Флуориметрическое определение примесей в лекарствах и сырье

18

42

Оглавление

Фармацевтический анализ -- это наука, о химической характеристике и измерении биологически активных веществ на всех этапах производства: от контроля сырья до оценки качества полученного лекарственного вещества, изучения его стабильности, установления сроков годности и стандартизации готовой лекарственной формы. Фармацевтический анализ имеет свои специфические особенности, отличающие его от других видов анализа. Лекарственные средства относятся к соединениям различной химической природы: неорганические, элементорганические, радиоактивные, органические соединения от простых алифатических до сложных природных биологически активных веществ. Чрезвычайно широк диапазон концентраций анализируемых веществ. Объектами фармацевтического анализа являются не только индивидуальные лекарственные вещества, но и смеси, содержащие различное число компонентов.[2,6,17]

Официальные методы исследования лекарственных средств предназначены для обеспечения их качества и описаны в фармакопейных монографиях - Государственной фармакопее, Международной фармакопее. Государственная фармакопея - сборник обязательных общегосударственных стандартов и положений, нормирующих качество лекарственных веществ.[17] Она основана на принципах отечественного здравоохранения и отражает современные достижения в области фармации, медицины, химии и других смежных наук. Ее требования к лекарственным средствам являются обязательными для всех предприятий и учреждений, которые изготовляют, хранят, контролируют качество и применяют лекарственные средства. Требования Международной фармакопеи носят рекомендательный характер и являются своеобразной основой для разработки национальных фармакопей.

Кроме официальных, существует значительное количество основных методов и методик, цель которых - подтверждать подлинность лекарственных средств. С начала 90-х годов XX века в ряде развитых государств Европы и Америки под эгидой ВОЗ начали создаваться дополнительные коллекции методов. В эти коллекции входят методики наиболее простые в применении и использующие ограниченный набор легко доступных реактивов. Непосредственная цель этих разработок в обеспечении качества в системе снабжения фармацевтическими препаратами при отсутствии хорошо оснащенной лаборатории и высоко квалифицированных кадров. Наибольшее распространение получили: реакции окрашивания и осаждения для подтверждения подлинности, тонкослойная хроматография для идентификации и контроля примесей, спектрофотометрия и титриметрия для количественной оценки содержания действующих веществ.

Любое фармакологически активное вещество органической природы можно представить как совокупность функциональных групп. Поскольку те или иные функциональные группы обусловливают фармакологическую активность лекарственного вещества, функциональный анализ позволяет сделать объективную оценку о его подлинности.[24]

Несмотря на громадное разнообразие структур лекарственных средств, можно выделить следующие функциональные группы:

- кислородсодержащие -ОН, -СНО, -СООН;

- азотсодержащие -NH2, =NH, =N, =N⁺H;

- серосодержащие -SH, -S0₃H, -S-S-.

Немаловажное значение для химических и биологических свойств вещества имеет структура углеродного скелета - предельная алифатическая, непредельная алифатическая и ароматическая, а также взаимное расположение групп. Особо следует выделить а,(3- и орто-расположенные пары групп, способных к донорно-акцепторному взаимодействию: -СООН и -ОН, -NH2 и -ОН, -NH2 и -СООН, -NH2 и =N- и т.д. В этих случаях проявляется специфичность химических свойств, позволяющая выделить четвертый вид функциональных групп - комбинированные.[27,50,73]

Общим принципом традиционных химических методов является применение характерных реакций для групп, подлежащих определению. Реакция должна быть не только возможно более специфичной, но и достаточно быстрой, в ней должны участвовать реагент или продукт реакции, легко поддающиеся определению. Наибольшее применение находят реакции, в которых потребляются или образуются: кислоты, основания, окислители, восстановители. С другой стороны, эффект реакции можно наблюдать непосредственно, если образуются малорастворимые, окрашенные или газообразные вещества. В ряде случаев подобные эффекты сопровождают формирование комплексных соединений, продуктов окисления и конденсации, замещения и этерификации.

В настоящее время флуориметрия находит достаточно широкое применение в научно-исследовательской и практической работе биохимических, физиологических, микробиологических, агрохимических и химических учреждений.

Флуориметрическое определение веществ основано на интенсивности излучения поглощаемого света веществом.[4,5,63]

Свет - это одна из форм лучевой энергии, которая распространяется в виде электромагнитных волн. Эти волны характеризуются длиной (А.), частотой (v) и скоростью распространения в вакууме (С), которая является постоянной. Длина волны и ее частота взаимосвязаны: =C

Любое химическое соединение может быть охарактеризовано как энергетическая система. С другой стороны, атомы и молекулы многих веществ способны поглощать энергию, поступающую к ним извне. Если молекуле сообщить дополнительную энергию, электроны могут переходить с основного энергетического уровня на уровень с более высокой энергией. В фотохимических процессах для этой цели используется энергия света, которая выражается формулой E=hv, где h - постоянная Планка. Поскольку энергетические уровни в молекуле квантованы, количество энергии, необходимое для перевода электрона в данной молекуле с одного уровня на более высокий, строго фиксировано. Только свет с длиной волны, точно соответствующей этому количеству энергии, может вызвать переход электрона на более высокий уровень. Если образец вещества облучать светом с другой частотой (более высокой или более низкой), он пройдет через вещество, не теряя своей интенсивности, так как не поглощается молекулами. Однако если пропускать через образец свет с нужной частотой, его энергия будет расходоваться на переход электронов на более высокие энергетические уровни, поэтому выходящий из образца свет будет иметь меньшую интенсивность.

Каждый образец вещества содержит большое число молекул; даже если все они находятся в основном электронном состоянии, они еще распределены по вращательным и колебательным состояниям (хотя наиболее заселенным является основное колебательное состояние v₀). Это означает, что молекула будет поглощать свет не только с одной определенной длиной волны, но и с близкими длинами волн, причем наиболее вероятному переходу будет соответствовать наиболее интенсивный пик. В многоатомных молекулах так много возможных переходов и они так близко расположены друг к другу, что в спектре наблюдается довольно широкая полоса. Высота пика зависит от числа молекул, в которых происходит переход электрона, и пропорциональна величине lg. (коэффициент экстинции) можно выразить отношением s=A/cl, где с-- концентрация в молях на литр, 1--длина кюветы в сантиметрах. Оптическая плотность в свою очередь может быть выражена: A=lg(Io/I), где Iо-- интенсивность падающего света, I--интенсивность прошедшего через образец света. Длина волны обычно замеряется на высоте пика и обозначается _макс.

Чисто колебательные переходы, такие, как переход между v₀ и v_b требуют намного меньшей энергии и лежат в инфракрасной области, а чисто вращательные переходы лежат в далекой инфракрасной и микроволновой областях.

Поглощение в ультрафиолетовой и видимой областях вызвано переходом электрона с одной орбитали (обычно орбитали основного состояния) на более высокую орбиталь. Количество энергии, необходимое для такого перехода, зависит главным образом от природы этих двух орбиталей.

В большинстве органических молекул все электроны в основном состоянии спарены, и, согласно принципу Паули, электроны внутри пары имеют противоположные спины. Когда один электрон из пары переходит на орбиталь с более высокой энергией, в принципе возможны две ситуации: этот электрон может иметь такой же спин, как и его бывший партнер, или противоположный спин. Состояние молекулы, в которой два не спаренных электрона имеют одинаковый спин, называется триплетным состоянием (Т), а состояние молекулы, в которой все спины спарены, называется синглетным (S). В большинстве случаев в соответствии с правилом Гунда триплетное состояние обладает более низкой энергией, чем соответствующее ему синглетное состояние. Поэтому для перевода электрона из основного состояния (которое почти всегда синглетно So) в возбужденное синглетное (Si, S2) или триплетное (Т₁ Т₂) состояние требуется разное количество энергии и, следовательно, свет разной длины волны.

Таким образом, может показаться, что переход данного электрона в синглетное или триплетное состояние зависит от количества энергии, сообщаемой молекуле. Однако это не так, поскольку переходы между энергетическими уровнями подчиняются определенным правилам отбора, согласно которым некоторые переходы «запрещены». Среди нескольких типов запрещенных переходов отметим два, наиболее важные.

1. Спин-запрещенные переходы. Переходы, при которых меняется спин электрона, запрещены, поскольку изменение спина на противоположный влечет за собой изменение углового момента, что нарушило бы закон сохранения углового момента. Поэтому синглет- триплетные и триплет-синглетные переходы являются запрещенными, а синглет-синглетные и триплет-триплетные - разрешенными.

2. Переходы, запрещенные симметрией. К этому классу относятся переходы в молекулах, имеющих центр симметрии. Запрещены переходы g-g или u-u, тогда как разрешены переходы g-u и u-g (g - четная орбиталь, u - нечетная орбиталь).

Слово «запрещенный» часто пишут в кавычках, поскольку в действительности эти переходы не запрещены, а маловероятны. В большинстве случаев переходы из основного синглетного состояния в возбужденное триплетное настолько невероятны, что практически никогда не наблюдаются, поэтому можно с уверенностью утверждать, что в большинстве молекул происходят только синглет-синглетные переходы. Однако в некоторых случаях это правило нарушается, в частности, когда в молекуле присутствуют тяжелые атомы, такие, как иод; тогда по спектрам можно показать наличие переходов синглет--триплет. Часто можно наблюдать запрещенные симметрией переходы, но обычно соответствующие им пики имеют низкую интенсивность.

При возбуждении молекулы электрон (обычно один), как правило, переходит на самую низшую вакантную орбиталь, хотя возможны также переходы и на более высокие орбитали, если они доступны. Электронные переходы в органических молекулах можно разделить на четыре типа.

1. Алканы, не имеющие ни п-, ни я-электронов, могут возбуждаться только таким образом.

2. Спирты, амины; простые эфиры и т. д. могут возбуждаться таким образом.

3. Этот путь возбуждения характерен для алкенов, а также для альдегидов, сложных эфиров и подобных соединений.

4. Эти переходы, а также три предыдущих характерны для альдегидов, кетонов, сложных эфиров и др.

Четыре типа электронных переходов приведены в порядке уменьшения энергии. Самая высокая энергия света (дальний ультрафиолет) требуется для перехода тогда как переходы могут быть вызваны обычным ультрафиолетовым облучением. Однако этот порядок может иногда меняться в зависимости от природы растворителя.

Группу, обусловливающую поглощение света молекулой, называют хромофором. Примерами хромофоров в видимой и ультрафиолетовой областях служат группы С=0, N=N, Ph и N02, в далекой ультрафиолетовой области (ниже 200 нм) - группы С=С, С=С, С1 и ОН. В той же самой молекуле могут присутствовать заместители, которые смещают полосы поглощения хромофорной группы (за счет резонансного взаимодействия) и повышают интенсивность поглощения; такие заместители называют ауксохромами. К ним относятся группы С1, ОН и NH2, в присутствии которых полосы поглощения таких хромофоров, как Ph или С=0, в ультрафиолетовой и видимой областях претерпевают батохромный сдвиг. Поскольку ауксохромы сами являются хромофорами, поглощающими обычно в далекой ультрафиолетовой области, иногда бывает трудно решить, какая группа в молекуле ауксохромная, а какая--хромофорная. Например, что служит хромофором в молекуле ацетофенона (PhCOMe), группа Ph или С=0? В подобных случаях отнесение к той или иной группе становится бессмысленным.

Фотохимически возбужденная молекула не может пребывать в этом состоянии долгое время. Обычно происходят переходы из состояния So в состояние Si. Могут происходить переходы в S2 и более высокие синглетные состояния, однако в жидкостях и твердых телах молекулы обычно быстро возвращаются из этих высоковозбужденных состояний в состояние S1 за время порядка 10-13--10-11с. Выделяющаяся при этом энергия малыми порциями передается в окружающее пространство при соударении с соседними молекулами. Такой процесс называют энергетическим каскадом. Аналогичным образом при возбуждении до более высоких синглетных состояний и спаде до состояния S, сначала заселяется множество колебательных подуровней S|, но все они, также каскадно, переходят к самому низкому колебательному уровню - Si, который в большинстве случаев оказывается единственным важным возбужденным синглетным состоянием. Молекула в таком состоянии может подвергаться различным физическим и химическим превращениям. Физические пути превращения молекул в состоянии S| и в возбужденных триплетных состояниях показаны на модифицированной диаграмме Яблонского (рис. 1).

Рисунок. 1. Модифицированная диаграмма Яблонского, показывающая переходы из основного состояния в возбужденные.

Прямыми линиями показаны излучательные переходы, волнистыми линиями -- безизлучательные переходы. 1С -- внутренняя конверсия. ISC -- интеркомбинационная конверсия, hvf-- флуоресценция, hv_p -- фосфоресценция.

1. Молекула в состоянии Si может отдавать свою энергию небольшими порциями, переходя с более высоких колебательных уровней на более низкие и в конце концов возвращаясь в основное состояние. Поскольку в исходном состоянии молекула обладает большим запасом энергии, этот процесс, называемый внутренней конверсией (1С), происходит довольно медленно, и большая часть молекул в состоянии Si претерпевает другие превращения.

2. Молекулы в состоянии Si могут сразу перейти на один из низких колебательных уровней состояния S₀, отдав всю избыточную энергию в форме света. Этот процесс, происходящий обычно за время порядка 10-9с, называется флуоресценцией.

Этот относительно медленный процесс характерен главным образом для малых молекул, например двухатомных, и молекул с жесткой конфигурацией, например ароматических. Для большинства других соединений флуоресценция очень слабая, и часто ее невозможно детектировать.

Физические процессы, которым подвергаются возбужденные молекулы

* - Надстрочный значок v указывает на колебательно-возбужденное состояние; возбужденные состояния выше Si или Ti опущены.

Спектры флуоресцентного излучения обычно представляют собой зеркальное отображение спектров поглощения. Однако это отображение не точное, а приблизительное, поскольку флуоресцирующие молекулы переходят с самого низкого колебательного уровня состояния Si на различные колебательные подуровни состояния S₀, тогда как при возбуждении молекулы переходят с самого низкого колебательного уровня S₀ на различные колебательные подуровни Si. Единственным общим пиком является пик, соответствующий переходам между самыми низкими колебательными уровнями двух состояний, т. е. между уровнем v₀ одного состояния и уровнем v₀ другого состояния; этот общий пик обозначают обычно 0--0. В растворах даже пики 0--0 могут не совпадать, так как два состояния сольватируются по-разному. Флуоресценция почти всегда бывает вызвана переходом Si --» S₀.

Любые химические реакции в состоянии S| должны происходить очень быстро, иначе их опередит процесс флуоресценции.

3. Большинство молекул в состоянии Si (хотя, конечно, далеко не все) могут претерпевать интеркомбинационную конверсию (ISC), переходя в самое низкое триплетное состояние Т). Показательным примером служит бензофенон, в котором почти 100 % молекул, возбужденных до состояния S_b переходят в состояние Т,. Интеркомбинационная конверсия из синглетного состояния в триплетное относится к разряду спин-запрещенных, так как она связана с изменением угловых моментов, но она часто происходит за счет компенсации внутри системы без потери энергии. Синглетное состояние обычно имеет более высокую энергию, чем соответствующее ему триплетное состояние; один из путей высвобождения избыточной энергии состоит в переходе молекулы из состояния S, на высокий колебательный уровень состояния Т], а затем в переходе по колебательным уровням состояния Ti к самому низкому уровню. Этот каскадный переход происходит очень быстро, за 10-12 с. Если заселены состояния Т₂ и другие, более высокие, они также быстро каскадируют к самому низкому колебательному уровню состояния Т,.

4. Молекула в состоянии Т1 может вернуться в основное состояние So путем выделения энергии в виде тепла (интеркомбинационная конверсия) или света (фосфоресценция). Конечно, и здесь существуют препятствия, связанные с угловыми моментами, так что оба процесса, и интеркомбинационная конверсия, и фосфоресценция, очень медленные (10-3 -10-1 с). Это означает, что состояния Т1 имеют намного большие времена жизни, чем состояния Si. Если оба процесса происходят в одной и той же молекуле, фосфоресценция наблюдается при более низких частотах, чем флуоресценция (поскольку разность энергии между состояниями S,h S₀ больше, чем между состояниями T1 и So), и в течение более длительного времени (благодаря большему времени жизни состояния Т1).

5. Если ни один из описанных выше процессов не успевает произойти, молекула в возбужденном состоянии (S| или ТО может передать всю избыточную энергию соседней молекуле; этот процесс носит название фотосенсибилизации. При этом возбужденная молекула [донор (D)] переходит в состояние S₀, тогда как другая молекула [акцептор (А)] становится возбужденной: D* + А -- А* + D.

Таким образом, молекула может достичь возбужденного состояния двумя путями - поглотив квант света или получив энергию от другой возбужденной молекулы. Молекулу-донор в этих случаях называют также фотосенсибилизатором. Перенос энергии от возбужденной молекулы подчиняется правилу сохранения спина Вигнера; это правило является частным случаем закона сохранения момента.[5,6,10,14,27,50]

1.1 Физико-химические свойства и применение А цетилсалициловой кислоты