Письменный перевод с английского языка на русский "DNA Replication in Archaea, the Third Domain of Life"

Detailed structural studies of the heterologous PCNA from S. solfataricus revealed that the interaction modes between the subunits are conserved with those of the homotrimeric PCNAs. T. kodakarensis is the only euryarchaeal species that has two genes encoding PCNA homologs on the genome. These two genes from the T. kodakarensis genome, and the highly purified gene products, PCNA1 and PCNA2, were characterized.

PCNA1 stimulated the DNA synthesis reactions of the two DNA polymerases, Pol B and Pol D, from T. kodakarensis in vitro. PCNA2 however only had an effect on Pol B. The T. kodakarensis strain with pcna2 disruption was isolated, whereas gene disruption for pcna1 was not possible. These results suggested that PCNA1 is essential for DNA replication, and PCNA2 may play a different role in T. kodakarensis cells.

The sensitivities of the Дpcna2 mutant strain to ultraviolet irradiation (UV), methyl methanesulfonate (MMS) and mitomycin C (MMC) were indistinguishable to those of the wild type strain. Both PCNA1 and PCNA2 form a stable ring structure and work as a processivity factor for T. kodakarensis Pol B in vitro. The crystal structures of the two PCNAs revealed the different interactions at the subunit-subunit interfaces.

On the other hand, the archaeal RFC consists of two proteins, RFCS (small) and RFCL (large), in a 4 to 1 ratio. A different form of RFC, consisting of three subunits, RFCS1, RFCS2, and RFCL, in a 3 to 1 to 1 ratio, was also identified from M. acetivorans. The three subunits of RFC may represent an intermediate stage in the evolution of the more complex RFC in Eukaryota from the less complex RFC in Archaea.

Figure 6. Electron Microscopic Analysis of P. furious DNA polymerase-PCNA-DNA complex.

The subunit organization and the spatial distribution of the subunits in the M. acetivorans RFC complex were analyzed and compared with those of the E. coli г-complex, which is also a pentamer consisting of three different proteins. These two clamp loaders adopt similar subunit organizations and spatial distributions, but the functions of the individual subunits are likely to be diverse.

11. DNA ligase

DNA ligase is essential to connect the Okazaki fragments of the discontinuous strand synthesis during DNA replication, and therefore, it universally exists in all living organisms. This enzyme catalyzes phosphodiester bond formation via three nucleotidyl transfer steps. In the first step, DNA ligase forms a covalent enzyme-AMP intermediate, by reacting with ATP or NAD+ as a cofactor. In the second step, DNA ligase recognizes the substrate DNA, and the AMP is subsequently transferred from the ligase to the 5'-phosphate terminus of the DNA, to form a DNA-adenylate intermediate (AppDNA). In the final step, the 5'-AppDNA is attacked by the adjacent 3'-hydroxy group of the DNA and a phosphodiester bond is formed. DNA ligases are grouped into two families, according to their requirement for ATP or NAD+ as a nucleotide cofactor in the first step reaction. ATPdependent DNA ligases are widely found in all three domains of life, whereas NAD+-dependent DNA ligases exist mostly in Bacteria. Some halophilic archaea and eukaryotic viruses also have NAD+-dependent enzymes.

Three genes (LIG1, LIG3 and LIG4) encoding ATP-dependent DNA ligases have been identified in the human genome to date and DNA ligase I (Lig I), encoded by LIG1, is a replicative enzyme that joins Okazaki fragments during DNA replication. The first gene encoding a eukaryotic-like ATP-dependent DNA ligase was found in the thermophilic archaeon, Desulfolobus ambivalens. Subsequent identifications of the DNA ligases from archaeal organisms revealed that these enzymes primarily use ATP as a cofactor. However, this classification may not be so strict. The utilization of NAD+, as well as ATP, as a cofactor has been observed in several DNA ligases, including those from T. kodakarensis, T. fumicolans, P. abyssi, Thermococcus sp. NA1, T. acidophilum, Picrophilus torridus, and Ferroplasma acidophilum, although ATP is evidently preferable in all of the cases.

The dual co-factor specificity (ATP/NAD+) is an interesting feature of these DNA ligase enzymes and it will be enlightening to investigate the structural basis for this. Another dual co-factor specificity exists in the archaeal DNA ligases, which use ADP as well as ATP, as found in the enzymes from A. pernix and Staphylothermus marinus, and in the case of Sulfobococcus zilligii, GTP is also the functional cofactor. The DNA ligases from P. horikoshii and P. furiosus have a strict ATP preference.

Sufficient biochemical data have not been obtained to resolve the issue of dual co-factor specificity, and further biochemical and structural analyses are required. The crystal structure of P. furiosus DNA ligase was solved and the physical and functional interactions between the DNA ligase and PCNA was shown. The detailed interaction mode between human Lig I and PCNA is somewhat unclear, because of several controversial reports.

The stimulatory effect of P. furiosus PCNA on the enzyme activity of the cognate DNA ligase was observed at a high salt concentration, at which a DNA ligase alone cannot bind to a nicked DNA substrate. Interestingly, the PCNA-binding site is located in the middle of the N-terminal DNA binding domain (DBD) of the P. furiosus DNA ligase, and the binding motif, QKSFF, which is proposed as a shorter version of the PIP box, is actually looped out from the protein surface. Interestingly, this motif is located in the middle of the protein chain, rather than the N- or C-terminal region, where the PIP boxes are usually located. To confirm that this motif is conserved in the archaeal/eukaryotic DNA ligases, the physical and functional interactions between A. pernix DNA ligase and PCNA was analyzed and the interaction was shown to mainly depend on the phenylalanine 132 residue, which is located in the predicted region from the multiple sequence alignment of the ATP-dependent DNA ligases.

The crystal structure of the human Lig I, complexed with DNA, was solved as the first ATPdependent mammalian DNA ligase, although the ligase was an N-terminal truncated form. The structure comprises the N-terminal DNA binding domain, the middle adenylation domain, and the C-terminal OB-fold domain. The crystal structure of Lig I (residues 233 to 919) in complex with a nicked, 5'-adenylated DNA intermediate revealed that the enzyme redirects the path of the dsDNA, to expose the nick termini for the strand-joining reaction. The N-terminal DNA-binding domain works to encircle the DNA substrate like PCNA and to stabilize the DNA in a distorted structure, positioning the catalytic core on the nick.

The crystal structure of the full length DNA ligase from P. furiosus revealed that the architecture of each domain resembles those of Lig I, but the domain arrangements strikingly differ between the two enzymes. This domain rearrangement is probably derived from the “domain-connecting” role of the helical extension conserved at the C-termini in the archaeal and eukaryotic DNA ligases. The DNA substrate in the open form of Lig I is replaced by motif VI at the C-terminus, in the closed form of P. furiosus DNA ligase.

Both the shapes and electrostatic distributions are similar between motif VI and the DNA substrate, suggesting that motif VI in the closed state mimics the incoming substrate DNA. The subsequently solved crystal structure of S. solfataricus DNA ligase is the fully open structure, in which the three domains are highly extended. In this work, the S. solfataricus ligase-PCNA complex was also analyzed by SAXS. S. solfataricus DNA ligase bound to the PCNA ring still retains an open, extended conformation. The closed, ring-shaped conformation observed in the Lig I structure as described above is probably the active form to catalyze a DNA end-joining reaction, and therefore, it is proposed that the open-to-closed movement occurs for ligation, and the switch in the conformational change is accommodated by a malleable interface with PCNA, which serves as an efficient platform for DNA ligation.

After the publication of these crystal structures, the three-dimensional structure of the ternary complex, consisting of DNA ligase-PCNA-DNA, using the P. furiosus proteins was obtained by EM single particle analysis. In the complex structure, the three domains of the crescent-shaped P. furiosus DNA ligase surround the central DNA duplex, encircled by the closed PCNA ring. The relative orientations of the ligase domains remarkably differ from those of the crystal structures, and therefore, a large domain rearrangement occurs upon ternary complex formation.

In the EM image model, the DNA ligase contacts PCNA at two sites, the conventional PIP box and a novel second contact in the middle adenylation domain. It is also interesting that a substantial DNA tilt from the PCNA ring axis is observed. Based on these structural analyses, a mechanism in which the PCNA binding proteins are bound and released sequentially. In fact, most of the PCNA binding proteins share the same binding sites in the interdomain connecting loop (IDCL) and the C-terminal tail of the PCNA. The structural features exclude the possibility that the three proteins contact the single PCNA ring simultaneously, because DNA ligase occupies two of the three subunits of the PCNA trimer.

In the case of the RFCPCNA-DNA complex structure obtained by the same EM technique, RFC entirely covers the PCNA ring, thus blocking the access of other proteins. These ternary complexes appear to favor a mechanism involving the sequential binding and release of replication factors.

12. Flap endonuclease 1 (FEN1)

Efficient processing of Okazaki fragments to make a continuous DNA strand is essential for the lagging strand synthesis in asymmetric DNA replication. The primase-synthesized RNA/DNA primers need to be removed to join the Okazaki fragments into an intact continuous strand DNA. Flap endonuclease 1 (FEN1) is mainly responsible for this task. Okazaki fragment maturation is highly coordinated with continuous DNA synthesis, and the interactions of DNA polymerase, FEN1, and DNA ligase with PCNA allow these enzymes to act sequentially during the maturation process, as described above. FEN1, a structure-specific 5'-endonuclease, specifically recognizes a dsDNA with an unannealed 5'-flap.

In the eukaryotic Okazaki fragment processing system, 5'-flap DNA structures are formed by the strand displacement activity of DNA polymerase д. Lig I seals the nick after the flapped DNA is cleaved by FEN1. These processing steps are facilitated by PCNA. The interactions between eukaryotic FEN1 and PCNA have been well characterized, and the stimulatory effect of PCNA on the FEN1 activity was also shown.

The crystal structure of the human FEN1-PCNA complex revealed three FEN1 molecules bound to each PCNA subunit of the trimer ring in different configurations. Based on these structural analyses together with the description in the DNA ligase section, a flip-flop transition mechanism, which enables proteins to internally switch for different functions on the same DNA clamp are currently being considered. The eukaryotic homologs of FEN1 were found in Archaea.

The crystal structures of FEN1 from M. jannaschii, P. furiosus, P. horikoshii, A. fulgidus, and S. solfataricus have been determined. In addition, detailed biochemical studies were performed on P. horikoshii FEN1. Thus, studies of the archaeal FEN1 proteins have provided important insights into the structural basis of the cleavage reaction of the flapped DNA. Our recent research showed that the flap endonuclease activity of P. furiosus FEN1 was stimulated by PCNA.

Furthermore, the stimulatory effect of PCNA on the sequential action of FEN1 and DNA ligase was observed in vitro (Kiyonari et al., unpublished). Based on these results, a model of the molecular switching mechanisms of the last steps of Okazaki-fragment maturation was constructed. The quaternary complex of FEN1-Lig-PCNA-DNA was also isolated for the EM single particle analysis. These studies will provide more concrete image of the molecular mechanism.

13. Summary and perspectives

Research on the molecular mechanism of DNA replication has been a central theme of molecular biology. Archaeal organisms became popular in the total genome sequencing age, as described above, and most of the DNA replication proteins are now equally understood by biochemical characterizations. In addition, the archaeal studies are especially interesting to understand the mechanisms by which cells live in extreme environmental conditions.

Furthermore, it is also noteworthy that the proteins from the hyperthermophilic archaea are more stable than those from mesophilic organisms, and they are advantageous for the structural and functional analyses of higher-ordered complexes, such as the replisome. Studies on the higher-ordered complexes, rather than single proteins, are essential for understanding each of the events involved in DNA metabolism, and the archaeal research will continuously contribute to the development and advancement of the DNA replication research field, as summarized in part in a recent review.

In addition to basic molecular biology research, DNA replication proteins from thermophiles have been quite useful reagents for gene manipulations, including genetic diagnosis, forensic DNA typing, and detection of bacterial and virus infections, as well as basic research. Numerous enzymes have been commercialized around the world, and are utilized daily. An example of the successful engineering of an archaeal DNA polymerase for PCR is the creation of the fusion protein between P. furiosus Pol B and a nonspecific dsDNA binding protein, Sso7d, from S. solfataricus, by genetic engineering techniques.

The fusion DNA polymerase overcame the low processivity of the wild type Pol B by the high affinity Sso7d to the DNA strand. As another example, we successfully developed a novel processive PCR method, using the archaeal Pol B with the help of a mutant PCNA. Several DNA sequencing technologies, referred to as “next-generation sequencing”, have been developed, and are now commercially available.

Single-molecule detection, using dye-labeled modified nucleotides and longer read lengths, is now known as “third-generation DNA sequencing”. These technologies apply DNA polymerases or DNA ligases from various sources, indicating that these DNA replication enzymes are indispensable for the development of DNA manipulation technology. These facts prove that the progress of the basic research on the molecular biology of archaeal DNA replication will promote the development of the new technologies for genetic engineering.

Russian Translation

Репликация ДНК у архей, третьего домена жизни

1. Введение

Точное дублирование и передача генетической информации являются абсолютно необходимыми для живых организмов. Молекулярный механизм репликации ДНК был одной из центральных тем молекулярной биологии, поэтому прилагались постоянные усилия для выяснения точного молекулярного механизма репликации ДНК, которые проводились после открытия структуры двойной спирали ДНК в 1953 году. Белковые факторы, которые функционируют в процессе репликации ДНК, были определены на сегодняшний день в трех доменах жизни (рис. 1).

Рисунок 1. Стадии репликации ДНК

Размещено на http://www.allbest.ru/

Археи, третий домен жизни, очень интересные живые организмы для изучения из аспектов молекулярной и эволюционной биологии. Быстрый прогресс и полный анализ генома позволили нам выполнить сравнительные исследования генома. Кроме того, недавние экологические исследования показали, что археи обитают не только в экстремальных условиях, но и в более обычной среде обитания. В таких ситуациях биология архей является одной из самых захватывающих областей исследования.

Клетки архей имеют одноклеточную ультраструктуру без ядра, напоминающую бактериальные клетки, но белки, участвующие в генетических путях обработки информации, в том числе в репликации, транскрипции и трансляции ДНК, во многом схожи с теми же белками, что и у эукариот. Таким образом, большинство архейных белков идентифицируются как гомологичные ко многим эукариотическим белкам репликации, в том числе ORC (точка инициации транскрипции), Cdc6, GINS (Sld5-Psf1-Psf2-Psf3), МСМ (поддержание минихромосом) RPA (репликация белка А), PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток), RFC (репликационный фактор С), FEN1 (клапан эндонуклеазы 1), в дополнение к эукариотической праймазе, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы; это явно отличает их от бактериальных белков, и эти белки биохимически характеризуются. Их сходство показывает, что механизмы репликации ДНК архей и эукариот произошли от общего предка, который отличался от бактерий.

Таким образом, организмы архей могут служить хорошими примерами и разъяснить функции каждого из компонентов эукариотического типа в комплексе механизмов репликации. Геномные и сравнительные исследования генома архебактерий упрощаются тем, что размер генома и количество генов архебактерий намного меньше, чем у эукариот. Механизм репликации у архей, вероятно, более упрощен, чем у эукариот. С другой стороны, интересным фактом является то, что кольцевая структура генома сохраняется у бактерий и архей и отличается от линейной формы эукариотических геномов. Эти особенности побудили нас изучить механизм репликации ДНК архей, в надежде получить фундаментальное понимание этого молекулярного механизма и его технику с эволюционной точки зрения.

Изучение репликации бактериальной ДНК на молекулярном уровне началось примерно в 1960 году, а затем исследования эукариот проводились с 1980 года. Так как позже археи были признаны третьим доменом жизни, исследования репликации ДНК архей стали активно проводиться после 1990 года. С увеличением имеющейся общей последовательности генома, процесс исследования репликации ДНК архей был быстрым, и глубина наших знаний о репликации ДНК архей почти сопоставима со знаниями в бактериальных и эукариотических областях исследований. В этой главе мы обобщим наши текущие знания о репликации ДНК у архей.

2. Инициация репликации

Основной механизм репликации ДНК был предсказан в "теории репликона" Якоба и др. Они предположили, что фактор инициации признает репликатор, который сейчас называют инициатором репликации, чтобы начать репликацию хромосомной ДНК. Затем инициатор репликации ДНК E.coli был идентифицирован как ORIC (начало хромосомы). Инициатор репликации архей был выявлен в Pyrococcus abyssi в 2001 году как первый инициатор начала репликации архей.

Инициатор был расположен вверх по течению от гена, кодирующего Cdc6 и ORC1-подобные последовательности в геноме Pyrococcus. Мы обнаружили ген, кодирующий аминокислотную последовательность, которая имела сходство с эукариотическими Cdc6 и ORC1, которые являются эукариотическими инициаторами. Убедившись, что этот белок фактически связывается в ORIC области на хромосомной ДНК, мы назвали генный продукт Cdc6/Orc1, из-за его примерно равной гомологии с областями эукариотических ORC1 и Cdc6. Ген состоит из оперона и гена распознавания ДНК полимеразы D (она была первоначально названа Pol II, как вторая ДНК-полимераза в Pyrococcus furiosus) в геноме.

ORIC является сохраненными повторами 13 связывающих белков, как предсказано ранее биоинформатиками, и два из повторов больше и окружают предполагаемый DUE (элемент раскручивания ДНК) с AT-богатых последовательностей в геномах Pyrococcus (рис. 2). Более длинная повторяющаяся последовательность обозначается как ORB (фактор инициации распознавания), и это было фактически доказано в исследовании Cdc6/Orc1 у Sulfolobus solfataricus. Повтор13 связывающих белков называется miniORB, как минимальная версия ORB. Полный анализ микрообластей генома P. abyssi показал, что Cdc6/Orc1 связывается с ORIC областью с крайней специфичностью, и специфическое связывание P. furiosus Cdc6/Orc1 в ORB и miniORB было подтверждено в пробирке. Следует отметить, что многообразие точек инициации было определено в геноме Sulfolobus. В настоящее время хорошо известно, что есть три точки инициации у Sulfolobus, и они одновременно принимают участие в клеточном цикле.

Анализ механизма того, как несколько точек инициации используются для репликации генома является интересной темой в научно-исследовательской области изучения репликации ДНК архей. Главный вопрос заключается в том, как регулируется инициация репликации из нескольких точек инициации, и как протекает процесс репликационной вилки после столкновения двух вилок с противоположных направлений.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 2. Область ORIC в геноме Pyrococcus.

3. Как распознают Cdc6/Orc1 в ORIC?

Важным шагом в характеристике инициации репликации ДНК у архей - понять, как белок Cdc6/Orc1 признает область ORIC. На основе разбора аминокислотной последовательности архейных Cdc6/Orc1 установлено, что белки принадлежат к AAA+ семье белков. Были определены кристаллическая структура Cdc6/Orc1 белка из Pyrobaculum aerophilum и один из двух Cdc6/Orc1 белков, ORC2 из Aeropyrum Pernix (два гомолога в этом организме авторы называют ORC1 и ORC2 ). Эти Cdc6/Orc1 белки состоят из трех структурных доменов.

Домены I и II принимают складчатую структуру в семье AAA + белков. Свернутая крылатая спираль (WH), которая показывает число ДНК-связывающих белков, находится в области III. Четыре ORB расположены попарно с обеих сторон DUE в области ORIC у А. Pernix, и ORC1 связывается с каждым ORB в виде димера. Был предложен механизм, в котором ORC1 связывает все четыре ORB, чтобы ввести более высокий порядок сборки для разматывания DUE, с изменениями как в топологии, так и в суперспиральности. Кроме того, установлено, что кристаллическая структура Cdc6-1 и Cdc6-3 у С. solfataricus (два из трех Cdc6/Orc1 белков в этом организме) с образованием гетеродимера связана с ori2 ДНК (один из трех истоков в этом организме), и была определена область ORC1 у А. Pernix, связанная с последовательностью происхождения. Эти исследования показали, что N-концевой AAA + АТФазы домен (домен I + II) и С-концевой WH домена (домен III) способствуют процессу связывания ДНК и структурной информации не только определением полярности инициатором сборки на происхождение, а также указывают существенные искажения индукции, которые, вероятно, вызывают раскручивание ДНК-дуплекса, чтобы начать процесс репликации в ДНК. Эти структурные данные также предоставляют подробный режим взаимодействия между белком инициатора и ORIC в ДНК.

Мутационный анализ Methanothermobactor thermautotrophicus Cdc6-1 белка показал существенное взаимодействие между остатком аргинина, который сохраняется в архейных Cdc6/Orc1 и инвариантный гуанин в последовательности ORB. Область Cdc6/Orc1 в P. furiosus трудно привести в растворимую форму. Определенный сайт в ORIC, соответствующий раскручиванию в лабораторных условиях, был определен с помощью белка, подготовленного к процедуре денатурации-ренатурации.

Как показано на рисунке 2, область раскручивания составляет около 670 пар оснований от области перехода между ведущими и отстающими синтезами, которые были определены ранее в естественных условиях в точке инициации репликации (RIP). Хотя детали репликации, которая должна быть создана в развернутой области, полностью не поняты у архей, ожидается, что она минимально включает MCM, GINs, праймазы, PCNA, ДНК-полимеразы, и RPA, как описано ниже. Следующие исследования P. furiosus показали, что АТФазы Cdc6/Orc1 белка были полностью подавлены ??путем связывания с ДНК, содержащей ORB.

Эксперименты на ограниченный протеолиз и ДНКаза-I-отпечаток предположили, что Cdc6/Orc1 белок изменяет свою конформацию на последовательность ORB в присутствии АТФ. Физиологический смысл этого конформационного изменения не установлен, но оно должно выполнять важные функции, чтобы начать процесс инициации, как и в случае бактериального белка DnaA. Кроме того, результаты анализа в пробирке показали, что MCM (MCM белковый комплекс) в геликаза-репликативной ДНК, полученной в ORIC области, является Cdc6/Orc1-зависимым, но не АТФ-зависимым. Однако, этого сигнала недостаточно для активации функции раскручивания MCM, и некоторые другие функции еще предстоит определить, чтобы функциональная нагрузка этой геликазы содействовала прогрессированию вилки репликации ДНК.

4. MCM геликаза

После разматывания области ORIC, репликативная геликаза должна оставаться загруженной, чтобы обеспечить непрерывное раскручивание двухцепочечной ДНК по мере продвижения вилки репликации в двух направлениях. Комплекс белка MCM, состоящий из шести субъединиц (Mcm2, 3, 4, 5, 6, 7), как известно - «ядро» репликативной геликазы в эукариотических клетках.

MCM далее взаимодействует с Cdc45 и GINS с образованием тройной сборки, называющейся "CMG комплекс", который, как полагают, является функциональной геликазой в эукариотических клетках (рис. 3). Однако эта идея до сих пор не применима для эукариотических репликативных геликаз.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 3. ДНК-Амортизация комплекса у эукариот и архей

Комплекс CMG является репликативной геликазой для шаблона реакции раскручивания ДНК у эукариот. Геномы архей содержат гомологи MCM, GINS и белки, но гомологи Cdc45 не были идентифицированы. Последние исследования показывают, что RecJ-фильная экзонуклеазная GAN, которая имеет слабую гомологическую последовательность, что и Cdc45, может работать в качестве геликазного комплекса с MCM и GINS.

Большинство архейных геномов, по-видимому, кодируют по меньшей мере один Mcm гомолог и геликазу, и активность этих белков из нескольких архейных организмов была подтверждена в пробирке. В отличие от эукариотических MCM, архейные MCM состоят из гомогексамера или двойного гомогексамера, которые имеют различные активности геликазы ДНК сами по себе в пробирке, и, следовательно, эти MCM сами по себе могут функционировать как репликативная геликаза в естественных условиях.

В настоящее время проводится большое количество исследований Структурно-функциональных отношений в архейных MCM с использованием очищенных белков и сайт-направленного мутагенеза. Первоначальный отчет использования ChIP метода показал, что белок MCM у P. Abyssi преимущественно связывается с инициацией в естественных условиях в экспоненциально растущих клетках. MCM геликаза в P. furiosus не отображает значительной активности геликазы в пробирке. Однако активность ДНК геликазы явно стимулировали добавлением GINS (Gins23-Gins51 комплекс), который является гомологом эукариотического GINS комплекса (описано ниже более подробно). Этот результат позволяет предположить, что работа комплекса с другими сопутствующими факторами в ядре комплекса в P. Furiosus похожа на эукариотический комплекс CMG, как описано выше.

Некоторые археи имеют более двух Cdc6/Orc1 гомологов. Было обнаружено, что два Cdc6/Orc1 гомолога, Cdc6-1 и Cdc6-2, подавляют геликазную активность MCM в M. thermautotrophicus. Аналогично, Cdc6-1, ингибирует активность в MCM у С. solfataricus. В противоположность этому, Cdc6-2 белок является стимулятором геликазной активности MCM в Thermoplasma acidophilum. Функциональное взаимодействие между Cdc6/Orc1 и белками МСМ должно быть исследовано более подробно для достижения более глубокого понимания сохранения и разнообразия механизмов инициирования репликации ДНК у архей.

Еще одна интересная особенность начала репликации ДНК заключается в том, что несколько архей имеют несколько генов, кодирующих гомологи MCM в их геномах. На основе последнего комплексного анализа генома, тринадцать видов архей имеют более одного MCM гена. Тем не менее, многие из MCM генов в геноме архей, кажется, находятся внутри подвижных элементов, имеющих вирусное происхождение. Например, два из трех генов в геноме Thermococcus kodakarensis располагаются в областях, куда генетические элементы, возможно, были интегрированы.

Создание системы генетических манипуляций для Т. Kodakarensis является первой для гипертермофильных эвриархей и выгодно для исследования функции этих MCM белков. Две группы недавно провели эксперименты по разрушению генов для каждого гена MCM. Эти эксперименты показали, что штамм-нокаут для MCM1 и MCM2 было легко выделить, но MCM3 не может быть нарушена. Содержится значительное количество MCM 3 в клетках Т. Kodakarensis. Кроме того, лабораторный эксперимент с использованием очищенного белка MCM показал, что только форма MCM 3 обладает стабильной гексамерной структурой в растворе. Эти результаты подтверждают утверждение, что MCM 3 является основным белком в основной геликазе в нормальном процессе репликации ДНК у T. kodakarensis.

Функции двух других белков MCM до конца не изучены. Гены для MCM1 и MCM 2 стабильно передаются по наследству, и их генные продукты могут выполнять некоторые важные функции в метаболизме ДНК у T. kodakarensis. Активность ДНК геликазы рекомбинантного белка MCM1 обладает высокой активностью в лабораторнцх условиях, и различные количества белка MCM1 присутствует в клетках T. kodakarensis. Кроме того, MCM1 функционально взаимодействует с комплексом GINS из T. Kodakarensis. Эти наблюдения являются убедительным доказательством того, что MCM1 действительно участвует в некоторых процессах ДНК, а так же может быть замещена MCM 3.

Наши эксперименты показали, что иммунопреципитация MCM1 сопоставима с MCM 3 и GINS, и хотя они не образуют гетерогексамерного комплекса, предполагают, что MCM1 участвует в реплисоме или репарсоме и выполняет некоторые функции в клетках Т. kodakarensis. Хотя западный блот-анализ не смог обнаружить MCM 2 в выписке из экспоненциально растущей клетке T. kodakarensis, RT-PCR эксперимент обнаружил наличие следов гена MCM2 в клетках. Рекомбинантный белок MCM 2 также имеет АТФазы и геликазы деятельности в пробирке. Таким образом, ген MCM2 экспрессируется в нормальных условиях роста и может работать в некоторых процессах с быстрой отдачей. В будущем необходимы эксперименты по измерению эффективности транскрипции гена MCM2 на количественной ПЦР, а также оценка стабильности белка MCM2 в экстракте клеток.

Фенотипический анализ исследования чувствительности Д MCM1 и Д MCM2 мутантных штаммов на повреждения ДНК, вызванными различными мутагенами, как сообщалось для других репараций ДНК генов, связанных в Т.kodakarensis, может дать ключ к выяснению функции белков MCM. Methanococcus maripaludis S2 имеет области четырех MCM в своем геноме, три из которых, кажется, быть получены из фага, направленное протеомическое исследования выявило пептиды, происходящих из трех из четырех продуктов гена MCM. Кроме того, четыре генных продукта совместной экспрессии в клетке E.coli совместно очищаются таким же фракциями. Эти результаты позволяют предположить, что несколько белков MCM являются функциональными в клетках М. maripaludis.

5. Комплектование MCM в области ORIC

Другой важный вопрос - как MCM комплектуется на развернутой области ORIC. Детальный механизм загрузки геликазы MCM не выяснен. Считается, что архебактерии используют различные механизмы сборки геликазы MCM в ORIC.

Анализ набора в лабораторных условиях показал, что MCM у P. Furiosus комплектует ORIC ДНК Cdc6/Orc1-зависимым образом. Этот анализ показал, что предварительная загрузка Cdc6/Orc1 на ORB ДНК приводит к явному снижению комплектации MCM в регионе ORIC, полагая, что свободные Cdc6/Orc1 предпочтительнее в качестве геликазного сборщика, сообщающегося с MCM и доводящий его до ORIC. Было бы интересно понять, каким образом две задачи, инициация распознавания и комплектование MCM, выполняются в белке Cdc6/Orc1, так как домен WH, который в первую очередь распознает и связывает ORB, также имеет сильное сродство к белку MCM.

Сборка белка MCM на ДНК ORB Уокер-мутанта P. furiosus в Cdc6/Orc1 произошла с той же эффективностью, что и в немутантных типах Cdc6/Orc1. В случае ДНК-связывания Cdc6/Orc1 у P. Furiosus имеет сходство в присутствии и в отсутствии АТФ, как и в случае инициации белков из Archaeoglobus fulgidus, С. solfataricus, А. Pernix. Так что до сих пор не известно, является ли обязательным гидролиз АТФ, и регулирует ли активность Cdc6/Orc1 набор белков MCM на ORIC в клетках.

Еще одной важной проблемой является очень низкая эффективность сборки белков MCM, о чем стало известно в лабораторных исследованиях. Количественная оценка сборки белка MCM в лабораторных условиях показала, что в ORB было собрано менее одного гексамера MCM. Стало известно, что линейные ДНК, содержащие ORB1 и ORB2, используемые в проверке сборки, не могут быть пригодны для восстановления механизма репликации ДНК у архей, и может потребоваться шаблон, который будет более точно имитировать хромосомную ДНК.

Кроме того, может оказаться, что еще не идентифицированы белки, необходимые для достижения эффективной сборки геликазы в клетках P. furiosus в лабораторных условиях. Наконец будет необходимо построить в лабораторных условиях более определенную систему репликации для анализа регуляторных функций Cdc6/Orc1 именно в процессе инициации репликации.

В М. thermautotrophicus белки Cdc6-2 могут отделяться мультимерами MCM. Cdc6-2 может потребоваться в качестве грузчика MCM геликазы в организме. Взаимодействие между Cdc6/Orc1 и MCM, вероятно, общее для изучаемых организмов. Тем не менее, влияние Cdc6/Orc1 на активность геликазы MCM отличается у различных организмов, как описано выше. Некоторые другие белковые факторы могут действовать у различных архей, например белок, отдаленно связаный с эукариотической Cdt1, который играет решающую роль во время комплектации MCM у эукариот, существует у некоторых архей, хотя его функции еще не были охарактеризованы.

6. GINS

Эукариотический комплекс GINS был первоначально идентифицирован в Saccharomyces cerevisiae как существенный белковый фактор для инициации репликации ДНК. GINS состоит из четырех различных белков, Sld5, Psf1, Psf2 и Psf3 (поэтому, GINS является акронимом от японского go-ichi-ni-san, то есть цифры 5-1-2-3 после этих четырех субъединиц). Сохранение последовательности аминокислот из четырех субъединиц в комплексе GINS предполагает, что они являются паралогами предковой формы. Тем не менее, большинство архейных геномов имеют только один ген, кодирующий этот белок, и, что более интересно, Crenarchaeota и Euryarchaeota (два основных рода архей) имеют два гена с последовательностями, аналогичными Psf2 и Psf3 и Sld5 и Psf1, их соответственно называют GINS23 и GINS51.

Гомолог GINS, обозначенные как GINS23, был обнаружен биохимически в С. solfataricus как первый белок GINS в археях, в процессе дрожжевого двухгибридного скрининга взаимодействия партнеров MCM белка и другой субъединицы, обозначенной как GINS15, был идентифицирован масс-спектрометрическим анализом иммуноаффинно-очищенного нативного GINS из экстракта S. Solfataricus. У S. solfataricus GINS состоит из двух белков, Gins23 и Gins15, и образует тетрамерную структуру с молярным соотношением 2:2. GINS из P. furiosus, комплекс GINS23 и GINS51, с соотношением 2:2, был определен в качестве первого эвриархейного комплекса GINS. Было отдано предпочтение белку GINS51, потому что GINS15 не соответствовал порядку цифр в аббревиатуре GINS.

Гексамер MCM2-7 был сопоставлен в комплексе с Cdc45 и GINS из зародышей Drosophila melanogaster и S. cerevisiae, а "CMG (Cdc45-MCM2-7-GINS) комплекс", как описано выше, должен быть важен для функции репликативной геликазы. Комплекс CMG был также связан с репликативной вилкой в экстрактах яиц Xenopus laevis, и большой молекулярный механизм, содержащий Cdc45, GINS и MCM2-7, был предложен в качестве анвиндосомного отделителя ДНК в репликативной вилке.

Поэтому, GINS должны быть решающим фактором не только для процесса инициации, но и процесса пролонгации эукариотической репликации ДНК. Так как комплекс GINS у S. solfataricus взаимодействует с MCM и праймазой, предполагается, что GINS состоит в реплисоме. Конкретные функции GINS в реплисоме еще предстоит определить. Стимуляции или ингибирования геликазной или примазной активностей при взаимодействии GINS S. Solfataricus в лабораторных условиях не наблюдалось. С другой стороны, активность MCM геликазы ДНК P. Furiosus явно стимулировали добавлением к P. Furiosus комплекса GINS, как описано выше.

В отличие от S. solfataricus и P. furiosus, каждый из которых экспрессирует GINS23 и GINS51, Thermoplasma acidophilum имеет один гомолог GINS, GINS51. Рекомбинантный белок из GINS51 T. Acidophilum принял форму гомотетрамера, что было определено при помощи гель-фильтрации и электронной микроскопии. Кроме того, физическое взаимодействие между T. acidophilum GINS51 и MCM было обнаружено при помощи поверхностного плазмонного резонансного анализа (SPR). Несмотря на то, что GINS51 у T. acidophilum не влияет на геликазную активность, его родственные MCM, при равном соотношении каждой молекулы, были испытаны в лабораторных условиях, и избыточное количество Gins51 ясно стимулировало геликазную активность. В случае T. kodakarensis, АТФазы и геликазная активность MCM1 и MCM3 явно стимулируется GINS T. Kodakarensis в лабораторных условиях. Интересно, что деятельность геликазы MCM1 имеет более сильный стимул, чем у MCM3.

Также были обнаружены физические взаимодействия между GINS T. Kodakarensis и белками МСМ. Эти сообщило о том, что МСМ-GINS комплекс является общей частью репликативной геликазы у архей. Недавно определенная кристаллическая структура тетрамера GINS в T. Kodakarensis, состояая из GINS51 и GINS23, была определена как схожая со структурой GINS человека. Каждая субъединица GINS человека разделяет аналогичные фрагменты, и собирается в гетеротетрамер уникальной трапециевидной формы. Sld5 и Psf1 обладают б-спиральным (A) доменом на N-конце и в-многожильным доменом (B) на С-конце (AB-тип).

С другой стороны, Psf2 и Psf3 являются перестановкой предыдущей версии (BA-тип). Основные структуры каждой субъединицы и тетрамерной сборки GINS T. kodakarensis аналогичны GINS человека. Однако, расположение С-концевого домена B из GINS51 удивительно различается между двумя структурами GINS.

Гомологичная модель гомотетрамерного GINS из T. acidophilum была собрана с использованием кристаллической структуры GINS T. kodakarensis в качестве шаблона. GINS51 имеет длинную неупорядоченную область, вставленную между А и В областями, и это позволяет конформации С-концевых доменов быть более гибкой. Это расположение домена приводит к образованию асимметричного гомотетрамера, вместо симметричной собрки GINS в T. kodakarensis.

Cdc45 белок повсеместно распространен от дрожжей до человека, что подтверждает мнение, что образование комплекса CMG является универсальным в эукариотических процессах репликации ДНК. Однако никаких гомологов Cdc45 у архей выявлено не было. Недавний доклад о биоинформатическом анализе показал, что первичная структура эукариотической и прокариотической Cdc45 RecJ имеют общих предков. Действительно, гомолог ДНК-связывающего домена RecJ был совместно очищен с помощью GINS из S. solfataricus.

Наш опыт обнаружил стимуляцию 5'-3' экзонуклеазной активности гомологов RecJ из P. Furiosus и Т. Kodakarensis по родственным комплексам GINS. Гомолог RecJ из T. kodakarensis образует стабильный комплекс с GINS, а экзонуклеазная деятельность 5'-3' усиливается в лабораторных условиях, поэтому гомолог RecJ в недавней работе был обозначен как GAN, от GINS-Associated Nuclease.

Другой доклад отмечает, что структура Cdc45 человека, полученная анализом малого угла рассеивания рентгеновских лучей (МУР) согласуется с кристаллографической структурой семьи RecJ. Эти результаты будут способствовать дальнейшему исследованию структуры и функции высшего порядка анвиндосом в археях и в эукариотических клетках.

7. Праймазы

В инициации синтеза цепи ДНК праймаза необходима для синтеза короткого олигонуклеотида в качестве праймера. DNAG и белки p48-p58 являются праймазами у бактерий и эукариот соответственно. P48-p58 праймаза далее образует комплекс с p180 и p70, чтобы сформировать ДНК-полимеразу б-праймазного комплекса. Каталитические субъединицы эукариотической (p48) и архейной праймаз отчасти схожи, но имеют отчетливую гомологичную последовательность с такими же праймазами семейства X-полимеразы ДНК.

Впервые архейная праймаза была идентифицирована с Methanococcus jannaschii, как ORF с последовательностью такой же, как у эукариотической p48. Продукты гена проявили активность ДНК-полимеразы и смогли синтезировать олигонуклеотиды на матричной ДНК.

Мы характеризовали p48-подобный белок (p41) из P. furiosus. Неожиданно было установлено, что у архей белок p41 не синтезирует короткие РНК сам по себе, но преимущественно использует дезоксинуклеотиды, позволяющие синтезировать ДНК до несколько тысяч пар нуклеотидов в длину. Кроме того, ген, находящийся по соседству с геном p41, кодирует белок с очень слабым сходством с p58-субъединицей эукариотической праймазы. Генный продукт, обозначенный p46, в лабораторных условиях фактически образует стабильный комплекс с p41, и комплекс может синтезировать короткие РНК праймеры, а также ДНК из нескольких сотен нуклеотидов.

Короткие РНК, но не ДНК-праймеры, были обнаружены в клетках Pyrococcus, так что можно предположить, что некоторые механизмы преимущественно использовали РНК-праймеры, которые существуют в клетках.

Дальнейшие исследования по гомологам праймаз из S. solfataricus, Pyrococcus horikoshii, P. Abyssi, в лабораторных условиях дали схожие результаты. Примечательно, что p41 является каталитической субъединицей, и он один модулирует активность в гетеродимерных праймазах архей.

Малые и большие субъединицы также называют PRIS и PRIL соответственно. Кристаллическая структура N-концевого домена PRIL, объединенной с PRIL, в праймазе S. solfataricus показала, что PRIL не контактирует непосредственно с активным сайтом PRIS и, следовательно, большие субъединицы могут взаимодействовать с синтезированными праймерами, для регулировки его длины до 7-14 мер. Структура каталитического центра аналогична полимеразе семейства X-ДНК.

3'-концевая нуклеотидная трансферазная активность, обнаруженная в праймазе S. solfataricus, а также заполнение пробелов и странд-смещение деятельности в праймазе P. abyssi также поддерживают структурное сходство между PRIS и семейством X-полимераз ДНК. Уникальная область, названная PADT, обнаруженная в комплексе PRISL в S.solfataricus, была научно опубликована совсем недавно.

Область может быть включена в восстановление двунитевой цепочки у архей. Архейный геном также кодирует последовательность, похожую на бактериальную праймазу типа DNAG. Гомолог DNAG из генома P. furiosus была выделен в E. coli, но в лабораторных условиях белок не показал активность синтеза праймера, и таким образом, архейный DNAG-подобный белок не может действовать в качестве праймазы в клетках Pyrococcus.

Исследованием DNAG-подобного белка было доказано участие в деградации РНК, как компонента экзосомы. Тем не менее, в недавно опубликованной статье сообщается, что гомолог DNAG из S. solfataricus фактически синтезирует праймеры с 13 нуклеотидных цепочек. Было бы интересно узнать, если две различные праймазы разделят праймер синтеза для ведущих и отстающих нитей репликации, в клетке Sulfolobus, по предположению авторов.

Интересна предлагаемая гипотеза об эволюции PriSL и DNAG из последнего универсального общего предка (LUCA). Белок PriSL в клетке Sulfolobus продемонстрировал как происходит взаимодействие с MCM через GINS23. Это праймазно-геликазное взаимодействие, вероятно, обеспечивает связь раскручивания ДНК и праймера при продвижении вилки репликации.

Кроме того, непосредственное взаимодействие между PriSL и загрузчика RFC (описанное ниже) в S. solfataricus может регулировать синтез праймера и передачи его в ДНК-полимеразные клетки архей.

8. Одноцепочечный ДНК-связывающий белок

Одноцепочечный ДНК-связывающий белок, который называется SSB у бактерий и архей и RPA у эукариот, является важным фактором для защиты разматывания одноцепочечной ДНК при нуклеазной атаке, химических модификаций и других нарушений во время процессов репликации и репарации ДНК. SSB и RPA имеют структурно подобные домены, содержащие общие фрагменты, называемые OB (олигонуклеотид / олигосахарид-связывающие) фрагменты, хотя и имеют малое сходство в своих аминокислотных последовательностях.

Общая структура позволяет предположить, что механизм одноцепочечного ДНК-связывания сохраняется в живых организмах, несмотря на отсутствие сходства последовательностей. Белок SSB у E. coli является гомотетрамером от 20 кДа пептида с одним ОВ-фрагментом и SSB от Deinococcus radiodurans и Thermus aquaticus, состоящий из гомодимера пептида, содержащего два OB-фрагмента.

Эукариотическая RPA является стабильным гетеротримером, состоящим из 70, 32 и 14 кДа белка. RPA70 содержит два тандемных повтора ОВ-фрагмента, которые отвечают за основные взаимодействия с одноцепочечной ДНК в ее центральной области. N-концевые и С-концевые области RPA70 осуществляют взаимодействие с RPA32, а также со многими клеточными или вирусными белками. RPA32 содержит ОВ-фрагменты в центральной и С-концевой областях взаимодействия с другими субъединицами РПА и различными клеточными белками. RPA14 также содержит ОВ-фрагменты.

Эукариотические RPA взаимодействуют с SV40 Т-антигеном и ДНК-полимеразами б-примазного комплекса, и таким образом формируют часть комплекса инициации при репликации. RPA также стимулирует Polб-праймазную активность и PCNA-зависимые Polд активности. RPA от М. jannaschii и М. thermautotrophicus были зарегистрированы в 1998 году, как первый одноцепочечный ДНК-связывающий белок архей. Эти белки имеют сходства их аминокислотных последовательностей с эукариотической RPA70 и содержат четыре или пять повторов ОВ-фрагмента и один цинк-направляющий фрагмент.

RPA в М.jannaschii существует в виде мономера в растворе и имеет однонитевой ДНК-связывающий фрагмент. С другой стороны, RPA P. furiosus образует комплекс, состоящий из трех отдельных подразделений, RPA41, RPA32 и RPA14, похожих на эукариотические RPA. В лабораторных условиях RPA в P. furiosus поразительно стимулирует RADA-раскрученные обменные реакции.

В то время как у эвриархей имеются гомологи эукариотического типа RPA, кренархейные белки SSB оказываются гораздо более связанными с бактериальными белками, с одной стороны имея OB-фрагмент и с другой стороны С-концевой хвост. Однако кристаллическая структура белка SSB из S. solfataricus показала, что ОВ-фрагменты домена больше похожи на эукариотические гомологи RPA, что поддерживает тесную связь между археями и эукариотами.

RPA из Methanosarcina acetivorans демонстрирует уникальные свойства. В отличие от нескольких белков RPA в других архебактериях и эукариотах, каждая субъединица RPA в M.acetivorans - RPA1, RPA2 и RPA3 являются 4, 2 и 2 OB-фрагментами соответственно, и могут выступать в качестве отдельных одноцепочечных ДНК-связывающих белков. Кроме того, каждый из трех белков RPA, а также их комбинации, очевидно, стимулируют активность удлинения праймера BI ДНК-полимеразы М. acetivorans,

как было показано ранее в лабораторных условиях для бактериальных SSB и эукариотических RPA.

Архитектура SSB и RPA предполагает, что они состоят из различных комбинаций OB-фрагментов. Бактериальные и эукариотические организмы содержат один тип SSB или RPA соответственно. С другой стороны, организмы архей имеют различные RPA, состоящие из различных организаций ОВ-фрагментов. Гипотезу, что гомологичная рекомбинация может играть важную роль в создании такого разнообразия OB-фрагментов в клетках архей была предложена на основе экспериментов, характеризующих соединение RPA с различными OB-фрагментами.

9. ДНК-полимераза

ДНК-полимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи между терминалом 3'-ОН праймазы и б-фосфатом входящего трифосфата для продления короткого праймера, и, следовательно, основного игрока в процессе репликации ДНК. На основе сходства их аминокислотных последовательностей ДНК-полимеразы были разделены на семь семей: A, B, C, D, E, X и Y.