27

24

m (крысы) гр.

175,5±21,9

167,4±25,4

m (печени) гр.

7,7±1,2

7,3±1,4

N (кол-во физиологических отправлений)

3-8

0-2

К 1группе (высокоэмоциональные животные) отнесли крыс с количеством физиологических отправлений от 3<, а ко 2 группе (низкоэмоциональных животных) менее 2.

Рабдомиолиз моделировали введением 50%-го водного раствора глицерола в дозе 1 мл на 100 г массы тела по 0,5 дозы в каждую бедренную мышцу. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом спустя 4ч после введения глицерола. Манипуляции с животными проводили в соответствии с правилами «Европейской конвенции защиты позвоночных

животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей » (Страсбург, 1985 г.).

L-Аргинин вводили внутрибрюшинно в дозе 60мг на 100г массы тела за полчаса до инъекции глицерола.

Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора [25].

Печень перфузировали охлажденным физиологическим рас твором, и в гомогенате печени определяли активность тирозинаминотрансферазы (ТАТ, 2.6.1.5 - L-тирозин :2-оксоглутарат аминотрансфераза). В гомогенатах печени, почек, сердца и мозга определяли содержание белковых и небелковых SH-групп.

3.2 Методы исследования

3.2.1 Определение количества белка в тканях по методу Лоури [18]

Принцип метода: Метод основан на способности циклических аминокислот - триптофана и тирозина, а также полипептидных цепей в комплексе с медью восстанавливать реактив Фолина. При восстановлении жёлтая окраска реактива переходит в синий цвет.

Реактивы:

1. 2% раствор Na2CO3 в 0.1 N NaOH. После приготовления фильтруется через стеклянный фильтр.

20 г. Na2CO3 развести в 1000 мл дистиллированной воды;

2. 1% раствор CuSO4·5H2O и 2% раствор сегнетовой соли -- Na- K-тартрата /Na2C4H4O6 или K2C4H4O6/ смешивают как 1:1.

3. Реактив Фолина: 100 г. вольфрамата натрия /Na2WO4·2H2O/ и 25 г. молибдата натрия /Na2MoO4·2H2O/ растворяют в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 мл 80% раствора фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. К колбе присоединяют обратный холодильник и смесь кипятят в течении 10 часов. После чего в колбу добавляют 150 г 50 мл дистиллированной воды и 3-5 капель брома /Br2/. Смесь кипятят без холодильника 15 мин под тягой для удаления избытка брома. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры,доводят до объёма 1л, и фильтруют через стеклянный фильтр и хранят в тёмном стекле с притёртой пробкой. Полученный раствор должен быть ярко-жёлтого цвета. Перед работой определяют концентрацию кислоты в полученном растворе. Для этого реактив титруют 1 N NaOH по фенолфталейну: 1 мл реактива Фолина ,250 мл дистиллированной воды,5-10 капель 1% фенолфталейна и титруют

1 N NaOH до розовой окраски.

4. Физиологический раствор. 0.09г NaCl развести в 100 мл дистиллированной воды.

5. 0.15 М КСl 10 мл.

- 0.112 г КСl

- 9.888 мл дистиллированной воды.

6. 7 % раствор трихлоруксусной кислоты.

7. 0.1 N NaOH 100 мл.

8. Реактив А: 1 мл реактива 2 смешать с 50 мл реактива 1.

9. Рабочий раствор альбумина: 1 мл которого содержит 10 мг белка.

Методика определения белка в тканях.

Животное декапитируем, извлекаем печень, промываем физиологическим раствором и просушиваем фильтровальной бумагой. Навеску ткани 100 мг гомогенизируем в 4 мл 0.15М КСl. Отобрать 0.5 мл гомогената, развести дистиллированной водой в соотношении 1:2 и перемешать. Отобрать 0.1 мл разведённого гомогената, добавить 0.4 мл 7 % ТХУ и центрифугировать 5 мин при 1500 обор/мин. Осадок растворить в 0.1 N NaOH, добавляя его до объёма 0.1 мл. Затем добавить 9 мл реактива А и опять перемешать. Дать постоять 10 мин при комнатной температуре. Прилить 0.9 мл реактива Фолина и опять перемешать. После чего оставить пробы при комнатной температуре на 1 час. Затем колориметрировать против холостой пробы на ФЕКе при красном светофильтре с длиной волны 540-750 нм и длиной оптического пути 1 см.

Холостую пробу готовят следующим способом: в пробирку отмерить 9.1 мл реактива А, добавить 0.9 мл реактива Фолина и тщательно перемешать.

Количество белка в пробе определить при помощи калибровочного графика. Для построения графика используют водный раствор кристаллического альбумина сыворотки быка.

Из этого раствора готовят ряд разведений следующим способом согласно схеме:

Исходный раствор белка,мл	Дистиллированная вода,мл	Концентрация белка,мкг/мл	0.1 мл содержит белка в мкг
0.1	0.9	1000	100
0.2	0.8	2000	200
0.3	0.7	3000	300
0.4	0.6	4000	400
0.5	0.5	5000	500

Из полученных рабочих растворов отобрать пробы по 0.1 мл и провести цветную реакцию по прописи. На оси абсцисс откладываем концентрацию белка в мкг, на оси ординат -- величину экстинции и строим кривую.

Норма белка в ткани: 100-200 мг/г ткани.

3.2.2 Определение активности тирозинаминотрансферазы по методу Шепарда [18]

Для определения активности тирозинаминотрансферазы (ТАТ) брали 1 гр печени крыс и гамогенезировали в 4 мл К-фосфатного буфера (рН=7,6).

Реактивы:

1. L-Тирозин

2. б-Кетоглутаровая кислота

3. Диэтилдитиокарбамат

4. Пиридоксальфосфат

5. Феназинметасульфат

6. 0,75 М фосфатный буфер рН=7,0 (готовят перед опытом)

7. 0,14М KCl фосфатный буфер рН=7,6

Метод:

Активность тирозинаминотрансферазы исследуется по определению увеличения концентрации р-оксифенилпирувата в инкубированных образцах (контроль - при нулевой температуре), измеряя экстинцию окраски, образующейся при взаимодействии этого метаболита с феназинметасультфатом. Смесь для определения активности содержит 0,1 мл печеночной фракции, 6 ммолей L-тирозина, 0,1 ммоль пиридоксальфосфата, 5 ммолей б-кетоглутаровой кислоты и 100 ммолей фосфатного буфера (рН=7,6), в общем объеме 3 мл, депротеинировали, добавляя 1,0 мл 20% фосфорной кислоты при t=-0 C (контроль) и после 20-минутной инкубации при t=-37 C (опыт). 1,0 мл депротеинированных смесей добавляли к 4 мл раствора феназинметасульфата рН=7,0. После 1 ч развития окраски при комнатной температуре в месте, защищенном от световых лучей, измеряли поглощение света на ФЭКе при длине волны 670нм, кювета толщиной 10,0 мм.

Активность фермента выражается в единицах (нмоли образовавшегося р-оксифенилпирувата/мин при условиях инкубации) на мг белка.

Расчет активности фермента:

Тканевая активность (мкмоль/мин на 1гр ткани):

А=10,25*а,

где а-мкмоль р-ОПФ в пробе,

10,25 - коэффициент, учитывающий разведение и перевод полученных данных в мкмоль на 1 г ткани печени за 1 мин.

Удельная активность (нмоль/мин на мг белка):

С=А/В,

где А-тканевая активность, мкмоль/мин на гр ткани,

В-количество мг белка на 1 г ткани печени.

3.2.3 Определение количества SH-групп в печени, почках, сердце и мозге крыс методом Фоломеева [18]

Количество сульфгидрильных групп определяли методом Фоломеева в модификации. Фотоколориметрический ультрамикрометод количественного определения сульфгидрильных групп белка и небелковых соединений.

Принцип метода:

Метод основан на эквивалентном взаимодействии молекулярного йода со свободными SH-группами белков и низкомолекулярных соединений в присутствии 3М KI, а также фосфатного буфера рН=7,6, при температуре среды более 20С. О количестве йода, прореагировавшего с SH-группами, судят по результатам сравнения опытной и контрольной проб на фотоэлектроколориметре (ФЭК).

Реактивы:

1. 3М KI (готовят перед опытом)

2. 5% раствор крахмала (готовят каждый день)

3. 0,1н раствор I2(готовят раз в неделю)

4. 0,001н раствор I2 (готовят из 0,1н раствора I: 0,1 мл 0,1н раствора I +9,9мл Н2О)

5. 0,14 М KCl фостфатный буфер рН=7,6

6. 7% ТХУ

Ход работы:

Определение общих сульфгидрильных групп:

К 0,1 мл супернатанта (20% гомогенат печени) добавляют 2мл 3М KI, 0,1 мл 5% раствора крахмала и 3 мл фосфатного буфера рН=7,6 (общий объем равен 5, 2 мл). Пробу перемешивают и в кювете с длиной оптического пути 10 мм и помещают в ФЭК против контрольной пробы. Стрелку гальванометра и шкалу экстинций устанавливают на нуле. Затем в пробу вносят 0,1 мл 0,001н раствора I2, тщательно перемешивают и колориметрируют через 10с после внесения йода в пробу. Длина волны 490нм. Контрольную пробу на реактивы колориметрируют аналогично. О количестве SH-групп в пробе судят по количеству йода (в эквивалентах), взаимодействующего с тиогруппами.

Расчет проводят по формуле:

Х=0,1*(Ек-Ео)/Ек,

где Х-количество SH-групп (в мкмоль)

0,1-количество йода, вносимого в пробу (в мкэкв)

Ек и Ео-экстинции соответственно контрольной и опытной проб

Определение SH-небелковых соединений

К 0,1 мл супернатанта (полученного из гомогената с добавлением 7% ТХУ в соотношении 1:1, после центрифугирования в течение 5 мин при 3000 об/мин) добавляют 2 мл 3М KI, 0,1 мл 5% раствора крахмала и 3 мл фосфатного буфера рН=7,6. Пробу перемешивают и в кювете с длинной оптического пути 10мм помещают в ФЭК против контрольной пробы. Стрелку гальванометра и шкалу экстинций устанавливают на нуле. Затем в пробу вносят 0,1 мл 0,001н раствора I2, тщательно перемешивают и колориметрируют через 10сек после внесения йода в пробу. Длина волны 490 нм.

Содержание SH-групп белков определяют по разнице концентраций общих и небелковых SH-групп.

3.3 Статистическая обработка результатов

Проверка нормальности распределения оценивалась по критерию Шапиро-Уилка. Учитывая нормальное распределение данных, для каждой группы рассчитывались средние значения и стандартные отклонения. Для оценки достоверности различий между группами использовался t-тест Стьюдента для независимых переменных [1].

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рис. 4. Содержание белковых SH-групп у контрольных животных 1 и 2 групп (*-р<0,05 по отношению к 1й группе).

Рис. 5. Содержание небелковых SH-групп у контрольных животных 1 и 2 групп.

Из рис. 4 видно, что содержание белковых SH-групп в контроле печени и почек высокоэмоциональных животных в 2,7 и в 2,2 раза соответственно выше, чем в контроле низкоэмоциональных животных. Таким образом, установлено различие в содержании белковых SH-групп в печени и почках крыс с различным эмоциональным статусом.

Реактивность к стрессу, стрессоустойчивость, являются основным критерием приспособленности и жизнеспособности при изменении условий обитания, в экстремальных ситуациях и при других стрессовых воздействиях.

Выявлено, что для «эмоциональных» крыс, отобранных в тесте “открытого поля”, характерно более высокое содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов в мозге, печени, сердце до и после стресса по Десидерато в сравнении с «неэмоциональными» животными. Устойчивость животных к эмоциональному стрессу зависит и от содержания в гипоталамусе отдельных олигопептидов, таких как в-эндорфин и вазопрессин. При этом показано, что у устойчивых к эмоциональному стрессу животных наблюдается более высокое содержание указанных олигопептидов, чем у предрасположенных к стрессу. Наиболее характерным признаком устойчивости животных к эмоциональному стрессу оказался высокий уровень содержания НА в гипоталамусе.

Показано, что не любые эмоции, а именно отрицательные эмоции пассивно-оборонительного характера приводят к развитию и /или усугублению течения патологических синдромов различного генеза. Выявлены генетические и индивидуальные различия в устойчивости к эмоциональному стрессу. Обнаружена связь между устойчивостью к эмоциональному стрессу и содержанием биогенных аминов и нейропептидов - субстанции Р, дельта-сон-индуцирующего пептида (DSIP), бета-эндорфина, пролактина и др. в различных структурах мозга. Установлено антистрессовое действие пептидов, показаны различия в устойчивости к эмоциональному стрессу у особей с индивидуально-типологическими особенностями поведения [11].

Содержание НА и А в различных отделах головного мозга снижается в состоянии страха. Выраженный феномен дефекации в ОП связан с низкой концентрацией НА в гипотоламусе. Снижение содержания НА в ЦНС приводит к увеличению эмоциональности у крыс. Реакция ярости характеризуется повышением содержания НА и А в гипоталамусе. Эмоциональная реактивность крыс зависит не только от нервной системы, но и от эндокринной. Так, увеличение содержания АКТГ повышает боязливость и снижает агрессивность у животных. Эмоциональность рассматривается как реакция страха и развивается в первую очередь благодаря активации холинэргических механизмов головного мозга [13].

Таблица 2. Содержание небелковых SH-групп в печени высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицерол
х±m (мкмоль на 1г тк)	12,23 ± 3,34	9,44 ± 4,16	11,11 ± 3,37	9,38 ± 3,04
n	9	6	6	6
100%	100	77	91	77
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05

Таблица 3. Содержание небелковых SH-групп в печени низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицерол
х±m (мкмоль на 1г тк)	12,15 ± 3,41	7,96 ± 2,13	10,15 ± 2,2	6,06 ± 2,4
n	6	6	6	6
100%	100	66	84	50
p		р<0,05	p>0,05	р<0,05

Рис. 6 Содержание небелковых SH-групп в печени крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Из таблицы 3 и рисунка 6 видно, что содержание небелковых SH-групп в печени 2й группы животных снижается при действии глицерола в 1,5 раза, а при совместном действии аргингина с глицеролом в 2 раза.

Введение глицерола, видимо, способствует развитию оксидативного стресса и образование свободных радикалов, активных форм кислорода и азота, и аткивацией ферментов антиоксидантной защиты. Введение крысам аргинина, вероятно, оказывало прооксидантное дейсвтие, на что указывает снижение небелковых SH-групп и может свидетельствовать об их окислении в процессе защиты от АФК и реакционно способных метаболитов.

Таблица 4. Содержание небелковых SH-групп в почках высокоэмоциональных животных

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицерол
х±m (мкмоль на 1г тк)	14,08 ± 4,65	9,87 ± 1,67	11,31 ±3,32	8,3 ± 2,61
n	9	6	6	6
100%	100	70	80	59
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05

Таблица 5. Содержание небелковых SH-групп в почках низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеол
х±m (мкмоль на 1г тк)	13,04 ± 3,67	10,71 ± 2,72	8,58 ± 2,66	7,37 ± 1,85
n	6	6	6	6
100%	100	82	66	57
p		p>0,05	р<0,05	р<0,05



Рис. 7 Содержание небелковых SH-групп в почках крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Из табл. 5 и рисунка 7 видно, что содержание небелковых SH-групп в почках 2й группы животных снижается в 1,5 раза при действии аргинина и в 1,8 раз при действии аргинина с глицеролом.

В последнее время показано, что введение аргинина может приводить к усилению синтеза NO в организме. Этот феномен известен как «аргининовый парадокс». Так, при выраженных воспалительных процессах, а также индукции соответствующей формы NO-синтазы и развитии оксидативного стресса, введение аргинина может не только не оказать терапевтического действия, но даже ухудшить состояние за счет гиперпродукции пероксинитрита и других токсичных реактивных форм азота.

Физиологические и токсические функции NO реализуются в результате сложных химических превращений, основными участниками которых являются переходные металлы, тиолы, кислород, супероксид и другие радикалы. При этом реализуются прямые и опосредованные другими активными формами азота пути действия NO [6].

Таблица 6. Содержание небелковых SH-групп в серце высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицерол
х±m (мкмоль на 1г тк)	9,41 ± 2,81	8,51 ± 3,95	11,53 ± 4,24	6,14 ± 2,21
n	9	6	6	6
100%	100	90	123	65
p		p>0,05	p>0,05	р<0,05

Таблица 7. Содержание небелковые SH-групп в сердце низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицерол
х±m (мкмоль на 1г тк)	10,41 ± 2,85	6,43 ± 3,5	5,67 ± 2,2	5,53 ± 2,95
n	6	6	6	6
100%	100	62	54	53
p		p>0,05	p<0,05	p<0,05

Рис. 8 Содержание небелковых SH-групп в сердце крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Как видно из рисунка 8 и табл. 6 и 7, содержание небелковых SH-групп в сердце 2 группы животных снижается при действии аргинина и совместном действии аргинина с глицеролом в 1,8 и 1,9 раз соответственно. Также отмечено снижение и в 1й группе животных при совместном действии аргинина и глицерола в 1,5 раза. Введение аргинина оказывает прооксидантное дейсвтие, что связано со снижение небелковых SH-групп и свидетельствует об их окислении. Совместное введение аргинина и глицерола еще более усиливает прооксидантный эффект.

Таблица 8. Содержание небелковых SH-групп в мозге высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицерол
х±m (мкмоль на 1г тк)	11,19 ± 4,74	9,39 ± 2,24	9,79 ± 4,04	6,89 ± 2,72
n	9	6	6	6
100%	100	84	87	62
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05

Таблица 9. Содержание небелковых SH-групп в мозге низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	11,56 ± 3,36	7,82 ± 2,95	6,22 ± 1,78	6,24 ± 4,0
n	6	6	6	6
100%	100	68	54	54
p		p>0,05	p<0,05	p<0,05

Рис. 9 Содержание небелковых SH-групп в мозге крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Как видно из табл. 9 и рисунка 9, содержание небелковых SH-групп в мозге 2й группы животных снижается под действием аргинина и совместном действии аргинина с глицеролом в 1,9 раз. Снижение небелковых SH-групп, вероятно, связано с их окисленим и образованием окисленнях S-S соединений, а также их включение в окислительные реакции. Небелковые тиолы оказывают в этих условиях антиоксидантные свойства, восстанавливая различные окисленные субстраты.

Аргинин - субстрат NO-синтаз, и известны антиоксидантные свойства NO в связи с его способностью связываться с гемом и тем самым ограничивать его прооксидантный эффект. Поэтому при предварительном введение аргинина ожидалось снижение проокислительных эффектов глицерола (в этом случае введение аргинина перед глицеролом должно было бы нормализовать или хотя бы уменьшить эффекты глицерола). Этого не было обнаружено, а, напротив, было выявлено действие аргинина, подобное глицеролу (снижение небелковых тиогрупп). Введение аргинина, вероятно, оказывает прооксидантное дейсвтие, на что указывает снижение небелковых SH-групп и свидетельствует об их окислении. Это связано, вероятно, с высокой продукцией пероксинитрита. В данной работе использовались не физиологические дозы аргинина и, вероятно, по этому его введение не только не оказало терапевтического действия, но даже ухудшило состояние за счет гиперпродукции пероксинитрита и других токсичных реактивных форм азота.

Таблица 10. Содержание белковых SH-групп в печени высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	13,48 ± 3,06	12,87 ± 2,74	10,63 ± 5,7	11,29 ± 4,28
n	7	6	5	5
100%	100	95	79	84
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05

Таблица 11. Содержание белковых SH-групп в печени низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	4,93 ± 1,9	10,45 ± 4,82	16,19 ± 3,94	15,64 ± 3,85
n	4	6	4	4
100%	100	212	328	317
p		р<0,05	р<0,05	р<0,05

Рис. 10. Содержание белковых SH-групп в печени крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Из рисунка 10 и табл. 11 видно, что содержание белковых SH-групп в печени 2й группы животных повышается при введении глицерола, аргинина и аргинина с глицеролом в 2,1, 3,3 и 3,2 раза соответственно. Повышение белковых SH- групп в печени может быть связано с адаптивным синтезом SH-cодержащих белков, таких как металлотионеины, что может происходить при поступлении в организм металлов и увеличении в крови глюкокортикоидов.

Таблица 12. Содержание белковых SH-групп в почках высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	9,69 ± 5,05	11,57 ± 3,54	9,65 ± 3,04	9,13 ± 5,77
n	6	6	5	3
100%	100	119	100	94
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05

Таблица 13. Содержание белковых SH-групп в почках низкоэмоциональных животных

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	4,38 ± 1,19	11,48 ± 6,46	12,92 ± 4,16	10,16 ± 4,95
n	4	6	6	6
100%	100	127	143	113
p		р<0,05	р<0,05	р<0,05

Рис. 11. Содержание белковых SH-групп в почках крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Как видно из табл. 13 и рисунка 11, содержание белковых SH-групп в почках крыс 2й группы повышается при действии глицерола, аргинина и совместном действии аргинина и глицерола в 2,6, 2,9 и 2,3 раза соответственно. Повышение содержания белковых SH-групп в почках может свидетельствовать об интенсивном синтезе SH-содержащих белков.

Таблица 14. Содержание белковых SH-групп в сердце высокоэмоциональных животных

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	15,61 ± 8,19	11,42 ± 3,51	9,34 ± 4,01	12,57 ± 3,18
n	8	6	6	4
100%	100	73	60	81
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05

Таблица 15. Содержание белковых SH-групп в сердце низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	10,85 ± 4,54	17,42 ± 4,42	15,98 ± 4,22	11,27 ± 4,14
n	5	6	5	5
100%	100	161	147	104
p		р<0,05	p>0,05	p>0,05

Рис. 12. Содержание белковых SH-групп в сердце крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Из табл. 15 и рисунка 12 видно, что содержание белковых SH-групп в сердце 2й группы животных увеличивается при действии глицерола в 1,6 раз. Это повышение может быть связано с интенсивным синтезом в серце низкоэмоциональных крыс SH-содержащих белков, которое происходит при большом поступлении глюкокортикоидов, так как они оказывают значительное стимулирующее влияние на функции миокарда, и повышают системное кровяное давление. Глюкокортикоиды способствуют гипертрофии миокарда при длительном воздействии, так как активируют синтез белка и нуклеиновых кислот в сердечной мышце. Суммарный эффект гормонов стресса на сердечно-сосудистую систему приводит к стимуляции ее гиперфункции, ускорению транспорта крови, а значит -- кислорода и субстратов.

Таблица 16. Содержание белковых SH-групп в мозге высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	12,31 ± 3,28	10,47 ± 1,43	10,82 ± 4,44	3,73 ± 1,31
n	7	6	6	4
100%	100	85	88	30
p		p>0,05	p>0,05	р<0,05

Таблица 17. Содержание белковых SH-групп в мозге низкоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m (мкмоль на 1г тк)	13,02 ± 6,08	14,73 ± 5,98	11,19 ± 8,66	4,12 ± 2,62
n	3	6	5	4
100%	100	113	86	32
p		p>0,05	p>0,05	p>0,05



Рис. 13. Содержание белковых SH-групп в мозге крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Как видно из табл. 17 и рисунка 13, содержание белковых SH-групп в мозге снижается при совместном действии аргинина и глицерола в 1й группе животных в 3,3 раза. Совместное введение этих веществ влияет на SH-cодержащие белковые молекулы, которые могут окисляться и образовывать S-S соединения. Окисление SH-групп белков сопровождается изменением их структуры, свойств и каталитической активности, и таким образом наблюдается падение содержания белковых SH-групп.

На основании полученных данных видно, что влияние введения глицерола и аргинина на содержание небелковых и белковых тиолов более выражено у животных 2й группы.

Таблица 18. Активность ТАТ высокоэмоциональных животных.

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m нмоль р-ОФП/мин на 1 мг белка	22,91 ± 6,34	9,18 ± 7,28	5,33 ± 1,39	8,84 ± 2,81
n	9	6	6	6
100%	100	40	23	39
p		р<0,05	р<0,05	р<0,05

Таблица 19. Активность ТАТ низкоэмоциональных животных

	Контроль	Глицерол	Аргинин	Аргинин+глицеpол
х±m нмоль р-ОФП/мин на 1 мг белка	21,94 ± 9,93	6,32 ± 5,31	3,29 ± 1,79	16,46 ± 6,19
n	5	6	6	6
100%	100	29	15	75
p		р<0,05	р<0,05	p>0,05

Рис. 14. Активность тирозинаминотрансферазы в печени крыс при введении глицерола и аргинина (*-р<0,05 по отношению к контролю).

Как видно из табл. 18, 19 и рисунка 14, активность TAT понижается под действием глицерола в 1й и 2й группе животных в 2,4 и 3,5 раза соответственно. При действии аргинина активность снижается в 4,3 и 6,7 раз. Совместное действие аргинина и глицерола привело к снижению активности ТАТ в 1й группе животных в 2,6 раз, в то время как во 2й группе не было достоверного снижения активности фермента.

Снижение активности ТАТ может быть вызвано деградацией фермента, обусловленной АФК и азота при оксидативном стрессе, вызванном введением глицерола, блокированием его синтеза путем влиянием на экспрессию генов NO (подавление репликации ДНК и уменьшение содержания мРНК) или изменением каталитической активности, вызванной свободными радикалами. Использование нефизиологических концентраций аргинина обуславливает способность NO выступать в качестве токсического агента и, возможно, влиять на активность и синтез ТАТ. Оксид азота вызывает также ингибирование связывающей способности глюкокортикоидных рецепторов и может, таким образом, препятствовать экспрессии гена ТАТ.

NO и супероксид-анион подвергаются быстрому радикал-радикальному взаимодействию с образованием медиатора окислительного клеточного повреждения - пероксинитрита. Пероксинитрит вызывает повреждение белков и липидов клеточных мембран, что может способствовать утечке ТАТ из клетки. При этом NO легко проходит через внешнюю и внутреннюю мембраны клеток и, оказавшись внутри клетки, он повреждает ДНК клетки-мишени путем ее дезаминирования, а также ингибировать рибонуклеотидредуктазу, которая регулирует скорость репликации ДНК. Это и объясняет цитотоксическое действие NO на клетку-мишень [6].

ВЫВОДЫ

1. Выявлены базовые различия в содержании белковых SH-групп у крыс с различным эмоциональным статусом: у низкоэмоциональных животных этот показатель ниже, чем у высокоэмоциональных, в печени и почках.

2. Введение глицерола вызывало снижение содержания небелковых SH-групп в печени низкоэмоциональных животных.

3. Введение аргинина вызывало снижение содержания небелковых SH-групп в почках, сердце и мозге низкоэмоциональных крыс.

4. Совместное введение аргинина и глицерола вызывало снижение содержания небелковых SH-групп во всех исследуемых органах низкоэмоциональных и в сердце высокоэмоциональных крыс.

5. Введение глицерола вызывало увеличение содержания белковых SH-групп в печени, почках и сердце, а введение аргинина вызывало аналогичный эффект в печени и почках низкоэмоциональных крыс.

6. Совместное введение аргинина и глицерола вызывало снижение содержания бекловых SH-групп в мозге высокоэмоциональных животных.

7. Введение глицерола и аргинина вызывало снижение активности тирозинаминотрансферазы у животных обеих групп, при этом, совместное введение аргинина и глицерола вызывало снижение активности тирозинаминотрансферазы у животных 1й группы.

8. В исследованный нами срок более выраженные изменения изучаемых показателей при введении глицерола и аргинина были выявлены у низкоэмоциональных животных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атраментова Л.О., Утевська О.М. Статистичнi методи в бiологii: пiдручник. - Х: ХНУ iменi Каразiна, 2007.- 288с.

2. Березуцький В.В. Науково-практичний коментар до Закону України про охорону праці.-Х.Вид-во Форт.-2009.-379.

3. Висвесваран П., Гунтупалли Я. Чрезвычайные воздействия окружающей среды. Рабдомиолиз// Клинические лекции по медицине критических состояний.-1999.- Том 15, № 2.

4. Гаджиев В. Г. Изучение гормональной регуляции и тканеспецифической экспрессии гена тирозинаминотрансферазы у крыс: Автореф. дис. канд. біол. наук. - Москва, 1992. - 150с.

5. Горчакова Н.А., Гудивок Я.С., Гунина Л.М. под общ. ред. Олейника С.А., Гуниной Л.М., Сейфуллы Р.Д Фармакология спорта.- К.: Олимп.-л-ра, 2010.

6. Дмитриенко Н.П., Кишко Т.О., Шандренко С.Г. Аргинин: биологическое действие, влияние на синтез оксида азота.// Украинский химиотерапевтический журнал. -- 2008.-№2. -22c.

7. ДНК участок GRE: Расположение. [Электронный ресурс]

Режим доступа: http://humbio.ru/humbio/endocrinology/0010ed72.htm#000b0833.htm

8. Дорожко Е. В. Определение некоторых тиоловых соединений в биологических объектах методом вольтамперометрии: Автореф. дис. на соискание ученой степени кандидата химических наук. - Томск, 2010. - 22с.

9. Инструкция по охране труда №69 при эксплуатации лабораторных центрифуг; утв. приказом ректора университета 25.02.2008г. № 0108-4/117.

10. Инструкция по охране труда №71 при выполнении работ в лабораторіях биологического профиля; утв. приказом ректора университета 25.02.2008г. № 0108-4/117.

11. Исмайлова, Х. Ю., Агаев, Т. М., Семенова, Т. П. Индивидуальные особенности поведения: (моноаминергические механизмы). - Баку: «Нурлан», 2007. - 228 с.

12. Костюшов В.В., Костюшова Л.А., Тымчишин О.Л., Костюшова Н.В., Ратушненко В.А. Феномен высвобождения небелковых SH-групп при взаимодействии белков острой фазы сыворотки крови с антисыворотками и его диагностическое значение [Электронный ресурс]: Центральный военный клинический госпиталь, г. Одесса.

Режим доступа: http://www.ecologylife.ru/ekologiya-goroda/page/6

13. Кулагин Д.А. Болондинский В.К. Нейрохимические аспекты эмоциональной реактивности и двигательной активности крыс в новой обстановке// Успехи физиологических наук. -1986.-Том 17; №1.-92.

14. Лабораторная крыса (справочний материал)// Лабораторные животные.-1993. -Т.3.

15. Морозов И.В., Смагулова Ф.О., Сотникова Н.В., Мертвецов Н.П. Нуклеотидная последовательность гена ТАТ крысы. Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН. Биоорганичиская химия, 1999.- Том 25, №4.-312-320с.

16. Морозов И. В. Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Новосибирск, 1998. - 132 с.

17. Органическая химия. [Электронный ресурс]: Серосодержащие соединения.

Режим доступа: http://www.chemistry.ru/course/content/chapter12/section/paragraph4/subparagraph8.html

18. Охрименко С. М., Гурьева Н. Ю., Калиман П. А. // Вісник ХНУ. Серія: Біологія. -2005. - № 1-2. - 56-60c.

19. Подковкин В.Г., Иванов Д.Г. Изменение показателей метаболизма коллагена у крыс с различным эмоциональным статусом при остром стрессе// Успехи современного естествознания. - 2008. - № 11. - 17-21с.

20. Правила безпечної роботи з хімічними речовинами у вищих та середніх спеціалізованих навчальних закладах, на підприємствах і в установах систем Держосвіти СРСР (НПАОП 80.0-1.01-89), наказ від 13.10.89р. Держосвіти СРСР.

21. Северин Е.С. Биохимия: Учеб. для вузов, 2003.- 779 с.

22. Сера. [Электронный ресурс]: Столица-Медикл

Режим доступа: http://smed.ru/guides/190/#article

23. Солопов В.Н., Резников И.И., Чучалин А.Г. Роль серосодержащих соединений в патогенезе и лечении хронических неспецифических заболеваний легких. // «Клиническая медицина».- 1988.- №6.- 60-63с.

24. Торчинский Ю. М., Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков.- М.: Изд-во «Наука», 1971.-225с.

25. Филимоненко В. П., Никитченко И. В., Калиман П. А. // Укр. бiохім. журн.-2009. - 81, № 1. - 34-43с.

26. Химия органических соединений серы, под ред. Л. И. Беленького.- М.: Мир, 1988.-320с.

27. Чарыева, Г. Х. Индукция тирозинаминотрансферазы печени при гипертермии: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Ашхабад, 1985. - 160с.

28. Чугасова В. Антиоксиданты природные и синтезированные. [Электронный ресурс]: Cosmetics & Medicine.

Режим доступа: http://www.cmjournal.com/rp326.htm

29. Boshart M., Falk Weih F., Schmidt A., Fournier K., Schьtz G. A cyclic AMP response element mediates repression of tyrosine aminotransferase gene transcription by the tissue-specific extinguisher locus Tse-1// Cell.-1990. - V.61.-P. 905-916.

30. Brumback, R.A., Feeback, D.L., and Leech, R.W. Rhabdomyolysis in childhood. // Paediatric Neurology. - 1992. - V.39, №4. - Р. 821-858.

31. Fujimoto S. S., Fujino M., Matsuda K., Maeda M., Ohira H., Kawasaki K., Tamaki N. Mechanism of liver tyrosine aminotransferase increase in ethanol-treated mice and its effect on serum tyrosine level// Journal of Nutritional Science and Vitaminology.-2007.-V.53;№6.-P.489-95 [Abstract].

32. Goldman L., Ausiello D. Rabdomyolysis// Cecil Medicine.-2007.-V.23; chap 114.

33. Holt S., Moore K. Pathogenesis of renal failure in rhabdomyolysis: The role of myoglobin // Exp. Nephrol. -- 2000. -- Vol. 8. -- P. 72-76.

34. Jackson M. J., Jones D.A., Edwards R.H.T. Experimental skeletal muscle damage: the nature of the calcium activated degenerative processes// Eur J Clin Invest.-1984.-V. 14.-P. 369-374.

35. Kakulas B.A., Mastaglia, F.L. Drug-induced, toxic and nutritional myopathies//Skeletal Muscle Pathology.-1992.-2ed. - P. 511-540.

36. Knochel, J.P. Hypophosphataemia and rhabdomyolysis// J Clin Invest.-1992.-V.5.- P. 455-457.

37. Knochel, J.P. Mechanisms of rhabdomyolysis. Current Opinion in Rheumatology// J Clin Invest.-1993.-V.5.- P.725-731.

38. Mehere P., Han Q., Lemkul J.A., Vavricka C.J., Robinson H., Bevan D.R., Li J. Tyrosine aminotransferase: biochemical and structural properties and molecular dynamics simulations// Protein Cell.- 2010.- V.11.-P.1023-32.

39. Miller M.S., Wogan G.N. Inhibition of steroid-inducible tyrosine aminotransferase gene expression by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in a rat hepatoma cell line// Carcinogenesis. -1986.-V.8.-P.1273-8 [Abstract].

40. Morel Yannick, Barouki Robert. Repression of gene expression by oxidative stress// Biochem. J.- 1999.- V.342. Pt 3. - P.481-496 [Abstract].

41. Patsoukis Nikolaos, Papapostolou Ioannis, Zervoudakis George, Georgiou Christos D., Matsokis Nikolaos A., Panagopoulos Nikolaos. Thiol redox state and oxidative stress in midbrain and striatum of weaver mutant mice, a genetic model of nigrostriatal dopamine deficiency// Neuroscience Letters.-2005.-V. 376, Issue 1.- P. 24-28 [Abstract].

42. Penn A.S. Myoglobinuria// West J Med. 1986.-V. 2. - P.1785-1805 [Abstract].

43. Poels P.J.E., Gabreлls F.J.M. Rhabdomyolysis// Clin Neurol & Neurosurg.-1993.- V.95, Issue 3.-P.175-192.

44. Shelly L. L., Tynan W., Schmid W., Schtitz G., Yeoh G. C. T. Hepatocyte Differentiation In Vitro: Initiation of Tyrosine Aminotransferase Expression in Cultured Fetal Rat Hepatocytes// The Journal of Cell Biology.-1989.- V. 109, Issue 6.-P. 3403-3410.

45. Shenton D., Smirnova J.B., Selley J.N., Carroll K. Hubbard S. J., Pavitt G.D., Ashe M.P., Grant C.M. Global Translational Responses to Oxidative Stress Impact upon Multiple Levels of Protein Synthesis//The journal of biological chemistry.-2006.-V. 281, № 39.- Р. 29011-29021.

46. Sivaraman S., Kirsch J.F. The narrow substrate specificity of human tyrosine aminotransferase-the enzyme deficient in tyrosinemia type II // FEBS J.-2006.-V.27, №9.-Р.1920-9.

47. Steinberg R. A., Levinson B.B. , Tomkins G. M. “Superinduction” of tyrosine aminotransferase by actinomycin D: a reevaluation // Cell.-1975.-V.5, № 1.-Р.29-35 [Abstract].

48. Wellingera R., Guigoz Yves. The effect of age on the induction of tyrosine aminotransferase and tryptophan oxygenase genes by physiological stress// Mech Ageing Dev.-1986.-V.34, № 2.- Р. 203-17[Abstract].

49. Woodrow G., Brownjohn A.M., Turney J.H. The clinical and biochemical features of acute renal failure due to rhabdomyolysis // Renal Fail. -- 1995. -- Vol. 17. -- P. 467-474.

50. Zager R.A. Rhabdomyolysis and myohemoglobinuric acute renal failure// Kidney International.-1996.-V.49.- Р. 314-326.

Размещено на Allbest.ru