Зміни властивостей мієлінової оболонки за умов ішемічного ушкодження

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміст

Вступ

1. Структура мієлінової оболонки

2. Зміни мієлінової оболонки при ішемічному ушкодженні

2.1 Сучасні уявлення про ішемію мозку

2.2 Види ішемічних мозкових ушкоджень

2.3 Вплив гіпоксія-індукованого фактору на стан мієліну

2.4 Дані про вплив ішемії мозку на експресію ОБМ

2.5 ОБМ - важливий діагностичний показник ішемічного ушкодження мозку

2.6 Нейротропний вплив препарату енцефабол за умов ішемії мозку

2.7 Ішемія мозку та енергетичний дефіцит олігодендроцитів

2.8 Дегенерація олігодендроцитів та їх відновлення після фокальної ішемії мозку

Висновки

Список бібліографічних посилань

Вступ

Мієлінова оболонка - це комплекс ліпідних та білкових компонентів, утворений мембранами гліальних клітин, сконцентрованих навколо аксонів нейронів. Відкриття мієліну приписують видатному вченому німецькому Рудольфу Вірхову (1854 р.), який використовував методи світлової мікроскопії для вивчення структури тваринних тканин. Детальне вивчення мієлінової оболонки аксонів дозволило з'ясувати механізми процесу передачі нервових імпульсів. Функціями мієлінової оболонки є: прискорене проведення нервового збудження, побудова опорного молекулярного матриксу аксонів та забезпечення процесів їх трофічного росту, а також підтримка сталості систем міжклітинної комунікації [1].

Обмін компонентів мієліну постійно змінюється протягом онтогенезу. У мозку гризунів структура мієлінової оболонки змінюється з віком: у молодих та дорослих особин спостерігається максимальний вміст компонентів мієліну у білій речовині мозку, а за умов старіння домінують катаболічні процеси і кількість мієліну зменшується у декілька разів.

Різні патологічні стани нервової системи або усього організму в цілому можуть суттєво порушувати структуру мієлінової оболонки. Так, за умов ішемічного інсульту спостерігаються деструктивні зміни зони компактного мієліну аксонів у різних відділах головного мозку. При цьому вміст протеоліпідного білка (ліпофіліну), основного білка мієліну (ОБМ) та мієлін-асоційованого глікопротеїну у нервовій тканині є низьким.

Мета курсової роботи - вивчення змін метаболізму мієлінової оболонки на прикладі основного білка мієліну у мозку ссавців протягом старіння та на початкових етапах постнатального розвитку.

Згідно з метою були поставлено завдання: на основі аналізу сучасних літературних джерел з'ясувати структурно-фунціональні зміни мієліну за умов ішемічного ушкодження мозку гризунів.

1. Структура мієлінової оболонки

Мієлінізація нервових волокон ЦНС - динамічний процес, в основі якого лежить багаторівнева координація проліферації і диференціації клітин-попередників (OPCs) в зрілі олігодендроцити. Ці процеси необхідні для побудови мієлінових оболонок навколо аксонів нейронів, що, в свою чергу, служить умовою для забезпечення швидкої стрибкоподібної нервової провідності. Розкриття механізмів і молекулярних посередників мієлінізації служить важливою ланкою для розуміння біології нейро-гліальних взаємодій і має важливе практичне значення при лікуванні демієлінізуючих розладів ЦНС [2].

Рентгеноструктурний аналіз та електронна мікроскопія внесли свій внесок у вивчення структури мієлінових оболонок (мієліну). Виняткова властивість цих мембран полягає в тому, що їх формування здійснюється шляхом спірального обвиття відростків олігодендроглії в ЦНС і шванноцитів у ПНС навколо аксонів нервових клітин. За даними електронної мікроскопії у структурі мієліну виділяють суцільні концентрично розташовані темні лінії, відокремлені одна від одної світлими проміжками. Подвійна мембрана клітини декілька разів спірально закручується навколо аксона. Темні лінії утворюються призлитті внутрішніх листків клітинної мембрани, асвітлі- зовнішніх. Внутрішні листки складаються зліпідів, азовнішні - збілків.

Ліпіди мієліну представлені фосфоліпідами, гліколіпідами іхолестеролом. Вони побудовані заєдиним планом, мають гідрофобний компонент («хвіст») і гідрофільну групу («голівку»). На частку холестеролу відводиться близько 28%, 43% - нафосфоліпіди і 29% становлять гліколіпіди (галактоліпіди).

За допомогою рентгеноструктурного аналізу тканин головного мозку щурів досліджено білкові компоненти мієліну (29 білків). Докладно вичені основний білок мієліну (myelin basic protein або MBP), протеоліпідний білок, мієлін-асоційований глікопротеїн (рис. 1. 1), конексин 32 та периферичний мієліновий білок [3].

Рис. 1.1. Білки мієліну: MAG - мієлін-асоційований глікопротеїн; MOG - мієлін-олігодендроцитарний глікопротеїн; PLP - протеоліпідний білок (ліпофілін); MBP - основний білок мієліну (ОБМ)

Процеси утворення мієлінової оболонки у центральній та периферичній нервовій системі мають певні відмінності. При формуванні мієліну ЦНС один олігодендрогліоцит має ??'язки з декількома сегментами мієліну кількох аксонів; при цьому до аксона приєднується відросток олігодендрогліоциту, розташованого на деякій відстані від аксона, а зовнішня поверхня мієліну контактує з позаклітинним простором. Шванівська клітина при утворенні мієліну ПНС формує спіральні пластинки мієліну та відповідає лише за окрему ділянку оболонки між перехватами Ранв'є. Цитоплазма шванівської клітини витискується з простору між спіральними витками і залишається тільки на внутрішній та зовнішній поверхнях мієлінової оболонки

Мієлінові оболонки нервових клітин ЦНС і ПНС мають високий вміст специфічного маркерного протеїну - основного білка мієліну (далі - ОБМ) [4]. Показано, що нервові волокна, у складі яких виявлено цей протеїн, можуть максимально ефективно проводити нервове збудження. Тому ОБМ - це важливий структурний білок, який бере участь у синтезі мієліну і грає важливу роль в ЦНС [5, 6].

Транскрипційні продукти гена ОБМ в людини, миші та щура відрізняються. Виділяють, принаймні, 5 видів транскриптів, у тому числі білки з молекулярними масами 21,5 кДа, 18,5 кДа, 17а, 17b і 14 кДа в мозку миші. Тим не менш, є тільки 4 види продуктів, що складаються з 21,5 кДа, 20,2 кДа, 18,5 кДа і 17,3 кДа-ізоформ ОБМ в людському мозку, з яких 18,5 кДа ОБМ є основним протеїном у зрілому мозку [7, 8]. Ген ОБМ людини розташований на 18-й хромосомі і має у своєму складі 3 промоторні області для ініціації зчитування інформації [3].

ОБМ щура представлений чотирма изоформами з молекулярними масами 21,5, 18,5, 17,0 і 14,0 кДа відповідно. Якщо говорити про перші дві ізоформи білка, то їх кодують екзони, комплементарні людським за нуклеотидними послідовностями, проте відмінні за кількістю окремих нуклеотидів. При експресії ізоформ ОБМ з молекулярними масами 17,0 і 14,0 кДа в першому випадку відбувається делеція 6-го екзону, в другому - 2 і 6-го екзонів відповідно [3].

Білковий продукт гену ОБМ - основний компонент мієлінової оболонки, вміст якого може становити до 80% сухої маси білкових компонентів мієліну [6]. Висока експресія гену ОБМ спостерігається саме в олігодендроцитах головного мозку на рівні РНК згідно з даними серійного аналізу генної експресії (SAGE) [9].

ОБМ [10] локалізований в серозній поверхні мієліну і тісно інтегрований у сфінголіпідний матрикс [10]. Такий тісний контакт важливий для стабілізації олігодендроглії ЦНС [11]. Втрата білка призводить до перешкоди мієлінізації, оскільки зниження рівня його експресії в тканинах мозку відображає тяжкість ушкодження ЦНС і мієліну [12, 13]. Експерименти на тваринах [14] довели, що в головному мозку дорослих щурів транскрибується незначна кількість ОБМ мРНК, в той час як максимум експресії білка припадає на початковий постнатальний розвиток.

2. Зміни мієлінової оболонки при ішемічному ушкодженні

2.1 Сучасні уявлення про ішемію мозку

Ішемічне ураження органів чи тканин виникає внаслідок повного припинення чи зменшення притоку до них артеріальної крові, у зв'язку з повною або частковою обтурацією, звуженням аретерій й артеріол, що призводить до тимчасової дисфункції чи ушкодженню ураженого органу.

Ішемія головного мозку та серця нині є головними причинами інвалідизації та смертності (при інсультах стовбурової частини мозку), які викликають тяжкі цереброваскулярні наслідки, зокрема погіршення стану організму [15].

В основі патогенезу ішемії мозку (головного або спинного) гостре чи хронічне (рис. 2.1) кисневе голодування, нестача поживних речовин, необхідних для нормального функціонування клітин. Це може призвести до загибелі останніх [16].

Рис. 2.1. Хронічна ішемія головного мозку

Виділяють декілька груп патогенетичних факторів, в результаті яких розвивається ішемія мозку:

А) морфологічні зміни судин, які забезпечують кров'ю тканину мозку - аномалії великих церебральних судин, оклюзуючі ураження (атеросклеротичні бляшки (рис. 2.2), тривалий спазм судини, підвищене тромбоутворення), порушення конфігурації та форми судин (аневризми, вроджені вади судинної стінки та судинні мальформації);

Б) зміни фізико-біохімічних показників крові та систему гомеостазу - підвищене згортання крові та збільшення агрегації формених елементів зі схильністю до тромбоутворення, зміна вмісту білкових фракцій (диспротеїнемії), зміни електролітного складу крові (при патології нирок чи ендокринних захворюваннях);

В) розлади загальної та церебральної гемодинаміки, які сприяють зниженню інтенсивності мозкового кровообігу - серцево-судинні захворювання в стадії декомпенсації, тяжкі анемії, токсичні ураження;

Г) вікові та індивідуальні особливості метаболізму нейронів з різною реакцією на локальне обмеження мозкового кровотоку [17].

Рис. 2.2. Атеросклеротична бляшка у серединній мозковій артерії (у центрі)

2.2 Види ішемічних мозкових ушкоджень

Незалежно від причини ішемічного ушкодження нейронів результатом є виникнення осередку фокальної (точкової) ішемії - ішемічного інсульту або прогресуючої дисфункції головного мозку. Хронічна ішемія формується при тривалій недостатності кровообігу тканини мозку внаслідок ушкодження нейронів [18].

Ішемія мозку буває глобальною чи осередковою (локальною). У свою чергу, глобальна ішемія може бути незворотньою, наростаючою й транзиторною (перехідною). Так, глобальна та незворотня ішемія мозку характерні для передлетального стану мозга. Глобальна наростаюча ішемія спостерігається за умов агонії. У результаті цих двох типів глобальної ішемії у мозковій тканині розвиваются аутолітичні процеси [19].

Виділяють також транзиторні (перехідні) порушення мозгового кровообігу, прояви яких лежать в основі передінсультних станів і виникають раптово. До них відносять: сильний головний біль, запаморочення, порушення зору (при цьому втрачається половина зорового поля чи може має місце повна втрата зору), розлади другої сигнальної системи (мовлення), порушення орієнтувальних рефлексів, зниження пам'яті тощо.

Основним етіологічним фактором розвитком хронічної ішемії мозку є поєднання артеріальної гіпертензії з атеросклеротичним ураженням церебральних судин. За умов атеросклерозу холестеринові бляшки трансформуються в тромби. Останні - облітеруючий фактор для судин. При відриві частини бляшки спостерігається оклюзія судини, що, у свою чергу, призводить до ішемізації певної ділянки мозку з наступним формуванням патологічного осередку загиблих внаслідок острої гіпоксії клітин [20].

У результаті повільного прогресування хронічної ішемії формуються зони ураження дрібних артерій та/або великих артеріальних стовбурів. При ураженні артеріол розвивається осередкове чи дифузне пошкодження тканини мозку у вигляді мікроінфарктів. Патологічні зміни великих артерій - причина територіальних (генералізованих) мозкових інфарктів [21] (рис. 2. 3 та рис. 2.4).

2.3 Вплив гіпоксія-індукованого фактору на стан мієліну

Як було зазначено вище, мієлінові мембрани - обов'язкова складова нервової тканини, ключовою функцією яких є інтеграція передачі нервового збудження. По-перше, так досягається сальтаторна (прискорена) трансдукція сигналу від нейрону до виконавчої (ефекторної) клітини (нейро-ефекторна комунікація). По-друге, завдяки наявності специфічних гідрофобних білків мієлінова оболонка стабілізує аксони, регулюючи поширення потенціалу дії за колатеральним (аксон одного нейрону > колатеральний (лінкерний) відросток > аксон другого нейрону) та ортодромним (дендрит > сома нейрону > аксон > клітина-ефектор) механізмами.

Рис. 2.3. Фронтальний зріз на рівні передньої третини варолієвого мосту. Джерело ішемічного інфаркту мосту, що розвинувся в результаті травматизації скроневої долі головного мозку

Рис. 2.4. Некроз нейронів у периферичних ділянках інфаркту мозку, х200 (забарвлення за Нісслем)

За умов фокальної ішемії, коли тільки формується осередок ураження, метаболізм ендотелію та астроглії змінюється. Ендотеліоцити починають синтезувати у високих концентраціях гіпоксія-індукований факор HIF-1б (hypoxia-inducible factor 1-alpha, фактор, індукований гіпоксією) (рис. 2.5).



Рис. 2.5. Структура фактору, індукованого гіпоксією (HIF-1б)

За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР) встановлено, що за експресію HIF-1б відповідає ген hif1A, який у людей міститься на 14-й, у мишовидних гризунів - на 12-й хромосомі. Експресія гену hif1A регулюється ядерним транскрипційним фактором NF-кB [22, 23].

Для HIF-1б властива пара- та аутокринна дія. Показано, що він за допомогою спеціальних транспортних білків може переноситися на клітини, які тісно межують з ендотелієм. Продемонстровано, що астроглія та інші типи гліоцитів також здатні продукувати HIF-1б. Гіпоксія-індукований фактор у невеликих концентраціях підвищує резистентність клітин до кисневого голодування, проте його надлишок знижує метаболічний потенціал останніх, що може призвести до некрозу ішемізованих тканин.

HIF-1б - це транскрипційний регуляторний фактор, який є гетеродимером і складається з двох субодиниць: б і в. Субодиниця в є спеціальним рецепторним комплексом Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator), який транспортує б-субодиницю в ядро клітини. Далі HIF-1б вибірково впливає на експресію гіпоксія-відповідаючих ділянок генів [23].

Олігодендроцити, що формують мієлінову оболонку навколо аксонів, на відміну від інших типів гліальних клітин, є найбільш чутливими до дії HIF-1б, оскільки не мають відповідних захисних механізмів для підтримки рівня аденозинтрифосфату (АТФ) та інших макроергів, в результаті чого може відбуватися їх загибель шляхом некрозу, рідше - апоптозу. Значна втрата клітин цього типу вважається однією з важливих причин демієлінізації. В невисоких концентраціях HIF-1б, навпаки, підвищує стійкість олігодендроглії до ішемії через активацію кінази р38МАРК/МSK-1, яка запускає МАР-кіназний сигнальний шлях [22].

У головному мозку новонароджених тварин гіпоксія-індукований фактор - один з головних ключових факторів, які разом з генами Wnt7а/7b впливають на розвиток білої речовини, стимулюють ангіогенез у зв'язку з потребами нейронів та глії в умовах гіпоксії. Це забезпечує функціонування проліферуючих клітин-попередників олігодендроцитів [24, 25].

Показано, що HIF-1б в концентраціях, вищих в 10 разів від норми, незворотньо блокує життєдіяльність олігодендроглії, що, у свою чергу, припиняє мієліногенез. Паралельно в мікрогліальних клітинах активуються протеїнази білків мієліну (калікреїн-залежна пептидаза 6, амінопептидази тощо), які розщеплюють ОБМ, МАГ, ліпофілін, білок Вольфграма, мієлін-асоційований олігодендроцитарний основний білок (МООБ) на неактивні пептидні фрагменти. Сфінгомієлінази, активовані HIF-1б, руйнують ліпідний сфінгомієліновий каркас мієлінових оболонок, причому активність цієї групи ферментів набагато вища у ЦНС, ніж у ПНС. Звідси бачимо, що HIF-1б чинить опосередкований вплив на демієлінізацію нервових волокон [25]

Загибель олігодендроцитів за умов ішемії також може відбуватися за рядом механізмів, серед яких порушення іонного гомеостазу, приток кальцію у внутрішньоклітинний простір, мітохондріально-опосередкована ініціація клітинної загибелі та зниження аксонального транспорту. Внаслідок цього демієлінізацію можна розглядати як патологічну реакцію у нервовій системі на рівні «глія-мієлін-нейрональний комплекс» у відповідь на вплив ішемії чи інших ендо- та екзогенних ушкоджуючих факторів [26].

2.4 Дані про вплив ішемії мозку на експресію ОБМ

Основний білок мієліну (ОБМ) - структурно-функціональний маркер мієлінової оболонки (мієліну) ЦНС. ОБМ входить до складу серозної (білкової) лінії мієліну, утворюючи при цьому тісні інтегративні комплекси зі сфінголіпідами та стабілізує аксони нервових клітин [26]. Протеїн визначає специфічність нервової тканини [27], оскільки зниження його експресії індукує порушення перебігу мієлінізуючих процесів у мозку [12]. Коливання концентрації ОБМ в різних відділах головного мозку - важливий діагностичний показник багатьох патологічних станів ЦНС, зокрема церебральної ішемії.

Експерименти, проведені з використанням головного мозку молодих (3-місячних) щурів, показують, що експресія гену ОБМ у різних відділах мозку неоднакова і має хвилеподібний характер. Максимальний вміст матричної РНК (мРНК) (рис. 2.6) білка виявлено у гіпокампі, таламусі та корі великих півкуль, в той час як мінімум експресії характерний для довгастого мозку й мозочка [28].

Рис. 2.6. мРНК основного білка мієліну (третинна структура)

Дослідженнями [29] та [30] вперше продемонстровано різке зниження рівня ОБМ та білкової мРНК, характерне для початкових етапів ішемічного ушкодження мозку мишей (церебральної ішемії), викликаного високими концентраціями адреналіну (при підшкірному або внутрішньочеревному введенні) чи механічним шляхом (при оклюзії серединної мозкової артерії). Ішемічно-гіпоксичний стан мозку індукує загибель олігодендрогліальних клітин з наступною демієлінізацією аксонів. При цьому порушується структура гемато-енцефалічного бар'єру, що, у свою чергу, призводить до вивільнення ОБМ у кров [31].

Мінімальні показники протеїну виявлені на першу-другу ішемічну добу впродовж терміну ішемічної експозиції. Так, показано, що експресія ОБМ мРНК та самого білка суттєво зменшується на 23-24-ту годину церебрального ішемічного ушкодження в ішемізованих ділянках, проте підсилюється в периішемічних зонах (зонах, розташованих поряд з ішемізованою ділянкою) [32]. На 7-му добу спостерігається стійке підвищення вмісту ОБМ практично у всіх відділах мозку, що свідчить про поступову регенерацію мієлінових оболонок. Доведено, що підвищення експресії протеїну можна викликати штучним шляхом - введенням речовин-нейропротекторів - доксицикліну, корвітину (рис. 2.7), енцефаболу [33], б-кетоглутарату та пікрозиду II [34, 35].

Рис. 2.7. Нейропротекторні препарати: А - доксициклін; Б - корвітин (кверцетин)

2.5 ОБМ - важливий діагностичний показник ішемічного ушкодження мозку

Першими дослідженнями, пов'язаними з вивченням ролі ОБМ як маркера ушкодження мієліну при ішемічному інсульті, були роботи В.І. Скворцової та Т.П. Клюшник (1999) [36]. У 2000-2007 р.р. аналогічні експерименти були проведені російським фізіологом Є.І. Гусєвим [37-45].

Вивчаючи рівень білка у сироватці крові та лікворі хворих на ішемічний інсульт, Гусєв та його послідовники виявили наступні закономірності:

1. При дослідженні змісту основного білка мієліну (ОБМ) і аутоантитіл до нього в цереброспинальній рідини і сироватці крові 25 хворих з ішемічним інсультом показана значна варіабельність величин концентрації білка в 1-у добу інсульту. За виявленими результатами усі пацієнти були розділені на 3 групи [38].

2. У пацієнтів першої групи вміст ОБМ на початкових етапах захворювання коливався у межах норми, однак до 3-ї доби з моменту вступу до стаціонару зростав в середньому на 238%. Для хворих другої групи були характерні нормальний рівень ОБМ в 1-у добу і різке (на 130%) його наростання до 3-ї доби. У пацієнтів третьої групи вміст ОБМ значно (в 15-20 разів) перевищував норму і продовжував збільшуватися до 3-ї доби [38].

3. Порівняння отриманих показників встановило залежність ступеня підвищення вмісту ОБМ від локалізації та поширеності вогнища ішемії. У всіх хворих першої групи при магнітно-резонансній томографії (МРТ) головного мозку були виявлені зони обмежених (локальних) коркових інфарктів (об'єм ушкодженої зони склав менше 5 см³). У хворих другої групи виявлялися поширені корково-підкіркові вогнища (більше 25 см³) або інфаркти в білій речовині мозку невеликих розмірів (до 5 см³) [38, 39].

Високий вміст ОБМ при надходженні до стаціонару спостерігався у пацієнтів з генералізованими (більше 15 см³) підкірковими вогнищами ішемії. При цьому кореляційний зв'язку між концентрацією білка і тяжкістю інсульту, варіантом його патогенетичного розвитку не виявлено [38].

Таким чином, лише до 3-ї доби інсульту у всіх хворих відзначалося підвищення вмісту ОБМ в цереброспинальній рідини (лікворі), тоді як збільшення концентрації іншого маркеру - астроцитспецифічного кальційзв'язуючого білка S100в - реєструвалося вже в перші години після ішемії. Така відмінність, можливо, відображає особливості метаболізму досліджуваних білків [38, 40].

Чутливий до змін кальцієвого гомеостазу білок S100в одним з перших реагує на гостру ішемію мозку. Наростання його концентрації в цереброспінальній рідині за термінами приблизно відповідає розгортанню реакцій глутамат-кальцієвого каскаду. На відміну від S100в, ОБМ потрапляє в ліквор вже при генералізованій деструкції тканини мозку і є маркером морфологічного ушкодження білої речовини. Цим пояснюється його виоске накопичення [41].

4. З перших годин інсульту у всіх хворих виявлялося підвищення титру аутоантитіл до ОБМ в сироватці крові. Співвідношення високих і помірно підвищених титрів було аналогічним встановленому титру для білка S100в. Рівні підвищення титру аутоантитіл до S100в і ОБМ тісно корелювали між собою, відображаючи наявність апріорної сенсибілізації організму хворих з інсультом до різних структурних білків мозку [38]. Повторне дослідження на третю добу захворювання не виявило значимої динаміки титру антитіл до ОБМ. Не було встановлено кореляції між концентрацією білка в цереброспинальной рідини і титром аутоантитіл до нього в сироватці крові.

Нині проводяться інші дослідження, пов'язані з вивченням ролі ОБМ при різних патологічних станах мозку, пов'язаних з ішемічною етіологією. Особлива увага приділяється використанню нейротропних препаратів, які сприяють відновленню структури мієлінової оболонки (зокрема, енцефаболу) [33, 42].

2.6 Нейротропний вплив препарату енцефабол за умов ішемії мозку

Відомо, що у хворих з хронічною ішемією і гіпоксією як судинного, так і токсичного генезу, порушується біомеханіка потоку крові. У нормі потік крові в макро- і мікроциркуляторному судинному руслі є відносно ламінарним. Вплив ішемізуючих факторів, що виникають на тлі хронічної судинно-мозкової недостатності, хронічної гіпоксії і хронічних метаболічних інтрацеребральних розладів, формує турбулентний кровотік, що збільшують ішемію. В основі патоморфогенеза хронічної ішемії головного мозку лежить ураження церебральних артерій, що приводить до патології білої речовини мозку (демієлінізація, ураження клітин олігодендрогліі, апоптоз, атрофія кори великих півкуль) [33].

Препарат енцефабол (Піритинол) належить до групи нейротрофічних засобів, що поліпшують метаболізм головного мозку і особливо підсилюють анаболічні процеси. За своїм хімічним складом він близький до піридоксину, добре проникає через гематоенцефалічний бар'єр, зменшує обмін форфату між кров'ю і нервової тканиною, посилює транспорт глюкози і натрію. Енцефабол, таким чином, нормалізує психічну і моторну діяльність людини внаслідок підвищення метаболічної активності в синапсах ЦНС [42].

Виражений тонізуючий ефект препарату пов'язують з безпосередньою дією на нейрональну активність. Ряд авторів пов'язують даний механізм дії енцефаболу з посиленням активності нейронів лімбічної системи і ретикулярної формації, а також з посиленням обміну глюкози в енерговитратних областях головного мозку [33, 42].

Роботами інших авторів показано, що у хворих з системним і церебральним атероклерозом, посттравматичною енцефалопатією, хронічним алкоголізмом, хронічною ішемією головного мозку препарат нормалізує обмінні процеси головного мозку, активує утилізацію глюкози, знижує утворення молочної кислоти, посилює швидкість окислення глюкози. При цьому у пацієнтів з явищами недостатності мозкового кровообігу під дією препарату виявлено зниження явища загальної слабкості, дратівливості, головних болей, запаморочення, емоційної лабільності, підвищення працездатності, поліпшення когнітивних функцій, перш за все пам'яті, уваги, покращення психоемоційного фону [42].

Енцефабол - позитивний модулятор ремієлінізації аксонів головного мозку, активує відновлення молекулярних компонентів мембран. Впливає проліферацію олігодендробластів, посилює утворення ліпідних компонентів мієліну, сприяє агрегації білкових комплексів у межах фосфоліпідного бішару. Модулює підвищення сальтаторної (прискореної) передачі нервового збудження мієлінізованими нервовими волокнами [43].

Пікринол підвищує функціональну активність астроцитів, у результаті якої останні продукують нейротрофічні фактори - BDNF, NGF, GDNF, які сприяють відновленню ішемізованих ділянок головного мозку. При цьому BDNF стимулює проліферацію стовбурових клітин мозку, а GDNF відіграє ключову роль у диференціації гліальних клітин, особливо прекурсорів олігодендроглії. Це сприяє відновленню цілісності мієлінової оболонки.

Відмічено позитивний вплив пікринолу на відновлення мієліну ПНС, однак механізм цього процесу залишається недостатньо вивченим. Відомо, що препарат сприяє проліферації нейролеммоцитів - попередників шванівських клітин. Вони відповідають за утворення мієліну ПНС, сприяючи агрегації периферичного білка мієліну (myelin peripheral protein або myelin protein zero) з фосфоліпідами в ліпідні рафти [33, 44] (рис. 2.8).

Рис. 2.8 Енцефабол сприяє агрегації ліпідних рафтів у межах мієлінових мембран:

А - вигляд мієлінізованого аксону збоку, Б - поперечний розріз аксону

2.7 Ішемія мозку та енергетичний дефіцит олігодендроцитів

Різні форми церебральної ішемії корелюють з фазними змінами вмісту ATФ та ключових енергозалежних процесів в клітинах олігодендроглії [45]. Лише на останніх етапах кисневого голодування рівень енергетичного дефіциту стає достатнім для запуску основних механізмів, що призводять до порушення життєдіяльності та загибели клітин. Стрімке збільшення концентрації аденозинмонофосфату (AMФ) супроводжується активацією протеїнкіназної системи, яка є додатковим механізмом руйнування клітинних мембран, особливо мієліну. Найбільш повно пошкоджується зона юкстапаранодального сегменту [46].

В олігодендроцитах гліколіз не запобігає зниженню рівня АТФ на пізніх стадіях кисневого голодування. Однак існує велика кількість експериментальних даних, що вказують на те, що збільшення утилізації глюкози олігодендроглією та астроцитами внаслідок глутаматіндукованої активації Na⁺/K⁺-AT фази призводить до її метаболізації за гліколітичним шляхом до лактату, який, вивільняючись, трансформується нейронами в піруват і використовується як адекватний енергетичний субстрат, Експериментальні дослідження на моделях гострої церебральної ішемії виявили різну ступінь зменшення концентрації креатинфосфату, АТФ і аденозиндифосфату (АДФ) в тканині мозку поряд зі збільшенням вмісту неорганічного фосфату і лактату [47, 48].

Встановлено, що протягом декількох хвилин після початку гострої фокальної церебральної ішемії розвивається дефіцит макроергічних сполук (ATФ, креатинфосфату) в олігодендроглії мозку. У тварин з меншою чутливістю до гіпоксії достовірно знижується лише вміст ATФ і AДФ, тоді як рівень креатинфосфату короткочасно змінюється в перші хвилини ішемії і швидко відновлюється до норми. Градієнт падіння рівня ATФ в мозку низькорезистентних до гіпоксії тварин при малих значеннях парціального тиску кисню виражений набагато сильніше, ніж у мозку резистентних до гіпоксії тварин [48].

Особливості енергетичних змін у тканині мозку залежать й від локалізації ішемічного процесу. У більшості областей мозку реперфузія супроводжується повним або частковим поверненням енергетичного метаболізму до нормальних показників: збільшуються концентрації ATФ та креатинфосфату, знижується рівень лактату. У той же час в селективно чутливих до ішемії олігодендроцитах і нейронах (CA₁ зона гіпокампу, дорсолатеральній відділ стріатуму) зміни енергетичного метаболізму мають двофазний характер: слідом за короткочасною нормалізацією відзначається його вторинне гальмування [49].

Розвиток "постішемічної гіпоксії" призводить до значного порушення структурно-функціонального статусу мітохондрій, зменшення продукції нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату (НAДФ) в синаптосомах, що здійснює додатковий вплив на процеси незворотного пошкодження тканини мозку [48].

Вивчення кореляційних зв'язків між параметрами ядерної магнітно-резонансної спектроскопії ішемізованої тканини мозку, що відображають різні ланки енергетичного метаболізму, виявило достовірно вищий рівень сумарної сили зв'язку при більш низьких значеннях дисперсії елементів кореляційної матриці. Це дозволяє зробити висновок про більш жорстку організацію енергетичної системи в умовах навіть помірно вираженою ішемії мозку. Неадекватна впорядкованість енергетичної системи, можливо, є компенсаторною на початкових стадіях ішемії. Однак, за теорією "хаосу", більш впорядковані системи менш стійкі, а в певних умовах і більш уразливі. У зв'язку з цим при довготривалій ішемії менша пластичність енергетичної системи стає одним з факторів, що сприяють формуванню інфаркту мозку і детермінують можливість виживання нейронів [48, 50].

Олігодендроцити та нейрони, які мають високу схильність до хронічної ішемії (мозковий кровотік менше 10-15 мл / 100 г за 1 хв.), характеризуються підвищеною вразливістю до порушень енергетичного метаболізму, оскільки не здатні підтримувати іонний градієнт мембран за рахунок "знеструмлення" Na⁺/K⁺-ATФaзної ферментної системи. Швидкість розвитку аноксичної деполяризації мембран нейронів залежить від глибини і тривалості ішемії і веде до некротичної смерті клітини. Ймовірно, енергетичний дефіцит є чільним механізмом загибелі нейронів в області центрального інфаркту (ядерній зоні ішемії) [48].

У зоні пенумбри (напівтіні, яка оточує зону інфаркту) більш "м'яка" ішемія ініціює розвиток комплексу біохімічних перетворень, підтримуваних реакцією геному і молекулярними наслідками ішемічного процесу: включенням генів раннього реагування з вторинною експресією генів, що кодують цитокіни, молекули адгезії, інші прозапальні і трофічні фактори, а також гени апоптозу. В олігодендроцитах зростає експресія транскрипційного фактору NF-кB, проте зменшується експресія Olig-2 (рис. 2.9), необхідного для мієлінізації аксонів. Проте це явище є зворотним, оскільки при реперфузії та відновленні парціального тиску кисню рівень Olig-2 знову зростає [48]. Доведено, що білковий фактор нейрегулін 1в підвищує резистентність клітинних попередників олігодендроцитів, впливаючи на експресію Olig-2 [49].

Рис. 2.9. Скупчення олігодендроцитів, які продукують фактор Olig-2 (виявлений за допомогою специфічних моноклональних антитіл з імунофлуоресцентною міткою)

Енергетичний дефіцит і лактатацидоз є тригерами каскаду патобіохімічних реакцій, що протікають у всіх основних клітинних пулах ЦНС і призводять до формування інфаркту мозку за двома основними механізмами: некрозу та апоптозу [48].

2.8 Дегенерація олігодендроцитів та їх відновлення після фокальної ішемії мозку

Вперше вивченням проблеми загибелі олігодендроглії за умов фокальної ішемії та розробкою методів відновлення її клітин зайнялися команда американських дослідників з Washington University School of Medicine, очолювана професором Саллі МайАйвер (Sally R. McIver). Дослідження проводилися з використанням дорослих щурів-самців лінії Sprague Dawley вагою 200-250 г (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, Massachusetts). [50]

При виконанні роботи авторами були використані наступні терміни та позначення: BrdU - бромодеоксиуридин, CBF - мозковий кровотік, eGFP - enhanced green fluorescent protein (зелений флуоресцентний білок), LFB - барвник Luxol Fast Blue, LV - лентівірусний вектор, MBP (ОБМ) - основний білок мієліну, MCAО - оклюзія серединної мозкової артерії, OPC - клітини-попередники олігодендроцитів, SVZ - субвентрикулярна зона мозку, TTC - трифеніл тетразоліум хлорид, TUNEL - трансфераза термінального приєднання дезоксиуридинтрифосфату (маркер загиблих олігодендроцитів).

Вченими показано, що вразливість олігодендроцитів за умов церебральної ішемії сприяє втраті функціонально повноцінних мієлінових оболонок. Це може призводити до руйнування білої речовини мозку. Сучасні іммуноцитохімічні методи виявлення ушкоджень олігодендроцитів в експериментальних моделях базуються на використанні антитіл до специфічних епітопів, наявних у структурі ОБМ. При цьому ці методи не дискримінують структурних змін в олігодендроцитарній морфології [50].

В попередніх роботах дослідники описували використання лентівірусного вектору (LV), що несе сенсибілізований ген еGFP, розташований поряд з промотором гену ОБМ [51]. Це використано для селективної візуалізації ушкоджених ішемією, а також дозволяє оцінити ступінь ураження тканини мозку. У цьому дослідженні [50] вченими використано LV-MBP-еGFP для визначення олігодендроцитів у білій речовині головного мозку щурів за умов перехідної фокальної церебральної ішемії та встановлено ступінь ушкодження олігодендроглії через 24 годин, 48 годин і один тиждень після реперфузії шляхом оцінки кількісного виживання клітин і аналізу процесів мієлінізації. Вірусний вектор LV проникав у клітини олігодендроглії та вбудовувався в їх геном. При цьому, як було зазначено вище, вектор містив у своєму складі сенсибілізований еGFP та ген ОБМ [50].

В загиблих у результаті церебральної ішемії олігодендроцитах спостерігається невисока реплікативна активність вірусу, причому було відмічено прогресуючу втрату GFP(+)-клітин через 24 та 48 годин після індукції ішемічного ураження мозку. GFP(+)-клітини, які вижили, мали змінену морфологію ядра, яка нагадувала аналогічну морфологію пікнотичного ядра при некрозі. Проте їх ядро не піддавалося некротичним ураженням. Такі клітини не мали у своєму складі ферменту TUNEL, тобто були TUNEL-негативними. У таких клітин показано порушення процесів мієлінізації, в результаті чого фрагментована мієлінова оболонка на початку 24-ї години після ішемії не відновлювалася.

Через тиждень після ішемії, дослідники спостерігали відновлення популяцій GFP(+)-олігодендроцитів, що було добрим прогностичним показником при відновленні мієліногенезу. Проте, за допомогою BrdU- включень показано, що проліферуючі клітини-попередники олігодендроглії не були основним джерелом GFP(+)-олігодендроцитів. Ці спостереження ідентифікували наявність нових перехідних клітинних форм між попередниками і зрілими олігодендроцитами. Подальше вивчення таких нових попередників дозволить відкрити нез'ясовані механізми структурних змін мієліну при ішемічній патології мозку [50].

Виживання і збереження цілісності мієлінопродукуючих олігодендроцитів має вирішальне значення для нормальної функції аксонів білої речовини мозку. Існує все більше доказів на моделях хвороби і в трансгенних нокаут-мишей, позбавлених експресії білків мієліну, що первинна дисфункція в олігодендроцитах може призвести до вторинного пошкодження аксонів. Це спостерігається при різноманітних неврологічних порушеннях, зокрема розсіяному склерозі, інсульті, перинатальній травмі головного мозку тощо [52].

Уразливість олігодендроцитів за умов ішемічної пошкодження мозку продемонстрована в численних моделях в пробірці і опосередковується як окисними, так і ексайтотоксичними механізмами. При гострій ішемії, яка розвинулася в результаті травматизації головного чи спинного мозку продемонстровано втрату імунореактивності до олігодендроцит-специфічних маркерів і появу у клітинах пікнотичних ядер. Олігодендроцит-специфічна експресія флуоресцентних маркерів в умовах ішемічного інсульту демонструє зниження інтенсивності флуоресценції в мієліновій оболонці.

Дані ішемічного ушкодження білої речовини в природних умовах показані на ранніх тимчасових точках при фокальній ішемії, коли лише спостерігаються невеликі ультраструктурні змін в морфології мієлінових оболонок. Гістологічні та імуноцитологічні методи, використані у постійних і перехідних координаційних моделях ішемії вказали на відносну втрату імунореактивності для олігодендроцитів і білків мієліну, починаючи вже з 24 години після індукції ішемії [53].

У пробіркових моделях ішемія піддається фармакологічним маніпуляціям. Такі моделі є цінними для вивчення гострої відповіді олігодендроцитів при пошкодженні мозкової тканини, однак є неповним відображення того, що відбувається в природних умовах, де судинні і запальні реакції є додатковими факторами ушкодженння мієліну. У природних умовах дослідження були обмежені наявністю епітопів в пошкодженій тканині та забезпечили дослідників інформацією відносно невеликих структурних змін, які можуть відбуватися різними шляхами в сомі олігодендроцитів. Структурні зміни в олігодендроциті, що відбуваються у відповідь на ішемію, добре визначені при проведенні тривалих досліджень.

Зміна перебігу процесів ремієлінізації може сприяти функціональному відновленню при демієлінізуючих захворювань і може бути залученою в початкове відновлення функції клітин в моделі пошкодження спинного мозку. Як стверджують деякі дослідники, цього можна досягти, якщо замість ушкоджених клітин трансплантаційним шляхом ввести нові, генномодифіковані попередники олігодендроглії. Тим не менш, не цілком сформований потенціал для подібної заміни олігодендроцитів при ішемії білої речовини мозку, особливо якщо це стосується дорослого організму [50].

У мозку новонароджених тварин є запас недиференційованих клітин, які за умов травматизації мозку під дією ендогенних сигнальних молекул можуть утворювати різні класи клітин нервової системи. Так може утворюватися клас специфічних «білих» олігодендроцитів, які є достаньо стійкими при різних патологічних станах мозку. Проте для дорослого мозку така кількість клітин є набагато меншою, тому питання про формування «особливих» резистентних олігодендроцитів залишається відкритим. Визначення долі «білих» олигодендроцитів речовини після осередкової ішемії в довгострокових дослідженнях може дати уявлення про передбачувані ендогенні механізми репарації мієліну, такі як ті, що описані при у моделях травматичного пошкодження спинного мозку.

Саллі МакАйвер так коротко описує схему проведення досліджень. Рекомбінантний лентівірус створено на основі вірусу імунодефіциту людини. До складу рекомбінанту внесено невеликий 1,9 кб (кб = 1 кілобаза = 1000 пар нуклеотидів у ДНК) фрагмент промотора ОБМ разом з геном GFP. Рекомбінантний лентівірус був підготовлений перехідною ко-трансфекцією клітинної лінії НЕК 293Т з вектором МВР-EGFP та лентивірусів допоміжних плазмід (pMDLgpRRE, RSV-REV і PMDG для VSV-G pseudotyping) з використанням методу соосадження фосфатом кальцію. Обмін генетичним матеріалом міжвірусними геномами здійснився через 24 год і через 48 год трансфекції дослідники збирали лентівірусів, фільтрували через фільтр 0,45 мкм і концентрували за допомогою ультрацентрифугування (90 хвилин при 25000 обертів на хвилину), а потім ресуспендували в розчині Рінгера. Зараження клітин НЕК 293 з вірусом був використане для титрування за допомогою проточної цитометрії через 24 години після інфікування. Аліквоти вірусних суспензій зберігали при -80 °С до використання [50].

Дорослих Sprague Dawley самців щурів (Charles Rivers Laboratories, Вілмінгтон, штат Массачусетс) з масою тіла 200-250 г використовували в цьому дослідженні. Хірургія тварин і догляд проводилися відповідно до «Керівництва по догляду та використання лабораторних тварин» Інституту науково-дослідної лабораторі (ILAR). Всі процедури були схвалені Комітетом тваринних досліджень при Вашингтонському університеті.

Щурів анестезувати ізофлураном (3% індукції, 1,75% з технічного обслуговування (Stoelting, Wood Dale, Іллінойс). Після анестезії робили серединний розріз голови, при цьому шприць Гамільтона опускали в ліву бокову частину мозолистого тіла через невеликий отвір. Комбінований вектор LV-МВР-EGFP (4,5 мкл) був доставлений зі швидкістю 0,45 мкл / хв через наноін'єктор насоса (Stoelting), після чого голка шприця була залишена на місці протягом 5 хвилин, щоб забезпечити повне поширення вірусу [50].

Через шість днів після ін'єкції, щури піддавалися або фіктивній хірургії (Sham-контрольні тварини), або впливу перехідної фокальної ішемії за допомогою 60-хвилинної оклюзії середньої мозкової артерії (МСАО) внутрипросвітньою нейлоновою ниткою. Розрізи зашивали і тваринам давали відновитися після анестезії під час оклюзії. Після 60 хвилин MCAO щурів повторно анестезувати та припиняли ішемію шляхом видалення внутрішньопросвітнього шва. Дослідники використовували лазерний доплерівський зонд для вимірювання мозкового кровотоку (CBF) в різні моменти часу, щоб підтвердити наявність ішемічних станів тканини мозку: CBF вимірювали безпосередньо над територією MCA на початку оклюзії і до реперфузії, щоб підтвердити стійкий зниження кровотоку (<20% вихідного CBF), і на початку реперфузії, щоб підтвердити достатнє відновлення кровотоку (> 60% CBF). Тварини, що не відповідають цим критеріям, були виключені з дослідження. Sham-контрольні тварини були піддані тим же процедурам, без оклюзії МСА внутрішньопросвітним швом.

Тварини були розділені на наступні групи, відповідно до MCAO: 24 години реперфузії (n = 11 досліджуваних, 7 Sham-контрольних); 48 годин реперфузії (n = 11 досліджуваних, 7 Sham-контрольних); 1 тиждень реперфузії (n = 12 з ішемічним інсультом, 12 Sham-контрольних). Смертність, як правило, від затримки неповної реперфузії і / або кровотечі, був рівною серед груп (n = 2-3 на групу). Щоб відстежувати долю проліферуючих клітин, окремий набір тварин (N = 4-х тактний, 1 Sham-контроль) щодня отримував внутрішньочеревну ін'єкцію 50 мг/кг BrdU (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, штат Міссурі) в день після інсульту. Тварин умертвляли через один тиждень після реперфузії [50].

Щурів умертвляли в кожному певному пункті часу внутрішньосерцевою перфузії з PBS (potasium buffer solution, забуферений фосфатний розчин). Мізки тварин були витягнуті з наступним поділом на зрізи товщиною 3 мм. Зрізи інкубували у розчині хлориду трифеніл тетразолію (ТТС; Sigma-Aldrich) протягом 3 хвилин при 37 ° С, фіксували в 4%-му р-ні параформальдегіду протягом 24 годин, і піддавали кріопротекціі через градієнти сахарози (10-30%) протягом принаймні 24 годин кожен. TTC-пофарбовані зрізи були відскановані для документації розміру інфаркту та 20-мікрометрові послідовні кріозрізи були зібрані (кожні 4 частини) на 3 набори слайдів. Один набір був використаний для швидкого фарбування барвником LFB наступним чином: кріозрізи були зневоднені в 70, 80 і 95%-му етанолі (EtOH, 5 хв кожен), інкубовані в 1% LFB (в 95%-му EtOH + 10%-ої оцтової кислоти) протягом ночі при 60°С в герметичному контейнері, промивають у 95%-му EtOH, водою (2 хв), 0,05%-м карбонатом літію (1 хв), 70%-м етанолом і водою. Останні три кроки повторюються до тих пір, поки не отримають оптимальний контраст між білою і сірою областями речовини мозку.

Другий набір кріозрізів був використаний кількісної і морфологічної оцінки GFP(+)-олігодендроцитів. Третій сет був використаний для імуногістохімічного виявлення олігодендроцитів клітин-попередників (OPCs; NG2) або колокалізаціі з маркерами клітинної проліферації (BrdU) або загибелі (TUNEL). Зрізи промивали PBS (3 рази кожні 5 хв) і блокували протягом 30 хвилин з використанням 2% нормальної козячої сироватки (Sigma) і 0,1%-го Тритон-X (Sigma) в PBS. Тканину інкубували протягом ночі при 4°С в анти-кролячій NG2 (Millipore, Billerica, Massachusetts; 1: 100) або анти-BrdU блокуючій сироватці кролика (1: 1500; Мегабаза, Нью-Йорк); потім промивали розчином PBS (3 рази кожні 5 хв), та інкубували протягом 1-2 годин при кімнатній температурі з козячими анти-кролячими Alexa-594 вторинними антитілами (Invitrogen; 1: 1000). Виявлення BrdU проводили з 10-хвилинною інкубацією в 2 н. HCl при 37 °С з подальшою 20-хвилинною інкубацією в розчині 0,2 М борної кислоти, до стадії блокування процесу.

Для виявлення загибелі клітин маркер TUNEL (Millipore) був використаний відповідно до протоколу. Всі зрізи обробляли з Hoechst 33342 методом накладення ядерних плям (Invitrogen) та досліджували за допомогою лазерної скануючої конфокальної (Zeiss, Maple Grove, Міннесота) мікроскопії. Цифрові кольорові мікрофотографії були додатково оброблені за допомогою програми Adobe Photoshop [50, 51].

Розуміння механізмів ішемічного ушкодження в природних умовах в моделі ішемії є необхідним кроком на шляху до розробки терапевтичних втручань. У фокальній ішемії людини, інфаркти часто пов'язані з ураженням білої речовини, і ретельне вивчення клітинного пошкодження в білій речовині має вирішальне значення в моделях інсульту тварин. Попередні дослідження вивчали відносну зміні експресії олігодендроцит- і мієліноспецифічних маркерів, але ці епітопи можуть бути тимчасово втрачені, або замасковані при патологічних станах. Навіть у здорової тканини, візуалізація антитіл до цих антигенів, як правило, обмежена або в тілі клітини або товстим шаром мієліну, і може не показувати всіх змін у морфології олігодендроцитів, які відбуваються у відповідь на пошкодження. Трансгенні миші, які продукують олігодендроцитарні клони клітин з конкретними флуоресцентними мітками, дозволяють повністю візуалізувати мофологію олігодендроцитів, і надають розуміння ішемічного ушкодження цих клітин. Тим не менш, в лініях трансгенних тварин, отриманих нині, візуалізація флуоресцентних міток може бути вираженою в клітинах-попередниках, а не лише зрілих олігодендроцитах. Крім того, високі рівні експресії в трактах білої речовини ускладнюють розмежування окремих процесів мієліногенезу, і, отже, обмежують вимірювання аналізів, які нечутливі до тонких змін у морфології.

Електронна мікроскопія (ЕМ) має високу чутливість до виявлення клітинного пошкодження і використовується для опису ультраструктурних змін в олігодендроцітах, що відбуваються в ранні терміни після ішемії. EM забезпечує морфологічний деталі, необхідні для оцінки тонких відмінностей в життєздатності клітин, але для ультраструктурного кількісного аналізу травматизованої зони слід здійснювати повторний відбір біозразків в селективних, невеликих регіонах, які нерідко достатньо складно виявити. Крім того, більшість цих досліджень були обмежені виміром різких змін при ішемії білої речовини мозку [53].

Мало що відомо про часову залежність дегенеративних змін або регенеративного потенціалу білої речовини від тривалості дії фактору індукції ішемічного ураження. У цьому дослідженні вчені використовували лентивірусний вектор спеціально для зрілої мієлінпродукуючої популяції олігодендроцитів щурів в білій речовині. Направляючи LV-MBP-EGFP ін'єкцією у бічне мозолисте тіло, дослідники отримали зону поширення проліферуючих клітин при реперфузії. Конфокальна мікроскопія застосовувалася для того, щоб більш точно дослідити часовий хід відновлення білої речовини після MCAO. Використання TTC та фарбування LFB підтвердили, що ця модель ішемії провокує виникнення інфарктів, пов'язаних з ушкодженням білої речовини, як повідомлялося раніше. TTC-забарвлені тканини використовували для документування загальної площі інфаркту, а потім згодом обробляли для візуалізації травми білої речовини на клітинному рівні. Це важливо, оскільки MCAO може індукувати появу різних за розміром інфарктів, навіть якщо вимірювання потоку крові головного мозку послідовно знижується під час оклюзії. Тут використання ТТС дозволяє вченим стверджувати, що зменшення кількості GFP(+)-олігодендроцитів в бічному мозолистому тілі починається вже з 24-48 годин реперфузії після інсульту. Щодо розподілу GFP(+)-олігодендроцитів, які спостерігаються в білій речовини, дослідники також спостерігали залежне від часу зменшення числа тих клітин, що уздовж медіально-бічної зони мозолистого тіла, при майже повній відсутності в зовнішній зоні через 48 годин після ішемії [50].

Малоймовірно, що зниження експресії GFP відбувалося через неактивність промотора MBP, оскільки рівень транскрипції MBP збільшується після розвитку ішемії. GFP(+)-олігодендроціти, що вижили, були виявлені в регіонах ішемічної загибелі клітин, які мали у своєму складі маркер TUNEL. Враховуючи ці дані, то малоймовірно, що зниження GFP(+)-клітин пригнічується активністю промотора MBP.

Широкий некроз в смугастому тілі (corpus striatum) і корі є визначальною рисою серцевини інфаркту в цій моделі ішемії, тому цілком імовірно, що GFP(+)-олігодендроцити піддаються клітинній загибелі, що призводить до втрати або деградації GFP. Тут вчені прагнули вивчити олігодендроцити ближче до межі ішемізованої зони, де може бути більший потенціал клітин для відновлення. Тому що варіабельність в розмірах інфаркту є основною рисою цієї експериментальної моделі, дослідники не могли виключити можливість того, що деякі клітини, проаналізовані в даному дослідженн, загинули саме в центральній зоні (ядрі) інфаркту [50].

GFP(+)-олігодедроцити, що вижили, характеризувалися зниженням мієліноутворюючого потенціалу. При цьому були виявлені значні зони фрагментації мієлінових мембран на 24- і 48-у години після реперфузії. Живі GFP(+)-олігодедроцити характеризувалися також TUNEL(-)-показником та не мали пікнотичних ядер. Ці результати показують, що дегенерація процесів мієлінізації (мієліногенезу) може передувати загибелі олігодендроцитів [50]. Це переконливі перспективи у світлі доказів того, що на цей процес індукують високі концентрації глутамату. Показано, що за умов ішемії експресія субодиниць глутаматних рецепторів спостерігається саме в зонах демієлінізації [54].

Збереження морфології тіла клітини під час міелінової дегенерації представляє інтригуючу можливість того, що реміелінізація відбувається завдяки структурному відновленню раніше пошкоджених олигодендроцитів. На перший тиждень реперфузії після осередкової ішемії, спостерігалося відновлення інтактних процесів мієлінізації і кількості GFP(+)-олігодендроцитів в ішемізованій області білої речовини. Проте, як було зазначено раніше, порушення мієліногенезу спостерігалося через 24-48 годин після ішемії.

На додаток до відновлення структури олігодендроцитів спостерігалося і відновлення GFP(+)-клітин після ішемії білої речовини мозолистого тіла (corpus callosum). Репопуляціі GFP(+)-олігодендроцитів, візуалізовані в цьому дослідженні, швидше за все, походять від клітин-резидентів вже в білій речовині, а не клітин, що мігрують в районах з сірою речовиною.