Молекулярные механизмы передачи импульса в мембранах нейронов. Ионные каналы, рецепторы

Молекулярные механизмы передачи импульса в мембранах нейронов. Ионные каналы, рецепторы

1. БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ В НЕРВНЫХ КЛЕТКАХ

На каждом этапе рассмотрения биохимии нервной системы приходится вновь обращать внимание читателя на то обстоятельство, что нейроны способны выполнять свои функции только благодаря особым свойствам их наружной мембраны. Мембрана нейрона имеет специальные молекулярные устройства, которые позволяют ей генерировать, проводить и воспринимать нервный импульс, практически мгновенно изменять ионную проницаемость и создавать за счет этого трансмембранный ионный ток. Этот комплекс молекулярных событий приводит к направленному распространению нервного импульса по аксону на очень большие расстояния.

Способность к проведению нервного импульса в аксонах обусловлена, с одной стороны, наличием в его мембранах специфических белковых комплексов, которые представляют собой ионные каналы, управляемые электрическими потенциалами, с другой стороны, наличием белковых структур, поддерживающих ионные градиенты в мембранах, -- так называемых ионных насосов.

Насосы расходуют метаболическую энергию для перемещения ионов против концентрационных градиентов между вне- и внутриклеточной средой. Особенно важны различия в концентрациях ионов Na, К и Са. Наружная среда приблизительно в десять раз богаче ионами Na, чем внутренняя > а внутренняя среда в десятки раз богаче ионами К, чем наружная. Внеклеточные концентрации Са⁺ в сотни-тысячи раз выше внутриклеточных.

Ионы Na и К могут медленно проникать через поры в клеточной мембране по градиенту, поэтому ионные насосы непрерывно производят обмен вошедших в клетку ионов натрия на ионы калия из внешней среды, такое откачивание ионов натрия осуществляется внутренним мембранным белком -- Na⁺, К⁺-АТФазой или Na-насосом. Существуют и другие типы ионных насосов, преимущественно называемых по типу ионов, которые они транспортируют, например Са-насосы, К-насосы и т.д..

Модель генерации нервного импульса, созданная А. Ходжкиным и А. Хаксли применительно к аксону, описывает проведение электрического сигнала путем изменения проницаемости для ионов натрия и калия. Эта модель, ставшая классической, принесла авторам известность и Нобелевскую премию в 1956 г. Основная идея модели генерации нервного импульса сводится к следующему: механизмы ионной проницаемости натрия и калия работают независимо друг от друга и описываются с помощью констант скоростей реакции, зависящих от единственной переменной -- мембранного потенциала. С помощью экспериментальных подходов эта теоретическая модель была успешно подтверждена.

Поскольку концентрация ионов натрия и калия по ту и другую сторону мембраны различаются, внутренняя область аксона имеет значительный отрицательный потенциал по отношению к наружной среде. Когда нервный импульс возникает в основании аксона, трансмембранная разность потенциалов в этом месте локально понижается. Это ведет к тому, что непосредственно за этой зоной с измененным потенциалом вдоль аксона открываются ионные каналы для входа ионов Na. Процесс является самоусиливающимся: поток ионов натрия через мембрану приводит к открыванию все большего числа ионных каналов. Затем натриевые каналы закрываются, но вслед за этим открывается другая группа каналов -- для ионов К, которые выходят наружу. Этот поток восстанавливает потенциал внутри аксона до потенциала покоя. Резкий скачок потенциала или электрический "спайк" называется потенциалом действия и является электрическим выражением нервного импульса.

Итак, возникновение быстрых импульсных сигналов связано с работой ионных каналов. Ионные каналы -- это макромо-лекулярные комплексы, которые образуют сквозные гидрофильные поры в липидном матриксе и способны регулировать транспорт ионов через мембрану клетки. Другими словами, ионные каналы представляют собой ионселективный фильтр, способный избирательно регулировать проницаемость клетки для ионов. Так, работа одного ионного канала способна изменять ионные токи от 2 до 10 рА, что соответствует транспорту от 12 до 60x10 моновалентных катионов в секунду. Такая величина обменного процесса ионов в клетке превосходит во много раз известные до сих пор ферментные или транспортные механизмы и хорошо согласуется с теоретическими расчетами, сделанными для модельной поры.

Ионные каналы имеют два фундаментальных свойства: они способны избирательно пропускать ионы и имеют механизм контроля за скоростью перемещения ионов -- воротные токи. Однако избирательность каналов для определенных ионов не является абсолютной, так как они могут в определенной степени пропускать и "чужие" ионы, сходные по заряду или размерам.

Механизм селективности ионных каналов определяется взаимодействием между ионами и специфическим структурным участком канала, его воротами. Воротные механизмы, регулирующие открывание и закрывание мембранных каналов, представлены двумя типами. Существуют каналы, которые открываются и закрываются в ответ на изменения потенциалов, т.е. управляются электрически. Второй тип воротного механизма связан с работой ионных каналов, открываемых в ответ на химический сигнал, т.е. управляемых химически.

Деполяризация, связанная с потенциалом действия, распространяется вдоль аксона как волна электрической активности. Главное преимущество электрического проведения импульса по аксону состоит в том, что возбуждение быстро распространяется на большие расстояния без какого-либо ослабления сигнала. Для возникновения серии нервных импульсов необходимо сложное взаимодействие разных ионных каналов, включая электроуправляемые и хемоуправляемые ионные каналы. Все нервные импульсы имеют практически одинаковую амплитуду; кодирование информации на этом уровне происходит за счет разной частоты, генерируемой в единицу времени. В общем, чем сильнее сигнал, тем выше частота разрядов.

2. Na-КАНАЛЫ

Потенциал-зависимые Na-каналы -- обязательный элемент внешней мембраны нейронов. В последние годы благодаря обнаружению специфических блокаторов электровозбудимых натриевых каналов удалось раскрыть молекулярную структуру каналов и, в частности, выделить составляющий их белок в индивидуальном виде.

Одним из хорошо исследованных блокаторов Na-каналов является тетродотокснн, который необратимо связывается с белком канала и позволяет его маркировать для последующей очистки. Наибольших успехов в исследовании функции и структурной организации натриевых каналов добились японские исследователи Р. Нума и др. Они показали, что этот мембранный белок представляет собой гликопротеид сМ_г = 250-300 кД, состоящий из нескольких субъединиц, которые образуют на внутренней поверхности гидрофильную трубчатую структуру, при денатурации в восстановительных условиях белок диссоциирует на два основных компонента, которые специфически связывают Н-тетродотоксин в присутствии фосфолипидов. Диаметр поры этого канала колеблется в пределах 0,4-0,6 нм. Через такую пору могут проходить ионы натрия, связанные с молекулами воды. Избирательность для ионов Na существует, но не является абсолютной.

ТТХ-связывающие белки выделены из различных объектов: головного мозга, клеток нейробластомы, нейронов моллюсков, аксонов кальмара и др. С помощью моно- и поликлональных антител «показано наличие общих антигенных детерминант у белков каналов, выделенных с помощью тетродотоксина. Иммунохимические данные наряду с результатами ограниченного протеолиза и химической модификации молекул свидетельствуют в пользу трансмембранной модели потенциал-независимого натриевого канала. Доступность некоторых участков белка для иммуноглобулинов в липидных мембранах или липосомах подтверждает гипотезу о значительных конформационных перестройках молекулы натриевого канала под действием электрического поля.

В настоящее время установлена полная первичная последовательность ТТХ-чувствительных белков и структура гена, кодирующего синтез в нервной клетке Na-каналов.

Изменение конформационного состояния структурных компонентов ионного канала тесно связано с процессами фосфо-рилирования а- и р-пептидных субъединиц. Обнаружено, что Na-каналы мозга млекопитающих содержат одну а-субъедини-цу, ассоциированную с двумя полипептидами: pj и р₂. Установлено, чтоа-субъединица является трансмембранным белком, имеющим участки связывания ряда нейротропных веществ на внешней поверхности мембран, и участки связывания для фосфорилирования цАМФ-зависи-мой протеинкиназой. Оказалось, что этого единственного а-полипептида вполне хватает, чтобы сформировать ионный канал, но не достаточно для выполнения его функций.

Функционированию ионного канала способствуют Рр и р₂-субъединицы, которые размещены в основном на внешней поверхности мембран и ковалентно связаны с а-субъединицей через дисульфидную связь. Эти р-субъединицы сильно гликозилиро-ваны, приблизительно 30% их массы составляют карбогидраты, большая часть которых приходится на сиаловую кислоту. Последняя и придает ионному белковому комплексу сильный отрицательный заряд, который и позволяет полноценно функционировать каналу. С другой стороны, эти карбогидраты необходимы ддя нормального биосинтеза и точной сборки функционального канала в нейронах. Показано, что если гликозилирование ингибировано, то новый синтез а-субъединицы быстро останавливается, и она не включается в клеточную поверхность мембраны.

Процесс открывания Na-каналов под влиянием изменения потенциала мембраны -- активация натриевых каналов -- один из наиболее ярких примеров конформационных перестроек белков под влиянием электрического поля. Открывание каждого канала совершается по известному принципу -- "все или ничего". Этот процесс может быть остановлен инактивацией, которая опять-таки связана с переходом белков канала в другое конформационое состояние. Полный цикл активации и инактивации охватывает десятки тысяч натриевых каналов.

3. К-КАНАЛЫ

Потенциал-зависимые калиевые каналы так же, как и натриевые, распространены повсеместно в наружных мембранах нервных клеток и играют столь же важную роль в передаче скоростных сигналов. В отличие от ионов натрия, которые вызывают локальную деполяризацию мембраны и генерирование потенциала действия, калиевые каналы приводят к гиперполяризации нейрона и появлению тормозных потенциалов. Система быстрых калиевых каналов играет большую роль в стабилизации ритмической деятельности нейрона, которая является основным способом кодирования и передачи клеткой химических сигналов. Характерной чертой участия калиевых каналов в ритмической активности является резкое замедление нарастания деполяризации мембраны, вызванной предшествующим входом ионов Na.

Калиевые каналы являются более избирательными для ионов: они не пропускают практически ионы Na, проницаемость для ионов Rb, NH₄⁺ сравнительно мала. Полагают, что селективный фильтр калиевого канала имеет размеры порядка 0,26-0,3 нм. Ионы большего размера не проходят через канал по стерическим причинам, ионы меньшего диаметра -- в связи с тем, что они не могут успешно взаимодействовать с кислородо-содержащими анионами, находящимися в боковых цепях гидрофильных аминокислот, которые выстилают внутреннюю белковую пору.

Калиевые каналы подразделяются на три подтипа в зависимости от скорости проведения: быстрые, средние и медленные. Первые два подтипа каналов являются зависимыми от ионов Са и блокируются токсином скорпиона, в то время как третий вид калиевого канала блокируется одним из токсинов ада кобры и пчелы -- апамином.

Структура К-каналов в принципе сходна со структурой Na-каналов. На основании данных радиационной инактивации замороженных мембран были определены молекулярные массы для целого олигомерного комплекса -- от 165 до 400 кД в зависимости от типа клетки. Обнаружено, что у разных организмов сочетание полипептидных компонентов, составляющих макромолекулу ионофора, существенно различается. В отличие от белков других каналов белки калиевых каналов практически не гликозилированы.

Недавно были проведены работы по выделению генов, кодирующих синтез калиевых канальных полипептидов. Специфическая мРНК, выделенная из мозга крыс, была инъецирована в ооциты лягушки. Показано, что в этом случае регистрируются "новые" калиевые каналы. Найдена высокая степень го-мол огичности между нуклеотидными последовательностями, кодирующими синтез калиевых каналов в разных клетках. Особенно это касалось гидрофобных доменов, которые оказались наиболее консервативными в эволюции.

4. Са-КАНАЛЫ

Транспорт Са⁺ через кальциевые каналы жизненно важен для разнообразных клеточных функций, особенно в нервной ткани. Электровозбудимые кальциевые каналы изучены преимущественно на нейронах моллюсков. Сейчас становится очевидным, что у высших позвоночных они мало отличаются по физико-химическим характеристикам.

Специфичность кальциевых каналов не очень высока, они способны пропускать из наружной среды Na⁺ и ионы других щелочных металлов, если концентрация Са⁺ в наружной среде находится ниже микромолекулярного уровня. Кальциевые каналы пропускают также катионы других двухвалентных металлов, например Mg⁺ и Мп⁺. Однако эти катионы легко связываются внешней химической группировкой канала и становятся при определенных концентрациях эффективными блокаторами кальциевого канала. Полагают, что эта группировка является карбоксильной группой, находящейся в устье канала.

Общая схема молекулярной организации кальциевых каналов сходна с описанной выше для Na-каналов. Однако главная а-субъединица окружена большим числом субъединиц, служащих модуляторами активности канала. Пока не ясно, какие химические группировки ответственны за трансмембранный перенос кальция, понятно только, что он - существенно зависит от внутриклеточной концентрации Са⁺ и функционирования системы циклических нуклеотидов.

Несмотря на то, что численность кальциевых каналов значительно меньше, чем натриевых и калиевых ион-транспортных систем, при определенных условиях они могут самостоятельно вызывать деполяризацию нейрона. Однако сейчас очевидно, что главная функция кальциевых каналов состоит в сопряжении электровозбудимости с внутриклеточными процессами. Эта функция кальциевых каналов особенно важна для включения механизма выхода нейромедиатора из нервного окончания.

5. СИСТЕМЫ АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА ИОНОВ. Na⁺/K⁺ И Na⁺/Ca⁺ - НАСОСЫ

Как уже упоминалось, электрическое возбуждение в нервной ткани существенно зависит от механизмов пассивного и активного мембранного транспорта, контролирующего концентрации ионов и молекул внутри клеток и нередко в межклеточном пространстве. Аксоны обладают большим резервом Кононов и дефицитом Na⁺-noHOB. Миграции ионов, обеспечивающие прохождение импульсов и создающие изменения потенциала мембраны, быстро компенсируются этими резервами. "Выносливость" аксона очень велика -- утомление наступает лишь после прохождения 10 -- 10 импульсов, тем не менее перемещения ионов при прохождении импульса должны быть компенсированы в стадии покоя. Кроме того, мембрана в стадии покоя не является абсолютным барьером для перемещений ионов и постепенного уменьшения потенциала.

Ряд внутриклеточных процессов требует постоянной регуляции за счет активных ионных потоков через -мембрану. Наконец, особенно велики нарушения градиентов ионных концентраций при функционировании синапсов. Для компенсации всех этих нарушений градиентов служат ионные насосы.

Основной транспортной системой в нейронах, как и в большинстве других эукариотических клеток, является насос, который вытесняет Na⁺ и постоянно накапливает К⁺. Этот процесс требует присутствия АТФ и специфически ингибируется кардиоактивными гликозидами типа оуабаина.

Na⁺, К⁺-активируемая аденозинтрифосфотяза, или АТФ-фосфогидролаза К.Ф.3.6Л плазматических мембран нервных клеток осуществляет трансмембранный перенос одновалентных катионов против градиентов их электрохимических потенциалов, используя энергию гидролиза АТФ. Работая с максимальной скоростью, этот ферментативный комплекс способен транспортировать через мембрану около 200 ионов Na и 130 ионов К в 1с. Однако фактическая скорость работы фермента определяется потребностями клетки. У большинства нейронов на поверхностной мембране расположено до 200 натриевых насосов на квадратный микрон, причем в некоторых участках этой поверхности их плотность в 10 раз выше.

Молекула фермента состоит из каталитической а-субъединицы и $-гликопротеида, функциональная роль которого до сих пор неизвестна. Молекулярная масса комплекса белковых субъединиц Na⁺, К⁺-АТФазы составляет около 275 000, и размеры фермента колеблются в пределах 6-8 нм. Кроме полипептвдов Na⁺, К⁺-АТФаза содержит 3 углеводные цепи, которые присоединены к р-субъединице гликозидными связями. Одновременное использование методов генной инженерии и химии белка привело к установлению первичной структуры Na⁺, К⁺-АТФазы. С помощью моноклональных антител установлено внутри- и внеклеточное расположение некоторых участков а- и р-субъединиц. Предложена модель полипептидной цепи фермента, согласно которой сс-субъединица 7 раз пересекает бислойную мембрану и локализована главным образом в цитоплазме. свидетельствует в пользу того, что существуют общие функциональные и структурные взаимодействия между Na⁺, К⁺-АТФазой и ионными каналами для транспорта К⁺.

Сходным с Na⁺, К⁺-АТФазой является другой ионный насос -- Ка⁺/Са⁺-АТФаза. Она производит обмен каждого иона Са⁺ на 3 иона Na⁺. Значение этой системы особенно велико в нервных окончаниях, где система медиаторов связана с вхождением Са⁺ в терминаль и необходимостью компенсировать далее эти смещения градиента. Кроме того, ряд событий в постсинапти-ческой зоне тоже сопряжен с временным вхождением Са⁺.

6. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ, РЕЦЕПТОРЫ

Нейрон способен иметь до нескольких десятков тысяч межклеточных контактов, большинство из которых обеспечивается определенными морфологическими структурами -- синапсами. Клеточную поверхность нейронов можно рассматривать как приемник разнообразнейших сигналов.

Чем выше степень эволюционной организации нервной системы, тем разнообразнее природа химических синапсов. Особенно это касается головного мозга высших млекопитающих, включая человека. Очевидно, химические синапсы оказались эволюционно более выгодными для передачи дискретных сигналов по сравнению с другими типами межклеточных контактов, поскольку на их 'основе возможна не только передача сигнала, ко и его разнообразная модуляция, в том числе гуморальными факторами. Основой восприятия нейроном химического сигнала в синапсе, а также ряда модулирующих влияний являются рецепторы.

Рецепторы представляют собой надмолекулярные образования, состоящие из белков, а также гликолипидных компонентов. Они способны под действием медиатора либо нашэсредственно изменять потоки ионов через мембрану, либо индуцировать образование вторичш>тх мессенджеров, которые, в свою очередь, меняют ряд свойста лейрона.

Межнейрональные химические синапсы подразделяются на два типа: возбуждающие и тормозные, причем.первые, как известно, способствуют генерации новых импульсов, а вторые приводят к снятию действия приходящих сигналов. Это деление определяется в значительной мере природой рецепторов. Известны случаи, когда один и тот же медиатор оказывает возбуждающее или тормозное действие в зависимости от природы рецептора.

В зависимости от места положения синапсов их можно подразделить на сомато-аксональные, дентрито-аксональные, ден-трит-дентритные и др. Каждый из этих синапсов имеет свои особенности в функционировании. Схематически структура синапса может быть представлена следующим образом.

На рисунке хорошо видны утолщения, составляющие пре-синаптическую мембрану подходящего аксона, синаптическая щель и постсинаптическая мембрана. В пресинаптическом окончании находятся синаптические везикулы -- хранилища запасов нейромедиатора в пресинаптическом нейроне. Постсинаптическая мембрана является носителем рецепторов. В ряде случаев сами рецепторы могут быть визуализированы при посредстве электронной микроскопии.

При распространении нервного импульса происходит деполяризация пресинаптической мембраны я изменение ионных токов. Наиболее важным событием в нервном окончании является мобилизация ионов Са, которые вызывают миграцию и открывание многочисленных синаптических везикул. Эти везикулы непосредственно связываются с участками пресинапса и открытие их приводит к высвобождению нейромедиатора и диффузии его в синаптическую щель. В терминали аксона сконцентрированы и ферменты синтеза медиатора, митохондрии для энергетического обеспечения этого процесса, системы белков-транспортеров, способствующих узнаванию и обратному захвату молекул нейромедиатора. Этот последний механизм, по-видимому, существенно экономит затраты на синтез готового нейромедиатора и участвует в регуляции срока его действия.

В отличие от биохимических процессов выброса нейроме-диаторов из пресинапса, имеющих общий характер, постсинап-тическое действие нейромедиатора прекращается самыми разнообразными способами: разрушением его определенными ферментами, либо быстрым поглощением из области синапса гли-альными клетками, либо обратным захватом его в пресинаптическую терминаль. В качестве примера существования разных механизмов утилизации нейромедиаторов из синапса можно привести механизмы процессов, происходящих в холинергиче-ском, глутаматергическом и ГАМК-ергическом синапсах.

Механизм разрушения ацетилхолина преимущественно связан с работой фермента -- ацетилхолинэстеразы, который располагается на постсинаптической мембране и быстро гидроли-зует медиатор после взаимодействия с рецепторами. В глутаматергическом синапсе механизм удаления нейромедиатора заключается преимущественно в поглощении L-глутамата окружающими глиальными клетками. L-глутамат превращается в глутамин с помощью фермента глутаминазы, находящейся в глиальных клетках. В ГАМК-ергическом синапсе преобладает система обратного захвата медиатора.

7. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ НЕЙРОРЕЦЕПТИИ

В биохимии и физиологии нервной системы длительное время доминировала точка зрения, согласно которой местом активных пластических изменений нейронов является пресинапти-ческая мембрана. Были представлены многочисленные свидетельства, касающиеся сдвигов количества квантов нейромедиатора в процессе обучения, памяти, выработки условных рефлексов и др. Постсинаптическим мембранам отводилась либо пассивная роль, либо они вообще не рассматривались в качестве активных участников событий в нервных клетках. Впоследствии стало ясно, что процессы, происходящие в плазматической или синаптической мембране нейрона, являются одними из ключевых для понимания интегративных функций ткани мозга, решения проблем обеспечения эффективного взаимодействия между нервными клетками. В последние десятилетия особое внимание было обращено на изучение структурных компонентов постсинаптических мембран, в частности нейрорецепторов. Исследования тонкой структуры и функции нейрорецепторов показали их важную роль в трансформации химического сигнала в биоэлектрические потенциалы и в передаче информации на внутриклеточные реакции, которые определяют метаболизм нервной ткани.

Следует отметить, что нейрорецепторы расположены как на мембранах нейронов, так и на мембранах глиальных клеток. Однако у последних они имеются в ограниченном наборе и числе. Рецепторные системы, расположенные на глиальных элементах, отличаются от нейрональных весьма важным моментом -- они не способны продуцировать ответные реакции клеток в виде оперативных единиц информации. Иными словами, они не генерируют потенциалов действия. Как правило, глиальные клетки реализуют свое действие через внутриклеточные и межклеточные трофические регуляторные реакции, участвуя в метаболизме нейронглия.

Несмотря на огромное разнообразие клеточных рецепторов на мембране нейрона, их можно подразделять на два основных класса, которые различаются по механизмам действия и скорости проведения сигналов. Существуют быстродействующие ионотропные и медленнодействующие метаботропные рецепторы скорость действия первых составляет миллисекунды, в то время как у последних они находятся в секундно-минутном диапазоне. Время действия нейрорецепторов определяется структурной организацией рецепторных компонентов.

Быстродействующие рецепторы содержат в своей структуре ионный канал, открывающийся при контакте с нейромедиатором. Медленнодействующие рецепторы представляют собой комплекс из нескольких белков, которые при воздействии нейромедиатора последовательно меняют конформацию и в конечном счете активируют синтез или выход вторичного, уже внутриклеточного, медиатора. Эти два класса рецепторов обозначают нередко как рецепторы I и II класса. Для правильного восприятия терминологии целесообразно также указать, не рассматривая пока детали, что рецепторы класса II содержат в числе белков, передающих сигнал, так называемые G-белки. Их нередко упоминают, обозначая рецепторы этого класса.

Кроме охарактеризованных выше двух классов рецепторов существуют еще три особые группы рецепторов, которые хотя и присутствуют в нервной системе, но пока представляются не связанными прямо со специфическими функциями последней. К ним относятся рецепторы, переносяшие свои лиганды через мембрану, рецепторы, обладающие собственной тирозинкиназной активностью и, наконец, своеобразная группа, которая при взаимодействии с лигандом претерпевает частичное протеолитическое расщепление. В настоящем руководстве мы не рассматриваем эти группы рецепторов.

К первому классу рецепторов принадлежат никотиновые рецепторы ацетилхолина, рецепторы ГАМК_А, глицина, а также часть рецепторов глутамата и аспарагиновой кислоты. Рецепторы катехоламинов, серотонина, ГАМК_В и ряда пептидных соединений, а также мускариновые рецепторы ацетилхолина и некоторые из рецепторов глутамата относят ко второму классу. Последние типы рецепторов через систему вторичных посредников вызывают изменения в активности проте-инкиназ, способных фосфорилировать мембранные белки, включая ионные каналы.

Таблица 1

Структура, общий характер и функции рецепторов класса I

Таблица 2

Масса белков рецепторов класса II

Следует отметить, что в последние годы обнаружена группа нейрорецепторов, связь которых с ионными каналами осуществляется через G-белки, не сопряженные с перечисленными выше вторичными мессенджерами. Хотя в такую систему рецепции и не включены протеинкиназы, тем не менее участие G-белка в трансформации сигнала значительно увеличивает время действия по сравнению с нейрорецепторами класса 1.

Фундаментальным свойством всех нейрорецепторов является их лабильность и высокая скорость синтеза самого рецептора. Это свойство рецепторов конрастирует с более жесткой запрограммированностью синтеза белковых компонентов мембран, которая обычно наблюдается у других типов тканей. В нейронах развиты механизмы непрерывного синтеза рецепторов и их быстрой утилизации либо путем интернализации, либо с помощью пиноцитоза. Высокая скорость обновления нейрорецепторов обусловлена, по-видимому, необходимостью изменения "информационной емкости и "пропускной способности" нейрона. В этом случае генетический аппарат клетки способен, интегрируя всю приходящую информацию, "принять решение" путем перестройки синтеза белковых компонентов мембран. В этом скрыта одна из причин уникального свойства нейронов и нервной ткани в целом -- пластичности.

Таким образом, основная роль нейрорецепторов сводится к созданию специфических информационных входов, организующих единый функциональный ансамбль нейронов. Именно совокупность рецепторов определяет лицо клетки и ее реакции на поступление разнообразных химических сигналов.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе модуляции эффективности синаптической передачи, в которых важную роль играют рецепторные процессы, имеют альтернативу. С одной стороны, это изменение чувствительности к рецептору, с другой -- увеличение или снижение количества активных рецепторов на мембране. Заслуживают внимания и гипотезы, касающиеся посттрансляционной модификации нейрорецепторов, которая позволяет изменить количественные параметры их функционирования.

Внимание к проблемам нейрорецептии со стороны биохимиков, фармакологов и физиологов обусловлено еще и тем, что причиной многих дисфункций нервной системы является нарушение целостности мембранных компонентов как нейронов, так и глиальных клеток. Отметим, что существующие успехи в лечении некоторых нервно-психических заболеваний связаны в большей мере с прогрессом в исследовании именно молекулярных свойств ряда рецепторов. Оказалось, что многие нейрорецепторы выполняют роль избирательных мишеней действия известных лекарственных препаратов. Исследования в этой области нейробиологии служат сейчас постоянным источником для целенаправленного поиска и создания новых классов фармакологических средств, обладающих улучшенными терапевтическими свойствами.

8. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ НЕЙРОРЕЦЕПТИИ

Наиболее широко распространенным и разработанным методическим подходом для количественного анализа взаимодействия нейромедиаторов со своими рецепторами на мембране клетки является радиолигандный метод. Суть этого метода заключается в изучении параметров связывания радиоактивного лиганда с мембранно-связанными или изолированными рецепторными белками. В настоящее время существует хорошо развитая кинетическая теория рецептии и методы определения физико-химических параметров процесса образования комплекса лиганд-рецептор. Такой физико-химический анализ позволяет сделать определенные заключения о структуре активных центров нейрорецепторов, в частности, выяснить природу некоторых функциональных групп, которые ответственны за первую стадию взаимодействия лиганда с акцептором.

Для того чтобы кратко ознакомиться с количественной теорией взаимодействия веществ со своими рецепторами, рассмотрим простейшие условия, когда одна молекула лиганда взаимодействует с одним центром связывания:

где L -- лиганд; Q -- центр связывания; В -- комплекс лиганда со связывающим центром; К_{ и K.j -- кинетические константы. При динамическом равновесии скорость реакции образования комплекса В равна его скорости диссоциации, т.е. V_t = V__1? тогда концентрация вычисляется по формуле

При этом предполагается, что L и Q взаимодействуют между собой по закону действующих масс, т.е. скорости реакций образования комплекса и его диссоциации прямо пропорциональны концентрациям компонентов в системе. Отношение констант прямой и обратной реакции называют константой сродства К_с. Она характеризует соотношение занятых и свободных участков связывания при данной концентрации лиганда. Обычно для описания параметров связывания используют величину, обратную константе сродства,--

-- константу диссоциации. Эта константа соответствует величине, при которой происходит насыщение 50% связывающих участков:

Если вместо константы сродства К_с использовать обратную ей величину Кд, то, подставив это значение в уравнение, характеризующее равновесную реакцию взаимодействия лиганда с рецептором, получим следующее уравнение:

Приняв общее число рецепторов за 1, можно преобразовать уравнение к виду, аналогичному уравнению Михаэлиса, которое используется в энзимологии для описания кинетики обратимых ферментативных реакций:

где -- концентрация комплекса фермент-субстрат; --

концентрация субстрата и K_s -- константа диссоциации комплекса; -- исходная концентрация субстрата.

Согласно этим уравнениям зависимость величины эффекта от дозы лиганда или фермента описывается гиперболой. Чаще всего для работы пользуются графическим выражением зависимости эффекта не от концентрации, а от логарифма концентрации лиганда. Графически зависимость результатов может быть представлена разными способами, однако наиболее информативным способом расчета являются координаты Скэтчарда. Действительно, помимо равновесной константы связывания и общей концентрации центров связывания этот метод позволяет определить концентрацию свободного лиганда, соответствующую данной концентрации комплекса В. Константа диссоциации равна котангенсу угла наклона прямой. Отрезок на оси абсцисс от точки пересечения с прямой до начала координат соответствует максимальному уровню насыщения центров связывания.

Таким образом, представление результатов равновесного связывания в координатах Скэтчарда дает информацию о характере протекающего процесса и позволяет определить важные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия -- константу диссоциации и концентрацию центров, способных образовывать комплексы с нейромедиатором.

В качестве примера изучения рецепторного связывания нейромедиатора с белковыми компонентами на мембране нейрона приведем экспериментальные исследования глутаматных рецепторов радиолигандным методом. Так, исследования параметров связывания Н-глутамата с синаптическими мембранами, выделенными из коры больших полушарий головного мозга крыс, показали их зависимость от чистоты материала, способов хранения, условий проведения реакции связывания и др. При стандартизации всех указанных условий зависимость специфического связывания Н-глутамата с синаптическими мембранами имеет насыщающий характер. Представление экспериментальных данных в координатах Скэтчарда свидетельствует о наличии на мембранах однородной популяции участков связывания с К_д - 89,4 нМ и В_макс = 2,0 пмоль/мг белка.

Значение количества центров связывания, выраженное в СРМ, пересчитывается в фмоль/мг белка по следующей формуле:

>

где А^ -- молярная активность радиолиганда, Кю/моль; а -- 2,210~ pacn/мин; f -- эффективность счета; -- разность счета связывания радиолиганда с рецептором в отсутствие и в присутствии немеченого радиолиганда; t -- время счета; С -- концентрация белка, мг.

Для того чтобы отличить эти параметры связывания от неспецифического связывания и поглощения глутамата другими участками мембраны, существуют дополнительные экспериментальные приемы, в том числе проведение реакции в присутствии разных катионов. Истинное рецепторное связывание глутамата является Na*-независимым процессом, в то время как поглощение и транспорт этого нейромедиатора другими участками синапса происходит в присутствии высоких концентраций ионов Na.

Далее возникает вопрос, соответствуют ли эти независимые участки связывания самого глутамата тем рецепторным компонентам на мембране нейрона, которые способны вызывать физиологический ответ клетки на данный медиатор. Оказалось, что сродство и константа диссоциации, полученные экспериментальным биохимическим методом, находятся в пределах физиологических концентраций действия L-глутамата на нейроны позвоночных. Такие показатели реакции связывания нейромедиатора, как насыщаемость и обратимость, соответствуют аналогичным свойствам глутаматного рецептора, регистрируемым с помощью электрофизиологических методов. Более того, чувствительность к ряду известных агонистов и антагонистов, таких как NMDA, каинат, квисквалат и другие, была сходна с физиологическими ответами. Следует упомянуть, что характер связывания нейромедиатора в присутствии ионов Na существенно отличается от рецепторного взаимодействия и коррелирует с параметрами высокоаффинного поглощения L-глутамата клетками, регистрируемыми физиологически. Все это иллюстрирует пути оценки параметров связывания нейромедиатора и специфические трудности, возникающие при такой оценке.

Одним из основных подходов к изучению молекулярных свойств нейрорецепторов является изолирование индивидуальных рецепторных белков, специфически связывающих нейромедиаторы или необратимо взаимодействующих с их антагонистами или бло-каторами. Так, прогресс в исследовании никотиновых холино-рецепторов был обусловлен обнаружением а-бунгаротоксииа, который оказался специфическим блокатором этого типа рецепторов и позволил выделить мембранные белки и очистить их на основе радиолигандного метода. Наличие таких приемов дает возможность разграничить хеморецепторные процессы от ферментативного и транспортного метаболизма нейромедиато-ров. Особенно это важно для изучения рецепторов аминокислотных медиаторов нервной ткани.

Изучение химической природы мембранных белков включает предварительное выделение, солюбилизацию, очистку и анализ очишенных компонентов. Причем применение классических методов структурного анализа для характеристики мембранных белков имеет свои сложности и особенности. Как правило, они обусловлены свойствами мембран и их компонентов, в частности, наличием липидных и гликолипид-ных структур. Проблемы, связанные с экстракцией белковых компонентов мембран, их очисткой и анализом, составляют специальный раздел мембранологии. Здесь будут рассмотрены лишь самые общие моменты.

Выбор метода солюбилизации зависит от цели исследования и имеет смысл только тогда, когда дает возможность сохранить нативные свойства рецепторного белка и исследовать его с помощью обычных биохимических подходов. Поэтому выбор со-любилизирующего агента на первом этапе может оказаться ключевым для анализа структуры и функции рецептора.

Существует целый ряд самых разнообразных солюбилизи-рующих агентов, пригодных для решения проблем мембранной биохимии. Наиболее надежными среди них являются неионные и ионные детергенты. В основе их действия лежит амфифиль-ная природа этих агентов, позволяющая им взаимодействовать и с гидрофильными, и с гидрофобными участками мембранных белков. Эффект детергента, разрушающего взаимосвязи в мембране, определяется двумя видами взаимодействия: детергент-белок и детергент--детергент. Большое значение имеет последнее взаимодействие, так как чем выше способность молекул детергента взаимодействовать друг с другом, тем меньше будет количество молекул, способных взаимодействовать с белками. Этот критерий мицеллообразования служит характеристикой детергента и его способности растворять те или иные белковые компоненты. Низкий коэффициент мицеллообразования характерен для мягких солюбилизирующих агентов, таких как тритон Х=Ю0, дезоксихолат натрия, дигитонин и другие, которые позволяют выделять нативные мембранные белки с сохранением их биологической активности. В то же время додецилсульфат натрия с высоким коэффициентом мицеллообразования обладает большой связывающей способностью и значительно повреждает нативную конформацию белков. Как правило, этот детергент используется при анализе субъединичной структуры макромолекул, так как легко разрушает межмолекулярные связи. Это свойство нередко применяется для определения молекулярной массы субъединиц белков при электрофорезе в присутствии ДСН.

Перед тем как приступить к дальнейшему выделению и изучению мембранных рецепторных белков, следует по возможности более полно удалить избыток детергента, поскольку он может оказывать нежелательное действие на биологическую активность и последующий физико-химический анализ структуры нейрорецептора.

Классические методы исследования мембранных белков, в том числе нейрорецепторов, включают практически все биохимические методы с учетом присутствия детергентов. Основным приемом специфического выделения ничтожно малых количеств нейрорецепторов является аффинная хроматография, которая позволила добиться впечатляющих успехов в изучении молекулярных свойств самых разнообразных типов нейрорецепторов.

Эффективность аффинной хроматографии зависит преимущественно от выбора лиганда или акцептора, который определяет природу выделяемого мембранного белка. Существенным фактором в этом случае является сродство лиганда к рецептору, и поэтому самыми эффективными лигандами оказываются специфические блокаторы или антагонисты нейрорецепторных белков. Иногда для выделения конкретного белка используют две или три ступени аффинной хроматографии на разных сорбентах и с разными лигандами. Получили широкое распространение методы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда используется поликлональные или моноклональные антитела, полученные к компонентам рецептора.

Дальнейшее выделение и разделение фракций обычно осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, которая позволяет очищать индивидуальные компоненты мембранных белков. Причем обратнофазная хроматография дает уникальные возможности по разделению гидрофобных белков и пептидов. Нативность белковых компонентов рецепторов проверяют либо по лигандсвязьшающей функции, либо путем реконструкции их функции в разных модельных системах.

Одной из таких модельных систем, позволяющих контролировать ионтранспортные или ионселективные функции нейрорецепторов, служат липосомы. Способность липосом встраивать белки или целые рецепторные комплексы с сохранением их функциональной активности используется в мембранологии для моделирования функций белков "в чистом виде". В этом случае можно получать информацию о структурной организации компонентов, составляющих макромолекулу рецептора, и их внутренних перестройках в контролируемых условиях эксперимента.

В настоящее время разработано большое количество методов получения липосом, которые могут изменять фосфолипидный состав, заряд, "текучесть" или многослойность их компонентов. Размеры липосом могут варьировать от 25 нм до 100 мкм. Функцию белков, встраиваемых в липосомы, контролируют по динамике транспорта или накопления меченых ионов внутри липосом.

В последние годы исследователи возлагают особые надежды на иммунохимические способы идентификации структурных компонентов нейрорецепторов. Высокая специфичность антител и их способность узнавать разные антигенные детерминанты рецепторных комплексов широко используется для выяснения структурной организации нейрорецепторов и процессов их биосинтеза, включая генно-инженерные исследования. Иными словами, поли- и моноклональные антитела являются важным инструментом для изучения механизмов рецептии и общих вопросов нейробиологии.

Принципиальным решением множества проблем, связанных с применением антител, явилось создание новой гибридомной технологии, которая позволила получить моноклональные антитела. Эта техника была разработана в 1975 г. У.Келлером и А.Милстейном. Получаемые с помощью этого метода гибридные клетки синтезируют и выделяют в культуральную среду антитела, абсолютно одинаковые по своему сродству к той или иной антигенной детерминанте.

Гибридомная техника позволила получать самые разнообразные моноклональные антитела против химически индивидуальных антигенных детерминант на одной молекуле белка. В настоящее время моноклональные антитела широко используют для идентификации практически любых макромолекул, включая нейрорецепторы.

Следует подчеркнуть, что изучение структуры и функции нейрорецепторов и других мембранных компонентов нейрона является не самоцелью для нейробиологической науки. Важно понять, как молекулярные процессы, происходящие в нервных клетках, способны интегрировать самую разнообразную информацию и реализовать ее в виде сложных поведенческих, высших психических и эмоциональных реакций. Этот стратегический путь "от простого к сложному" получил в последние годы мощный импульс благодаря разработке принципиально новых способов прижизненной регистрации динамических биохимических реакций, происходящих в клетках головного мозга. Появились методы позитронно-эмиссионной томографии, ядерно-магнитного резонанса, гамма-сцинциграфии и другие, позволяющие прижизненно регистрировать системный метаболизм разных органов и тканей, включая головной мозг млекопитающих. Это создает предпосылки для успешного изучения нейрохимических основ формирования разнообразных функциональных состояний живого мозга человека, его наиболее сложной сферы деятельности --психической.

Одним из информативных методов является позитронно-эмиссионная томография, суть которой сводится к регистрации специальным устройством радионуклидных маркеров -- меченых химических соединений, включающихся специфически в тот или иной метаболический процесс. Причем этот процесс может быть воспроизведен в виде томографических, т.е. объемных послойных изображений распределения позитронной метки по структурам и зонам головного мозга. Наиболее точная локализация достигается при использовании одновременно двух противостоящих детекторов, регистрирующих совпадающие лучи. В настоящее время уже существует хорошо разработанные приемы оценки функционального состояния головного мозга с помощью измерения локального метаболизма глюкозы, медиаторов, С0₂ и кислорода в процессе разнообразной деятельности индивида.

Важной особенностью метода, позволяющей его использовать в прижизненном исследовании деятельности мозга людей, является применение изотопов, излучения которых с учетом сроков распада безвредны для организма.

Сейчас получены четко различающиеся "карты" излучений при различных формах деятельности мозга человека, например восприятия слов, обдумывания слов, воспроизведения энграмм и др. Резкие различия регистрируются при воздействиях на мозг наркотиков и других психотропных агентов.

Естественно, что при дальнейшей разработке метода ПЭТ и его внедрении в клиническую нейробиологию возник вопрос о выборе адекватных маркеров, которые способны выявлять си-наптические реакции в нервной ткани. Ряд исследователей успешно работают с препаратами, которые позволяют визуализировать определенные нейрорецепторы и выявлять конкретные медиаторные пути, включающиеся в выполнение того или иного вида деятельности мозга человека. В клинике этот метод дает возможность проводить раннюю диагностику не только опухолевых новообразований, но и контролировать различные деструктивные процессы. Кроме того, применяя его, можно определять эффективность лечебного воздействия фармакологических средств и их правильный выбор для успешного лечения болезней мозга. В качестве иллюстрации к сказанному следует привести исследования, проводимые Вагнером и его коллегами по изучению вклада дофаминергических путей и их рецепторов в патогенез некоторых заболеваний. Выбор дофаминовых рецепторов был обусловлен их четкой локализацией в некоторых подкорковых экстрапирамидных структурах и известной их дисфункцией при двигательных расстройствах, паркинсонизме и шизофрении.

Предпосылкой для применения в ПЭТ агонистов и антагонистов дофаминовых рецепторов явились результаты радиоли-гандного связывания известных аналогов дофамина с синаптическими мембранами in vitro. Параметры связывания, константы диссоциации и количество связывающих участков сопоставляли с данными, полученными при ПЭТ, так как связывание радиофармпрепаратов с мембранами клеток, головного мозга in vivo имеет аналогичные закономерности. Расчет прижизненного взаимодействия нейрорецептор-лиганд имеет некоторые особенности, однако они учитываются непосредственно в программах компьютерного обеспечения. Наиболее удачными радио-лигандами для исследования дофаминовых рецепторов оказались антагонисты ^пС-метилспиперон и ^лУС-спироперидол. Поглощение и селективная избирательность накопления этих соединений в базальных ганглиях головного мозга коррелировали со степенью деструктивного процесса у больных паркинсонизмом. Эти исследования подтвердили гипотезу о первичной вовлеченности нигро-стриарных структур в регуляцию двигательных функций.

Дальнейшее развитие регистрирующих устройств ПЭТ, увеличение степени разрешения приборов на микроуровне и поиск новых избирательных радиофармпрепаратов могут открыть уникальные перспективы прижизненного изучения динамических биохимических процессов, происходящих в ткани мозга при выполнении сложных видов деятельности.

9. ОБЩИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Основой всех ионотропных рецепторов является крупный белок, состоящий из пяти, реже четырех, белковых субъединиц. Молекулярные массы субъединиц варьируют обычно в пределах от 40 до 70 кД. Первичная структура белков различных ионотропных рецепторов обнаруживает высокую степень гомологии -- от 20 до 60%, что указывает на общность эволюционного происхождения. Субъединицы рецептора пронизывают толщу клеточной мембраны, образуя ионный канал. Участки полипептидных полей субъединиц, выстоявшие над поверхностью клетки, служат для узнавания и взаимодействия с медиатором. Участки субъединиц, проходящие через толщу фосфолипидной мембраны и образующие собственно канал, характеризуются богатством гидрофобных неполярных аминокислотных остатков, обладающих высоким сродством к липидному окружению рецептора. Участки субъединиц, расположенные на внутренней поверхности мембраны, служат, во-первых, для взаимодействия с клеточными скелетными белками, ограничивающими их подвижность, и, во-вторых, являются мишенью для факторов, регулирующих активность рецептора в зависимости от ряда внутриклеточных процессов. Лучшим примером ионотропного рецептора служит рецептор ацетилхолина, представленный на рис. 7. Выстоящие над мембраной участки ионотропных рецепторов связаны нередко с углеводными компонентами.