Методическое обеспечение лабораторной диагностики вирусного гепатита В

Желтушный период. Самочувствие больных, как правило, не улучшается, а в большинстве случаев ухудшается. Артралгии и экзантема исчезают, но нарастают диспептические симптомы. Иктеричность кожных покровов и слизистых оболочек медленно прогрессирует, достигая своего максимума не ранее 7-10-го дня с момента её появления. Желтуха обычно интенсивная, сопровождается кожным зудом. На коже нередко выявляют геморрагии в виде петехий или крупных синяков. При более тяжёлом течении отмечают носовые кровотечения, кровоточивость дёсен, а у женщин - ранний приход обильных менструаций. Моча приобретает тёмный цвет, у большинства больных кал ахоличен. Печень, как правило, увеличивается в размерах; она отчётливо болезненна при пальпации, достаточно мягкая по консистенции. Необходимо обратить внимание на то, что на фоне интенсивной желтухи нередко печень не увеличивается, что указывает на более тяжёлое течение гепатита. В 50-60% случаев наблюдают спленомегалию. Пульс урежен, однако при более тяжёлом течении можно наблюдать тахикардию. Тоны сердца приглушены, отмечают небольшую гипотонию. Больные обычно апатичны, испытывают головокружение, расстройства сна. Течение желтушного периода длительное, затягивается до 1 мес и более.

Период реконвалесценции начинается с момента уменьшения или исчезновения комплекса диспептических симптомов, после чего происходит медленное снижение билирубинемии. Что касается изменения размеров печени, то этот процесс иногда затягивается на несколько месяцев. При присоединении холестатического компонента (5-15% больных) заболевание приобретает торпидное течение. В этих случаях характерны невыраженная интоксикация, длительные холестатические проявления (высокие «монотонные» показатели билирубинемии и ферментемии, тёмная моча, ахоличный стул, увеличенная, не сокращающаяся в размерах печень, субфебрилитет).

Помимо острой циклической формы заболевания вирусного гепатита В может проявляться в виде хронической формы (хронизация в 5-10% случаев) и циррозов вирусной этиологии.

3.5 Осложнения

Наиболее тяжёлое и серьёзное в плане прогноза осложнение - острая печёночная энцефалопатия (печёночная кома). Она развивается при массивном цитолизе гепатоцитов и характеризуется глубоким угнетением функции печени, прогрессирующей психоневрологической симптоматикой и выраженными геморрагическими проявлениями. В своём клиническом развитии острая печёночная энцефалопатия проходит три последовательных стадии.

Стадия I (прекома I). Характерны резкое ухудшение состояния больного, усиление желтухи и диспептического синдрома (тошнота, повторная рвота), развитие геморрагических проявлений, появление печёночного запаха изо рта. Нарушаются ориентация во времени и пространстве, координация точных движений (пальценосовая и писчая пробы). Характерны замедление мышления, расстройства сна (сонливость днём и бессонница ночью), головокружение, чувство «провалов» (ощущение падения в пропасть при закрывании глаз). Обращает на себя внимание эмоциональная неустойчивость - апатия, вялость, чувство тревоги, тоски, сменяющиеся возбуждением, эйфорией. Могут появиться боли в области печени, повышение температуры тела. Брадикардия или нормокардия сменяется тахикардией. У больных с портокавальной недостаточностью отмечают преходящие нарушения сознания.

Стадия II (прекома II). Характерно более глубокое нарушение сознания; оно часто бывает спутанным. Больные дезориентированы во времени и пространстве, эйфоричны или агрессивны; возбуждение кратковременное и сменяется апатией, интоксикация усиливается. Появляется тремор рук и кончика языка, усиливается геморрагический синдром. Печень уменьшается в размерах и может стать недоступной для пальпации. Нарастает тахикардия, артериальное давление склонно к снижению. Развивается отёчно-асцитический синдром. Продолжительность обеих стадий прекомы - от нескольких часов до нескольких дней.

Стадия III (кома). Отличается потерей сознания и вначале бывает неглубокой. Больные реагируют стоном на сильные раздражители (например, пальпацию печени). Глотательный и роговичный рефлексы сохранены. Появляются патологические рефлексы, непроизвольное мочеиспускание и дефекация. При глубокой коме наступает арефлексия, утрачивается реакция на любые раздражители. Больные погибают при явлениях острой сердечнососудистой недостаточности.

Уже на начальных этапах развития острой печёночной энцефалопатии прогрессивно уменьшаются показатели протромбинового индекса, что имеет большое значение для оценки тяжести этого состояния.

Тяжёлое фульминантное (молниеносное) течение вирусного гепатита В чаще отмечают у пациентов молодого возраста, особенно при микст-инфекции (сочетании вирусного гепатита В + вирусного гепатита D или вирусного гепатита В + вирусного гепатита С). Характерно быстрое и раннее развитие острой печёночной энцефалопатии с высоким процентом (до 90%) летальных исходов.

При острой печёночной энцефалопатии характерны присоединение вторичной инфекции с развитием сепсиса, прогрессивное ухудшение функции почек с уменьшением почечного кровотока и скорости клубочковой фильтрации, снижением концентрации натрия в моче, повышением её плотности, уменьшением диуреза.

3.6 Лечение

Больных с острым циклическим течением вирусного гепатита В госпитализируют. В лёгких и среднетяжёлых случаях лечение аналогично таковому при вирусном гепатите А. При тяжёлом течении решают вопрос о назначении преднизолона по 40-60 мг/сут внутрь. Снижение доз производят постепенно с момента купирования симптомов интоксикации. Одновременно больным интенсифицируют дезинтоксикационную терапию (кристаллоиды и реополиглюкин в соотношении 1:3), проводят коррекцию нарушений водно-электролитного баланса (панангин, аспаркам при гипокалиемии), применяют лактулозу (нормазу), спазмолитические препараты (но-шпа, эуфиллин), назначают антибиотики с низкой резорбцией из кишечника (неомицин). В случаях выраженного холестаза рекомендованы препараты урсодеоксихолевой кислоты (уросан, урсофальк). При развитии острой печёночной энцефалопатии назначают глюкокортикоиды (внутривенно 240-480 мг и более преднизолона в сутки), хотя их эффективность сомнительна.

4. Профилактика

В комплексе профилактических мероприятий первостепенное значение имеют меры, направленные на предупреждение заражений вирусным гепатитом В при переливаниях крови и проведении лечебно-диагностических парентеральных манипуляций. Всех доноров подвергают комплексному клинико-лабораторному обследованию на наличие антигенов гепатита В. От донорства отстраняют лиц, перенесших вирусный гепатит В, независимо от срока давности, а также общавшихся с больными в течение последних 6 мес. К сдаче крови не допускают лиц, страдающих хроническим гепатитом (в том числе неясной этиологии) и подвергшихся за последние годы гемотрансфузии. Перспективным является внедрение аутогемотрансфузий, когда больному переливают его же кровь, заготовленную до плановой операции. Неспецифическую профилактику гепатита В проводят с применением одноразовых инструментов при манипуляциях, связанных с повреждением кожных покровов и слизистых, тщательной стерилизацией медицинского инструментария, а также жесткого контроля по обнаружению вирусных антигенов у доноров. Первостепенное значение имеет повсеместное внедрение и улучшение централизованной стерилизации изделий медицинского назначения. Прерывание естественных путей передачи вирусного гепатита В обеспечивают санитарно-гигиенические меры: индивидуализация всех предметов личной гигиены и раздельное их хранение (бритвенные приборы, зубные щетки, мочалки, расчёски, и др.), выполнение правил личной гигиены, предупреждение микротравм в быту и на производстве. Для профилактики полового пути передачи инфекции следует избегать случайных половых связей, использовать механические контрацептивные средства. Предупреждение профессиональных заражений в лечебно-профилактических учреждениях достигают неукоснительным соблюдением правил противоэпидемического режима, особенно в гемодиализных, хирургических, лабораторных и других отделениях, в которых персонал часто имеет контакт с кровью. При выполнении любых парентеральных вмешательств и процедур обязательно используют резиновые перчатки.

Учитывая многообразие путей передачи вирусного гепатита В и большое число источников инфекции, наиболее перспективное средство профилактики - вакцинация. Именно она является единственным средством профилактики гепатита В у новорождённых. Это первая вакцина, которая предотвращает раковое заболевание печени и снижает уровень носительства вируса в популяции. ВОЗ, обобщив многолетний опыт применения вакцины против гепатита В, рекомендует в качестве наиболее эффективной меры специфической профилактики этой инфекции введение вакцинации в национальные календари профилактических прививок вне зависимости от уровня носительства HВsAg. Сегодня есть все основания относить гепатит В к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики.

За последнее десятилетие в мире привито более 100 млн. человек, что позволило в ряде стран не только резко уменьшить заболеваемость гепатитом В и существенно повлиять на уровень носительства в популяции, но и сделать правомерным постановку вопроса о полном искоренении в этих странах гепатита В. Более 75 стран включили в свои программы вакцинации рутинную иммунизацию против гепатита В новорождённых и подростков. В настоящее время во многих странах Европы и Америки проводят сочетанную вакцинацию против гепатита В в рамках расширенной программы иммунизации детей. Специфическую профилактику гепатита В осуществляют путём применения одной из вакцин: HBVax-II (США), Энджерикс-В (Бельгия), Rec-HbsAg (Куба), Эувакс В (Южная Корея) и Комбиотех (Россия).

Все вакцины против гепатита В взаимозаменяемы. Любую из них можно применять для завершения курса первичной иммунизации, начатой другой вакциной. Вакцину вводят внутримышечно, у детей и взрослых - в область дельтовидной мышцы, у новорождённых и маленьких детей - в переднебоковую поверхность бедра. При сочетании с другими парентеральными вакцинами её вводят отдельным шприцем в другой участок. Вакцины индуцируют образование специфических антител к HBsAg. Титр анти-HBsAT, равный 10 МЕ/л, достаточен для создания невосприимчивости к вирусному гепатиту В. Достижение такого уровня антител после первичной иммунизации приводит к формированию долговременной иммунологической памяти и обеспечивает продолжительную защиту от гепатита В даже при дальнейшем падении уровня антител Иммунологическая память сохраняется по меньшей мере от 5 до 12 лет независимо от уровня антител сыворотки перед повторным ведением антигенов.

Вакцинации подлежат медицинские работники из групп высокого риска заражения вирусным гепатитом В, выпускники медицинских ВУЗов и техникумов, новорождённые, родившиеся от матерей-носителей HBsAg и женщин, переболевших гепатитом В в III триместре беременности, дети и персонал детских домов и специнтернатов, пациенты, находящиеся в отделениях с высоким риском заражения гепатитом В, лица, соприкасавшиеся с больными гепатитом В в очагах заболевания по месту жительства. Календарь Украины предусматривает проведение плановых прививок детям первого года жизни по схеме: новорожденные (в первые 12 часов жизни), 1 мес, 6 мес. В 13 лет вакцинируют детей, ранее не привитых против гепатита В по схеме 0-1-6 мес. Детям, родившимся от матерей, носителей вируса гепатита В или больных вирусным гепатитом В в III триместре беременности вакцинация против гепатита В проводится по схеме 0-1-2-12 мес. Вакцинации в любом возрасте подлежат: дети и взрослые, в семьях которых есть носитель HBsAg или больной хроническим гепатитом В; дети домов ребенка, детских домов и интернатов; дети и взрослые, регулярно получающие кровь и ее препараты, а также находящиеся на гемодиализе и онкогематологические больные; лица, у которых произошел контакт с материалом, инфицированным вирусом гепатита В; медицинские работники, имеющие контакт с кровью больных; лица, занятые в производстве иммунобиологических препаратов из донорской и плацентарной крови; студенты медицинских институтов и учащиеся средних медицинских учебных заведений (в первую очередь выпускники); лица, употребляющие наркотики инъекционным путем.

В настоящее время предполагается, что длительность поствакцинального иммунитета составляет примерно 15 лет. Накопленный опыт свидетельствует, что проведение вакцинации приводит к снижению заболеваемости в 10-12 раз и носительства HBsAg в популяции с 9-12% до 1%.

Более половины всех случаев заболеваний среди медицинских работников приходится на первые пять лет от начала работы, и основная их часть - при стаже от одного до пяти лет. Это свидетельствует о необходимости обязательной вакцинации против гепатита В медработников до начала их профессиональной деятельности.

Однако иммунизация только групп риска (медицинские работники, имеющие «кровяные контакты», новорождённые от носителей и больных, персонал и дети домов ребенка) не обеспечивает эффективного снижения заболеваемости. Активно повлиять на эпидемический процесс и добиться существенного снижения заболеваемости гепатитом В возможно лишь перейдя от вакцинации только лиц, составляющих «группы риска» к иммунизации подростков и новорождённых детей.

4.1 Эпидемиологический надзор

Большое значение имеют определение доли вирусного гепатита В среди всех острых гепатитов, регистрация и учёт хронических форм болезни. Анализ заболеваемости гепатитом проводят с учётом активности тех или иных путей заражения, определяющих социально-возрастную структуру заболевших. Серологический мониторинг включает в себя сбор информации о скрыто протекающем эпидемическом процессе вирусного гепатита В на популяционном, коллективном и индивидуальном уровнях.

Осуществляют оценку эпидемиологической эффективности вакцинации и других мер профилактики вирусного гепатита В среди различных групп населения, их социально-экономической значимости.

4.2 Мероприятия в эпидемическом очаге

Заболевшие острой формой вирусного гепатита, а также больные хронической формой в период обострения подлежат обязательной госпитализации в инфекционную больницу или отделение, а с подозрением на это заболевание - в диагностическое отделение или боксы. Выписку реконвалесцентов и допуск их к работе (в том числе работников пищевых предприятий и лиц, к ним приравненных) или в детские учреждения осуществляют по клиническим показаниям. Переболевшие вирусным гепатитом В подлежат диспансерному наблюдению сроком не менее 12 мес. Упомянутых лиц снимают с учёта при отсутствии хронического гепатита и 2-кратном отрицательном результате исследования на наличие HBsAg, проведённого с интервалом в 10 дней. Носителей HBsAg наблюдают в течение 2 лет. Обследование на наличие антигенов проводят сразу по выявлении, через 3 мес, а затем 2 раза в год до снятия с учёта. Если антигены обнаруживают более 3 мес, то таких носителей расценивают как хронических; они подлежат наблюдению как больные хроническим гепатитом. В отношении других лиц в очаге вирусного гепатита В никаких ограничительных мер не проводят.

Выделения больного и носителя, посуда, постельное и нательное бельё, полотенца и т.д. подлежат обработке дезинфицирующими средствами. Экстренная профилактика проводится путём введения специфического иммуноглобулина или вакцины (в соответствии с рекомендуемой схемой введения) при экстренных эпидемиологических ситуациях, т.е. при реальной угрозе заражения, например при случайном уколе или переливании инфицированной вирусом вирусного гепатита В крови.

5. Методы лабораторной диагностики вирусного гепатита В

Печень является своеобразной биохимической лабораторией организма. Когда функция печени нарушается, например, вследствие вирусного гепатита, это естественным образом отражается на активности ряда ферментов и концентрации многих веществ в крови больного.

Наиболее важным признаком гепатита является повышение активности ферментов (АлАТ и АсАТ, соответственно). Эти ферменты попадают в кровь в результате разрушения печеночной клетки и поэтому косвенно отражают выраженность этого процесса. По степени повышения АлАТ и АсАТ судят об активности гепатита. Если АлАТ повышено не более чем в 3 раза, говорят о мягком гепатите, в 3-10 раз - гепатите умеренной активности, более чем в 10 раз - высокой активности заболевания. Т.к. АсАТ может изменяться и при других заболеваниях внутренних органов, изменение АлАТ считают более специфичным для болезней печени.

Повышение в крови концентрации билирубина является следствием избыточного его образования или замедленного выведения из организма. При вирусных гепатитах нарушается выведение билирубина. Если концентрация билирубина в крови больше 30-35 мкмоль/л, появляется желтушное окрашивание слизистой полости рта, склер, а потом и кожи. У большинства больных гепатитом уровень билирубина не повышается.

Некоторые заболевания печени, иногда и вирусные гепатиты, протекают с синдромом холестаза (нарушением отделения желчи или некоторых ее компонентов). В этом случае у больных может повышаться активность таких ферментов как щелочная фосфатаза и гамма-глютамилтрансфераза (ГГТ), а также уровень холестерина и желчных кислот. Нужно иметь ввиду, что болезни печени не являются единственной причиной изменения активности и концентрации упомянутых ферментов или веществ.

Синтетическую функцию печени отражает концентрация белка в крови, в первую очередь - альбумина. При нарушении синтетической функции печени уменьшается концентрация в крови холестерина и мочевины.

Нужно сказать, что все перечисленные симптомы поражения печени не специфичны для вирусного гепатита, но могут встречаться и при других заболеваниях печени (алкогольном, лекарственном гепатите и др.).

Доказать, что выявленные при биохимическом исследовании крови изменения являются следствием вирусного гепатита можно лишь обнаружив в крови маркеры вирусных гепатитов.

5.1 Метод определения билирубина в сыворотке крови по диазореакции в присутствии акселератора (метод Йендрашика, Клеггорна и Гофа)

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая дает со связанным (прямым) билирубином сыворотки крови розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности окрашивания определяется концентрация билирубина, дающего прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный (непрямой) билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние и со смесью диазореактивов дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным билирубином определяют концентрацию несвязанного билирубина.

Реактивы

1. кофеиновый реактив (концентрат):

- бензонат натрия

- ацетат натрия

- кофеин

2. 0,9% раствор хлористого натрия.

3. Диазосмесь:

а) Диазореактив Й - сульфониловая кислота

б) Диазореактив ІІ - раствор нитрита натрия

Оборудование

1. Фотоколориметр КФК-3.

2. Колба мерная емкостью 200 мл, пробирки емкостью 10 мл (ГОСТ 1770-74).

3. Пипетки емкостью 1 и 5 мл (ГОСТ 29227-91).

Приготовление рабочих растворов

1. Рабочий кофеиновый реактив. Содержание флакона с кофеиновым реактивом (концентратом) количественно переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и, после растворения осадка, доводят дистиллированной водой до метки.

2. Диазосмесь. Перед работой смешивают необходимое количество раствора сульфаниловой кислоты и раствора нитрита натрия в отношении 100:3.

Ход определения

В 3 пробирки (для общего билирубина, прямого и для контроля) вводят реактивы согласно таблице:

Ингредиенты в мл	Опытная проба, мл	Холостая проба
	Общий билирубин	Прямой билирубин
Сыворотка	0,25	0,25	0,25
Кофеиновый реактив	1,75	-	1,75
0,9% р-р NaCl	0,25	2,0	0,5
Диазосмесь	0,25	0,25	-

Для определения прямого билирубина колориметрирование следует проводить через 5-10 минут после добавления диазосмеси (при температуре +18°С до +25°С), т.к. при длительном стоянии в реакцию вступает непрямой билирубин.

Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять на 20 минут (при температуре +18°С до +25°С), после чего колориметрируют. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется. Измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 530 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5 мм против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и прямого билирубина, вычитают показатель прямого билирубина.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и прямого билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель прямого билирубина.

Калибровочный график строится по готовому набору реактивов билирубин-эталон лиофизилированный, выпускаемый фирмой «Лахема» (Чехия).

Метод: Иендрашика ф. Филисит

КФК-3 №9001438

кювета 5 мм, л=530 нм

Стандарт: Билирубин - стандарт ф. Lachema 391,51 мкмоль/л

Годен до 31.01.2012 г.

Масштаб 1 мкмоль/л = 1 мм



№	Е	Еср	С, мккат/л
1	0	0	0
2	0,049 0,049 0,048	0,049	19,6
3	0,123 0,122 0,120	0,122	48,9
4	0,234 0,246 0,234	0,238	97,9
5	0,367 0,347 0,365	0,359	146,8

УЕ=0,768; Е0,360=147 мм;

УС=313,2; 1Е = 147х1/0,360=408,3

F=313,2/0,768=407,12; 1т. 0,049 = 0,049х408= 19,9 мм;

F=3,6; 2т. 0,122 = 0,122х408 = 49,7 мм;

3т. 0,238 = 0,238х408 = 97,1 мм;

4т. 0,359 = 0,359х408 = 146,7 мм.

Нормальные величины. Содержание общего билирубина - 8,55 - 20,52 мкмоль/л. Из него 75% приходится на долю непрямого.

Примечания

1. Сыворотка не должна быть гемолизирована.

2. Перед определением билирубина обследуемый человек не должен принимать лекарства и пищу, которые вызывают искусственное окрашивание сыворотки (морковь, апельсин), а также витамин «С».

5.2 Метод определения активности аспартатаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.) в сыворотке крови динитрофенилгидразиновым методом (по Райтману, Френкелю, 1957)

Принцип метода

Аспартатаминотрансфераза (L-аспартат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.1.) катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов и 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающей при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Реактивы

1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый 2 ммоль/л

2. 2,4 - динитрофинилгидразин раствор 1 ммоль/л в НСl 1 моль/л

3. Натрий гидроокись

4. Субстрат АсАТ:

- фосфатный буфер 0,1 моль/л

- L-аспартат0,1 моль/л

- 2-оксаглуторат 2 ммоль/л

5. 0,9% р-р NaCl

Приготовление рабочего раствора

Раствор гидроокиси натрия

В мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3. Раствор устойчив.

Ход определения

Ингредиенты (мл)	Проба	Контрольный раствор
Субстратный раствор АсАТ	0,5	0,5
Физиологический раствор	-	0,1
Предварительно инкубируют в течении 3 мин при 37°С
Сыворотка крови	0,1	-
Перемешивают, инкубируют точно 60 мин при 37°С
2,4 - ДНФГ	0,5	0,5
Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при температуре (от + 15°С до +25°С)
0,4н NaOH	5,0	5,0

Перемешивают, выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Колориметрируют при длине волны 530 нм в кювете 1х1 мм, против холостой пробы.

Калибровка

В обозначенные пробирки вносят пипеткой отдельные растворы в вышеприведенном порядке. После добавления реактива 2 содержимое пробирок перемешивают и через 20 мин добавляют раствор NaOH. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора №2-5 против раствора №1. строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.

Раствор №	Физиологический раствор (мл)	Реактив 4 (мл)	Реактив 1 (мл)	Реактив 2 (мл)	Раствор NaOH	Конечная кат. конц. (мккат/л)
1	0,10	0,50	-	0,50	5,00	0
2	0,10	0,45	0,05	0,50	5,00	0,28
3	0,10	0,40	0,10	0,50	5,00	0,56
4	0,10	0,35	0,15	0,50	5,00	0,83
5	0,10	0,30	0,20	0,50	5,00	1,11

Расчет

По оптической плотности пробы в калибровочном графике находят концентрацию фермента.

Предупреждение

Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре (от +2 до +8)°С в течении одной недели.

При каталитической концентрации фермента свыше 0,56 мккат/л анализ проводят с сывороткой, разбавленной физиологическим раствором (результат умножить на разведение).

При кат. концентрации фермента	Разведение
(0,56 - 0,70)	3х
(0,70 - 0,80)	5х
(0,80 - 1,00)	10х
(1,00 - 1,20)	30х
Свыше 1,20	50х

Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках диабетиков) вызывает повышение активности ферментов АсАТ и АлАТ. В таких случаях необходимо вычесть из оптической плотности пробы оптическую плотность сывороточного контрольного раствора. Сывороточный контрольный раствор приготавливают точно так же, как и пробу, с той лишь разницей, что сыворотку добавляют в пробирку после реактива 2.

Гемолиз повышает каталитическую концентрацию ферментов АсАТ и АлАТ. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства (сапонаты).

Референтные величины

АсАТ (мккат/л) 0,06-0,14

Предельные величины 0,42

5.3 Метод определения активности аланинаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.) в сыворотке крови динитрофенилгидразиновым методом (по Райтману, Френкелю, 1957)

Принцип метода

Аланинаминотрансфераза (L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.2.) катализирует реакцию между L-аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов и 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.

Реактивы

1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый 2 ммоль/л;

2. 2,4 - динитрофинилгидразин раствор 1 ммоль/л в НСl 1 моль/л;

3. Натрий гидроокись;

4. Субстрат АлАТ:

- фосфатный буфер 0,1 моль/л;

- DL-альфа-аланин 0,2 моль/л;

- 2-оксаглуторат 2 ммоль/л;

5. 0,9% р-р NaCl.

Приготовление рабочего раствора

Раствор гидроокиси натрия

В мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3. Раствор устойчив.

Ход определения

Ингредиенты (мл)	Проба	Контрольный раствор
Субстратный раствор АлАТ	0,5	0,5
Физиологический раствор	-	0,1
Предварительно инкубируют в течении 3 мин при 37°С
Сыворотка крови	0,1	-
Перемешивают, инкубируют точно 60 мин при 37°С
2,4 - ДНФГ	0,5	0,5
Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при температуре (от + 15°С до +25°С)
0,4н NaOH	5,0	5,0

Перемешивают, выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Колориметрируют при длине волны 530 нм в кювете 1х1 мм, против холостой пробы.

Калибровка

В обозначенные пробирки вносят пипеткой отдельные растворы в вышеприведенном порядке. После добавления реактива 2 содержимое пробирок перемешивают и через 20 мин добавляют раствор NaOH. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора №2-5 против раствора №1. строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.



Раствор №	Физиологический раствор (мл)	Реактив 4 (мл)	Реактив 1 (мл)	Реактив 2 (мл)	Раствор NaOH	Конечная кат. конц. (мккат/л)
1	0,10	0,50	-	0,50	5,00	0
2	0,10	0,45	0,05	0,50	5,00	0,28
3	0,10	0,40	0,10	0,50	5,00	0,56
4	0,10	0,35	0,15	0,50	5,00	0,83
5	0,10	0,30	0,20	0,50	5,00	1,11

Калибровочный график АсАТ и АлАТ

Метод: Reitman, Frankel ф. Lachema

АБхФк-02 - «НПП-ТМ»

кювета 1х1, л=530 нм

годен до 31.11.2011

№	Е	Еср	С, мккат/л
1	0	0	0
2	0,085 0,079 0,078	0,08	0,28
3	0,162 0,153 0,165	0,160	0,56
4	0,235 0,225 0,230	0,230	0,83
5	0,310 0,309 0,292	0,303	1,11

УЕ=0,773; Е0,300=110 мм;

УС=2,78; 1Е = 366,7

F=2,78/0,773=3,596; 1т. 0,08 Е = 0,008х366,7 = 29,3 мм;

F=3,6; 2т. 0,16 Е = 0,16х366,7 = 58,6 мм;

3т. 0,23 Е = 0,23х366,7 = 84,3 мм;

4т. 0,303 Е = 0,303х366,7 = 1,11 мм.



Масштаб 1 мккат = 100 мм

Расчет

По оптической плотности пробы в калибровочном графике находят концентрацию фермента.

Предупреждение

Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре (от +2 до +8)°С в течении одной недели.

При каталитической концентрации фермента свыше 0,56 мккат/л анализ проводят с сывороткой, разбавленной физиологическим раствором (результат умножить на разведение).

При кат. концентрации фермента	Разведение
(0,56 - 0,70)	3х
(0,70 - 0,80)	5х
(0,80 - 1,00)	10х
(1,00 - 1,20)	30х
Свыше 1,20	50х

Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках диабетиков) вызывает повышение активности ферментов АсАТ и АлАТ. В таких случаях необходимо вычесть из оптической плотности пробы оптическую плотность сывороточного контрольного раствора. Сывороточный контрольный раствор приготавливают точно так же, как и пробу, с той лишь разницей, что сыворотку добавляют в пробирку после реактива 2.

Гемолиз повышает каталитическую концентрацию ферментов АсАТ и АлАТ. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства (сапонаты).

Референтные величины

АлАТ (мккат/л) 0,06-0,14

Предельные величины 0,42

5.4 Метод определения общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции

Принцип метода

Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция).

Реактивы

1. Лиофилизированный альбумин для приготовления 5 мл калибровочного раствора (100+2) г/л или 5 мл готового раствора альбумина (100+2) г/л.

2. Биуретовый реактив (концентрированный раствор):

- сульфат меди (15.0+0,75) г/л;

- гидроокись натрия (40,0+2) г/л;

- калия нитрат тартрат (45,0+2,25) г/л;

- йодит калия (25,0+1,25) г/л;

Оборудование

1. Анализатор биохимический фотометрический кинетический АБхФк-02 - «НПП-ТМ».

2. Колба мерная емкостью 500 мл, пробирки емкостью 10 мл (ГОСТ1770-74).

3. Пипетки емкостью 1; 0,1; и 5 мл (ГОСТ 29227-91).

Приготовление рабочих растворов

1. Калибровочный раствор альбумина. Если флакон содержит лиофилизированный альбумин, то в него вносят, аккуратно вытащив крышку, точно 4,5 мл физиологического раствора. Флакон закрывают крышкой и, не допуская пены, легкими вращательными движениями руки перемешивают его содержимое до полного растворения. Флакон не взбалтывать. Хранить при температуре от +2°С до +4°С. Раствор содержит (100+2) г/л альбумина. Если во флаконе раствор, то он готовый для использования.

2. Биуретовый реактив. Содержимое одного флакона с концентрированным раствором биуретового реактива перенести в мерную колбу емкостью 500 мл и довести до метки дистиллированной водой. Потом перенести в полиэтиленовую емкость, которая герметично закрывается. Раствор стабильный.

Ход определения

Ингредиенты, мл	Калибровочная или исследуемая проба	Холостая проба
Калибровочный или исследуемый раствор	0,02	-
Физиологический раствор	-	0,02
Биуретовый реактив	1,00	1,00

Смешивают, оставляют на 30 мин при комнатной температуре (от + 18°С до +25°С). Измеряют оптическую плотность калибровочной и исследуемой проб против холостой на АБхФк-02 - «НПП-ТМ», длина волны 540 нм. Окрашивание стабильно в течение 60 минут.

Расчет концентрации общего белка проводят по формуле:

С= Е_иссл /Е_калх100. где

С - концентрация общего белка в исследуемой пробе, г/л;

100 - концентрация общего белка в калибровочном растворе, г/л;

Е_иссл - оптическая плотность исследуемой пробы, ед. опт. плотности;

Е_кал - оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт. плотности.

Нормальные величины 65-85 г./л.

Примечания

1. Биуретовая реакция чувствительна к температуре. Повышение температуры увеличивает скорость развития окраски. Поэтому определение необходимо проводить при одной и той же температуре. Обычно это комнатная температура.

2. Время экспозиции проб в ходе исследования также сказывается на интенсивности окраски реакционной смеси. Поэтому для получения сопоставимых результатов колориметрирование всегда проводится через одинаковые интервалы времени, которые выбирают в промежутке между 30 - 60 мин. экспозиции.

3. Содержание белка в стандартном растворе должно быть не меньше 70 г./л.

4. При содержании белка в сыворотке крови больше 100 г./л сыворотку разводят физиологическим раствором, а результаты умножают на коэффициент разведения.

5. Все реактивы готовят на прокипяченной дистиллированной воде.

Заключение

Острый вирусный гепатит В передается преимущественно парентеральным путем (с продуктами крови, при использовании инфицированных шприцев и т.д.), при половых контактах, а также вертикально (от матери ребенку). Инкубационный период может колебаться в зависимости от дозы возбудителя. От момента заражения до развертывания клинических проявлений может пройти 160 дней. НВsAg обнаруживается в сроки от 6 до 43 дней с момента инфицирования. Часто наблюдается безжелтушное течение заболевания. Выздоровление отмечается более чем в 95% случаев. Однако острый вирусный гепатит В следует считать потенциально опасным, поскольку возможны переход в хроническую форму, развитие вирусоносительства и возникновение фульминантного гепатита.

Диагноз предположительно ставится на основании клинической картины и повышения уровня аминотрансфераз и подтверждается более чем у 80% больных с помощью определения НВsAg. У остальных пациентов ВГВ как этиологический фактор заболевания устанавливается при выявлении высокого титра анти-НВс-IgM.

Этиотропного лечения впервые возникшего острого гепатита В в настоящее время не существует.

В отличие от вирусного гепатита А, при гепатите В излечение наблюдается не у всех больных. О хроническом течении можно думать при сохранении маркеров гепатита В (НВsAg, НВеAg, ВГВ-ДНК) более 3 месяцев с начала острого заболевания.

Огромное значение придают профилактике гепатита В с помощью вакцинации. Отдают предпочтение симультанной (активно-пассивной) вакцинации. Эта вакцинация показана во всех ситуациях, связанных со случайной инокуляцией материала, инфицированного ВГВ, а также новорожденным, родившимся у НВsAg-положительных матерей.

Большое значение приобретает активная защитная вакцинация всех работников здравоохранения, а также тех, кто профессионально контактирует с кровью или ее продуктами.

Список литературы

1. Горячковский О.М. «Клиническая биохимия» /Изд. 2-е, вып. и доп. - Одесса: Асторопринт, 1998. - 608 с.

2. Еналеева Д.Ш., Фазылов В.Х., Созинов А.С. Хронические вирусные гепатиты В и С. Что надо знать о болезни? - Казань: МЕДпрессинформ, 2003. - 144 с.

3. Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Волжанин В.М., Гусев Д.А. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение. - СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2003. - 192 с.

4. Белозеров Е.С., Иоанниди Е.А. Вирусный гепатит. - М: АПП «Джангар», 2004. - 160 с.

5. Майкер К.-П. Гепатит и последствия гепатита: Практич. рук.: Пер. с нем./ Под ред. А.А. Шептулина. - М.: ГЭОТАР МЕДИЦТНА, 2000. - 432 с.

6. Маджидов В.М., Шапунова И.И. Диагностика и исходы вирусного гепатита. Т: Медицина, 1979. - 127 с.

7. Неменова Ю.М. Методы клинических лабораторных исследований. М: «Москва», 1967. - 445 с.

8. Базарнова М.А. Руководство по клинической диагностике. Ч. 3: Клиническая биохимия. - К: Вища шк. Головное изд-во, 1986. - 279 с.

9. Под редакцией проф. Е.С. Кетиладзе Вирусный гепатит. Австралийский (SH - HB) антиген при вирусном гепатите / сборник трудов. - М - 1973. -295 с.

10. Камышников В.С., Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: Справочник: В 2т. Т.1-2-е изд. - Мн: Интерпрессервис, 2003 - 495 с., ил.

11. Камышников В.С., Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: Справочник: В 2т. Т.2-2-е изд. - Мн: Интерпрессервис, 2003 - 463 с., ил.

12. Скляров О.Я., Фартушок Н.В., Сойка Л.Д., Смачило І.С., Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження: підручник для студ. ВМНЗ І-ІІ рівня акредитації. - К: Медицина, 2009. - 352 с.

13. Камышников В.С., О чем говорять медицинские анализы: справ. пособие - 3-е изд. - Минск: Беларус. наука, 2001 - 189 с.

14. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородний И.В., Клиническая биохимия: пособие - М: Триада-Х, 2002 - 504 с.

Размещено на Allbest.ru