Практикум по энзимологии

2. Пробы, содержание тестостерона в которых предположительно превышает 16 нг/мл, следует разводить с использованием нулевого стандарта.

3. Если при первой постановке образец сыворотки показал концентрацию больше, чем высший стандарт, то образец должен быть разведен в 10 или в 100 раз нулевым стандартом и проанализирован снова. При подсчете должен приниматься во внимание фактор пересчета.

ВНИМАНИЕ! В данном тесте нельзя использовать пробы, содержащие азид натрия.

1. Закрепите желаемое количество полосок с подготовленными лунками в держателе.

2. Внесите по 25 мкл стандартов тестостерона и проб в соответствующие лунки.

3. Внесите 200 мкл иммуноферментного конъюгата в каждую лунку.

4. В течение 10 сек. смешивайте реагенты в панели. На этом этапе чрезвычайно важно добиться полного смешивания реагентов.

5. Не закрывая панель, инкубируйте при комнатной температуре 60 мин.

6. Освободите лунки от содержимого (например выплеснув и постучав по фильтровальной бумаге). Трижды промойте лунки раствором для промывки (по 400 мкл в лунку). Тщательно “выбейте” остатки жидкости на фильтровальной бумаге. Операцию № 6 рекомендуется осуществлять в автоматическом режиме, используя автоматический вошер для планшет.

7. Внесите 200 мкл энзим-субстрата в каждую лунку с равными временными интервалами.

8. Инкубация 15 мин при комнатной температуре.

9. Остановите реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп-раствора с такими же временными интервалами, как на этапе 7.

10. Измерьте оптическую плотность в лунках при длине волны 450 + 10 нм в течение 10 мин после добавления стоп-раствора

Содержание отчета

1. Определите значение абсорбции для стандартов и образцов.

2. Используя любую миллиметровую или логарифмическую сетчатую бумагу, постройте стандартную кривую, нанося значения абсорбции (Y) Стандартов против их концентрации (Х) в нг/мл.

3. Используйте среднюю величину абсорбции каждой пробы для интерполяции концентрации Тестостерона путем простого наложения данных на указанную кривую.

Запишите концентрацию тестостерона в сыворотке крови.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Работы № 11 - № 14 выполняются каждая в течении одного дня, так как ферменты-маркеры субклеточных фракций инактивируются при замораживании-оттаивании. В случае нехватки времени на выполнение полной схемы работы выполняются в следующем варианте:

- активность ферментов-маркеров определяется в свежеприготовленном 1% гомогенате. 100 мг печени гомогенизируется в 1,9 мл рабочего буфера (в работе № 11 - 0,01 М трис-буфер рН 7,4; в работе № 12 - 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; в работе № 13 - буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; в работе № 14 - 0,1 М цитратный буфер рН 6,5). Затем гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок.

2. Определение белка по Лоури. Необходимые реактивы: реактив Фолина, реактив А, реактив В.

Реактив А. 0,5 г CuSO₄·5H₂O + 1 г цитрата Na на 100 мл воды, хранить в морозильнике. Для использования разморозить небольшую часть и хранить в холодильнике.

Реактив В. 4 г NaOH + 54 г Na₂CO₃·10H₂O (или 20 г Na₂CO₃) на литр воды.

Реактив С. 50 мл В + 1 мл А. Готовить непосредственно перед определением концентрации белка.

Для определения концентрации в три пробирки наливают по 0,5 мл разведенного раствора белка, в каждую из трех пробирок и в контроль (0,5 мл дист. воды) приливают по 1 мл реактива С, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Затем приливают по 0,1 мл реактива Фолина и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Можно больше. Все пипетки сразу промыть дистиллированной водой. Измеряют светопоглощение на ФЭК при л=750 нм в кювете толщиной 1 см против контроля.

Библиографический список

1. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. - М.: Наука, 1986. - 332 с.

2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - Т. 1 - 3.

3. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир,

1980. - 432 с.

4. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. - М.: Мир, 1986. - 374 с.

5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высш. школа, 1980. - 272 с.

6. Практикум по биохимии/ под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьёвой.

- М.: МГУ, 1989. - 509 с.

7. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. - М.: Наука, 1978. - 248 с.

8. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. - М.: Мир,

1979. - 280 с.

9. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983. - 293 с.

10. Бернхард С. Структура и функция ферментов. - М.: Мир, 1971. - 334 с.

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. Г. БЕЛИНСКОГО

В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин

Практикум по энзимологии

Учебно-методическое пособие

Редактор - Л. И. Дорошина

Корректор - Е. С. Моисеева

Оригинал-макет - В. Б. Соловьев

Поз. 157

Подписано к печати 07.12.07 Формат 60 Ч 84 / 16

Бумага писчая белая Печать офсетная

Усл. - печ. л. 3,0 Уч. - изд. л. 3,2

Тираж экз. 100 Заказ № 175 / 07 Цена С. 183

Редакционно-издательский отдел ПГПУ им. В. Г. Белинского:

440026, Пенза, ул. Лермонтова, 37,

Педагогический университет, корпус 5, комната 466

Отпечатано с готового оригинал-макета в мини-типографии

ООО КФ «Партнер-ДелКон»:

г. Пенза, ул. Богданова, 2а,

тел. 52-58-60, 52-58-61

E-mail: p-audit@p-audit.ru, www.p-audit.ru