоры. Органические вещества корневых выделений растений обеспечивают микроорганизмы питанием и энергией. Кроме того, корни вносят вклад в создание окислительного и водного потенциалов, необходимых для существования почвенных микроорганизмов и осуществления ими процесса ремедиации. В свою очередь ризосферные микроорганизмы, продуцируя различные биологически активные вещества, в том числе фитогормоны, способствуют увеличению поглощающей поверхности корней и, следовательно, усиливают способность растений поглощать загрязнители.

Среднее содержание мышьяка для незагрязненных почв принято 2 мг/кг [3]. Почвы с естественным содержанием мышьяка не представляют опасности для здоровья человека. Предельно-допустимая концентрация люизита и ипритно-люизитных смесей в почве составляет 0,1 и 0,01 мг/кг соответственно. Почвы, содержащие значительное количество мышьяка, например, в результате возможных аварий или аварийных ситуаций на объектах по хранению и уничтожению химического оружия, представляют угрозу для населения и окружающей среды. Поэтому вопросы их фитобиотоксичности и опасности для здоровья человека выступают на первый план.

Специфическая особенность почвы по сравнению с другими объектами (вода, воздух) состоит в сложности оценки степени загрязнения ее токсичными веществами. Общее содержание загрязняющих веществ в почве служит необходимым, но недостаточным показателем загрязнения. Увеличение общего содержания элемента в почве может и не приводить к негативному воздействию его на экосистему и ее компоненты. Только увеличение содержания в почве подвижных соединений элемента создает возможность его перехода в сопряженные с почвой среды (растения, природные воды и т.д.) и тем самым таит реальную угрозу для организмов.

Представляет значительный интерес оценка воздействия продуктов трансформации люизита на растения и ризосферные микроорганизмы. В качестве объекта исследования выбран 2-хлорвиниларсиноксид - продукт гидролиза люизита в объектах окружающей среды.

Целью работы являлось изучение поведения люизита и продуктов его трансформации в объектах окружающей среды, оценка воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост семян подсолнечника и пшеницы, а также культуры Azospirillum brasilense Sp 245 и бактериальную продукцию индолил-3-уксусной кислоты.

Для достижения поставленной цели необходимо решение следующих задач:

изучение реакций люизита и 2-хлорвиниларсиноксида с химическими соединениями, моделирующими активные компоненты почв (вода, полифункциональные соединения);

оценка воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост семян подсолнечника и пшеницы, а также ризосферных микроорганизмов Azospirillum brasilense Sp 245.

1. Литературный обзор

Чистый 2-хлорвинилдихлорарсин представляет собой бесцветную жидкость, почти не имеющую запаха. Со временем он приобретает фиолетовую или темно-красную окраску. Технический продукт не является индивидуальным веществом и помимо 2-хлорвинилдихлорарсина (а-люизита) содержит бис-(2-хлорвинил)-хлорарсин (|3-люизит) и треххлористый мышьяк. В свою очередь, а-люизит существует в форме двух пространственных изомеров, различающихся физическими свойствами (табл.1):

Таблица 1 Физические свойства изомеров а -люизита

Константа	Цис-изомер	Транс-изомер
р20, г/см3	1,8598	1,8793
tK,°c	169,8	196,6
Р25нас ,' ММ рт. СТ.	1,562	0,4
С „ас ' МГ/Л	2,3	4,5
t ° С1ПЛ 1 v-/	Минус 44,7	Минус 2,4

Наиболее токсичным в смеси является транс- а -люизит, который в основном и образуется при получении 0В. Цис-изомер возникает при нагревании или ультрафиолетовом облучении транс-изомера, поэтому большинство физических констант технического люизита совпадают или близки по значению соответствующим константам транс- а -люизита [4].

Технический люизит представляет собой темно-бурую маслянистую жидкость со своеобразным запахом, напоминающим запах листьев герани. Плотность его 1,88 г/см3 при температуре 20° С; плотность пара по воздуху 7,2; растворимость в воде при температуре 20° С около 0,05%; хорошо растворим в органических растворителях, жирах, маслах. Он смешивается со многими 0В и сам растворяет их, поэтому может использоваться в качестве компонента тактических смесей. В различные материалы люизит проникает быстрее иприта.

Температура кипения около 190° С (с разложением). Давление насыщенного пара при температуре 20° С 0,39 мм рт. ст., максимальная концентрация пара в воздухе 4,41 мг/л. Температура замерзания определяется степенью очистки и составляет от минус 10 до минус 15° С.

Технический люизит представляет собой смесь мышьякорганических соединений (а-, (3- и у-люизиты) и трихлорида мышьяка. Содержание а-люизита (2-хлорвинилдихлорарсин) составляет 65% (цис-изомер - 10%, наиболее токсичный транс-изомер - 90%). Содержание (3-люизита [бис-(2-хлорвинил)хлорарсин] - 7-10%, у-люизита [трис-(2-хлорвинил)арсин] - 4-12%. Наиболее токсичен а-люизит, (3-люизит значительно менее токсичен, а у-люизит не является ОВ. В техническом продукте присутствуют все три формы люизита. Технический люизит представляет собой темно-бурую жидкость с резким и неприятным запахом листьев герани. При хранении люизита необходимо иметь в виду, что образование р- и у-люизита из а-люизита катализируется хлорным железом, которое, в свою очередь, образуется в результате хлорирования железной поверхности оболочек хлористым водородом, являющимся продуктом гидролиза люизита. Со следами влаги в процессе хранения люизит реагирует с образованием малорастворимого и токсичного 2-хлорвиниларсиноксида, дальнейшее окисление которого приводит к образованию 2-хлорвиниларсоновой кислоты, не обладающей кожно-нарывным действием. Треххлористый мышьяк в процессе хранения может гидролизоваться с образованием мышьяковистого ангидрида и хлористого водорода.

Основной компонент технического люизита - а-люизит. Он является дихлорангидридом ненасыщенной 2-хлорвиниларсонистой кислоты, т.е. содержит подвижные ангидридные атомы хлора, трехвалентный мышьяк, достаточно непрочную мышьяк-углеродную связь и кратную связь С=С. Такое строение обусловливает сравнительно высокую реакционную способность а-люизита, который склонен к разнообразным химическим превращениям. Одна группа его химических реакций обусловлена замещением атомов хлора, связанных с мышьяком, на другие остатки, другая группа связана с окислением мышьяка, третья - затрагивает мышьяк-углеродную связь. Встречаются, кроме того, химические превращения, обусловленные специфическим строением а -люизита.

Люизит легко гидролизуется уже во влажном воздухе [2], образуя на первой стадии 2-хлорвиниларсонистую кислоту ClCH=CHAs(OH)2, на второй стадии - 2-хлорвиниларсиноксид ClCH=CHAs=O.

ClCH=CHAsCl2 + Н2О -* ClCH=CHAs(OH)2 + 2HC1 ClCH=CHAs(OH)2=> H2O + ClCH=CHAs=O + (ClCH=CHAs=O)n

Гидролизованный люизит обнаруживает высокую токсичность, близкую к исходному продукту.

В большинстве обзоров реакция гидролиза люизита дана как обратимая. Однако равновесие между люизитом, 2-хлорвиниларсонистой кислотой и 2-хлорвиниларсиноксидом не истинное, т.к. в растворе не остается люизита. Образование оксида люизита и его полимера -особенность реакции дегидратации [2].

Образующийся оксид представляет собой твердое, мало растворимое в воде вещество, по токсичности не уступающее люизиту (LD5o, мышь, subcutaneous, 5 мг/кг) [2].

Постоянная Генри для а-люизита составляет 3,2 * 10~4 атм»м3/моль. Это означает, что люизит может улетучиваться из воды. Однако большая скорость гидролиза люизита [1] приводит к его трансформации. 2-Хлорвиниларсонистая кислота - это водорастворимое соединение. Данные о поведении или стойкости в объектах окружающей среды этого соединения отсутствуют. 2-Хлорвиниларсиноксид мало растворим в воде. Сведения о его стабильности в водных растворах приведены в [1]. Для оценки стабильности 2-хлорвиниларсиноксида в воде была исследована зависимость скорости разложения этого вещества в водных растворах от рН. Анализ полученных данных показывает, что 2-хлорвиниларсиноксид в водных растворах достаточно стабилен, причем его стойкость выше в кислых средах (при рН=4,4 Т5о=53 суток). Напротив, в нейтральной (рН=6,4) и слабощелочной (рН=9,4) средах, какими являются большинство поверхностных вод, скорость разложения этого вещества примерно в два раза выше (Т5о=21-25 суток), чем в кислых. Разложение 2-хлорвиниларсиноксида в природных водах, по-видимому, происходит не только за счет гидролиза, но и за счет окисления до 2-хлорвиниларсоновой кислоты, не обладающей кожно-нарывным действием. Возможна дальнейшая трансформация в неорганический мышьяк, т.е. образование арсенитов и арсенатов. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что в водных растворах продукт трансформации 2-хлорвинилдихлорарсина - 2-хлорвиниларсиноксид может сохраняться значительно дольше, чем исходное соединение, и приводить к длительному загрязнению природных сред.

В случае попадания больших количеств люизита в воду он оседает на дно, мгновенно покрываясь слоем арсиноксида, который препятствует дальнейшему растворению и гидролизу люизита [1].

Взаимодействие люизита с основаниями и щелочами зависит как от их силы и концентрации, так и от строения 0В. Слабые основания только нейтрализуют выделяющийся хлористый водород и, смещая равновесие процесса вправо, ускоряют гидролиз. Достаточно применить разбавленный водный раствор аммиака, чтобы полностью превратить люизит в оксид 2-хлорвиниларсина. Водные 18-20% растворы щелочей полностью разлагают люизит. При этом транс-изомер а-люизита при комнатной температуре разлагается с выделением ацетилена:

ClCH=CHAsCl2 + 6 NaOH ----»> СН=СН + Na3AsO3 + 3 NaCl + 3 Н2О

Цис-изомер а-люизита реагирует несколько иначе. При действии разбавленных растворов щелочей он превращается в соль, при действии концентрированных растворов щелочей быстро разрушается с выделением хлористого винила:

ClCH=CHAsCl2 + 4 NaOH ----+ ClCH=CHAs(ONa)2 + 2 NaCl + 2 Н2О ClCH=CHAsCl2 + 5 NaOH ---- C1CH=CH2 + Na3AsO3 + 2 NaCl + 2 H2O

При температуре выше 40° С концентрированные щелочи разрушают цис- а -люизит, подобно транс-изомеру, с выделением ацетилена. (3-Люизит разлагается щелочами только при нагревании.

Легкость гидролиза ограничивает возможность применения люизита в сырую погоду, снижает его стойкость и явилась одной из причин отказа от него как от индивидуального отравляющего вещества. Реакции люизита с растворами щелочей применимы для целей его дегазации и индикации.

В водной и водно-спиртовой среде люизит легко взаимодействует с сероводородом с образованием твердого малорастворимого 2-хлорвиниларсинсульфида, обладающего раздражающим действием [4]:

ClCH=CHAsCl2 + H2S ----> ClCH=CHAs=S + 2 НС1

Аналогично реагируют с ним меркаптаны:

С1СН=СНАзС12 + 2HSR ----+ ClCH=CHAs(SR)2 + 2 НС1

Особенно легко происходят эти реакции в случае тиолов с двумя близко расположенными меркаптогруппами, так как при этом образуются устойчивые пяти- или шестичленные гетероциклы, например:



Последние реакции используются при количественном определении продуктов гидролиза люизита - 2-хлорвиниларсонистой кислоты и 2-хлорвиниларсиноксида [5,6], которые с алкандитиолами образуют дитиоарсоланы либо дитиоарсаны - пяти- и шестичленные гетероциклические соединения.

Люизит очень легко окисляется любыми окислителями (йодом, перекисью водорода, гипохлоритами, хлораминами, азотной кислотой, перманганатами, хроматами) с образованием (3-хлорвиниларсоновой кислоты, не обладающей кожно-нарывным действием:

С1СН - CHAsCl2 + [О ] + 2Н2О ---*» С1СН =CHAs(O)(OH)2 + 2HC1

При хлорировании люизита в безводной среде сначала образуется неустойчивый 2-хлорвинилтетрахлорарсин, который затем разлагается с разрывом мышьяк- углеродной связи:

С1СН = CHAsCl2 ---* С1СН =CHAsCLt ---»* С1СН=СНС1 + АзС13

В водных растворах 2-хлорвинилтетрахлорарсин гидролизуется:

ClCH=CHAsCl4 + ЗН20---»-ClCH=CHAs(0)(OH)2 + 4 НС1

Гипохлориты щелочных и щелочноземельных металлов энергично разлагают люизит как в водной среде, так и в сухом виде, например:

В данной реакции последовательно идут щелочной гидролиз, окисление люизита и солеобразование. Реакция используется для дегазации люизита.

В природных водах соединения мышьяка находятся в растворенном и взвешенном состоянии, соотношение между которыми определяется химическим составом воды и значениями рН. В растворенной форме мышьяк встречается в трех- и пятивалентной форме, главным образом в виде анионов.

В речных незагрязненных водах мышьяк находится обычно в микрограммовых концентрациях. В минеральных водах его концентрация может достигать нескольких миллиграммов в 1 дм3, в морских водах в среднем содержится 3 мкг/дм3, в подземных - встречается в концентрациях пЮ5 мкг/дм3. Соединения мышьяка в повышенных концентрациях являются токсичными для организма животных и человека: они тормозят окислительные процессы, угнетают снабжение кислородом органов и тканей.

ПДКВ мышьяка составляет 0,05 мг/дм3.

Брауман изучал биологическое метилирование соединений мышьяка в различных природных экосистемах [3,7]. Было установлено, что проба воды из пруда, содержащая арсенит, при наличии питательной среды в аэробных условиях через определенный период времени начинает вырабатывать алкилмышьяковые кислоты и триметиларсин. Пробы вод озер и рек свидетельствуют, что наибольшая концентрация метилмышьяковых кислот приходится на верхний слой, т.е. они могут оставаться в водной фазе. Вместе с тем они могут осаждаться гидроксидом железа, о чем свидетельствует наличие метилмышьяковых кислот в донных отложениях.

Люизит обладает общеядовитым и кожно-нарывным действием при любом пути воздействия на организм и независимо от вида боевого состояния [4]. Техническому 0В присуще, кроме того, раздражающее действие.

Общеядовитое действие люизита обусловлено его способностью нарушать внутриклеточный углеводный обмен. Этот процесс осуществляется в присутствии пируват-дегидрогеназной ферментной системы, объединяющей несколько ферментов и коферментов. Одним из коферментов (небелковых простетических групп) является липоевая кислота:

Она связана с апоферментом (белковой частью двухкомпонентного фермента пируватоксидазы) и в процессе катализа превращается то в окисленную (дисульфидную), то в восстановленную (с двумя меркаптогруппами) форму:



Люизит взаимодействует с меркаптогруппами дигидролипоевой кислоты и таким образом исключает фермент из участия в окислительно-восстановительных процессах:

В итоге нарушается энергоснабжение всех органов и тканей организма. Местное действие люизита обусловлено ацилированием белков кожных покровов и тканей.

Склонность люизита к образованию циклических арсинсульфидов позволила создать средства для профилактики и лечения поражений этим 0В. К ним относятся 2,3-димеркаптопропанол (БАЛ) и натриевая соль 2,3-димеркаптопропан-сульфокислоты (Унитиол):

2. Обсуждение результатов

2.1 Изучение трансформации люизита и 2-хлорвиниларсиноксида в реакциях с химическими соединениями, моделирующими активные компоненты окружающей среды

Основными процессами, определяющими поведение люизита в почве, являются испарение, сорбция его почвенными частицами, гидролиз, окислительно-восстановительные реакции. Доминирующий процесс -адсорбция. Скорость этих процессов зависит от того, в какой форме находится люизит в почве - в нерастворенной (например, при проливе), либо в растворенной (при смыве дождями или талыми водами). Скорость трансформации люизита в почве будет зависеть также от метеорологических условий, типа почвы, ее состава и влажности. Нами изучен процесс трансформации люизита на реальных образцах почвы пгт Горный Саратовской области. Показано, что скорость трансформации люизита в 2-хлорвиниларсиноксид существенно зависит от наличия влаги в почве. Так, при влажности почвы 55 % и температуре 25°С превращение завершается к исходу первых суток. При влажности 3 % - в течение трех суток.

В качестве активных компонентов подземных и поверхностных вод, способных приводить к деструкции люизита, следует отнести воду, S- и N-содержащие соединения. Учитывая такое важное обстоятельство, что люизит легко гидролизу ется (см. разд.1), целесообразно изучить реакционную способность продукта его трансформации - 2-хлорвиниларсиноксида.

На первом этапе оценивалась реакционная способность различных полифункциональных соединений при реакции с 2-хлорвиниларсиноксидом в воде в гомогенных условиях; на втором этапе - в гетерогенных условиях.

В качестве объектов исследования выбраны следующие доступные кислород-, серу- и азотсодержащие соединения: 2-аминоэтанол, 3-аминопропанол, 2-меркаптоэтанол, этиленгликоль, унитиол и цистеин.

2-Хлорвиниларсиноксид - малорастворимое в воде соединение. Установлено, что концентрация насыщенного при 20°С водного раствора 2-хлорвиниларсиноксида составляет 2,36 * 10~4 М (или 0,036 мг/мл). Подготовленный раствор арсиноксида смешивали с растворами 2-аминоэтанола, 3-аминопропанола, 2-меркаптоэтанола, этиленгликоля, унитиола и цистеина, взятыми в эквимольном соотношении. Измерения выполняли с использованием спектрофотометра на диодной матрице HP 8452А (США). Спектры поглощения регистрировали при температуре 20°С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Результаты представлены на рис. П1-9 (Приложение 1). Как видно из рис. П1-9, реакционная способность нуклеофильных реагентов в реакциях с 2-хлорвиниларсиноксидом в водной среде изменяется в ряду: меркапто- > амино- > гидроксипроизводные.

Важно отметить, что этот ряд активности совпадает с найденным для иприта и продуктов его первичной деструкции [8].

Реакционная способность в гетерогенных условиях оценивалась по убыли (растворению) осадка 2-хлорвиниларсиноксида и накоплению продуктов реакции. Наибольшую активность проявляли соединения с меркаптогруппой, наименьшую - спирты, т.е. выявлена та же самая закономерность.

Продукты реакции экстрагировали хлористым метиленом. Анализ выполнялся с использованием хромато-масс-спектрометрической системы фирмы «Хьюлетт-Паккард» (США) на базе масс-селективного детектора 5792, газового хроматографа 5890 и персонального компьютера с программным обеспечением «MS Chemstation HP G1034C».

Хроматограммы реакционных смесей и масс-спектры показаны на рис. П10-18 (Приложение 1). Как видно из рис. П10-18, состав реакционных смесей весьма непрост.

Обнаружены:



2-Хлорвиниларсиноксид вступает во взаимодействие с активными компонентами почвы, но скорость этих процессов, по - видимому, мала из-за низкой растворимости вещества.

2.2 Оценка воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост семян подсолнечника и пшеницы

Для оценки воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост семян подсолнечника и пшеницы были проведены лабораторные эксперименты с разными концентрациями вещества.

Предварительно выполнялось контрольное проращивание семян подсолнечника и пшеницы с выдержкой в течение трех дней. В результате была установлено, что из 100 семян подсолнечника и пшеницы проросли 96 и 97 семян соответственно.

Были приготовлены водные растворы 2-хлорвиниларсиноксида с концентрацией в диапазоне 3,0-3,5 * 10» - 3,0-3,5 * 10» , причем всегда концентрация вещества в последующем растворе была на порядок меньше, чем в предыдущем. Производилось замачивание в этих растворах семян подсолнечника и пшеницы в течение 1 часа. Семена выкладывались в чашки Петри на смоченную раствором 2-хлорвиниларсиноксида соответствующей концентрации фильтровальную бумагу и проращивались в течение 3 дней. После этого выполнялись контрольные измерения длины и массы проростков подсолнечника и колеоптилей пшеницы, а также учитывалось количество проросших семян. Проводилось по три опыта. Погрешность определения не превышала 25%. Полученные экспериментальные данные приведены в табл.П1,2 (Приложение 2) и не противоречат данным работы [12].

Данные табл. Ш и П2 обработаны нами с учетом длины и массы контрольных образцов. На рис. 1 и 2 показаны зависимости отношения длины и массы проростков подсолнечника и колеоптилей пшеницы к контролю от концентрации 2-хлорвиниларсиноксида. Такие зависимости указывают на проявление 2-хлорвиниларсиоксидом парадоксального токсического эффекта. Они нелинейны и/или немонотонны при достоверном увеличении концентрации (дозы) токсоагента.



Этот эффект наиболее ярко проявляется в случае подсолнечника. Наибольшее угнетение роста растения обнаруживается при концентрации 2-хлорвиниларсиноксида 3,0 * 10»17 мг/мл. Для пшеницы получена более сложная картина. Области активации и угнетения роста колеоптиля чередуются. Отметим, что при концентрации 2-хлорвиниларсиноксида 3,0 * 10~17 мг/мл также наблюдается значительное угнетение роста пшеницы.

К настоящему времени факт существования феномена парадоксальной токсичности уже никем не отрицается. Строго научной трактовки часто встречающегося в биологии феномена парадоксальной токсичности [9] до сих пор не существует. Считается, что его происхождение обусловлено одновременной реализацией разных механизмов токсичности и проявлениями защитных реакций организма. В этом смысле ничего необычного (парадоксального) в токсикодинамике таких агентов нет, когда концентрация (доза) > 10~10 мг/мл. Когда же эффект проявляется в области сверхмалых концентраций (< 10~12 - 10»15 мг/мл и менее), а таких примеров мало, то возникают трудности с объяснением полученных результатов.

Рис. 1. Зависимость отношения длины проростка подсолнечника к контролю (А) от концентрации (С) 2-хлорвиниларсиноксида

Рис. 2. Зависимость отношения длины (А) и массы (В) колеоптиля пшеницы к контролю от концентрации (С) 2-хлорвиниларсиноксида

Рост растений регулируется фитогормонами [10]. Между первичным механизмом действия фитогормона и ростовой или морфогенетической реакцией растения лежит сложная цепь биохимических, биофизических и структурных изменений в клетке. Мы еще не знаем всех звеньев этой цепи, так как исследование механизма действия фитогормонов стало возможным сравнительно недавно. Что касается ауксинов, то диапазон их физиологического действия широк, они участвуют в регуляции многих физиологических процессов, происходящих в растении, и трудно предположить, что в основе лежит единый механизм. В данном случае важно сосредоточить внимание именно на первичной регулирующей реакции, т.е. реакции между гормоном и его рецептором, а последующие реакции будут относиться к способу действия. В свое время было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих механизм действия фитогормонов, однако ни одна из них не дала исчерпывающего объяснения. Выдвигались гипотезы о роли взаимодействия ауксина с коэнзимом А, о действии ауксина на синтез нуклеиновых кислот и белка, делались попытки объяснить действие ауксина как эффектора АТФ-азы, которая выполняет роль протонного насоса в клеточной мембране. Ауксин, согласно данной гипотезе, повышает активность АТФ-азы, в результате чего выделяются ионы водорода, что может привести к увеличению растяжимости клеточной стенки. Выход ионов водорода в окружающую среду приводит к ее подкислению, что было показано и другими авторами. Анализ многочисленных данных о механизме действия ауксина свидетельствует о существовании быстрых и медленных реакций организма на действие гормона. Предполагается, что быстрые реакции обусловлены взаимодействием гормона со специфическим рецептором, локализованным в плазматической мембране клеток ауксин-чувствительных тканей. Ауксин-рецепторный комплекс активирует Н*-насос, что обеспечивает условия для размягчения клеточных стенок и их растяжения под действием тургора; активация переноса протонов из цитоплазмы в клеточную стенку приводит к ее подкис лению. Ионы Н+ вытесняют из клеточной стенки ионы кальция, которые по электрохимическому градиенту поступают в цитоплазму, где способствуют секреции кислых гидролаз. Ионы Н+ и Са+2 являются промежуточными посредниками при действии ауксина на рост растяжением, а также основой аттрагирующей активности растущих клеток. Транспорт ионов Н+ наружу на основе электрохимического потенциала обеспечивает поступление в клетку Сахаров, слабых кислот, аминокислот и других соединений. От работы протонного насоса зависите также и процесс старения клеток. Снижение уровня ауксина приводит к ухудшению работы Н+-насоса, что, в свою очередь, способствует активации кислых гидролаз, вызывающих процессы де градации в клетке. Медленные реакции организма на действие ауксина обусловлены регуляцией экспрессии генов, ответственных за программу роста растяжением. При этом существенными является связывание ауксина с ядерно-цитоплазматическим рецептором, что обеспечивает транспорт гормона в ядро и активацию с процесса транскрипции. Комплекс рецептора с ауксином, проникая в ядро, активирует синтез всех форм РНК. Ауксин влияет и на трансляцию - наблюдалось увеличение числа полисом в обработанных клетках. Известно, что ауксин активирует синтез специфических белков, что обеспечивает рост растяжением.

Таким образом, ауксины способствуют нормальному росту клеток путем регуляции растяжения клеточных стенок, кроме того, активированный ауксином Н+-насос играет важную роль в процессах жизнедеятельности растения.

В растительных клетках индолил-3-уксусная кислота (ИУК) образуется в основном из триптофана. Схема синтеза ИУК показана на рис. 3. Индолилпируватный путь (а) катализируется ферментом трансаминазой у многих растений, например пшеницы и подсолнечника, и ризосферных бактерий Azospirillum [10].

Можно предположить, что 2-хлорвиниларсиноксид при концентрации 3,0* 10~17 мг/мл изменяет структуру воды вблизи активной поверхности трансаминазы, инактивируя таким образом фермент. По сути - это перестройка сетки водородных связей воды, т.е. фазовый переход второго рода (меняется структура сетки водородных связей воды без изменения энергии системы). По-видимому, фермент чутко откликается на эти изменения и при определенных условиях происходят конформационные изменения белка, сопровождающиеся переходом его в неактивную форму. Аналогичный эффект наблюдали ранее [11] на примере поли-М-винилкапролактама (ПВКЛ).

Макромолекулы ПВКЛ в воде претерпевают фазовое разделение в интервале температур 32-38°С. Особенностью фазового перехода является то, что изменение мутности при осаждении ПВКЛ с молекулярной массой М > 1000 происходит в очень узком температурном интервале ( Т 1,0 -1,5 °С).

При исследовании водных систем, содержащих ПВКЛ, было обнаружено, что температура фазового перехода «растворение-осаждение» в значительной мере зависит от присутствия в растворе соединений различного строения. Осаждение ПВКЛ наблюдается при концентрации 2-хлорвиниларсиноксида 1,0 * 10~17 мг/мл.

Нами исследовано также влияние 2-хлорвиниларсиноксида на рост культуры Azospirillum brasilense Sp 245 и бактериальную продукцию индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

Бактерии рода Azospirillum выделяют ИУК [13,14] , гибберелины [15,16] и цитокининподобные вещества [17]. Среди фитогормонов ИУК обнаруживает наибольшую активность в стимулировании процесса роста растений. Морфологические изменения корня растений, наблюдаемые после инокуляции относят к ауксиноподобным эффектам [18,19]. Под влиянием ИУК происходит игибание, скручивание и ветвление корневых волосков, возрастает их длина и количество [20]. Это, в свою очередь, ведет к увеличению активной поглощающей поверхности корней и, как следствие, усилению роста растения.



Рис. 3. Пути синтеза индолил-3-уксусной кислоты из триптофана:

а - индолилпируватный путь, катализируемый трансаминазой у Azospirillum и многих растений, например пшеницы и подсолнечника;

б - путь, катализируемый оксидазой боковой цепи триптофана у Pseudomonas;

в - путь через триптамин, обнаруженный у Agrobacterium tumefaciens и некоторых видов растений -овса, ячменя, табака, томатов;

г - индолил-3-ацетамидный путь у P.savastanoi;

д - превращение индолил-3-ацетонитрила у Alcaligenes faecalis.

Кроме того, ауксины вероятно активируют различные гены, которые могут функционировать в различных ауксин-регулируемых процесов, например, клеточная элонгация, клеточное деление и клеточная дифференциация [21-23]. Но не всегда инокуляция Azospirillum приводит к усилению роста растения. Причиной этому может быть сверхпродукция ИУК при слишком высокой плотности инокуляции. Предполагают, что продукция почвенными микроорганизмами вторичных метаболитов, которая стособствует или задерживает рост растения, контролируется условиями окружающей среды и на нее оказывает влияние корневая активность [24].

2.3 Оценка воздействия 2-хлорвиниларсиноксида на рост культуры Azospirillum brasHense Sp 245 и бактериальную продукцию индолил-3-уксусной кислоты

Фитогормоны микробного происхождения способствуют быстрейшему формированию фунциональных систем растений, ведут к их сбалансированному питанию, что в конечном счете, сказывается на развитии и продуктивности растительного организма [25]. ИУК является одним из важнейших гормонов роста растений [20]. Регуляция микробной продукции фитогормонов представляет интерес при изучении ассоциативных бактерий, поскольку они обитают в ризосфере, где существуют вариабельные, нестационарные условия протекания процессов и присутствуют различные химические соединения, которые могут влиять на продукцию ИУК количественный состав корневых выделений, доступных ризосферным микроорганизмам, непрерывно меняются во времени. Очевидно, что при этом параметры системы «растение-микроорганизм» будут меняться и соответственно биохимические процессы синтеза ИУК будут иметь свои особенности [26].

Значительное распространение в почвах бактерий рода Azospirillum и их способность к продукции фитогормонов, причем в количествах, которые обладают в ризосфере физиологической активностью [16,17,27], дает возможность использовать их в качестве модельных систем изучения ассоциаций «растение-микроорганизм «. Более того считают, что именно способность микроорганизмов синтезировать фитогормоны является первостепенным фактором, лежащим в основе улучшения процессов роста и развития растений. Поэтому интерес исследователей к биосинтезу ИУК связан ещё и с ролью этого процесса при становлении и функционировании ассоциаций «растение-микроорганизм». В работе [28] показано, что бактерии Azospirillum brasilense используют антраниловую кислоту, индол и триптофан в качестве предшественников синтеза ИУК.

Синтез ИУК по Трп-независимому пути, когда гипотетическими предшественниками фитогормона являются соединения, лежащие на отрезке антранилат --...-- индол, является маловероятным.

Кроме того, известные биохимические схемы Трп-зависимых бактериальных путей синтеза ИУК [28] были дополнены соответствующими квантовохимическими расчетами термодинамических параметров как для синтеза самого Трп из антрониловой кислоты, так и для синтеза ИУК из триптофана несколькими путями: через индолилацетамид и индолилпировиноградную кислоту. Судя по этим данным, процесс синтеза ИУК сдвинут в сторону продуктов реакции, т.е. в сторону продукции ИУК.

Квантовохимические расчеты в совокупности с экспериментальными данными дают ещё одно обоснование предположению, что ИУК, как вторичный метаболит, является продуктом катаболизма Трп и этот процесс необходим самому микроорганизму для детоксикации Трп [29].

В экспериментах с 2-хлорвиниларсиноксидом использовали раствор с начальной концентрацией 0,036 мг/мл. Концентрация триптофана в среде составила 100 мг/мл. На 50 мл среды при культивировании бактерий были добавлены объемы раствора 2-хлорвиниларсиноксида и определена оптическая плотность трехсуточной культуры, приведенные в табл.2.

Как видно из табл. 2, образцы 1-3, 6, 9, И, 16 и 17 характеризуются пониженной оптической плотностью растворов, что свидетельствует о низком росте биомассы.

В качестве стандартов использовали аутентичные индольные соединения (Fluka). По полученным хроматограммам не выявлено пропорциональной зависимости синтеза ИУК от концентрации 2-хлорвиниларсиноксида в растворе культуральной жидкости. При концентрациях 2-хлорвиниларсиноксида 10~2- 10~4, 10~7, 10~10 и 10»17 мг/мл продукции ИУК не наблюдалось (см. Приложение 3, рис.П19-П21).

В проведенных ранее экспериментах по светорассеянию водных растворов 2-хлорвиниларсиноксида в интервале концентраций 10» -10» мг/мл установлено [11], что в диапазоне малых и сверхмалых концентраций вещества наблюдаются максимумы, свидетельствующие об аномальном молекулярном рассеянии света. Максимумы светорассеяния проявляются при концентрациях вещества 10»9, 10»13 и 10»17 мг/мл. Показано, что водный раствор 2-хлорвиниларсиноксида с концентрацией 1 * 10»17 мг/мл близок к точке фазового перехода второго рода.

Таблица 2 Условия и результаты эксперимента с культурой Azospirillum brasilense Sp 245

Образец №	Объем (мл) раствора 2-хлорвиниларсиноксида с концентрацией 0,036 мг/мл раствора	Оптическая плотность OD660
1	5	0,025
2	0,5	0,22
3	5х10'2	0,41
4	5x10»3	0,5
5	5х10'4	0,5
6	5х10»5	0,37
7	5xlQ-6	0,51
8	5х10'7	0,48
9	5х10'8	0,38
10	5х10-у	0,5
11	5х10-ш	0,38
12	5х10-п	0,45
13	5х10-12	0,52
14	5х10-13	0,46
15	5х10-14	0,46
16	5х10-15	0,31
17	5х10'16	0,11
18	5х10-17	0,42
19	5х10'18	0,48
Контроль (К)	0	0,5

Можно предположить, что обнаруженные эффекты имеют общую природу и проявляются как для растений, так и бактерий и связаны с перестройкой сетки водородных связей воды под влиянием сверхнизких концентраций 2-хлорвиниларсиноксида, приводящего к изменению структуры приповерхностной воды и инактивации (угнетению) трансаминазы. Эти эффекты могут иметь важные экологические последствия. Воздействие 2-хлорвиниларсиноксида на растения и ризосферные микроорганизмы в предельно низких концентрациях может привести к значительному снижению (гибели) урожая зерновых и масличных культур.

3. Экспериментально-методическая часть

3.1 Синтез 2-хлорвиниларсиноксида

В трехгорлую колбу объемом 250 мл загружают 1,5 г люизита и 100 мл воды. Гидролиз проводят при интенсивном перемешивании в течение 12 часов. Осадок отфильтровывают, сушат, взвешивают. Получают 0,463 г 2-хлорвиниларсиноксида. Тпл = 143-145°С. Тпл[30] = 143°С.

3.2 Физико-химический анализ продуктов реакции 2-хлорвиниларсиноксида с химическими соединениями, моделирующими активные компоненты окружающей среды

Подготовленный раствор арсиноксида смешивают с растворами 2-аминоэтанола, 3-аминопропанола, 2-меркаптоэтанола, этиленгликоля, унитиола и цистеина, взятыми в эквимольном соотношении. Измерения выполняют с использованием спектрофотометра на диодной матрице HP 8452А (США). Спектры поглощения регистрируют при температуре 20°С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см.

Продукты реакции экстрагируют хлористым метиленом. Анализ выполняют с использованием хромато-масс-спектрометрической системы фирмы «Хьюлетт-Паккард» (США) на базе масс-селективного детектора 5792, газового хроматографа 5890 и персонального компьютера с программным обеспечением «MS Chemstation HP G1034C».

3.3 Методика проращивания семян подсолнечника и пшеницы в присутствии 2-хлорвиниларсиноксида

Семена подсолнечника и пшеницы промывают водой, затем детергентом (2-3 капли жидкого моющего средства на 200 мл воды) и проточной водой. Промытые семена заливают на 10 с 70%-ным этиловым спиртом, а затем промывают автоклавированной водой до исчезновения запаха спирта. Готовят растворы 2-хлорвиниларсиноксида в диапазоне концентраций 3,0-3,5 * 10~2 - 3,0-3,5 * 10~20. Замачивают семена подсолнечника или пшеницы в этих растворах в течение 1 часа.

Чашки Петри и фильтровальную бумагу для проращивания семян автоклавируют, стерильным пинцетом раскладывают по 10 семян на увлажненную водой (контроль) или раствором 2-хлорвиниларсиноксида фильтровальную бумагу, закрывают и оставляют на 3 суток в темном месте при температуре не выше 26°С. Измеряют длину и массу проростков.

3.4 Методика культивирования бактерий Azospirillum brasilense Sp 245 в присутствии 2-хлорвиниларсиноксида

Бактерии Azospirillum brasilense Sp 245 выращивают в конических колбах, содержащих по 50 мл синтетической малатной среды и 2-хлорвиниларсиноксид в различных концентрациях, на качалке при температуре 31° С. Контролем служит культура, выращенная без добавления мышьяка. Посевным материалом служит культура, которую выращивали на агаризированной среде того же состава. рН сред доводят до 7. Автоклавирование проводят при 0,5 атм в течение 30 мин. Культуру выращивают трое суток. Оптическую плотность (OD) измеряют на спектрофотометре при длине волны 660 нм.

Индолил-3-уксусную кислоту и триптофан в образцах культуральной жидкости определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для ВЭЖХ культуральную жидкость центрифугируют при 13000 g в течение 5 минут и надосадочную жидкость профильтровывают через 0,22 мкм мембранный фильтр. Разделение веществ на обратно-фазовой колонке осуществляют при следующих условиях: длина волны -298 нм, жидкая фаза - метанол/ вода/уксусная кислота (36:64:1), скорость -0,5 мл/мин. В качестве стандартов используют аутентичные индольные соединения (Fluka).

Выводы

1. Основными процессами, определяющими поведение люизита в почве, являются испарение, сорбция его почвенными частицами, гидролиз и окислительно-восстановительные реакции. Доминирующий процесс - адсорбция. Скорость этих процессов зависит от формы нахождения люизита в почве - нерастворенной (например, при проливе), либо растворенной (при смыве дождями или талыми водами). Скорость трансформации люизита в почве зависит также от метеорологических условий, типа почвы, ее состава и влажности.

2. Скорость трансформации люизита в 2-хлорвиниларсиноксид существенно зависит от наличия влаги в почве. При влажности почвы 55 % и температуре 25°С превращение завершается к исходу первых суток. При влажности 3 % - в течение трех суток.

3. Показано, что реакционная способность нуклеофильных реагентов в реакциях с 2-хлорвиниларсиноксидом уменьшается в ряду меркапто- > амино- > гидроксипроизводные, что совпадает с рядом активности, найденным для иприта и продуктов его первичной деструкции. 2-Хлорвиниларсиноксид устойчив в почве.

4. Изучено влияние 2-хлорвиниларсиноксида на рост семян подсолнечника и пшеницы. Показано, что 2-хлорвиниларсиоксид проявляет парадоксальный токсический эффект. Наибольшее угнетение роста подсолнечника обнаруживается при концентрации 2-хлорвиниларсиноксида 3,0 * 10~17 мг/мл. Для пшеницы выявлено несколько чередующихся областей активации и угнетения роста колеоптиля, но при концентрации 2-хлорвиниларсиноксида 3,0 * 10~17 мг/мл также наблюдается значительное угнетение роста семян пшеницы.

5. Изучено влияние 2-хлорвиниларсиноксида на рост культуры Azospirillum brasilense Sp 245 и бактериальную продукцию индолил-3-уксусной кислоты. При концентрациях 2-хлорвиниларсиноксида 10~2 - 10~4, 10»7 , 10»10 и 10»17 мг/мл продукции индолил-3-уксусной кислоты не наблюдается.

6. Обнаруженные эффекты, по-видимому, имеют общую природу, проявляются как для растений, так и бактерий в форме стресса и связаны с перестройкой сетки водородных связей воды под влиянием сверхнизких концентраций 2-хлорвиниларсиноксида (фазовый переход второго рода). Этот переход приводит к изменению структуры приповерхностной воды и инактивации (угнетению) трансаминазы, отвечающей за синтез регулятора роста индолил-3-уксусной кислоты из триптофана у пшеницы, подсолнечника и Azospirillum brasilense Sp 245.

Литература

1. Савин Ю.И., Вишенкова Е.М., Пасынкова Е.М. Исследование поведения иприта и люизита в воде и почве при условиях, имитирующих природные среды. - Рос.хим.ж. (Ж.росс.хим.об-ва им.Д.И.Менделеева), 1995, N4,c.l21-125.

2. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D. et al. The Sources, Fate, and Toxicity of Chemical Warfare Agent Degradation Products. - Environmental Health Perspectives, 1999, vol.107, No. 12, p. 933-974.

3. Гамаюрова B.C. Мышьяк в экологии и биологии. - М.: Наука, 1993. - 208с.

4. Александров В.Н., Емельянов В.И. Отравляющие вещества. - М.: Воениздат, 1990. - 271 с.

5. Степанов А.И., Гехман А.Е., Рамендик Г.И., Нефедов В.И. Исследование взаимодействия продуктов гидролиза а-люизита с алкандитиолами. - Рос.хим.ж. (Ж.росс.хим.об-ва им.Д.И.Менделеева), 1995, N4, с.27-31.

6. Элбро Т., Дерет Д., Симак Р. Определение люизита и продуктов его разложения в пробах почв и воды с использованием пламенно-фотометрического и фотоионизационного детекторов в полевых условиях. - Рос.хим.ж. (Ж.росс.хим.об-ва им.Д.И.Менделеева), 1995, N4, с. 125-128.

7. Braman R.S. Arsenical pesticides / Ed. E.A.Woolson. Wash. (D.C.): Amer.Chem.Soc., 1975, p.108-123.

8. Щербаков А.А. Трансформация иприта в объектах окружающей среды. Саратов: Изд-во «Научная книга», 2001. - 120 с.

9. Криштопенко С.В., Тихов М.С., Попова Е.Б. Парадоксальная токсичность. - Нижний Новгород: Изд-во НГМА, 2001. - 164 с.

10. Мишке И.В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. - Рига: Зинатне, 1988.- 151 с.

11. Кузнецов П.Е., Назаров Г.В., Злобин В.А., Любунь Е.В., Щербаков А.А. Детектирование 2-хлорвиниларсиноксида в сверхнизких концентрациях. - Сборник научных статей , часть II. Биология, экология, медицина. Саратов, СВИРХБЗ, 2002. с.57-61.

12. Шляхтин Г.В., Рембовский В.Р., Хохоев Т.Х., Рябова Т.П. и др. Реакция растений и животных природных экосистем на действие люизита. - Рос.хим.ж. (ж.рос.хим.об-ва им.Д.И.Менделеева), 1993, T.XXXVII, № 3, с.108-113.

13. Fallik E., Okon., Epstein E., Goldman A., Fischer M. Identification and quantification of IAA and in Azospirillum brasilense -inoculated maize roots. // Soil Biochem. - 1989. -Vol.21. -P. 147-153.

14. Omay S.H., Schmidt W.A,, Martin P. Indoleacetic acid production by rhizosphere bacterium Azospirillum brasilense Cd under in vitro conditions. // Can. J. Microdiol. -1992. - Vol. 39.-P. 187-192.

15. Bottini R., Fulchieri N., Pearce D., Pharis R. P. Identification of gibberellins Al, A3 and iso-A3 in culture of A. lipoferum. // Plant Physiol. -1989.-Vol. 89. -P. 1-3.

16. Janzen R.A., Rood S.B., Dormaar J. F. and McGill W.B. Azospirillum brasilense produces gibberellin in pure culture on chemically-definet medium and in co-culture on straw // Soil Biol. Biochem. -1992. -Vol. 24. -P. 1061-1064.

17. Tien T.M., Gaskins M.N., Hubbell D.H. Plant growth substances products by Azospirillum brasilense and their effekt on the growth of pearl millet. // Appl. Environ Microbiol. -1979. -Vol. 37. -P. 1016-1024.

18. Costacurta A.,Vanderleyden J. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria // Critical Reviews in Microbiol.-1995. V. 21. - P. 1-18.

19. Kold W. and Martin P. Response of plant roots to inoculation with Azospirillum brasilense and to application of indol-acetic acid // Azospirillum 3: Genetics, Physiology, Ecology / Ed. Klingmuller W. -Berlin : Springer -Verlag, 1985.-P. 215-221.

20. Jain D.K., Patriquin D. G. Characterization of substance produced by Azospirillum which causes branching of wheat root hairs // Can. J. Microbiol. -1985.-Vol. 31.-P.206-210.

21. Zhan-Bin Lin, Ulmasov Т., shi X., Hagen G., Guilfoyle T.J. Soybean GH3 promoter contains multiple auxin-inducible elements // the Plant Cell. -1994. -Vol. 6. -P. 645-657.

22. Delbarre A., Muller P., Imhoff V., Barbier-Brygoo H., Maurel C., leblanc N., Perrot-Rechenmann C.,Guern J. The rol b gene of Agrobacterium rhizogenes does not increase the auxin sensitivity of tobacco protoplasts by modifying the intracellulular auxin concentration // Plant PHYSIOL. -1994. -Vol. 105. -P. 563-569.

23. Кацы Е.И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений // Генетика. -1997. -Т. 33, №5. -С. 565-576.

24. Lebuhn M., Heulin Т., Hartmann A. Production of auxin and other indolic and phenolic compounds by Paenbacillus polymyxa strain isolated from different proximity to plant roots // FEMS Microbiol. Ecology. -1997. -Vol. 22 - P. 325-334.

25. Паников Н.С., Афремова В.Д., Асеева И.В. Рост растений и микроорганизмов, ассоциированных с корнями, на минеральных средах разного состава // Агрохимия. -1987. -№3. -С. 51-58.

26. Берестецкий О.А., Швытов И.А., Кравченко Л.В. Имитационное моделирование ассоциированной азотфиксации в ризосфере небобовых культур // Доклады ВАСХНИЛ.-1986, №7. -С. 6-7.

27. Crozier A., Arruda P., Jasmin J. M., Monteiro A. M. Т., Sandberg G. Analysis of indole-3-acetic acid and related indoles in culture medium from Azospirillum lipoferum and Azospirillum brasilense // Appl. Environ. Microbiol. -1988. -Vol. 54. -P. 2833-2837.

28. Захарова Е.А. Синтез индолил-3-уксусной кислоты у бактерий Azospirillum brasilense. - Дисс...канд. биол. наук. Саратов, 1998.

29. Ваг Т. and Okon Y. Induction of indole- 3-acetic acid synthesis and ! possible toxicity of tryptophan in Azospirillum brasilense Sp 7 // Symbiosis. -] 1992.-Vol. 13.-P. 191-198.

30. Соборовский Л.З., Якубович А.Я. Синтезы ОВ. - Л.: Гос.изд-во оборонной прмышленности, 1939. - с. 199.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Рисунок П1.

Спектры поглощения 2-хлорвиниларсиноксида (1), 2-аминоэтанола (2) и реакционной смеси (3) во времени. 1 и 2 - раствор сравнения - вода; 3 -раствор сравнения - 2-хлорвиниларсиноксид

Рисунок П2.

Спектры поглощения 2-хлорвиниларсиноксида (1), 2-меркаптоэтанола (2) и реакционной смеси (3) во времени. 1 и 2 - раствор сравнения - вода; 3 -раствор сравнения - 2-хлорвиниларсиноксид



Рисунок П3.

Аналогичен рис.2. Смешение реагентов проводилось в кювете. Время наблюдения от 3 до 34 с.

Рисунок П4.

Аналогичен рис.2. Спектры поглощения реакционной смеси регистрировали относительно воды. Время наблюдения от 3 до 80 с.



Рисунок П5.

Спектры поглощения 2-хлорвиниларсиноксида (1), этиленгликоля (2) и реакционной смеси (3) во времени. 1 и 2 - раствор сравнения - вода; 3 -раствор сравнения - 2-хлорвиниларсиноксид. Время наблюдения 3 мин.

Рисунок П6.

Аналогичен рис.5. Смешение реагентов проводилось в кювете. Время наблюдения от 5 с до 10 мин.



Рисунок П7.

Спектры поглощения 2-хлорвиниларсиноксида (1), 3-аминопропанола (2) и реакционной смеси (3) во времени. 1 и 2 - раствор сравнения - вода; 3 -раствор сравнения - 2-хлорвиниларсиноксид. Смешение в кювете. Время наблюдения от 3 с до 3 мин.

Рисунок П8.

Спектры поглощения 2-хлорвиниларсиноксида (1), унитиола (2) и реакционной смеси (3) во времени. 1 и 2 - раствор сравнения - вода; 3 -раствор сравнения - 2-хлорвиниларсиноксид. Смешение в кювете. Время наблюдения от 2 с до 3 мин.



Рисунок П9.

Спектры поглощения 2-хлорвиниларсиноксида (1), цистеина (2) и реакционной смеси (3) во времени. 1 и 2 - раствор сравнения - вода; 3 -раствор сравнения - 2-хлорвиниларсиноксид. Смешение в кювете. Время наблюдения от 2 с до 3 мин.

Рисунок П10.

Хроматограмма реакционной смеси 2-хлорвиниларсиноксида и 2-аминоэтанола. Масс-спектр вещества с временем удерживания 10,657 мин



Рисунок П11.

Хроматограмма реакционной смеси 2-хлорвиниларсиноксида и 2-аминоэтанола. Масс-спектр вещества с временем удерживания 12,596 мин



Рисунок П12

Хроматограмма реакционной смеси 2-хлорвиниларсиноксида и 2-аминоэтанола. Масс-спектр вещества с временем удерживания 13,338 мин



Рисунок П13.

Хроматограмма реакционной смеси 2-хлорвиниларсиноксида и 2-меркаптоэтанола. Масс-спектр в-ва с временем удерживания 13,363 мин

Рисунок П14.

Хроматограмма реакционной смеси 2-хлорвиниларсиноксида и этиленгликоля. Масс-спектр вещества с временем удерживания 13,347 мин



Рисунок П15.

Хроматограмма реакционной смеси 2-хлорвиниларсиноксида и 3-аминопропанола. Масс-спектр в-ва с временем удерживания 13,341 мин