Лекарственные формы инсулина

Инсулины средней длительности действия хуже растворимы, медленнее всасываются из подкожной клетчатки, вследствие чего обладают более длительным эффектом. Продолжительное действие этих препаратов достигается наличием специального пролонгатора -- протамина (изофан, протафан, базал) или цинка. Замедление всасывания инсулина в препаратах, содержащих инсулин цинк суспензию составную, обусловлено наличием кристаллов цинка. НПХ-инсулин (нейтральный протамин Хагедорна, или изофан) представляет собой суспензию, состоящую из инсулина и протамина (протамин -- белок, изолированный из молок рыб) в стехиометрическом соотношении.

К инсулинам длительного действия относится инсулин гларгин -- аналог человеческого инсулина, полученный методом ДНК-рекомбинантной технологии -- первый препарат инсулина, который не имеет выраженного пика действия. Инсулин гларгин получают путём двух модификаций в молекуле инсулина: заменой в позиции 21 А-цепи (аспарагин) на глицин и присоединением двух остатков аргинина к С-концу В-цепи. Препарат представляет собой прозрачный раствор с рН 4. Кислый рН стабилизирует гексамеры инсулина и обеспечивает длительное и предсказуемое всасывание препарата из подкожной клетчатки. Однако из-за кислого рН инсулин гларгин нельзя комбинировать с инсулинами короткого действия, которые имеют нейтральный рН. Однократное введение инсулина гларгина обеспечивает 24-часовой беспиковый гликемический контроль. Большинство препаратов инсулина обладают «пиком» действия, отмечающимся, когда концентрация инсулина в крови достигает максимума. Инсулин гларгин не обладает выраженным пиком, поскольку высвобождается в кровоток с относительно постоянной скоростью. [19, стр.8-9]

Препараты инсулина пролонгированного действия выпускаются в различных лекарственных формах, оказывающих гипогликемический эффект разной продолжительности (от 10 до 36 ч). Пролонгированный эффект позволяет уменьшить число ежедневных инъекций. Выпускаются они обычно в виде суспензий, вводимых только подкожно или внутримышечно. При диабетической коме и прекоматозных состояниях пролонгированные препараты не применяют.

Комбинированные препараты инсулина представляют собой суспензии, состоящие из нейтрального растворимого инсулина короткого действия и инсулина-изофан (средней длительности действия) в определённых соотношениях. Такое сочетание инсулинов разной продолжительности действия в одном препарате позволяет избавить пациента от двух инъекций при раздельном использовании препаратов. [19, стр.10]

1.11 Показания к применению инсулина

Основным показанием к применению инсулина является сахарный диабет типа 1, однако в определённых условиях его назначают и при сахарном диабете типа 2, в том числе при резистентности к пероральным гипогликемическим средствам, при тяжёлых сопутствующих заболеваниях, при подготовке к оперативным вмешательствам, диабетической коме, при диабете у беременных. Инсулины короткого действия применяют не только при сахарном диабете, но и при некоторых других патологических процессах, например, при общем истощении (в качестве анаболического средства), фурункулёзе, тиреотоксикозе, при заболеваниях желудка (атония, гастроптоз), хроническом гепатите, начальных формах цирроза печени, а также при некоторых психических заболеваниях (введение больших доз инсулина -- гипогликемическая кома); иногда он используется как компонент «поляризующих» растворов, используемых для лечения острой сердечной недостаточности.

Инсулин является основным специфическим средством терапии сахарного диабета. Лечение сахарного диабета проводится по специально разработанным схемам с использованием препаратов инсулина разной продолжительности действия. Выбор препарата зависит от тяжести и особенностей течения заболевания, общего состояния больного и от скорости наступления и продолжительности сахароснижающего действия препарата.

Все препараты инсулина применяются при условии обязательного соблюдения диетического режима с ограничением энергетической ценности пищи (от 1700 до 3000 ккал).

При определении дозы инсулина руководствуются уровнем гликемии натощак и в течение суток, а также уровнем глюкозурии в течение суток. Окончательный подбор дозы проводится под контролем снижения гипергликемии, глюкозурии, а также общего состояния больного. [20, стр.567]

1.12 Применение инсулина при беременности

Основным медикаментозным методом лечения сахарного диабета во время беременности является инсулинотерапия, которая проводится под тщательным контролем. При сахарном диабете типа 1 продолжают лечение инсулином. При сахарном диабете типа 2 отменяют пероральные гипогликемические средства и проводят диетотерапию.

Гестационный сахарный диабет (диабет беременных) -- это нарушение углеводного обмена, впервые возникшее во время беременности. Гестационный сахарный диабет сопровождается повышенным риском перинатальной смертности, частоты врождённых уродств, а также риском прогрессирования диабета через 5-10 лет после родов. Лечение гестационного сахарного диабета начинают с диетотерапии. При неэффективности диетотерапии применяют инсулин.

Для пациенток с ранее имевшимся или гестационным сахарным диабетом важно в течение всей беременности поддерживать адекватную регуляцию метаболических процессов. Потребность в инсулине может уменьшаться в I триместре беременности и увеличиваться во II-III триместрах. Во время родов и непосредственно после них потребность в инсулине может резко снизиться (возрастает риск развития гипогликемии). В этих условиях существенное значение имеет тщательный контроль содержания глюкозы в крови.

Инсулин не проникает через плацентарный барьер. Однако материнские IgG-антитела (класс антител) к инсулину проходят через плаценту и, вероятно, могут вызывать гипергликемию у плода за счёт нейтрализации секретируемого у него инсулина. С другой стороны, нежелательная диссоциация комплексов инсулин-антитело может привести к гиперинсулинемии и гипогликемии у плода или новорожденного. Показано, что переход с препаратов бычьего/свиного инсулина на монокомпонентные препараты сопровождается снижением титра антител. В связи с этим при беременности рекомендуют использовать только препараты инсулина человека.

Аналоги инсулина (как и другие, недавно разработанные средства) с осторожностью назначают при беременности, хотя достоверных данных о неблагоприятном воздействии нет. В соответствии с общепризнанными рекомендациями FDA (Food and Drug Administration), определяющими возможность применения ЛС (лекарственные средства) при беременности, препараты инсулинов по действию на плод относятся к категории B (изучение репродукции на животных не выявило неблагоприятного действия на плод, а адекватных и строго контролируемых исследований у беременных женщин не проведено), либо к категории C (изучение репродукции на животных выявило неблагоприятное действие на плод, а адекватных и строго контролируемых исследований у беременных женщин не проведено, однако потенциальная польза, связанная с применением ЛС у беременных, может оправдывать его использование, несмотря на возможный риск). Так, инсулин лизпро относится к классу B, а инсулин аспарт и инсулин гларгин -- к классу C. [20, стр.568-569]

1.13 Противопоказания к применению инсулина

Инсулин противопоказан при заболеваниях и состояниях, протекающих с гипогликемией (например, инсулинома), при острых заболеваниях печени, поджелудочной железы, почек, язве желудка и двенадцатиперстной кишки, декомпенсированных пороках сердца, при острой коронарной недостаточности и некоторых других заболеваниях.

Осторожность необходима при применении инсулина у больных с заболеваниями щитовидной железы, болезнью Аддисона, почечной недостаточностью. [20, стр.570]

1.14 Взаимодействие инсулина с другими лекарственными препаратами

Препараты инсулина можно комбинировать друг с другом. Многие ЛС могут вызывать гипо- или гипергликемию, либо изменять реакцию больного сахарным диабетом на лечение. Следует учитывать взаимодействие, возможное при одновременном применении инсулина с другими лекарственными средствами. Альфа-адреноблокаторы и бета-адреномиметики увеличивают секрецию эндогенного инсулина и усиливают действие препарата. Гипогликемическое действие инсулина усиливают пероральные гипогликемические средства, салицилаты, ингибиторы МАО - моноаминооксидаза (включая фуразолидон, прокарбазин, селегилин), ингибиторы АПФ (ангиотензинпревращающий фермент), бромокриптин, октреотид, сульфаниламиды, анаболические стероиды (особенно оксандролон, метандиенон) и андрогены (повышают чувствительность тканей к инсулину и увеличивают резистентность тканей к глюкагону, что и приводит к гипогликемии, особенно в случае инсулинорезистентности; может понадобиться снижение дозы инсулина), аналоги соматостатина, гуанетидин, дизопирамид, клофибрат, кетоконазол, препараты лития, мебендазол, пентамидин, пиридоксин, пропоксифен, фенилбутазон, флуоксетин, теофиллин, фенфлурамин, препараты лития, препараты кальция, тетрациклины. Хлорохин, хинидин, хинин снижают деградацию инсулина и могут повышать концентрацию инсулина в крови и увеличивать риск гипогликемии.

Ингибиторы карбоангидразы (особенно ацетазоламид), стимулируя панкреатические в-клетки, способствуют высвобождению инсулина и повышают чувствительность рецепторов и тканей к инсулину; хотя одновременное использование этих ЛС с инсулином может повышать гипогликемическое действие, эффект может быть непредсказуемым.

Целый ряд ЛС вызывают гипергликемию у здоровых людей и усугубляют течение заболевания у больных сахарным диабетом. Гипогликемическое действие инсулина ослабляют: антиретровирусные ЛС, аспарагиназа, пероральные гормональные контрацептивы, глюкокортикоиды, диуретики (тиазидные, этакриновая кислота), гепарин, антагонисты Н2-рецепторов, сульфинпиразон, трициклические антидепрессанты, добутамин, изониазид, кальцитонин, ниацин, симпатомиметики, даназол, клонидин, БКК (блокаторы кальциевых каналов), диазоксид, морфин, фенитоин, соматотропин, тиреоидные гормоны, производные фенотиазина, никотин, этанол.

Глюкокортикоиды и эпинефрин оказывают на периферические ткани эффект, противоположный инсулину. Так, длительный приём системных глюкокортикоидов может вызывать гипергликемию, вплоть до сахарного диабета (стероидный диабет), который может наблюдаться примерно у 14% пациентов, принимающих системные кортикостероиды в течение нескольких недель или при длительном применении топических кортикостероидов. Некоторые ЛС ингибируют секрецию инсулина непосредственно (фенитоин, клонидин, дилтиазем) либо за счёт уменьшения запасов калия (диуретики). Тиреоидные гормоны ускоряют метаболизм инсулина.

Наиболее значимо и часто влияют на действие инсулина бета-адреноблокаторы, пероральные гипогликемические средства, глюкокортикоиды, этанол, салицилаты.

Этанол ингибирует глюконеогенез в печени. Этот эффект наблюдается у всех людей. В связи с этим следует иметь в виду, что злоупотребление алкогольными напитками на фоне инсулинотерапии может привести к развитию тяжёлого гипогликемического состояния. Небольшие количества алкоголя, принимаемого вместе с едой, обычно не вызывают проблем.

Бета-адреноблокаторы могут ингибировать секрецию инсулина, изменять метаболизм углеводов и увеличивать периферическую резистентность к действию инсулина, что приводит к гипергликемии. Однако они могут также ингибировать действие катехоламинов на глюконеогенез и гликогенолиз, что сопряжено с риском тяжёлых гипогликемических реакций у больных сахарным диабетом. Более того, любой из бета-адреноблокаторов может маскировать адренергическую симптоматику, вызванную снижением уровня глюкозы в крови (в том числе тремор, сердцебиение), нарушая тем самым своевременное распознавание пациентом гипогликемии. Селективные бета1-адреноблокаторы (в том числе ацебутолол, атенолол, бетаксолол, бисопролол, метопролол) проявляют эти эффекты в меньшей степени.

НПВС (нестероидные противовоспалительные средства) и салицилаты в высоких дозах ингибируют синтез простагландина Е (который ингибирует секрецию эндогенного инсулина) и усиливают таким образом базальную секрецию инсулина, повышают чувствительность в-клеток поджелудочной железы к глюкозе; гипогликемический эффект при одновременном применении может потребовать корректировки дозы НПВС или салицилатов и/или инсулина, особенно при длительном совместном использовании. [8, стр.40-42]

1.15 Получение инсулина

Инсулин человека можно производить четырьмя способами:

- полным химическим синтезом;

- экстракцией из поджелудочных желёз человека (оба этих способа не подходят из-за неэкономичности: недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья для массового производства вторым способом);

- полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин (см. Прил. Е);

- биосинтетическим способом по генно-инженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.

Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и денатурации).

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

- белок носитель, обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культурную среду;

- аффинный компонент, существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

В Великобритании с помощью Escherichia coli (кишечная палочка) синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

Химическим способом получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина.

Следующий этап - включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном Escherichia coli - особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.

Из Escherichia coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью в-галактозидазы Escherichia coli). В результате Escherichia coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путём, затем проводят и очистку. В бактериях синтезируется около 100 000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Природа гормонального вещества, продуцируемого Escherichia coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.

Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).

В Институте РАН (Российская академия наук) получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов Escherichia coli из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro (технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» -- вне живого организма) осуществляется в той же последовательности, что и in vivо, (то есть «внутри живого организма» или «внутри клетки») - отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трёх дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединённого к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus (Стафилококк золотистый).

Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого приводят к инсулину.

Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединённого к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения, и расщепляли бромцианом.

Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращённофазовой) ВЭЖХ, показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединённого к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.

Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу «голова-хвост» с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе. [12, стр.10-15]

1.16 Лекарственные формы и системы доставки инсулина

Порошки для инъекций: подкожно - при повседневном приёме, внутривенно и интраперитониально - при коме

Суспензии для подкожного введения.

Растворы для инъекций:

- портативный инжектор в виде авторучки (для многократных подкожных инъекций при интенсивной инсулинотерапии)

- системы с «замкнутым кругом» (инфузионные системы контролирующие уровень глюкозы в крови; только при диабетической коме)

- системы с «открытым циклом» (инсулиновые помпы (см. Прил. Ж) - резервуар и помпа, запрогромированная на введение регулярного инсулина с рассчитанной скоростью без измерения уровня глюкозы; подкожно, внутривенно, интраперитониально).

Аэрозоли для интраназального введения.

Проводятся разработки по созданию пероральных форм. [11, стр.193]

1.17 Форма выпуска препаратов инсулина

В настоящее время выпускается значительное число инсулиновых препаратов, в том числе полученных из поджелудочных желёз животных и синтезированных методами генной инженерии. Препаратами выбора для проведения инсулинотерапии являются генно-инженерные высокоочищенные человеческие инсулины, обладающие минимальной антигенностью (иммуногенной активностью), а также аналоги человеческого инсулина.

Препараты инсулина из тканей животных по степени очистки делятся на монопиковые (МП) и монокомпонентные (МК). Получаемые в настоящее время из поджелудочных желёз свиней обозначают дополнительно буквой С (СМП - свиной монопиковый, СМК - свиной монокомпонентный); крупного рогатого скота - буквой Г (говяжий: ГМП - говяжий монопиковый, ГМК - говяжий монокомпонентный). Препараты человеческого инсулина обозначают буквой Ч.

Препараты инсулина выпускаются в стеклянных флаконах (см. Прил. И), герметически укупоренных резиновыми пробками с алюминиевой обкаткой, в специальных так называемых инсулиновых шприцах (см. Прил. К) или шприц-ручках (см. Прил. Л). При использовании шприц-ручек препараты находятся в специальных флаконах-картриджах (пенфиллах). [20, стр.569]

1.18 Хранение инсулина

Хранение инсулина организовывают согласно Приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Минздравсоцразвития России) от 23.08.2010 № 706н (редакция от 28.12.2010) «Об утверждении Правил хранения лекарственных средств». [1]

Не допустимо использовать инсулин с истёкшим сроком годности, указанным на флаконе.

Запас инсулина хранится в холодильнике при температуре 2-8 градусов тепла (отделение для фруктов и овощей).

Хранить используемые для ежедневных инъекций флаконы с инсулином или шприц-ручки при комнатной температуре в течение 1 месяца.

Не подвергать инсулин замораживанию (при ношении зимой в сумке), перегреванию (летом в закрытой машине или на пляже) и действию прямого солнечного света -- это приведёт к потере его свойств.

Не сдавать запас инсулина в багаж (при поездке в отпуск, командировку и так далее), так как он может потеряться, разбиться, замёрзнуть.

Не использовать инсулин, если он изменил свой внешний вид (например, в инсулине короткого действия плавают хлопья).

Инсулин, как все лекарственные препараты хранится в недоступном для детей месте. [6, стр.15]

2. ВЫЯВЛЕНИЕ ВОСТРЕБОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ИНСУЛИНА

Рассмотрены коммерческие лекарственные формы инсулина, а также сложности и стратегии при разработке альтернативных систем доставки гормона (трансбуккальной, трансдермальной, интраназальной, ингаляционной и пероральной). На настоящий момент разработана лишь одна клиническая форма неинвазивного инсулина. [16, стр.249]

2.1 Анализ различных лекарственных форм инсулина в лекарственных препаратах

Был проведён анализ на химическую и физическую стабильность лекарственной формы инсулина на примере готовой лекарственной формы инсулина человека пролонгированного действия.

Лекарственная форма содержит высокоочищенную субстанцию инсулина человека, протаминсульфат, цинка хлорид, глицерин, м-крезол, фенол, натрийдигидрогенфосфат дигидрат или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат, натрий хлорид и воду, имеет остаточную протеолитическую активность не более 0,005 адсорбционных единиц и рН 6,9-7,8. Технический результат - создание готовой лекарственной формы инсулина человека пролонгированного действия, которая отличается химической и физической стабильностью при хранении и обеспечивает сокращение сроков её приготовления (см. Табл. 10).

Таблица 10 - Результаты анализа

№ примера	Содержание высокомолекулярных соединений, %	Внешний вид суспензии после хранения в течение 25 месяцев
	На момент производства	После 25 месяцев хранения при температуре 4 °C
1	0,2	0,85	Гомогенная система, отсутствие комков
2	0,25	0,97	Гомогенная система, отсутствие комков
3	0,55	1,8	Гомогенная система, отсутствие комков
4	0,6	2,0	Гомогенная система, отсутствие комков

Известны препараты инсулина пролонгированного действия, в которых как действующее вещество использовалась субстанция свиного инсулина, как пролонгаторы ионы цинка и протаминсульфат, как изотонический агент г - лицерин, как консерванты - м-крезол и фенол, как вещество с буферной ёмкостью - натрий фосфорнокислый или уксуснокислый («Современные гормональные средства», Киев: Здоровье, 1994 год). Но такие препараты содержали большое количество вредных для здоровья человека примесей, которые вызывали нежелательные аллергические реакции и осложнения.

Более совершенными и наиболее близкими по составу к заявляемой готовой лекарственной форме инсулина пролонгированного действия являются лекарственные препараты по патенту США №5547930, 1996 года, «Кристаллы инсулина ASPВ28», которые содержат как действующее вещество аналог субстанции инсулина ASPВ28 в количестве 3,55-4,375 г/л, как пролонгаторы - цинка хлорид в количестве 0,0323-0,0395 г/л и протаминсульфат в количестве 0,463-0,565 г/л, как изотонический агент глицерин в количестве 30-33 г/л, как консерванты - м-крезол в количестве 1,4-1,6 г/л и фенол в количестве 1,2-1,3 г/л, как агент с буферной ёмкостью - динатрийгидрогенфосфат в количестве 1,8-1,9 г/л и воду. К недостаткам этого медицинского препарата можно отнести большое содержание глицерина и протаминсульфата (30-33 г/л и 0,463-0,565 г/л по сравнению с 14-18 г/л и 0,238-0,318 г/л в заявляемом решении соответственно). И хотя авторы патента №5547930 не дают данных по химической стабильности препарата при хранении, но известно, что глицерин при хранении препарата увеличивает образование ковалентно прошитых димеров инсулина и дезамидоинсулинов (Fcta Pharm. Nord. 4(3), стр. 152), а протаминсульфаты способствуют образованию протамин-инсулинов, которые также относятся к высокомолекулярным соединениям и большое количество которых свидетельствует о химической нестабильности готовой лекарственной формы во времени, что, в свою очередь, приводит к увеличению частоты клинических аллергических реакций у больных диабетом. Кроме того, использование в прототипе как действующего вещества аналога субстанции инсулина ASPВ28приводит к удлинению процесса приготовления готового лекарственного средства, потому что рост кристаллов по данным авторов патента №5547930 занимает 7 суток (по сравнению с 18-20 часами в заявляемом решении).

Задачей изобретения является создание готовой лекарственной формы инсулина человека пролонгированного действия, которая отличается химической и физической стабильностью при хранении, и обеспечение сокращения сроков её приготовления.

Поставленная задача решается тем, что готовая лекарственная форма инсулина человека пролонгированного действия, содержащая высокоочищенную субстанцию инсулина человека, протаминсульфат, цинка хлорид, глицерин, м-крезол, фенол, динатрийгидрогенфосфат гептагидрат и воду, согласно изобретению отличается тем, что высокоочищенная субстанция инсулина человека имеет остаточную протеолитическую активность не более 0,005 абсорбционных единиц, а композиция содержит динатрийгидрогенфосфат гептагидрат или натрийдигидрогенфосфат дигидрат и дополнительно натрия хлорид и имеет рН 6,9-7,8 при следующем соотношении компонентов, г/л: высокоочищенная субстанция инсулина человека 3,214-3,928; протаминсульфат 0,238-0,318; цинка хлорид 0,014-0,0225; глицерин 14-18; м-крезол 1,4-1,6; фенол 0,5-0,7; натрийдигидрогенфосфат дигидрат 2,4-2,8 или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат 2,0-2,3; натрий хлорид 0,15-0,3; вода - остальное.

В заявляемом решении как действующее вещество, то есть высокоочищенная субстанция инсулина человека, может быть использована полусинтетическая субстанция инсулина человека, полученная реакцией транспептидации свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями, которая проводится в присутствии трипсина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина, и постадийно очищенная хроматографией высокого давления, или субстанция инсулина человека, полученная по рекомбинантной технологии, причём обе субстанции инсулина человека должны характеризоваться остаточной протеолитической активностью не более 0,005 абсорбционных единиц. Как пролонгаторы в заявляемом решении могут использоваться протаминсульфат с остаточной протеолитической активностью тоже не более 0,005 абсорбционных единиц и цинка хлорид; в качестве изотонических агентов используются глицерин и натрия хлорид; консервантов - м-крезол и фенол; вещества с буферной ёмкостью - натрийдигидрогенфосфат дигидрат или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат. Растворение субстанции инсулина человека и корректировка рН смеси до 6,9-7,8 реализуются известными способами с помощью НСl и NaOH соответственно.

Решение поставленной задачи иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

- Пример 1

3,571 г субстанции инсулина человека суспендировали в 150 мл воды, затем с помощью 1 М НСl рН суспензии довели до 3,1 для растворения кристаллов субстанции. 0,318 г протаминсульфата растворили в 25 мл воды и довели рН раствора до 3,1, добавляя 1 М НСl. 0,0225 г цинка хлорида добавили к раствору протаминсульфата. Потом смешали раствор субстанции инсулина человека и раствор, который содержал протаминсульфат и цинка хлорид.

После этого приготовили буферный раствор, который содержал 2,5 г натрийдигидрогенфосфата дигидрата, 1,5 г м-крезола, 0,6 г фенола, 16 г глицерина и 0,2 г натрия хлорида в объеме 800 мл и довели рН буферного раствора до 7,8, провели стерилизующую фильтрацию и профильтровали туда смесь кислых растворов субстанции инсулина человека, протаминсульфата и цинка хлорида. Полученную смесь выдерживали при перемешивании 18 часов при температуре 18°С для получения кристаллической суспензии готового лекарственного препарата. Готовый препарат разлили в асептических условиях в картриджи ёмкостью 1,5 и 3,0 мл. Готовый препарат проанализировали методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Анализ показал практическое отсутствие инсулина в супернатанте при общем содержании инсулина 98 МЕ/мл. Содержание высокомолекулярных белков составило 0,2%. Форму и размер кристаллов определяли с помощью микроскопа при 400-кратном увеличении. Кристаллы имели тетрагональную форму и длину от 1 до 25 мкм.

- Пример 2

75% кристаллической доли лекарственной формы готовили, как в примере 1, за исключением того, что вместо натрийдигидрогенфосфата дигидрата брали динатрийгидрогенфосфат гептагидрат в количестве 2,0 г, а смесь всех компонентов выдерживали при перемешивании при такой же температуре 20 часов. 25% растворимой части лекарственной формы готовили следующим образом: 1,19 г субстанции инсулина человека суспендировали в 100 мл воды, с помощью 1 М НСl довели рН до 3,1. В 230 мл воды приготовили буферный раствор, который содержал 0,66 г динатрийгидрогенфосфата гептагидрата, 0,5 г м-крезола, 0,2 г фенола, 5,28 г глицерина и 0,066 г натрия хлорида. Буферный раствор смешали с раствором субстанции инсулина, откорректировали рН полученного раствора до 7,3 и провели стерилизующую фильтрацию в емкость с кристаллической частью готовой лекарственной формы. Смесь перемешивали в течение 1 часа и потом в асептических условиях провели разлив. Анализ готового препарата таким же методом, как в примере 1, показал общее содержание инсулина человека 97,3 МЕ/мл, содержание инсулина в супернатанте 24 МЕ/мл. Содержание высокомолекулярных белков составило 0,25%. Кристаллы имели тетрагональную форму и длину от 1 до 20 мкм.

- Пример 3

Готовое лекарственное средство получали, как в примере 1, но натрия хлорида брали 0,35 г. Общее содержание инсулина в медицинском препарате, определённое методом аналитической ВЭЖХ, составило 98 МЕ/мл, в супернатанте - 0,5 МЕ/мл. Содержание высокомолекулярных белков было 0,55%. Форма и размер кристаллов были, как в примере 1.

- Пример 4

Готовую лекарственную форму получали, как в примере 1, но натрия хлорида брали 0,1 г. Общее содержание инсулина в медицинском препарате, определённое методом аналитической ВЭЖХ, составило 96,8 МЕ/мл, в супернатанте - 0,8 МЕ/мл. Содержание высокомолекулярных белков составляло 0,6%. Форма и размер кристаллов были, как в примере 1.

Для определения химической и физической стабильности полученные образцы медицинских препаратов, которые на момент приготовления отвечали всем требованиям, предъявляемым к препаратам инсулина Европейской фармакопеей, выдерживались при температуре 4°С в течение 25 месяцев. После этого образцы были проанализированы аналитической системой ВЭЖХ на содержание высокомолекулярных соединений (ВМС). Внешний вид суспензии определялся визуально. Полученные данные сведены в таблицу, представленную выше.

Таким образом, как видно из приведённых примеров и таблицы, химическая и физическая стабильность полученных в соответствии с изобретением образцов готовых лекарственных форм инсулина человека пролонгированного действия (примеры 1 и 2) более чем в три раза превышает данные, которые требуются Европейской фармакопеей, а их состав позволяет сократить производственный процесс более чем в семь раз.

Готовая лекарственная форма инсулина человека пролонгированного действия, содержащая высокоочищенную субстанцию инсулина человека, протаминсульфат, цинка хлорид, глицерин, м-крезол, фенол и воду, отличающаяся тем, что высокоочищенная субстанция инсулина человека имеет остаточную протеолитическую активность не более 0,005 адсорбционных единиц, а композиция содержит натрийдигидрогенфосфат дигидрат или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат и дополнительно натрий хлорид и имеет рН 6,9-7,8 при следующем соотношении компонентов, г/л:

высокоочищенная субстанция инсулина человека 3,214-3,928

протаминсульфат 0,238-0,318

цинка хлорид 0,014-0,0225

глицерин 14-18

м-крезол 1,4-1,6

фенол 0,5-0,7

натрийдигидрогенфосфат дигидрат 2,4-2,8

или динатрийгидрогенфосфат гептагидрат 2,0-2,3

натрия хлорид 0,15-0,3

вода. [17, стр.71-77]

2.2 Инъекционные формы аналогов инсулина и его конъюгатов

С развитием биотехнологии стало возможным производить инсулины с изменённой аминокислотной последовательностью, тем самым влияя на их физико-химические, биологические и фармакокинетические свойства. Было синтезировано более 300 аналогов инсулина, но лишь немногие из них достигли рынка.

Основная цель создания таких аналогов инсулина - устранение недостатков традиционных препаратов: пролонгирование или, напротив, ускорение действия; повышение стабильности нативного инсулина; устранение вариабельности действия и приближение изменений концентрации глюкозы в крови к физиологическим.

Первым аналогом человеческого инсулина, который был введён на рынок, стал инсулин Lispro (известный также как Humalog). Он отличается от инсулина человека инверсией аминокислотных остатков в положениях В28 и В29. Такая инверсия позволяет уменьшить взаимодействие между В-цепями инсулина и тем самым ускорить его действие. С-концевые аминокислотные остатки в В-цепи играют важную роль в способности молекулы инсулина человека к образованию димеров и гексамеров в растворе. При подкожном введении инсулин Lispro мгновенно диссоциирует до мономеров, в то время как обычный препарат инсулина остаётся в гексамерной форме. При этом наблюдается более адекватный ответ к уровню глюкозы в крови. Препарат начинает действовать через несколько минут после инъекции, пик действия наблюдается через час, действие длится около 4 ч.

Похожими свойствами обладает другой быстродействующий аналог инсулина - Aspart (известный также как Novolog, Actrapid и Asp B28), отличающийся от нативного инсулина человека заменой Pro на Asp в положении В28. Механизм ускорения действия такой же, как в случае инсулина Lispro. Препарат начинает действовать через 15 мин после инъекции, пик действия достигается через 40-50 мин, действие длится 6 ч. При этом пиковые концентрации в 2 раза превышают концентрации в случае использования обычного инсулина в тех же доз.

Apidra - торговое название другого быстродействующего аналога инсулина Glulisine, недавно появившегося на рынке. От нативного человеческого инсулина он отличается двумя заменами: в положениях В3 и В29. Его профиль действия похож на профили Aspart и Lispro.

Все вышеперечисленные аналоги инсулина являются быстродействующими препаратами. Больным диабетом было бы гораздо удобнее принимать препараты с пролонгированным действием. Первым таким пролонгированным аналогом стал инсулин Glargine (торговое название - Lantus). Увеличить длительность действия удалось за счёт присоединения двух остатков Arg к С-концевому остатку В-цепи, сдвинув изоэлектрическую точку инсулина с 5,4 до 6,7 и тем самым понизив растворимость при введении подкожно. Замена Asp на Gly в положении А21 нужна для предотвращения дезаминирования и димеризации при кислых значениях рН. Препарат начинает действовать через час после инъекции, длительность действия составляет около 24 ч. На настоящий момент это единственный инсулин, рекомендованный для инъекций 1 раз в сутки.

Присоединение к молекуле инсулина жирных кислот, способных связываться с альбумином, позволило получить инсулиновый аналог, который остается в растворённом состоянии после инъекции. Таким препаратом стал Levemir - торговое наименование инсулина Detemir. Молекулярная структура инсулина Detemir отличается от структуры человеческого инсулина присоединением к Lys в положении B29 жирнокислотного остатка миристиновой кислоты. Ацилирование молекулы инсулина жирной кислотой обеспечивает связывание с альбумином и пролонгирует всасывание из подкожно-жирового слоя. После инъекции инсулин Detemir образует жидкостное депо в подкожно-жировой клетчатке. Молекулы инсулина в растворе соединены в гексамеры. Как только введённый инсулин Detemir попадает в интерстициальную жидкость, некоторые гексамеры обратимо агрегируют с образованием дигексамеров. Такая агрегация происходит в результате контакта между цепями жирных кислот молекул инсулина Detemir. Было показано, что инсулин Detemir обладает дозозависимой длительностью действия. Была выявлена линейная взаимосвязь дозы и ответной реакции для фармакокинетического и фармакодинамического эффектов. При дозе инсулина Detemir 0,4 Ед/кг длительность действия составляла 20 ч.

В работе показано, что пришивка инсулина к альбумину позволила увеличить продолжительность действия инсулина в 4 раза по сравнению с нативным инсулином, введённым в той же дозе, при этом образованный конъюгат был водорастворимым.

Пролонгировать время действия инсулина и увеличить устойчивость белка к протеолизу по сравнению с традиционными препаратами позволяет также ковалентная сшивка гормона с полимерами. Среди полимерных конъюгатов наибольшее распространение получили различные конъюгаты с активированным ПЭГ (полиэтиленгликоль).

Конъюгат инсулина с карбоксиметилдекстраном обладал в 10 раз более длительным гипогликемическим эффектом, чем нативный инсулин, а его биоактивность была ниже в 3 раза (на крысах).

Таким образом, многочисленные исследования продемонстрировали клинически значимые преимущества терапии аналогами и конъюгатами перед использованием соответствующих традиционных препаратов инсулина.

Однако для людей, страдающих диабетом, более удобным было бы неинвазивное введение инсулина. [16, стр.250-251]

2.3 Альтернативные способы доставки инсулина в организм человека

За 85 лет, которые прошли с момента открытия инсулина, было опубликовано более 2000 статей, посвящённых различным аспектам доставки инсулина. Среди альтернативных путей доставки инсулина были исследованы окулярный (через глаз), ректальный (через прямую кишку), трансдермальный (через кожу), трансбуккальный (через слизистую ротовой полости), сублингвальный (под язык), интраназальный (через носовую полость), пульмонарный (через лёгкие) и пероральный (через желудочно-кишечный тракт). Тем не менее, к настоящему моменту лишь одна форма неинвазивного инсулина разрешена для клинического применения, хотя существует множество идей, разработок и препаратов, проходящих различные фазы клинических испытаний.

В работе рассмотрены попытки создания окулярного инсулина, но, ни одна из них не увенчалась успехом. Был сделан вывод, что такой метод не подходит для доставки инсулина.

Преимуществом ректального пути доставки является прямое попадание инсулина в кровоток через лимфатическую систему, недостатком - невозможность абсорбции инсулина без применения веществ, усиливающих абсорбцию. Однако даже с применением таких веществ биодоступность инсулина при ректальном методе доставки составляет 4-10%. Кроме того, в работе было показано, что действие ректального инсулина гораздо короче действия инсулина, введённого подкожно. На данный момент нет разработок ректального инсулина, дошедших до клинических испытаний. [16, стр.251-253]

2.3.1 Трансдермальный путь доставки в организм человека

Доставка инсулина через кожу является перспективной из-за лёгкости апплицирования и большой площади поверхности кожи (1-2 м2). Серьёзной проблемой трансдермального пути доставки является плохая проницаемость липидного рогового слоя кожи для таких больших и гидрофильных молекул, как инсулин. Для преодоления липидного барьера применяют химические, электрические и физические методы. Самым распространённым методом является ионтофорез или низкочастотный ультразвук. На этом методе основана новая разработка компании Dermisonics - технология U-strip, позволяющая вводить инсулин через кожу.

Ультразвуковой генератор увеличивает размер пор кожи, инсулин проходит через них и попадает в кровоток.

Несколько иная технология у компании Altea Therapeutics: в этом случае за счёт электрической и термической энергии «срывается» роговой слой кожи, образуя микроканалы, через которые инсулин поступает в кровь. Введённый таким образом инсулин начинает действовать практически сразу, а продолжительность его действия составляет около 13 ч.

Также существует российская разработка трансдермального инсулина на основе спирторастворимого сополимера бутилметакрилата и метакриловой кислоты. Инсулин находится в системе в эмульсионной форме. In vitro было показано, что скорость диффузии инсулина из такой транспортной системы площадью 20 см2 через кожу составляет около 1,7 Ед/ч и соответствует физиологическому уровню секреции гормона поджелудочной железой. In vivo на людях показано наличие гипогликемического эффекта в течение 2 суток. На настоящий момент все три разработки проходят начальную фазу клинических испытаний.

Таким образом, трансдермальная доставка представляется достаточно перспективным путём введения инсулина. [16, стр.253]

2.3.2 Трансбуккальный и сублингвальный пути доставки в организм человека

Преимуществами доставки инсулина через ротовую полость являются доступность и большая площадь поверхности для абсорбции (100-200 см2), практически полное отсутствие протеолитических ферментов и большое количество сосудов. Однако серьёзными барьерами для абсорбции инсулина являются слоистая структура эпителия ротовой полости и слюна. Для преодоления этих барьеров были использованы различные вещества, повышающие абсорбцию (желчные соли, хелатирующие агенты, жирные кислоты и другие). Однако в этом случае снижение уровня глюкозы в крови in vivo составляло лишь 30% по сравнению с традиционным инсулином, введённым с помощью инъекций.

Новая разработка компании Generex - инсулин Oral-lyn (ранее Oralin) - на настоящий момент является единственной трансбуккальной формой инсулина, проходящей последнюю стадию клинических испытаний. В данном случае используется запатентованная технология компании Rapid Mist, позволяющая вводить инсулин в ротовую полость при помощи спрея. Согласно результатам клинических испытаний, действие Oral-lyn начинается быстрее, чем в случае подкожно введённого инсулина. [16, стр.253]

2.3.3 Интраназальный путь доставки в организм человека

Площадь эпителиальной поверхности носовой полости достаточно большая (150 см2), но основными барьерами для доставки инсулина таким методом является мукоцилиарный клиренс, трудности при проникновении через эпителиальный слой и ферментативная деградация (в слизистой оболочке носа присутствуют протеолитические ферменты (в основном аминопептидазы) и лизоцим).

По этим причинам эффективная абсорбция инсулина назальным путём практически невозможна без применения веществ, повышающих абсорбцию, способных к модулированию проницаемости назального эпителия и пролонгированию времени действия лекарства. Для этих целей применяют стимуляторы абсорбции, ингибиторы протеаз и мукоадгезивные вещества.

На ранних стадиях исследования по улучшению интраназальной абсорбции инсулина были использованы желчные соли, сапонины, тауро-дигидроксифузидат, диоксихолат. Почти все эти вещества увеличивали абсорбцию инсулина до 12-20%, но все они вызывали раздражение слизистой носа.

В некоторых работах для улучшения абсорбции различных лекарственных веществ были использованы хелатирующие агенты, в особенности ЭДТА (этилендиаминтетраацетат). Улучшение абсорбции при помощи хелатирующих агентов связано с их способностью раскрывать плотные клеточные контакты путём хелатирования двухвалентных катионов (магния и кальция). Последние, в свою очередь, играют важную роль в структуре и жёсткости клеточных мембран. Несмотря на то, что ЭДТА не оказывает раздражающего влияния на слизистую носа, такой метод в случае инсулина оказался малоэффективным. В то же время было показано, что жирные кислоты (например, капроновая) и фосфолипиды (например, лецитин) увеличивают абсорбцию инсулина в несколько раз.

Также для увеличения биодоступности инсулина, вводимого интраназально, используют вещества, которые одновременно увеличивают вязкость и при этом обладают биоадгезивными свойствами. Среди таких веществ карбопол (производное полиакриловой кислоты, образующее гели при низких концентрациях), карбоксиметилцеллюлоза. Карбопол способствует абсорбции инсулина в носовой полости, в то время как карбоксиметилцеллюлоза - нет, из чего можно сделать вывод о том, что вязкость и биоадгезивность - не единственные факторы, влияющие на интраназальную абсорбцию инсулина.

Были исследованы биоадгезивные системы доставки инсулина с применением различных микросфер из сефадекса, крахмала и хитозана. Предполагается, что положительно заряженные вещества, такие как хитозан, способны взаимодействовать с отрицательно заряженной слизистой носовой полости и увеличивать абсорбцию путём более тесного контакта с мембранами. Отрицательно заряженный гепарин нивелировал клеточные и абсорбционные изменения, вызываемые хитозаном . Авторами работы был сделан вывод, что хитозан увеличивает абсорбцию парацеллюлярным путём из-за структурных изменений в плотных клеточных контактах.

В работе было показано, что у овец применение хитозана увеличивало абсорбцию более эффективно, чем лецитин. Позже те же авторы показали, что степень интраназальной абсорбции зависит от концентрации хитозана. Те же авторы исследовали другую систему интраназальной доставки инсулина на основе хитозана (0,5 весовых %, рН 4). Максимум действия инсулина, введённого при помощи спрея с такой системой доставки, достигался через 20 мин, а продолжительность действия составляла всего 90 мин, в то время как инсулин, введённый подкожно, достигал максимума действия через 80 мин, а действие длилось 6 ч.

В настоящее время существуют две новые разработки интраназального инсулина, проходящие клинические испытания. Одна из них - Nasulin, разработка компании Bentley с применением собственной технологии доставки лекарственных средств через мембраны кожи, ротовой и носовой полостей CPE-215. Во время клинических испытаний (II стадия) пациентам рекомендовано применять спрей Nasulin 3 раза в день.

Вторая разработка принадлежит компании Nastech Pharmaceutical с применением технологии Exubera Inhalation Powder. По результатам начальной фазы клинических испытаний, препарат обладает очень быстрым действием с максимумом через 16-19 мин.

По сравнению с традиционной инвазивной доставкой инсулина, интраназальный путь гораздо более быстрый. Серьёзным недостатком этого метода доставки является частое раздражение слизистой носа (около 25% испытуемых). [16, стр.253-255]

2.3.4 Ингаляционный путь доставки в организм человека

На сегодняшний день ингаляционный или пульмонарный путь доставки инсулина, при котором пациент вдыхает лекарство через специальные ингаляторы, привлекает к себе большое внимание учёных и фирм-производителей. Большой интерес к пульмонарному пути доставки инсулина вызван следующими причинами. Во-первых, это большая площадь поверхности лёгких (около 140 м2); во-вторых, это возможность быстрого парацеллюлярного транспорта инсулина через эпителиальный монослой альвеолярной поверхности; в-третьих, иммунотолерантная природа лёгких; и, в-четвёртых, отсутствие протеолитических ферментов. Однако у этого метода есть и ограничения, среди которых цитозольная биодеградация инсулина и сложность перевода инсулина в пригодные для ингаляции формы.

В настоящий момент существует ряд разработок ингаляционного инсулина, проходящих последнюю фазу клинических испытаний. Инсулин переводят в ингаляционную форму при помощи дозированных ингаляторов под давлением, сухих порошковых ингаляторов и распылителей.

Совместная разработка фирм Pfizer и Nektar Therapeutics - технология Exubera Inhalation Powder - недавно успешно прошла, все клинические испытания и находится на стадии регистрации. Разработка разрешена в Европе и США для обоих типов диабета, но только для взрослых пациентов. Реально это пока единственная в мире клиническая форма, использующая неинвазивную систему доставки инсулина. Она представляет собой порошковый ингалятор с применением сжатого воздуха для диспергирования порошка инсулина в специальный резервуар для ингаляции. Порошок инсулина превращается в аэрозоль с размером частиц около 3 мкм, пригодный для ингаляции. Сухой порошок состоит из инсулина лишь на 60%, остальные компоненты - наполнители, в основном маннитол в качестве стабилизатора. Одноразовый расход порошка - 28 или 84 ЕД инсулина. Эффективность такой системы доставки оценивают как 10% от эффективности инсулина, введённого подкожно. Ингаляционный инсулин обладает более быстрым действием по сравнению с подкожно введённым, его действие длится от 5 до 10 ч.