Диагностика коклюшной и паракоклюшной инфекций

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет

Кафедра инфекционных болезней

Дипломная работа

Диагностика коклюшной и паракоклюшной инфекций

Исполнитель: Десятникова Е.Н.

Первый руководитель: Красавцев Е.Л.

Гомель, 2010.



РЕФЕРАТ

Дипломная работа

Перечень ключевых слов: коклюш, паракоклюш, B. pertussis, B. parapertussis, эпидемиология, лабораторная диагностика.

Объект исследования: 64 пациента, находившихся на лечении в Гомельской областной инфекционной клинической больнице с 2005года по 2009год.

Цель работы: определить значимость бактериологических и серологических методов диагностики.

Область применения: инфекционные болезни, педиатрия, лабораторная диагностика.

Коклюш остается актуальной инфекцией во все мире, в том числе в странах с высоким уровнем иммунизации. В то же время до сих пор отсутствуют высокочувствительные, специфичные и легко воспроизводимые методы диагностики этой инфекции, которые бы удовлетворяли потребности практического здравоохранения.

Представлен обзор данных по микробиологической характеристике возбудителя коклюша и паракоклюша. Описаны разные факторы патогенности Bardetella pertussis, их роль в развитии заболевания и формировании иммунитета человека. Рассмотрены некоторые вопросы патогенеза и клинической картины коклюша. Описываются различные методы лабораторной диагностики инфекции, вызванной Bardetella pertussis, их преимущества и недостатки. Для подтверждения диагноза учитывают клиническую картину, прямые методы выявления возбудителя заболевания и серологические методы диагностики. В лаборатории ГОИКБ применяют посев на коклюш и реакцию агглютинации для определения титра антител.

В результате работы была проведена обработка результатов исследований, полученных у инфекционных больных.



СОДЕРЖАНИЕ

Перечень условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Этиология возбудителей коклюшной и паракоклюшной инфекций

1.2 Патогенез

1.3 Клиническая картина

1.4 Лабораторная диагностика

1.4.1 Общий анализ крови

1.4.2 Микробиологические методы лабораторной диагностики

1.4.3 Иммунофлюоресцентный метод

1.4.4 Полимеразная цепная реакция

1.4.5 БЛОТ -ELISA

1.4.6 Серологические методы диагностики

1.5 Особенности серологической диагностики у привитых

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Методика проведения бактериологического исследования

2.2 Методика проведения РА

2.3 Методы статистического анализа

2.4 Характеристика обследованных больных

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1 Характеристика больных в группе привитых

3.2 Характеристика больных в группе привитых

3.3 Сравнительная характеристика привитых и не привитых

3.4 Значение бактериологического и серологических методов исследования

Заключение

Список литературы



ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АГГ - агглютиноген

ГОИКБ - Гомельская областная инфекционная клиническая больница

ОАК - общий анализ крови

ИФА - иммуноферментный анализ

КТ - коклюшный токсин

КУА - казеиново - угольный агар

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

СНО - клетки яичников китайских хомяков

IL- интерлейкин



ВВЕДЕНИЕ

Коклюш и паракоклюш являются высоко контагиозными бактериальными инфекциями респираторного тракта. Возбудители заболеваний - грамотрицательные бактерии Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis. B. parapertussis вызывает около 5 % всех случаев коклюша, точнее паракоклюш - заболевание, протекающее в атипичной, более легкой форме. У привитых людей, не болевших ранее, индекс восприимчивости достигает 0,7 - 0,75, т.е. из 100 человек, вступивших в тесный контакт с больным, заболевает 70 - 75 [1].

Источником инфекции является в основном больной человек, который выделяет возбудителя в течение 4--6 недель болезни. Заражение может произойти и от больного стертой формой, а также от здоровых людей, ставших временными носителями вследствие контакта с больным коклюшем. Биотопом возбудителя являются верхние дыхательные пути больного. Передача возбудителя происходит воздушно-капельным путем. Коклюш относится к эндемичным заболеваниям, однако каждые 3-5 лет случаются эпидемии. Количество случаев коклюша серьезно сократилось вследствие массовой вакцинации, тем не менее, даже в странах с большим охватом вакцинации регулярно случаются всплески заболевания.

Через 10-15 лет после вакцинации иммунитет ослабевает, и человек вновь становится уязвимым по отношению к коклюшу. На фоне массовой иммунизации у значительной части заболевших лиц болезнь протекает бессимптомно или с минимальными клиническими проявлениями, особенно у детей 4-6 лет, не имеющих достаточно высокий уровень поствакцинального иммунитета. В подобных случаях заболевание протекает в более мягкой форме, без проявления классических клинических стадий. Оно характеризуется неспецифическим длительным кашлем, продолжающимся в течение нескольких недель и даже месяцев. Поэтому практически не диагностируется коклюш у взрослых, что вероятно, связано не только со стертой клиникой и с отсутствием лейкоцитоза, но и с традиционным отношением врачей к коклюшу как к исключительно детской инфекции. Подростки и взрослые пациенты с не диагностированным коклюшем могут служить источником инфекции для не привитых детей. Наиболее высокому риску тяжелого заболевания подвергаются дети, которые еще слишком малы для того, чтобы получить полную вакцинацию и те, кто еще не завершил серию первичной вакцинации.

До настоящего времени регистрируется высокая заболеваемость коклюшем, особенно среди детей до года и 3-6 лет. Сохраняются ее периодические и сезонные подъемы, хотя и с меньшей степенью интенсивности. Как и ранее, коклюшем болеют привитые дети, часть из которых в относительно короткие сроки после прививок. Увеличивается число тяжелых и среднетяжелых форм инфекции среди не привитых детей, а также утративших поствакцинальный иммунитет.

Цель: Определить значимость бактериологических и серологических методов диагностики.

Задачи:

1. Определить половозрастной состав заболевших.

2. Определить диагностическую значимость бактериологического метода исследования.

3. Выявить особенности серологической диагностики у привитых.



Глава 1. Обзор литературы

1.1 Этиология возбудителей коклюшной и паракоклюшной инфекций

Возбудитель коклюша - Вогdetella pertussis - и паракоклюша-Bordetella parapertussis относятся к роду Воrdetella.

Бордетеллы представляют мелкие (0,5-2,0 мк. х 0,2-0,5 мк.) грамотрицательные коккобациллы. В.pertussis маленькая, неподвижная, овоидной формы палочка размером 0,3 -- 0,5 мк. х 0,5 --1,0 мк. При окраске толуидиновым синим обнаруживаются биполярно расположенные метахроматические гранулы. У палочки коклюша можно обнаружить также капсулу. В. рагареrtussis морфологически подобна, но размером несколько больше(0,6 -- 2,0 мк).

Устойчивость к физическим и химическим факторам.

Коклюшный микроб - облигатный паразит, вне организма он сохраняется очень недолго. В сухой мокроте - несколько часов; при температуре 50-55 °С погибает в течении 30 мин. Очень чувствителен к ультрафиолетовому свету и химическим антисептикам. Коклюшные и паракоклюшные микробы (в меньшей степени) чувствительны к антибиотикам[2].

Рост и питательные потребности микроорганизмов.

Бордетеллы -- строгие аэробы, использующие аминокислоты как источник азота, углерода и энергии. Углеводы, по-видимому, используют только бронхосептикозные микробы. Соли аммония и двуокись углерода образуются при биосинтезе из глутамата и других аминокислот путем окислительного дезаминирования (бронхосептикозный микроб может восстанавливать нитраты).

Микробы содержат следующие ферменты: глутаминсинтетазу, каталазу, супероксидную дисмутазу, пероксидазу, цитохромы А -- 603, В -- 560, C -- 553, D-- 629 и о, а также голубой протеин-азурин. Паракоклюшный микроб обладает уреазной активностью и образует тирозиназу.

При использовании простой среды определенного состава было установлено, что для коклюшного микроба необходимы только две аминокислоты. Одной должна быть глутаминовая кислота (или, по-видимому, глутамин) или пролин, а другой -- цистин или цистеин. Хотя глутаминовая кислота как субстрат для роста явно предпочтительнее, все же несколько других аминокислот также окисляются. Концентрация солей оказывает большое влияние на рост коклюшного микроба.

Коклюшные бактерии -- медленно растущие микроорганизмы, оптимальная температура роста 35 -- 36°С. Некоторые соединения, образующиеся в средах во время автоклавирования (коллоидная сера или сульфиды из цестеина и агара, органическая пероксидаза) и в процессе роста (ненасыщенные жирные кислоты), и марганец в агаре препятствуют росту коклюшного микроба. Чтобы устранить действие этих ингибиторов, используют крахмал, уголь, анионообменные смолы, альбумин, кровь 15% или больше (или эритроциты). Ватные пробки также содержат летучие жирные кислоты. Их действие можно исключить обработкой ваты органическими растворителями или использованием металлических крышек.

Для первичного выделения и культивирования коклюшных и паракоклюшных микробов наиболее пригодны среда Борде-Жангу и КУА. В качестве источника аминокислот для последней среды используют казеиновый или фасолевый гидролизаты.

Микробы на плотных питательных средах образуют гладкие, влажные, выпуклые, ровные, блестящие колонии с жемчужным оттенком. Самые мелкие и медленно растущие колонии на КУА у В.реrtussis, их размер 1-2 мм, вырастают за 48-72 часа; колонии B.parapertussis растут быстрее и после 24-48 часов колонии обычно в 1,5 раза больше в диаметре, чем коклюшные. Оба микроба неподвижны. B.pertussis обладает низкой ферментативной активностью (положительный тест на оксидазу). В.parapertussis вырабатывает ферменты тирозиназу и уреазу (отрицательный тест на оксидазу ). Кроме того, В.parapertussis менее прихотлива, растет на простом агаре, в то время как В.реrtussis нуждается в сложных питательных средах [3].

Антигенная структура. Коклюшный микроб по антигенным свойствам однотипен, но отличается сложностью антигенного строения - у него удается выявить до 12 антигенных компонентов. Коклюшный микроб имеет собственные видовые антигены и общие с паракоклюшными. Общие антигены имеются как у обоих видов (О-антиген), так и отдельные с каждым из них.[14]. Бардетеллы распологают 14 термолобильными капсульными (К) антигенами. Они выявляются в реакции агглютинации и поэтому называются «агглютиногенами». Их часто называют факторами и обозначают арабскими цифрами. Факторы 1-6 специфичны для B. pertussis. Из них фактор 1 представлен у всех штаммов коклюшной палочки и используется как специфический антигенный маркер (видоспецифический антиген) этого вида бардетелл. Фактор 2 - 5 неодинаково представлены у разных штаммов, позволяя дифференцировать серологические варианты (серотипы) коклюшной палочки. Фактор 14 специфичен для B. parapertussis. Переходя в R-форму, бордетеллы теряют капсулу и не агглютинируют антифакторными (анти-К) сыворотками[4].

Факторы патогенности. В настоящее время из В.реrtussis выделено и охарактеризовано несколько биологически активных субстанций, определяющих особенности взаимодействия возбудителя с организмом хозяина. Их изучение позволило понять некоторые особенности патогенеза и иммунитета, формирующегося как после иммунизации, так и после перенесенного заболевания.

Коклюшный токсин (КТ) - основной токсин В.реrtussis, обладает различной биологической активностью: является лимфоцитозстимулирующим фактором (ЛСФ), гистаминсенсибилизирующим фактором (ГСФ), протективным антигеном (ПА), повышает выработку инсулина. Он также является основным фактором патогенности В.реrtussis. КТ - экзотоксин, состоящий из двух функциональных частей (А и В) и пяти структурных субъединиц. Участок А (соответствует субъединице S1) - обладает ферментативной активностью, катализирует АДФ-рибозилирование трансдуцина (белка мембраны клетки-мишени), который является частью системы, ингибирующей клеточную аденилатциклазу. Нарушение контроля функционирования аденилатциклазы приводит к накоплению цАМФ, что нарушает функцию эпителиальных клеток-мишеней.

Участок В (включает субъединицы S2-S5) отвечает за присоединение токсина к рецепторам эпителиальных клеток-мишеней.

С коклюшным токсином связывают тяжесть заболевания и системные поражения. Однако, в ряде работ указывается на присутствие практически всех признаков коклюша у больных паракоклюшем, возбудитель которого, как известно, токсин не вырабатывает (отсутствие продукции КГ В.раrapertussis для исключения сочетанной инфекции проверялось в эксперименте), единственное отличие паракоклюшной инфекции от коклюшной - отсутствие у больных в крови лейкоцитоза.

Филаментозный гемагглютинин - высокомолекулярный поверхностный белок, компонент клеточной стенки, участвующий в адгезии. Уровень антител к гемагглютинину у иммунизированных детей коррелирует с защитой от коклюша.

Агглютиногены - поверхностные белки, вызывающие выработку антител, которые опосредованно через адгезию к слизистым оболочкам респираторного тракта вступают в реакцию агглютинации с бактериальными клетками. Присутствие этих антител в высоких титрах коррелирует с клинической защитой. Всего у бордетелл выделено 16 агглютиногенов, из них 7-й - общеродовой, а основным видовым для В.рertussis является 1-й. В зависимости от присутствия основных агглютиногенов выделяют четыре главных серотипа: 1.2.0; 1.0.3; 1.2.3; 1.0.0. У В.retussis выделяют также 4, 5. 6, 13, 15, 16 агглютиногены.

Видовой агглютиноген для B.parapertussis - 14-й. Понятие об агглютиногенах тесно связано с фимбриями (Fim). Выделяют Fim 2, Fim 3, Fim X.

Серотипирование В.реrtussis основано на реакции агглютинации бактериальных клеток с моноклинальными антителами к фимбриальным антигенам.

Аденилатциклаза - экзофермент (токсин), который при попадании в клетки хозяина катализирует образование цАМФ. Токсин - основной вирулентный фактор, действующий на начальном этапе инфекции.

Белками наружной мембраны (БНМ) яатяются: пертактин (69кДа), белки Вrk A, 92кДа, ЗОкДа, 32кДа, Vag8 (95кДа).

Пертактин (69кДа) - относится к генетически контролируемой системе адгезинов, продуцируемых бактерией при попадании в человеческий организм.

Выделен другой белок, сходный по аминокислотному составу с пертактином на 29% и также участвующий в адгезии. Этот белок назван Brk A (Воrdetella resistance to killing)). Предположительно, он отвечает за устойчивость к классическому комплемент-связанному пути элиминации.

Выделены также связанные с вирулентностью белки 92кДа, 30 кДа, 32 кДа. N-терминальные последовательности 30 кДа и 32 кДа гомологичны С-терминальной последовательности Р93 -предшественника пертактина.

Белки 84кДа и 75кДа, связываемые с вакцинацией (антитела к ним обнаружены у привитых- больных и здоровых), в низком проценте случаев- у невакцинированных больных. Не обнаружены они у невакцинированных и неболевших.

Таким образом , перечисленные белки наружной мембраны бордетелл являются факторами патогенности и одновременно протективными антигенами, обеспечивающими продукцию специфических антител. Это важно учитывать при создании адекватных противококлюшных вакцин.

Липополисахарид бордетелл. В его состав входят два липида:А и X.

С Х-фракцией связана биологическая активность липополисахарида. Липид А обладает низкой пирогенностью, нетоксичен, но сохраняет антивирусную активность, адъювантные свойства, обеспечивая неспецифическую защиту от некоторых бактерий. В целом липополисахарид обладает иммуногенностью, однако с ним связывают реактогенность клеточной вакцины.

Трахеальный цитотпоксин - фрагмент пептидогликана клеточной стенки. Относится к семейству мурамилпептидов с разнообразными биологическими свойствами: пирогенность, адъювантность, артритогенность, индукция медленноволнового сна и стимуляция продукции IL -1 (в ответ на IL-1 синтезируется оксид азота - цитотоксический фактор). Токсин поражает трахеальные эпителиальные клетки и вызывает цилиостаз. При этом нарушается мукоцилиарный клиренс - первая линия защиты, и создаются условия для персистирования возбудителя.

Дермонекротизирующий токсин обладает вазоконстрикторной активностью[5].

Таким образом, перечисленные выше компоненты бактериальной клетки возбудителя коклюша обладают антигенными и протективными свойствами разной степени выраженности. Определение уровней специфического иммунного ответа к определенным антигенам или группе антигенов коклюшного микроба имеет важное значение в оценке постинфекционного и поствакцинального иммунитета и зависит от чувствительности и специфичности используемых для этой цели серологических методов.

Все вышеперечисленные факторы присутствуют у свежевыделенных штаммов коклюшного микроба. Однако при хранении на искусственных питательных средах проявляется изменчивость возбудителя. Установлено, что коклюшный микроб проходит четыре фазы в процессе сапрофитизации: свежевыделенный микроб (гладкий штамм), обладающий высокими вирулентными и иммуногенными свойствами, относится к первой фазе. По мере перехода к четвертой фазе постепенно утрачивается иммуногенность и вирулентность, меняются культурально-биологические свойства.

В целом, бордетеллы (В.реrtussis, В.раrapertussis) имеют много общих компонентов в антигенном составе. При сравнительном иммуноэлектрофорезе с 28 видами бактерий из 44 выделенных антигенов В.реrtussis лишь два антигена давали перекрестную реакцию с представителями других родов, главным образом, с грамотрицательными бактериями, в то время как с В.раrapertussis перекрестно реагировали 40 антигенов В.реrtussis. Лишь один антиген (N21) можно считать видоспецифическим [6].

1.2 Патогенез

В патогенезе выделяют три стадии:

I стадия- адгезия. В ней участвуют КТ, ФГА, фимбрии, перлактин и фактор колонизации трахеи. Предполагается, что эти адгезины последовательно или одновременно действуют в процессе всего развития заболевания.

II стадия- локальное повреждение. После адгезии и размножения в месте входных ворот B. рertussis начинает продуцировать различные токсины. К основным факторам патогенности, действующим на этой стадии, относятся трахеальный цитотоксин, вызывающий цилиостаз и нарушающий отток слизи и аденилатциклазный гемолизин, который нарушает функцию эпителиальных и фагоцитирующих клеток дыхательных путей. КТ оказывает непосредственное повреждающее действие на ткани, но до конца его роль остается неизученной.

III стадия- стадия системных проявлений. В этой стадии возбудитель редко обнаруживается в клиническом материале, а ведущая роль в патогенезе отводится КТ [5].



1.3 Клиническая картина

Классификация коклюша

По типу:

1.Типичные.

2.Атипичные:

-абортивная;

-стертая;

-бессимптомная;

-транзиторное бактерионосительство коклюшной палочки.

По тяжести:

1. Легкая форма.

2. Среднетяжелая форма,

3. Тяжелая форма.

Характеристика клинических форм коклюша.

Типичная форма протекает без явлений интоксикации и повышения температуры тела, характеризуется приступообразным судорожным кашлем, усиливающимся ночью и по утрам, сопровождающимся покраснением лица, шумными вдохами (репризами), заканчивающимся отхождением вязкой слизи или рвотой.

Заболевание протекает циклично со сменой ряда периодов.

1.Инкубационный период продолжается от 3 до 14 дней (в среднем 7-8 дней).

2.Предсудорожный период колеблется от 3 до 14 дней. Характерны следующие клинико-лабораторные признаки: постепенное начало; удовлетворительное состояние больного; нормальная температура тела; сухой, навязчивый, постепенно усиливающийся кашель; отсутствие других катаральных явлений; отсутствие патологических (аускультативных и перкуторных) изменений в легких; продолжающееся усиление кашля несмотря на проводимую симптоматическую терапию; типичные гематологические изменения - лейкоцитоз с лимфоцитозом (или изолированный лимфоцитоз) при нормальной СОЭ; выделение коклюшной палочки из слизи с задней стенки глотки.

3.Период судорожного кашля продолжается от 2-3 до 6-8 недель и более. Основным симптомом этого периода является приступообразный судорожный (спазматический) кашель. При неосложненном течении заболевания температура тела больного остается нормальной. Приступ кашля представляет следующие друг за другом дыхательные толчки на выдохе, прерываемые свистящим судорожным вдохом - репризом, возникающим при прохождении воздуха через суженную (вследствие ларингоспазма) голосовую щель. Заканчивается приступ отхождением густой, вязкой, стекловидной мокроты или рвотой. Приступу может предшествовать аура (чувство страха, беспокойство, чихание, першение в горле и др.). Приступы кашля могут быть кратковременными или продолжаться 2-4 мин. Возможны пароксизмы - концентрация приступов кашля на коротком отрезке времени.

При типичном приступе кашля характерен вид больного: лицо краснеет, затем синеет, становится напряженным, набухают кожные вены шеи, лица, головы; отмечается слезотечение. Язык высовывается из ротовой полости до предела, кончик его поднимается кверху. В результате трения уздечки языка о зубы и ее механического перерастяжения происходит надрыв или образование язвочки.

Вне приступа кашля сохраняется одутловатость и пастозность лица больного, отечность век, бледность кожи, периоральный цианоз; возможны субконъюнктивальныс кровоизлияния, петехиальная сыпь на лице и шее.

Характерно постепенное развитие симптомов с максимальным учащением и утяжелением приступов судорожного кашля на 2-й неделе судорожного периода.

В судорожном периоде имеются выраженные изменения в легких: при перкуссии отмечается тимпанический оттенок, укорочение в межлопаточном пространстве и нижних отделах. Аускультативно над всей поверхностью лег-ких выслушиваются сухие и влажные (средне- и крупнопузырчатые) хрипы Характерным при коклюше является изменчивость симптомов: исчезновение хрипов после кашля и появление вновь через короткий промежуток времени. Рентгенологически наблюдается горизонтальное стояние ребер, повышенная прозрачность легочных полей, низкое расположение и уплощение купола диафрагмы, расширение легочных полей, усиление легочного рисунка. Возможно развитие ателектазов, которые чаще локализуются в области 4-5 сегментов легких.

4.Период обратного развития (ранней реконвалесцепции) продолжается от 2 до 8 недель. Кашель теряет типичный характер, возникает реже и становится легче. Улучшается самочувствие и состояние ребенка, исчезает рвота, нормализуются сон и аппетит больного.

5.Период реконвалесценции (поздней) продолжается от 2 до 6 месяцев. В это время сохраняется повышенная возбудимость ребенка, возможны следовые реакции (возврат приступообразного судорожного кашля при наслоении интеркуррентных заболеваний).

Атипичные формы коклюша. Абортивная форма - период судорожного кашля начинается типично, но очень быстро заканчивается (в течение -недели).

Стертая - у ребенка в течение всего заболевания сохраняется сухой навязчивый кашель, приступообразный судорожный кашель отсутствует.

Бессимптомная - клинические проявления заболевания отсутствуют, но имеется высев возбудителя и/или нарастание титров специфических антител в крови.

Транзиторное бактерионосительспию - высев коклюшной палочки при отсутствии клинических проявлений заболевания и без нарастания титров специфических антител в динамике исследования. Бактерионосительство у детей наблюдается редко (в 0,5-1,5% случаев).

Атипичные формы коклюша чаще отмечаются у взрослых и привитых детей.

По степени тяжести выделяют легкие, среднетяжелые и тяжелые формы коклюша.

При легкой форме число приступов судорожного кашля за сутки составляет 8-10; они непродолжительные. Рвоты не бывает, признаки кислородной недостаточности отсутствуют. Состояние больных удовлетворительное, самочувствие не нарушено, аппетит и сон сохранены. Изменения в анализе крови отсутствуют или количество лейкоцитов не превышает 10-15,0x10⁹ /л, содержание лимфоцитов - до 70%. Осложнений, как правило, не бывает.

Среднетяжелая форма характеризуется наличием приступов судорожного кашля до 15-20 раз в сутки, они продолжительные и выраженные. В конце приступа наблюдается отхождение вязкой густой слизи, мокроты и, нередко, рвота. Общее состояние больных нарушается: дети капризные, вялые, плаксивые, раздражительные, неохотно вступают в контакт. Аппетит снижается, уплощается весовая кривая; сон беспокойный, прерывистый. Во время приступа кашля появляется периоральный цианоз. Даже вне приступа кашля отмечается одутловатость лица, отечность век. Изменения в гемограмме выражены - лейкоцитоз до 20-25,0Х10⁹/л, лимфоцитоз до 80 %. Нередко возникают осложнения.

При тяжелой форме число приступов судорожного кашля за сутки достигает 25-30 и более. Приступы тяжелые, продолжительные, как правило, заканчиваются рвотой; наблюдаются пароксизмы. Отмечаются резко выраженные признаки кислородной недостаточности - постоянный периоральный цианоз, акроцианоз, цианоз лица, бледность кожи. Наблюдается одутловатость лица, пастозность век, нередко возникают геморрагии на коже шеи, плечевого пояса, возможны кровоизлияния в склеры глаз. Резко нарушается сон и аппетит, снижается весовая кривая. Больные становятся вялыми, раздражительными, адинамичными, плохо вступают в контакт. Изменения в гемограмме резко выражены: лейкоцитоз достигает 30-40,0х10⁹ /л и более, лимфоцитоз - до 85% и более. Характерно возникновение угрожающих жизни осложнений (остановка дыхания, нарушение мозгового кровообращения)[6].

1.4 Лабораторная диагностика

1.4.1 Общий анализ крови

В картине крови характерно: гиперлейкоцитоз (до 30-40х10⁹/л и более) и лимфоцитоз (до 70 -80%) , который появляется в катаральный период. По мере развития болезни эти изменения достигают максимума (в первые недели спазматического периода), а затем постепенно снижаются, параллельно стиханию инфекционного процесса[7]. Выраженность лейкоцитоза зависит от степени тяжести. СОЭ обычно замедлена или в пределах нормы[8].

Следует иметь в виду, что при наличии осложнений гемограмма может меняться: нарастание нейтрофилеза с ядерным сдвигом и ускорение СОЭ[7].

1.4.2 Микробиологические методы лабораторной диагностики

Коклюшный микроб (или другие бордетеллы) размножается в респираторном тракте больного. Данные бактериологического обследования больных в процессе болезни показывают, что микробы размножаются наиболее интенсивно в течение катаральной стадии и на 1 -- 2-ю недели пароксизмальной стадии. Микробы выделяются редко (7%) после 4-ой недели болезни. При субклинической форме болезни микробы выделяются только в течение 2 недель от начала кашля. При лечении антибиотиками количество бордетелл в респираторном тракте значительно меньше, и выделить их, безусловно, труднее.

Для бактериологического исследования используют выделения (слизь) с задней стенки носоглоточного пространства[9].

Получение материала для исследования.

Материал для микробиологического исследования может быть получен наиболее удобно, особенно для детей грудного возраста, носоглоточным тампоном. Материал, взятый тампоном через рот (постназальным тампоном), обычно более загрязнен посторонней флорой, которая затрудняет или подавляет рост бордетелл. Посев на среду непосредственно накашливанием на чашку со средой (метод "кашлевых пластинок") не так эффективен, как метод "тампонов" и вытесняется повсеместно в практике последним. Некоторые авторы получают мокроту (слизь) отсасыванием в коллектор. Идеальное время для забора материала, по-видимому, утро, перед едой.

· Метод "тампонов"

Носоглоточный тампон представляет собой маленький кусочек ваты, накрученной плотно на конец тонкой эластичной медной или нихромовой проволоки (диаметр приблизительно 0,51 мм). Стерилизовать пробирку с тампоном следует автоклавированием.

Помощник руками фиксирует голову ребенка. Кончик тампона, смоченный в стерильной жидкости (физрастворе или транспортной среде), вводят через ноздрю ребенка в носоглотку на пять см или больше, в зависимости от возраста ребенка, до соприкосновения с задней стенкой носоглотки и оставляют его там на несколько секунд. Часто при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля, это увеличивает шансы получения положительных результатов. Нельзя применять усилие при затрудненном продвижении тампона вследствие искривления носовой перегородки или аденоидов, следует попытаться ввести тампон через другую ноздрю, хотя иногда и это бывает невозможно.

Ротовой тампон представляет собой маленький кусочек ваты на согнутой проволоке (согнутая часть должна быть короткой, около 1см в длину). Тампон вводят через рот (следует избегать его загрязнения в ротовой полости), проводят его за мягкое небо к задней стенке глотки и осторожно вращают.

Затем тампон вынимают из ноздри (или ротовой полости) и сразу же делают им посев.

Если посев сделать на месте невозможно по техническим причинам и тампон необходимо отправить в лабораторию, то для сохранения тампона в удовлетворительном состоянии до его посева специально используют транспортную среду. Обычная транспортная среда, такая как среда Стюарта, непригодна для коклюшных микробов. Тампон можно использовать для посева в течение 4 часов при сохранении его в 1% растворе казеинового гидролизата, в полной диагностической среде или в такой же среде без агара. Обычно тампон хранится в пробирке с ватной пробкой, но для транспортной среды используют корковую пробку и проволока пропускается через пробку так, чтобы вата не коснулась агара или жидкости. После взятия пробы тампон помещают в пробирку и опускают проволоку до соприкосновения ваты с транспортной средой.

В лаборатории тампон вынимают из пробирки и используют для посева на чашке со средой.

При использовании этого метода частота выделения коклюшных микробов существенно не снижается, если транспортная среда доставлена в лабораторию в день взятия пробы, но если среду оставляют при комнатной температуре до следующего дня, то процент выделения может быть очень низким (происходит зарастание посторонней микрофлорой даже при добавлении в среду пенициллина).

Следует отметить, что тампоном можно сразу же сделать посев на косяк с КУА, модифицированным добавлением пенициллина, разлитым в маленькие флаконы с завинчивающимися крышками и отправить по почте в лабораторию для исследования на наличие коклюшных микробов. Положительные результаты дают культуры, транспортируемые не более 2 -- 3 дней.

· Метод "кашлевых пластинок"

В момент появления кашля раскрытую чашку с питательной средой подносят ко рту на расстоянии 15 -- 20 см. и держат несколько секунд (на протяжении 4 -- 6 кашлевых толчков). В случае отсутствия спонтанного кашля можно надавить на язык шпателем или слегка помассировать гортань.

После взятия материала чашку немедленно закрывают, чтобы избежать загрязнения (рекомендуется повторить процедуру с той же чашкой), и отправляют в лабораторию для инкубации. До отправки в лабораторию чашки можно хранить некоторое время при комнатной температуре, но это нежелательно, так как затягивается получение ответа.

· Сбор носоглоточных выделений отсасыванием

Стерильную полиэтиленовую питательную трубку присоединяют к одному из отверстий пластмассового коллектора для слизи. Другое отверстие соединяют с отсасывающим насосом (или шприцем). Трубку вставляют в ноздрю больного и продвигают в носоглотку. Выделения собирают в коллектор при отрицательном давлении не более 2 кг/см².

Трубку вынимают и повторяют процедуру через другую ноздрю. При необходимости слизь, выстилающую трубку, отсасывают небольшим количеством (не более 0,5 мл) 0,85% хлорида натрия.

Этот метод применяют в особых случаях, например, при обследовании новорожденных. Слизь используют сразу же для посева или для иммунофлюоресцентного метода таким же путем, как и тампон[10].

Среды для культивирования Для первичного выделения и культивирования коклюшных микробов в течение многих лет успешно применялась только оригинальная среда Борде--Жангу или ее модификации. Для диагностической работы рекомендуется модифицированный рецепт среды, в котором содержание крови уменьшено с 50% до 15 -- 20%. При таком содержании крови и соотношении солей возможно выявление гемолитической зоны вокруг колоний, что служит хорошим диагностическим критерием. Затем появилась другая, простая по составу среда -- полусинтетический угольный агар, с помощью которой многие лаборатории получают результаты не хуже, чем со средой Борде -- Жангу. В угольный агар , также как в среду Борде -- Жангу, добавляют дефибринированную кровь. Во всех практических лабораториях успешно используют казеиново-угольный агар (КУА). Это питательная среда обеспечивает результаты, адекватные результатам со средой Борде -- Жангу, но выгодно отличается от нее доступностью и простотой изготовления.

Питательная среда, используемая для посева тампоном, должна задерживать рост посторонней микрофлоры. Для подавления роста грамположительной микрофлоры обычно в питательные среды добавляют пенициллин. Для увеличения шансов на получение положительного результата для посева используют 2 чашки (одна без пенициллина). Но часть штаммов возбудителя коклюша чувствительна к пенициллину, в связи с чем использование этого антибиотика снижает процент положительных проб. Для предотвращения отрицательного влияния пенициллина на бордетелл в некоторых лабораториях используют уменьшенную дозу антибиотика. В зарубежной практике для этих целей используют цефалексин, а иногда и амфотерицин В- для подавления грибковой флоры. В отличие от пенициллина, цефалексин не подавляет рост B. pertussis и B.parapertussis и более активен в отношении сопутствующей микрофлоры.

Следует отметить, что каждую серию среды необходимо предварительно проверить с известной культурой коклюшных микробов на образование колоний и характерную гемолитическую зону.

Посев. Для получения изолированных колоний забор материала делают тщательным образом втирая его тампоном сначала на периферии среды в виде 4-5 бляшек, а потом Z -образным штрихом в центре чашки.

Инкубация и контроль культур Засеянные чашки или пробирки инкубируют в термостате при температуре 35--36°С в условиях повышенной влажности в течение 5 дней или до обнаружения характерных колоний. Участки среды, проросшие посторонней микрофлорой, вырезают стерильным скальпелем или иглой, чтобы предотвратить их разрастание. Чашки ежедневно просматривают на наличие роста с лупой или в бинокулярный стереоскопический микроскоп. Для выявления зоны гемолиза чашки просматриваются в проходящем, а колонии в отраженном свете.

Критерии для идентификации видов бордетелл. В. pertussis -- медленно растущий микроб, поэтому колонии появляются чаще всего не раньше, чем через 3 дня инкубации, а иногда только на 7-ой день. Колонии паракоклюшного микроба можно обнаружить уже через 24 часа роста. Для проведения диагностической идентификации бордетелл вполне достаточно выявить характерные колонии на поверхности твердой питательной среды, проверить среду на наличие зоны гемолиза и коричневого пигмента (образование тирозиназы), обнаружить характерные по виду микробы в мазках, окрашенных по Граму, и поставить агглютинацию на стекло с видоспецифическими сыворотками.

Порядок идентификации. Отбор колоний. Для идентификации отбираются колонии с гладкими краями, выпуклые, блестящие, серовато-белого цвета на среде Борде -- Жангу или серовато-кремового на КУА. На среде с кровью колонии окружены зоной гемолиза.

Часть отобранной колонии или колонию используют для агглютинации на стекле с поливалентными или моноспецифическими сыворотками к Агг 1,14 и 12 (контроль с физиологическим раствором). Для этого подозрительную колонию суспендируют в капле физраствора на предметном стекле, рядом с ней наносят каплю коклюшной или паракоклюшной (в случае покоричневения среды) сыворотки соответствующего разведения (для поливалентной сыворотки обычно 1/100), затем в нее переносят испытуемую суспензию и смешивают легким вращением стекла.

Капли с агглютинацией на стекле высушивают и окрашивают по Граму для микроскопии. В препаратах должны быть грамотрицательные, слабоокрашенные, овоидной формы палочки (коккобациллы), в сыворотке расположенные маленькими кучками, а в физрастворе отдельно или парами, иногда в виде коротких цепочек. Оставшуюся часть колонии (или другую колонию) используют для пересева на чашки или пробирки.

Для выявления колоний в ранней стадии роста успешно применяется люминесцентно-серологический метод. Очень хорошим дополнением к этому методу является проверка мазков -- отпечатков из микроколоний. Если в мазках обнаруживаются ярко светящиеся бактерии (с коклюшными и паракоклюшными люминесцирующими иммуноглобулинами), то немедленно регистрируется положительный результат. Это часто позволяет ускорить ответ на несколько дней.

Если рост на чашках не позволяет провести все указанные тесты, или полученные результаты недостаточно убедительны для заключения по какой-либо причине, то следует сделать пересев и повторить тест (желательно использовать агглютинацию на стекле).

Для идентификации возбудителей коклюша и паракоклюша используют признаки представленные в таблице 1.

Таблица 1- Сравнительная характеристика возбудителей коклюша и паракоклюша.

Признак	B.pertussis	B.parapertussis
Время появления колоний, (ч.)	48-72	24-48
Размер колоний (в мм.)	1-2	2-4
Подвижность	-	-
Рост на простом агаре	-	+
Образование коричневого пигмента на простом агаре	-	+
Редукция нитратов	-	-
Утилизация цитрата	-	+
Образование уреазы	-	+
Оксидаза	-	-
Агглютинация монорецепторными сыворотками к агглютиногенам	+	-
Фактор 1	+	-
Фактор 12	-	+
Фактор 14	-	-



Оценка и сообщение результатов

· Положительный результат

Если на чашках обнаружены колонии микробов, которые по культуральным, морфологическим и серологическим признакам соответствуют В. pertussis (В. раrapertussis) в реакции агглютинации на стекле, дают положительный ответ.

· Отрицательный результат

Если на 4 -- 5 день на чашках не найдено колоний, соответствующих роду Бордетелла, дают отрицательный ответ. В таких случаях рекомендуется анализ повторить.

При скудном росте на чашках или если они сплошь заросли посторонней микрофлорой, дают ответ "Коклюшные микробы (паракоклюшные) не выделены". При этом указывают причину и предлагают повторить исследование.

Дифференциация видов. Дифференциация должна основываться на результатах не только серологических (выявление серовариантов), но и биохимических тестов. Окончательную дифференциацию коклюшных и паракоклюшных микробов проводят путем пересева на агар с тирозином и постановкой пробы на уреазу. Пигмент (покоричневение среды) особенно хорошо виден на КУА или пептонном агаре, в последний добавляют 0,1% тирозина, а также на ломтике картофеля в пробирке с 5%-раствором глицерина в физиологическом растворе.

Для сохранения и поддержания культур в процессе работы необходимо их пересевать на средах Борде -- Жангу или КУА каждые 7 -- 10 дней. Для длительного сохранения культуры высушивают из замороженного состояния и хранят при температуре 3-8°С.

Поскольку выделение коклюшных микробов (методом культур) от больных с подозрением на коклюш связано с рядом трудностей (процедура требует много времени, специальной среды и т.д.), рекомендуется использовать в лабораторной диагностике следующие методы: 1) иммунофлюоресцентный метод для выявления коклюшных и паракоклюшных микробов в пробах секрета, полученного от больных; 2) выявление коклюшных и паракоклюшных антител в сыворотках больных с помощью реакции агглютинации, связывания комплемента[3].

коклюшный инфекция бактериологический диагностика

1.4.3 Иммунофлюоресцентный метод

Люминесцирующие коклюшные и паракоклюшные антитела можно использовать для ускоренной диагностики путем прямого окрашивания мазков из носоглоточной слизи и для ранней идентификации молодых колоний на чашках[5].

По своей специфичности и быстроте люминесцентно-серологический метод, впервые разработанный в 1960 -- 1961 годах, является одним из наиболее приемлемых методов диагностики коклюша и может полностью заменить метод выделения культур. Прямой метод иммунофлюоресценции успешно применяется для выявления коклюшных и паракоклюшных микробов в носоглоточных мазках от больных с подозрением на коклюш, от детей, контактировавших с ними, и от здоровых детей и дает результаты, совпадающие с результатами метода выделения культур.

Люминесцирующие иммуноглобулины получают из гиперимунных ослиных сывороток, конъюгацию с флюоресцеинизоцианатом. Люминесцирующие иммуноглобулины растворяют в дистиллированной воде.

Соответствие рабочего разведения растворов люминесцирующих иммуноглобулинов необходимо периодически проверять с известными культурами (мазки из суспензий на фосфатном буферном растворе густотой 10 Международных единиц мутности/мл.). При этом иногда свечение с чистыми культурами может быть менее ярким. При снижении активности препарата разведение уменьшают.

Ускоренная диагностика коклюшной и паракоклюшной инфекции прямым иммунофлюоресцентным методом.

Материал для исследования (выделение слизистой носоглотки) от больных или лиц, контактировавших с больными, забирают носоглоточным тампоном и немедленно делают на предметном стекле два мазка размером примерно 1,5см. в диаметре. Высушенные при комнатной температуре препараты фиксируют на огне (через пламя горелки) ацетоном или 96° этиловым спиртом 10 --15 минут. Фиксированные препараты можно хранить в закрытой чашке Петри в течение 2 месяцев в рефрижераторе. Перед окраской мазки должны быть согреты при комнатной температуре.

Окраска препаратов. На готовые препараты наносят люминесцирующие иммуноглобулины (на один мазок -- коклюшный, на другой -- паракоклюшный) и помещают во влажную камеру на 20 минут при температуре 35 -- 37°. При окончании окраски препарат сначала промывают физиологическим раствором (рН 7,2 -- 7,6) или фосфатным буфером в течение 5 -- 7 минут, а затем ополаскивают дистиллированной водой. После промывания препарат высушивают и затем последовательно просматривают в люминесцентный микроскоп.

При просмотре препаратов следует использовать нефлюоресцирующее иммерсионное масло. У коклюшных и паракоклюшных бактерий при окраске соответствующими люминесцирующими иммуноглобулинами должен быть видимый ярко-зеленый (изумрудный) ободок вокруг темного центра клетки (краевое свечение).

Люминесцирующие коклюшные и паракоклюшные иммуноглобулины иногда ярко окрашивают единичные особи стафилококков, дифтероидов и дрожжевых клеток. Морфология таких клеток и характер свечения (желто-зеленый) дает возможность правильно их идентифицировать. В сомнительных случаях требуется повторный анализ и выделение чистой культуры.

Положительный ответ по иммунофлюоресцентному методу или просмотре мазков из носоглоточных выделений в отношении возбудителя коклюша и паракоклюша выдают на основании обнаружения не менее 2 -- 3 характерно светящихся, типичных по морфологии клеток гомологичной культуры при просмотре не менее 50 полей зрения в различных участках каждого мазка[3].

1.4.4 Полимеразная цепная реакция

Современным и перспективным является молекулярно-биологическнй метод - полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Забор материала осуществляется назофарингеальными тампонами или путем аспирации носоглоточной слизи. Получены данные о том, что использование тампонов из кальция альгината и транспортировка материала в транспортной среде резко снижают эффективность метода, что связано с наличием факторов, ингибирующих полимеразную цепную реакцию. В связи с этими обстоятельствами рекомендовано использовать тампоны типа Dacron и «сухую» транспортировку, а еще более предпочтительно получать материал из носоглотки путем аспирации.

После предварительной экстракции ДНК проводят изолированное умножение (амплификацию) фрагмента гена микроорганизма с последующим выявлением амплифицированного участка.

Чувствительность метода составляет несколько бактерий в пробе, а специфичность приближается к 100% . Получение результата возможно в течение одного дня. В случаях выделения культур бордетелл от пациентов ПЦР дает положительный результат в 73-100%, а при отрицательных результатах бактериологического исследования эффективность ПЦР составляет 71%.

В настоящее время разработаны тест-системы для идентификации различных участков генома В.реrtussis: гена коклюшного токсина, порина, аденилатциклазного гемолизина, повторяющегося участка ДНК. Все участки, кроме последнего, встречаются в геноме возбудителя паракоклюша. Выбор в качестве объекта поиска повторяющегося участка ДНК предпочтительнее также из-за большей чувствительности при меньшем количестве циклов амплификации. Это снижает вероятность ложположительных результатов. Для повышения чувствительности и специфичности метода используют тест-системы, в которых после 20-25 циклов с внешними праймерами проходит 25-30 циклов с внутренними праймерами. Предложена система для параллельной диагностики с разделением В.реrtussis и В.раrapertussis. Для этого используются праймеры к повторяющимся последовательностям в геноме В.реrtussis (80 копий) и В.раrapertussis (20 копий). Для исключения влияния большого числа копий участка ДНК В.pertussis на чувствительность реакции с ДНК В.раrapertussis предложено использовать праймеры в соотношении, обратно пропорциональном количеству копий в ДНК, то есть 4:1.

Для визуализации результата используют окрашивание в агарозном геле и блот-гибридизацию.

Исключение ошибок:

-для исключения ложноположительных результатов необходимо проводить все этапы постановки реакции (выделение ДНК, собственно амплификацию и детекцию результатов) в различных помещениях. Дополнительно применяют систему «саггу-оveг» с урацил-N-гликозилазой, которая разрушает продукты предшествующих амплификации.

-для контроля ложоотрицательных результатов (при заборе аспирата) параллельно проводится реакция для определения человеческой ДНК, так как в образце всегда будут человеческие клетки, и результат учитывается как положительный только при положительной реакции на человеческую ДНК, что говорит о сохранности образца. Другой метод является ко-амплификация так называемого гетерогенного внутреннего стандарта - искусственно созданной и добавляемой в реакцию последовательности ДНК, амплификация которой происходит только при наличии двух праймеров: одного для B.pertussis , другой- для B.parapertussis (контроль работы праймеров)[6].



1.4.5 Блот -ELISA (ИФА)

Блот-ELISA- это исследование позволяет визуально определять колонии В. рertussis с помощью моноклональных антител к филаментозному гемагглютинину и липополисахариду возбудителя. Чашки с первичным посевом инкубируют при обычных условиях 40 часов, после чего на них помещают нитроцеллюлозные диски, далее следует инкубация чашек с дисками 10 мин при 22 °С. Затем диски снимают с чашек и обрабатывают лизирующим раствором с последующей инкубацией с моноклональными антителами и субстратом. В результате удается выявить единичные колонии В.рertussis. Перекрестных реакций с представителями других родов бактерий не отмечено. С помощью антител к гемагглютинину выявлялись также возбудители паракоклюша, а антитела к липополисахариду образовывали единичные перекрестные реакции с другими бордетеллами. Широкого распространения этот метод не получил [5].

1.4.6 Серологические методы диагностики

Серологическая диагностика коклюша заключается в обнаружении в исследуемой сыворотке специфических антител. . Исследования производят на 2 - 3-й неделе заболевания, когда в крови больных появляются специфические антитела. Результаты серологических реакций имеют диагностическое значение при изучении их в динамике, исследуя парные сыворотки больного с интервалом 1 - 2 недели. Серологические реакции следует ставить параллельно с коклюшным и паракоклюшным диагностикумами. . Кровь для исследования берут из пальца (0,8 - 1,0 мл) с соблюдением всех правил асептики[3]. .

Классическим серологическим методом диагностики коклюша, применяемым уже более 50 лет, является реакция агглютинации (РА). В данном методе выявляют антитела, индуцированные агглютиногенами возбудителей, находящихся в 1 фазе.

РА ставят с культурой, выращенной на казеиново- угольном агаре или среде Борде-Жангу в течение 2 суток. Сыворотку разводят до титра. Сыворотку соответствующего разведения и микробную взвесь берут в равных объемах. Смесь хорошо встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при 35-37 С.

Результат учитывают через 24 часа.. Интенсивность реакции отмечают плюсами(++++, +++, ++, +). За титр сыворотки принимают последнее разведение , в котором агглютинация имеется на ++, умноженное на 2[7].

Наиболее удобен метод ускоренной агглютинации, особенно для определения агглютининов в сыворотке привитых детей.

Для этого используются специальные стекла с лунками или полистероловые пластинки. Антиген и сыворотки разливают по каплям, а микробную суспензию готовят приблизительно густотой 20- 30 млрд/мл. Одновременно ставят контроль культуры с физиологическим раствором (подтверждающей отсутствие спонтанной агглютинации). При постановке реакции на стекле луночки покрывают покровными стеклами. На полистероловой пластинке лунки гораздо глубже и их можно не покрывать.

Для того, чтобы реакция произошла скорее, пластинку или стекло качают на специальной качалке. Продолжительность качания в зависимости от условий должна быть от 4-5 до 15 минут. При отсутствии прибора качание проводят руками. После качания пластинку переносят на 1 час в термостат.

Результаты, полученные при постановке реакции ускоренным способом полностью совпадают с пробирочным методом.

Учет результатов. При использовании РА для оценки противококлюшного иммунитета следует считать разведение 1:160 (условно-защитным титром), а разведение 1:320 (защитным титром). . Диагностическим титром реакции агглютинации у непривитых и не болевших детей считается разведение 1:80. . При коклюше агглютинирующие антитела могут отсутствовать в сыворотках заболевших, с бактериологически подтвержденным диагнозом, если парные сыворотки сравниваются с интервалом более месяца. Частоту ложноположительных результатов можно снизить путем абсорбции сывороток перед исследованием. У иммунизированных детей и взрослых положительные результаты реакции учитывают при исследовании парных сывороток крови, взятых с интервалом 1 - 2 недели при нарастании титра не менее чем в 4 раза. Недостатками реакции являются низкая чувствительность и нестандартность, так как титры агглютиногенов зависят от бактериального штамма, используемого в качестве антигена[10].

С целью повышения чувствительности реакции агглютинации были разработаны эритроцитарные диагностикумы для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Для проведения РНГА, обработанные эритроциты животных сенсибилизировали комплексом антигенов коклюшного микроба. Эта реакция более чувствительна, чем реакция агглютинации. Однако в процессе создания диагностикумов использовались различные методы сенсибилизации и стабилизации эритроцитов, а получение адсорбируемого антигена ( целые клетки возбудителя или клеточные компоненты) проводились различными способами, что привело к различной информативности получаемых данных. В этой связи РНГА не нашла широкого применения в практике[6].