Прокариоты. Патогенные микроорганизмы воздуха. Антибиотики микробного происхождения

Размещено на http://www.allbest.ru

Прокариоты

Морфология риккетсий и хламидий, характеристика, рисунок

Ответ: Прокариоты (лат. Procaryota, от др.-греч. рсп «ядро»), или доядерные -- одноклеточные живые организмы, не обладающие оформленным клеточным ядром и другими внутренними мембранными органоидами.

Клеточное ядро у прокариот отсутствует, ДНК находится во внутренней части клетки, где поддерживается белками и упорядоченно свернута. Весь этот белковый ДНК комплекс именуется нуклеоид, он и выполняет функции ядра. В клетках прокариотов отсутствуют постоянные одномембранные и двумембранные органоиды: митохондрии и пластиды, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть. Все их функции исполняют складки из плазматической мембраны - мезосомы. Сверху клеточной стенки очень часто встречается слизистая капсула. Свободное пространство между клеточной стенкой и мембраной является резервуаром протонов при аэробном дыхании и фотосинтезе. У бактерий, которые двигаются, имеются жгутики, основанием которых служит белки флагеллины.

Размножение прокариот может происходить бесполым (вегетативным) способом, путем дробления (деления) клеток или с помощью спор (конидий). В искусственных условиях (ограниченный объем питательной среды) размножение бактерий происходит по 4-м фазам - лаг-фаза, фаза экспоненциального роста, стационарная фаза и фаза отмирания.

Некоторые виды могут размножаться с помощью полового процесса (конъюгация). В процессе конъюгации одна клетка передает имеющуюся генетическую информацию к другой клетке, но увеличение числа особей при этом не происходит.



	Реккетсии (лат. Rickettsiae)	Хламидии (лат. Chlamydia)
	Риккетсии- семейство бактерий внутриклеточных паразитов. Названы по имени X. Т. Риккетса (1871--1910), в 1909 году впервые описавшего возбудителя пятнистой лихорадки Скалистых гор.	Хламидии -- род бактерий, виды которого относятся к облигатным внутриклеточным паразитам.
Морфология	Представители семейства Rickettsia представлены полиморфными, чаще кокковидными или палочковидными, неподвижными клетками. Грамотрицательны. В оптимальных условиях клетки риккетсий имеют форму коротких палочек размером в среднем 0,2--0,6 Ч 0,4--2,0 мкм, что сравнимо с размерами наиболее крупных вирусов (около 0,3 мкм).	Хламидии имеют округлую форму, диаметр 250--350 нм, размножаются внутриклеточно, как вирусы, культивируются в куриных эмбрионах, в организме белых мышей, в перевиваемых клеточных культурах.
Жизненный цикл	Жизненный цикл риккетсий имеет две стадии : - В вегетативной стадии микроорганизмы представлены палочковидными, бинарно делящимися и подвижными клетками. - Покоящиеся формы риккетсий -- сферические и неподвижные клетки, располагающиеся в клетках членистоногих и теплокровных.	Многие исследователи полагают, что хламидий отличают от других возбудителей инфекционных заболеваний уникальный жизненный цикл. Ее жизненный цикл существенно отличается от жизненного цикла бактерий: совокупность двух фаз -- внутриклеточного развития и внеклеточного существования и составляет жизненный цикл хламидий.
Биологические свойства	Риккетсий слабоустойчивы во внешней среде, быстро погибают при высоких температурах и под воздействием обычных дезинфицирующих средств. К низким температурам резистентны (долго сохраняют вирулентность в лиофилизированном состоянии при --20...--70 °С). Резистентны к сульфаниламидным препаратам и чувствительны к антибиотикам тетра-циклинового ряда.	Хламидии обладают гемагглютинирующей и токсической активностью, относительно устойчивы во внешней среде: при комнатной температуре сохраняются в течение нескольких суток, обычные дезрастворы убивают их в течение 3 часов. Чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам, фторхинолонам. Главные хозяева хламидий - человек, млекопитающие, птицы.
Рисунок	Продольный срез вегетативной (слева) и покоящейся (справа) форм риккетсий.	Chlamydia trachomatis

Рост и размножение бактерий

Ответ: Бактерии - (греч. bakterion -- палочка), большая группа микроскопических, преимущественно одноклеточных организмов, обладающих клеточной стенкой, содержащих много дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), имеющих примитивное ядро, лишённое видимых хромосом и оболочки, не содержащих, как правило, хлорофилла и пластид, размножающихся поперечным делением.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные -- путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра -- нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа:

Инициация,

Элонгация,

Терминация.

Размножение бактерий на плотной питательной среде.

Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений.

Меланины наряду с каталазой, супероксиддисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде.

Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру -- периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура --непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз:

I - исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается.

II - лаг-фаза, или фаза задержки размножения, характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой. Две первые фазы можно назвать пери одом адаптации бактериальной популяции, продолжительность кото рого определяется возрастом культуры, а также количеством и каче ством питательной среды.

III - лог-фаза, или логарифмическая (экспоненциальная) фаза, отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколько часов.

IV - фаза отрицательного ускорения характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода.

V - максимальная стационарная фаза характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток

VI - фаза логарифмической гибели бактерий происходит в постоянной скоростью и сменяется VII-VIII фазами уменьшения скорости отмирания клеток.



Микрофлора воздушной среды, количественный и качественный состав, методы исследования. Патогенные микроорганизмы воздуха. Источники контаминации воздуха аптечных учреждений

Ответ:

Воздух - неблагоприятная среда для микроорганизмов. Он не является средой постоянного обитания, а только временного нахождения или переноса микроорганизмов. В воздухе нет питательных веществ, постоянной оптимальной температуры, часто отсутствует влага, губительно действуют на микробы солнечные лучи. Микроорганизмы попадают в воздух главным образом с пылью или каплями жидкости с поверхности почвы, растений, животных, транспорта, водной поверхности. Микробы в воздухе распространены неравномерно. Количественный и качественный состав микрофлоры воздуха находится в прямой зависимости от микрофлоры почвы, над которой берут пробу воздуха.

Количество микроорганизмов зависит от:

- погоды (в дождливую их меньше, чем в сухую);

- времени года (летом их больше, чем зимой);

- места взятия пробы (над крупными населенными пунктами микробов больше, чем над сельской местностью).

Микроорганизмов мало в воздухе над лесами, садами, лугами, озёрами, океаном, высоко в горах и на севере.

Микрофлора воздуха характеризуется наличием большого количества шаровидных бактерий (микрококков, диплококков, сарцин, стафилококков), устойчивых к недостатку влаги и ультрафиолетовым лучам и образующих разноцветные пигментированные колонии на питательной среде, встречаются также палочковидные формы и плесневые грибы.

За сутки через легкие человека проходит 12-14 тыс. литров воздуха. Воздушным путем распространяются возбудители гриппа, туберкулёза, оспы, пневмонии, коклюша, ангины, катара верхних дыхательных путей и др.

Количественный состав микрофлоры воздуха.

Посев микроорганизмов из воздуха. (Р. Кох)

Метод заключается в том, что чашку Петри с мясопептонным агаром открывают в исследуемом помещении на 5 мин, после чего закрывают крышкой, оборачивают бумагой, переворачивают вверх дном во избежание размыва колоний конденсационной водой, подписывают и помещают в термостат при 28-30 єС для выращивания микробов, которые оседают на питательную среду вместе с пылью. По количеству выросших колоний можно судить о степени загрязненности воздуха микроорганизмами.. Количественный учёт микроорганизмов в воздухе. Р. Кох экспериментально установил, что за 5 мин на поверхность 100 см2 оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л, или

0,01 м3 воздуха.

Рассчитывают, сколько микробов содержится в 1 м3 воздуха над открытой при посеве чашкой Петри с МПА.

Для этого:

1. Через 5-7 дней после посева подсчитывают число выросших в чашке колоний (n). Колония - это потомство одной микробной клетки на питательной среде.

2. Узнают площадь чашки Петри, для чего измеряют диаметр внутренней чашки со средой (5 см2) и рассчитывают по формуле:

S чашки Петри = р r2 = 3,14*52 = 78,5 см2.

3. Определяют число микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Зная, сколько микробов выросло на площади 78,5 см2, можно пересчитать, сколько их было бы на 100 см2, а это, по методике Коха, соответствует их содержанию в 0,01 м3, значит в 1 м3 их должно быть в 100 раз больше. Рассчитывают число микроорганизмов в 1 м3 воздуха.

Воздух считается загрязнённым, если в 1 м3 более 4,5 тыс. микроорганизмов.

Качественный состав микрофлоры воздуха.

Под качественным анализом микрофлоры понимается описание культуральных и морфологических признаков микроорганизмов, что служит основой для определения их видовой принадлежности.

Культуральные признаки - это внешний вид колоний при выращивании на различных питательных средах. К культуральным признакам колонии относятся:

1) размер - крупные (диаметр 4-6 мм и более), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и точечные (не более 1 мм) колонии;

2) форма - круглая, овальная, неправильная, амёбовидная, ветвистая, ризоидная и др.;

3) цвет - белый, розовый, жёлтый, оранжевый, красный и др.;

4) профиль или рельеф - плоский, выпуклый, кратеровидный, конусовидный, изогнутый и др.;

5) поверхность - блестящая, матовая, морщинистая, гладкая и др.;

6) консистенция - жидкая, вязкая, пастообразная, сухая, плотная и др. (устанавливается прикосновением к поверхности колонии бактериологической петлей);

7) край - ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый и др. (рассматривают, пользуясь лупой или под микроскопом).

Количественный и особенно качественный состав микрофлоры воздуха является санитарным показателем степени загрязнения воздушной среды.

Методы исследования:

Метод, основанный на принципе ударного действия воздушной струи.

Предложен ряд аппаратов для исследования воздуха методом ударной струи. Аппарат, сконструированный советским ученым Ю. А. Кротовым, имеет преимущество перед другими.

Аппарат Кротова смонтирован в одном ящике и состоит из трех частей:

1) узла для отбора проб воздуха;

2) микроманометра;

3) питающего механизма, размещенного в деревянном футляре.

Прибор можно подключить как на 127 V, так и на 220 V, и при помощи специального переключателя и реостата регулировать скорость проходящей через прибор струи воздуха. При помощи аппарата Кротова в течение 1 минуты можно пропустить от 25 до 50 л воздуха. Механизм действия аппарата Кротова заключается в следующем. Исследуемый воздух при помощи центробежного вентилятора, вращающегося со скоростью 4000-- 5000 оборотов в минуту, энергично, засасывается через щель крышки прибора и ударяется о поверхность открытой чашки Гейденрейха, залитой питательным агаром и установленной на диске малой крыльчатки. Содержащиеся в воздухе микроорганизмы оседают на питательном агаре чашки Гейденрейха.

Седиментационный метод

Седиментационный метод является наиболее простым методом для изучения микрофлоры воздуха, хотя не обладает большой точностью.

Если применять чашки одного диаметра при одном сроке экспозиции, то этот метод может быть использован для получения сравнительных данных по бактериальному загрязнению воздуха. Техника этого метода заключается в следующем. Чашки Гейденрейха--Петри с застывшим агаром выставляют в открытом виде на разных высотах в помещении на различные сроки (от 15 минут до 1,5 часов). Затем чашки закрывают и ставят в термостат. Инкубацию посевов производят по методике, описанной выше.

Для пересчета количества микробов на 1 м3 пользуются формулой

В. Л. Омелянского, который считал, что в течение 10-минутной экспозиции на поверхность плотной питательной среды 100 см2 оседает столько микробов, сколько их находится в 10 л воздуха. Им была составлена соответствующая таблица расчета, пользуясь которой можно высчитать общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха. В этой таблице даны постоянные множители, на которые надо умножить полученные количества колоний в зависимости от диаметра и площади чашки, где производится посев.

Расчет числа микробов в 1 м3 воздуха (по Омелянскому)

Диаметр чашки в см	Площадь чашки в см2	Множитель расчета числа микробов в 1 м3 воздуха
8	50	100
9	63	80
10	78	60
11	95	50
12	113	45

прокариот патогенный микроорганизм

Пример. На чашке площадью 63 см2 выросло 25 колоний. Количество микробов в 1 м3 воздуха в данном случае равно 25X80 = 2000.

Патогенные микроорганизмы

Это микроорганизмы, которые вызывают болезни человека, животных, растений.

Болезнетворные микробы попадают в воздух из почвы и с выделениями больных людей и животных. В воздухе могут находиться определенное время возбудители вирусных инфекций, а также туберкулеза, сибирской язвы, столбняка и др. Аэрогенным путем передаются болезни вирусной этиологии. Распространяясь очень быстро, они поражают большое количество людей и животных.

Люди и животные, пораженные инфекцией дыхательных путей, при чихании, кашле выделяют в воздух множество капелек жидкости, в которых содержатся патогенные микробы. Мельчайшие из этих капель часами могут удерживаться в воздухе во взвешенном состоянии и переноситься с потоком воздуха на большие расстояния

Санитарно-показательные микроорганизмы используют в основном для косвенного определения возможного присутствия в объектах окружающей среды патогенных микроорганизмов. Их наличие свидетельствует о загрязнении объекта выделениями человека и животных, так как они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь выделения в окружающую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы кишечной палочки - (в группу входят сходные по свойствам бактерии родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс. Возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитающими на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, выделяющимися в окружающую среду (при кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки.

Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным требованиям:

должны обитать только в организме людей или животных и постоянно обнаруживаться в их выделениях;

не должны размножаться или обитать в почве и воде;

сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из организма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патогенных микробов;

методы их обнаружения и идентификации должны быть простыми, методически и экономически доступными;

должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем патогенные микроорганизмы;

в окружающей среде не должно быть близко сходных обитателей - микроорганизмов.

Факторы,способствующие микробному загрязнению воздуха помещений:

1.Отсутствие эффективной вентиляции.

2. Скученность людей.

3. Наличие больных и бациллоносителей среди персонала и покупателей в аптечных учреждениях в период эпидемий.

4. Некачественная, сухая уборка.

Источники контаминации воздуха аптечных учреждений:

В закрытых помещениях вследствие эксплуатации газовых плит, отопительных агрегатов, дыхания людей, разложения пищевых отходов, синтетических веществ, которые применяются в быту, микроорганизмов качество воздуха значительно ниже, чем на улице. В условиях производства имеет место загрязнения воздуха пылью и химическими токсическими веществами, которые выделяются в ходе технологического процесса. В условиях фармацевтических предприятий -- это пыль лекарственных средств, летучие химические вещества и компоненты биопроизводств.

прокариот патогенный микроорганизм антибиотик

Антибиотики микробного происхождения, классификация, характеристика

Ответ: Антибиотики - это вещества растительного, животного или микробного происхождения, способные вызывать гибель или подавлять рост микроорганизмов.

Существует множество классификаций антибиотиков, в основе которых приняты во внимание те или иные свойства и признаки антибиотиков:

по химическому строению (бета-лактамные, аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, полимиксины и др.),

в зависимости от типа воздействия (бактерицидные и бактериостатические),

по спектру действия (широкого спектра, преимущественно действующие на грамположительные и грамотрицательные кокки или грамотрицательные палочки и др.),

по механизму действия на микробную клетку антибиотики делят на две группы:

1. антибиотики, нарушающие функцию стенки микробной клетки

(в основном воздействуют на биохимические реакции стенки микробной клетки.);

2.антибиотики, влияющие на синтез РНК и ДНК или белков в микробной клетке (влияют на обменные процессы в микробной клетке).

По происхождению, антибиотики подразделяют на группы:

Антибиотики, образуемые грибами и лишайниками. К этой группе относят пеннициллин, гризеофульвин, цефалосфорин, усниновая кслота.

Огромная группа организмов, принадлежащая к грибам (известно около 100 тыс. видов), образует более 2500 разнообразных антибиотических веществ, отдельные представители которых завоевали всеобщее признание в качестве лечебных средств. Основная же часть грибных антибиотиков не нашла еще практического применения главным образом в силу своей высокой токсичности.

Характеристика: Важнейшее значение имеют Антибиотики группы пенициллина, образуемые многими расами Penicillium notatum, P. chrysogenum и другими видами плесневых грибов. Пенициллин подавляет рост стафилококков в разведении 1 на 80 млн. и мало токсичен для человека и животных. Он разрушается энзимом пенициллиназой, образуемой некоторыми бактериями. Из молекулы пенициллина было получено её «ядро» (6-аминопенициллановая кислота), к которому затем химически присоединили различные радикалы. Так, были созданы новые «полусинтетические» пенициллины (метициллин, ампициллин и другие), не разрушаемые ценициллиназой и подавляющие некоторые штаммы бактерий, устойчивые к природному пенициллину.

Антибиотики, продуцируемые бактериями. Эта группа отличается способностью продуцировать антибиотики в большинстве своем сапрофитные бактерии, обитающие в почве. К этой группе относят колицин, грамицидин, пиоционин, субтилин, полимиксин.

Характеристика: Антибиотики из бактерий в химическом отношении более однородны и в подавляющем большинстве случаев относятся к полипептидам. В медицине используют тиротрицин и грамицидин С из Bacillus brevis, бацитрацин из Bac. subtilis и полимиксин из Bac. polymyxa. Низин, образуемый стрептококками, не применяют в медицине, но употребляют в пищевой промышленности в качестве антисептика, например при изготовлении консервов.

Антибиотики, подуцируемые актиномицетами. К этой группе относят стрептомицин, неомицин, канамицин, хлортетрациклин, хлорамфеникол, эритромицин, тилозин, нистатин.

Характеристика: Антибиотики из актиномицетов весьма разнообразны по химической природе, механизму действия и лечебным свойствам. Ещё в 1939 году российские микробиологи Николай Александрович Красильников и А. И. Кореняко описали антибиотик мицетин, образуемый одним из актиномицетов.

Антибиотики животного происхождения. К этой группе относят фитонциды в чистом виде (например: аллицин - из чеснока, рафанин - из семян редиса, иманин - из зверобоя.

Характеристика: Наиболее известны среди них: лизоцим, открытый английским учёным Александером Флемингом в 1922 году; это энзим -- полипептид сложного строения, который содержится вслезах, слюне, слизи носа, селезёнке, лёгких, яичном белке и др., подавляет рост сапрофитных бактерий, но слабо действует на болезнетворных микробов; интерферон -- также полипептид, играющий важную роль в защите организма от вирусных инфекций; образование его в организме можно повысить с помощью специальных веществ, называемых интерфероногенами.

Антибиотики синтетического происхождения. К этой группе относят антибиотики, полученные искусственно путем биосинтеза (сульфаниламиды, производные хинолонов, производные 8-оксихинолина, производные нитрофурана).

Характеристика: Механизм действия препаратов состоит в том, что они препятствуют усвоению микроорганизмами необходимого для их жизнедеятельности вещества - параамино-бензойной кислоты (ПАБК). С участием ПАБК в микробной клетке происходит синтез фолиевой кислоты и метионина, которые обеспечивают рост и развитие клеток (факторы роста). Сульфаниламиды имеют структурное сходство с ПАБК и способны задерживать синтез факторов роста, что приводит к нарушению развития микроорганизмов ( бактериостатический эффект).

Генная инженерия. Основные этапы создания генетических конструкций. Препараты, полученные с помощью генной инженерии, применяемые в медицине и фармации

Ответ: Генная инженерия (генетическая инженерия) - совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

Генная инженерия - составная часть современной биотехнологии, теоретической основой ее является молекулярная биология, генетика. Суть новой технологии заключается о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма (in vitro) с последующим внедрением созданных конструкций в живой организм. В результате достигается их включение и активность в данном организме и у его потомства. Возможности генной инженерии - генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение генно-инженерно-модифицированных (генетически модифицированных, трансгенных) организмов с новыми уникальными генетическими, биохимическими и физиологическими свойствами и признаками, делают это направление стратегическим.

С точки зрения методологии генная инженерия сочетает в себе фундаментальные принципы (генетика, клеточная теория, молекулярная биология, системная биология), достижения самых современных постгеномных наук: геномики, метаболомики, протеомики с реальными достижениями в прикладных направлениях: биомедицина, агробиотехнология, биоэнергетика, биофармакология, биоиндустрия и т.д.

Задачи и методы генной инженерии.

Хорошо известно, что традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, которые препятствуют получению новых пород животных, сортов растений или рас практически ценных микроорганизмов:

1. Отсутствие рекомбинации у неродственных видов. Между видами существуют жесткие барьеры, затрудняющие естественную рекомбинацию.

2. Невозможность управлять процессом рекомбинации в организме извне. Отсутствие гомологии между хромосомами приводит к неспособности сближаться и обмениваться отдельными участками (и генами) в процессе образования половых клеток. В результате становится невозможным перенос нужных генов и обеспечение оптимального сочетания в новом организме генов, полученных от разных родительских форм;

3. Невозможность точно задать признаки и свойства потомства, т.к. процесс рекомбинации - статистический.

Природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности генома организма, практически невозможно преодолеть методами классической селекции.

Технология получения генетически модифицированных организмов (ГМО) принципиально решает вопросы преодоления всех естественных и межвидовых рекомбинационных и репродуктивных барьеров. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Генная инженерия позволяет оперировать любыми генами, даже синтезированными искусственно или принадлежащими не родственным организмам, переносить их от одного вида к другому, комбинировать в произвольном порядке.

Технология включает несколько этапов создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для встраивания в организм.

3. Перенос вектора с конструкцией в модифицируемый организм-рецепиент.

4. Молекулярное клонирование.

5. Отбор ГМО.

Первый этап - синтез, выделение и идентификация целевых фрагментов ДНК или РНК и регуляторных элементов очень хорошо разработан и автоматизирован. Изолированный ген может быть также получен из фаговой библиотеки.

Второй этап - создание in vitro (в пробирке) генетической конструкции (трансгена), которая содержит один или несколько фрагментов ДНК (кодирующих последовательность аминокислот белков) в совокупности с регуляторными элементами (последние обеспечивают активность трансгенов в организме). Далее трансгены встраивают в ДНК вектора для клонирования, используя инструментарий генной инженерии - рестриктазы и лигазы. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии (1978 г.). Как правило, в качестве вектора используют плазмиды - небольшие кольцевые молекулы ДНК бактериального происхождения.

Третий этап - собственно «генетическая модификация» (трансформация), т.е. перенос конструкции «вектор - встроенная ДНК» в отдельные живые клетки. Введение готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных представляет собой сложную задачу, которая была решена после изучения особенностей внедрения чужеродной ДНК (вируса или бактерии) в генетический аппарат клетки. Процесс трансфекции был использован как принцип введения генетического материала в клетку.

Если трансформация прошла успешно, то после эффективной репликации из одной трансформированной клетки возникает множество дочерних клеток, содержащих искусственно созданную генетическую конструкцию. Основой для появления у организма нового признака служит биосинтез новых для организма белков - продуктов трансгена, например, растений - устойчивости к засухе или насекомым-вредителям у ГМ растений.

Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации ограничивается встраиванием рекомбинантной плазмиды с последующим отбором модифицированных потомков (клонов). Для высших многоклеточных организмов, например, растений, то обязательным является включение конструкции в ДНК хромосом или клеточных органелл (хлоропластов, митохондрий) с последующей регенерацией целого растения из отдельной изолированной клетки на питательных средах. В случае животных, клетки с измененным генотипом вводят в бластоциды суррогатной матери. Первые ГМ растения были получены в 1982 году учеными из Института растениеводства в Кельне и компании Monsanto.

Производство лекарственных препаратов.

Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка.

Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

Микроорганизмы после введения соответствующих генов становятся продуцентами ценных для медицины белков. В биореакторах на специальных питательных средах выращивают бактерии, грибы, дрожжи, продуцирующие антибиотики, ферменты, гормоны, витамины и другие биологически активные соединения.

Например, клетки кишечной палочки служат для продуцирования человеческого инсулина. До 1982 г. инсулин получали весьма трудоемким способом обеспечивали только 10 % больных сахарным диабетом - инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм.

Было показано, что полученный таким способом инсулин не содержит эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.

Кишечная палочка также производит соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.

Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.

Противовирусный препарат интерферон в организме человека вырабатывается в крайне незначительных количествах. После выявления аминокислотной последовательности интерферона ген был искусственно синтезирован и встроен в вектор, затем вектор ввели в клетки бактерии и получили штамм-продуцент интерферона.



Нестерильные лекарственные средства, определение. Источники, пути и признаки микробного загрязнения мягких лекарственных форм (мази, линименты, суппозитории)

Ответ: Одним из показателей качества лекарственного средства является уровень его микробной чистоты. По этому показателю все лекарственные средства делят на две категории:

- стерильные;

- нестерильные.

Стерильными называют препараты, в которых в соответствии с требованиями ГФ не допускается содержание жизнеспособных клеток микроорганизмов. Их доля составляет около 20 % от общего количества лекарственного средства. Нестерильными называют такие лекарственные средства, в которых допускается содержание живых микроорганизмов, количество и качественный состав которых зависит от вида и назначения продукции и нормируется соответствующей документацией. На долю нестерильных приходится около 80 % общего числа выпускаемых лекарственных средств. Микробиологические требования к качеству нестерильных лекарственных средств вырабатывались в связи с выявлением случаев заболевания людей в результате применения загрязненных препаратов.

Контаминация лекарственных препаратов может происходить как в процессе производства, так и в период использования, особенно часто в условиях клиники, где происходит их загрязнение госпитальными штаммами микроорганизмов, например, Pseudomonas aeruginosa. Под воздействием ферментов микроорганизмов при несоблюдении условий производства и хранения лекарственных препаратов может происходить их биодеградация, скорость которой определяется химическим составом лекарственного средства, присутствием в нем веществ, легко усвояемых микроорганизмами или обладающих биоцидной активностью, условиями среды.

Некоторые компоненты лекарственных препаратов (крахмал, желатин, каолин, магния трисиликат, алюминия гидроксид, ПАВ, белки) могут защищать микробные клетки от консервантов. На возможность развития процессов биодеградации влияет форма упаковки, которая должна предотвращать доступ контаминантов и контролировать влажность.

Основные нестерильные лекарственные формы:

настои, отвары;

настойки;

порошки;

таблетки;

мази;

капли;

растворы;

пленки и др.

Роль микроорганизмов-контаминантов лекарственных средств в патологии человека.

Основными отрицательными последствиями для больных при использовании препаратов, содержащих микроорганизмы, могут быть снижение или отсутствие терапевтического действия препарата, возникновение заболеваний, неблагоприятных побочных реакций, а также передача и распространение лекарственно устойчивых бактерий. Заболевания могут иметь инфекционную или неинфекционную природу. Заболевания неинфекционной природы могут быть обусловлены продуктами биоразрушения БАВ и микробными токсинами. Последние могут вызывать ток-сикоинфекции и интоксикации (токсикозы). Токсикоинфекции - это обширная группа острых кишечных заболеваний, которые развиваются после приема per os (через рот) лекарственных препаратов, обильно контамини-рованных патогенными и условно-патогенными бактериями, содержащими эндотоксины.

Токсикоинфекции являются полиэтиологическими, их могут вызывать различные микроорганизмы: энтеротоксигенные варианты кишечной палочки, протей, энтерококки, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, реже - бактерии родов Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas. Токсикозы обусловлены попаданием экзотоксинов некоторых бактерий (S. aureus, С. botulinum), грибов, а также токсичных продуктов микробной деградации БАВ. Инфекционные заболевания, возникающие в результате использования контаминированных ЛС, могут иметь разную локализацию и клиническую форму: гнойно-септические инфекции (местные или генерализованные); грибковые поражения кожи, слизистых, глаз и других органов; заболевания вирусной природы.

Важную роль в развитии заболевания имеет способ применения контаминированных препаратов. Наибольшую опасность представляет их введение в кровоток, глаза, в полости тела, в норме свободные от микроорганизмов. При местном применении препаратов вероятность развития инфекционного процесса резко возрастает при обширных повреждениях тканей в результате травмы, ожога, хирургического вмешательства. Например, Staphylococcus aureus при попадании с лекарственного средства на поврежденную кожу и слизистые может вызывать гнойно-воспалительные процессы;

- при ингаляционном введении - стафилококковую пневмонию;

- при пероральном - токсикоинфекцию или интоксикацию;

- при попадании в кровяное русло - генерализованную инфекцию (сепсис).

Чаще в лекарственных препаратах встречаются:

стафилококки;

сарцины;

кишечная и синегнойная палочки и др.;

бациллы;

грибы плесневые и дрожжевые.

Наибольшее количество микробов обнаруживается в настоях и отварах, так как они богаты питательными веществами. Меньше микробов в настойках, они готовятся на этиловом спирте, который обладает антимикробным действием.

Микробы попадают в лекарственные препараты из:

сырья;

воды;

с аптечного оборудования;

при неправильном (особенно органолептическом) анализе;

воздуха;

рецептов;

с посуды;

с рук персонала.

Признаки порчи мазей, линиментов, суппозиториев:

изменение цвета;

изменение консистенции (расслаивание);

неспецифический запах;

появление пленок;

отсыревание.

Контроль стерильности лекарственных препаратов.

Целью испытания на стерильность является подтверждение полного отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в объекте. В некоторых случаях, например, в производстве вакцин проводят испытания на полное отсутствие вирусов в объекте. Анализу подлежит каждая партия препарата. За партию (серию) принимают количество препарата, для которого вероятность нарушения или недостижения стерильности одинакова.

Достоверность испытания на стерильность зависит от нескольких факторов:

-объема (массы) образца для анализа;

-состава и качества питательных сред;

-используемого метода исследования;

-соблюдения асептичных условий проведения анализа.

Объем образца.

В связи с тем, что метод испытания является разрушающим, отбирать на анализ большое количество образцов невыгодно, вместе с тем есть риск получить неадекватный ответ, если проводить испытание на малом числе образцов из серий большого объема. Размер выборочной пробы устанавливают в зависимости от вида стерилизации и числа единиц в серии. Если лекарственное средство стерилизуют паром под давлением 0,11±0,02 МПа и температуре 121 °С, то образец состоит из 10 единиц, независимо от числа образцов в серии. При других видах стерилизации минимальное количество образцов определяют по формуле:

n = 0,4vN

где: n - число единиц для анализа;

N-число единиц в исследуемой серии, при этом п должно быть не менее 3 и не более 40.

Метод анализа.

Контроль стерильности можно проводить двумя методами: прямым посевом образца в питательные среды и мембранной фильтрацией. При прямом посеве испытуемый препарат предварительно растворяют или суспендируют и вносят в среду в количестве, зависящем от объема содержимого одной единицы: если в ампуле 1 мл, то весь объем, для ампул объема \-\ мл засевают 1 мл, если объем составляет 5-19 мл -2 мл, для объема

20-100 мл - 2-4 мл, а при анализе содержимого флаконов объемом более 100 мл предпочтительным является метод мембранной фильтрации.

Объем питательной среды должен в 10 раз превышать объем образца для посева. Посевы втиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35 °С, а в среде Сабуро - 20--25 °С. Продолжительность инкубации 14 суток. Интерпретация результатов.

Посевы просматривают ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других признаков микробного роста. Выявленный рост подтверждают микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Препарат считают стерильным при отсутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе) испытание проводят повторно на таком же количестве образцов. При отсутствии роста испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям. В случае роста микроорганизмов при повтором посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, обнаруженными в первичном посеве испытуемый препарат считают нестерильным. Если выявлена другая морфологическая группа, то испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста в третьем испытании препарат считают стерильным. Если хотя бы в одной пробирке обнаружен рост, испытуемый препарат считают нестерильным.

Факторы вирулентности микроорганизмов. Характеристика эндо- и экзотоксинов

Ответ:Вирулентность (лат. virulentus - ядовитый) - степень патогенности данного штамма инфекционного агента в отношении животных определенного вида при стандартных условиях естественного или искусственного заражения. Например, бацилла сибирской язвы является патогенной, так как обладает свойством вызывать заболевание сибирской язвой. Но штамм одной культуры вызывает заболевание и смерть через 96 часов, а другой - через 6-7 дней. Следовательно, вирулентность первого штамма более высокая, чем второго.

Вирулентность возбудителя оценивают по DLM (dosis letalis minima) - минимальной смертельной дозе, равной количеству микробных клеток, которое вызывает гибель 90% восприимчивых животных определенного вида и DL50-дозе, вызывающей гибель 50% животных. Степень патогенности микроба определяется факторами вирулентности: адгезией, инвазией и агрессией.

Инвазивность (лат. invasio - нашествие, нападение) - способность микроба преодолевать защитные барьеры организма, проникать в органы, ткани и полости, размножаться в них и подавлять защитные средства макроорганизма. Инвазионные свойства патогенных бактерий обеспечиваются за счет микробных ферментов, так называемых факторов распространения (гиалуронидаза), капсул и других химических компонентов микробов. Это связанно с наличием специфических поверхностных структур, подавляющих фагоцитоз или активность комплимента, а также с особенностями метаболизма, обеспечивающих размножение возбудителя в организме хозяина.

Для поверхностных структур с антифагоцитарной функцией Глинн (A. Glynn, 1972) предлагает название «импедины».

У микроорганизмов различных видов эти структуры отличаются по химической природе, токсичности, протективной активностью: капсула (у пневмококков - полисахаридная, у сибиреязвенной бактерии - глутамил-полипептидная), О- и К-антигены энтеробактерий и др. Один и тот же возбудитель может продуцировать одновременно несколько компонентов различной химической природы, действующих на разные этапы фагоцитарного процесса. Биологическая активность структур зависит от количества продуцируемого вещества, его строения и степени полимеризации.

Ряд возбудителей (сальмонеллы, бруцеллы и др.) характеризуется способностью длительно размножаться в макрофагах. Имеется корреляция между чувствительностью животных определенного вида к инфекции и способностью возбудителя размножаться в их макрофагах. Полагают, что в основе этого явления лежит общностью молекулярной структуры антигенов паразита и хозяина. В силу иммунологической толерантности в организме таких животных отсутствуют соответствующие антитела на начальном этапе инфекции и паразит беспрепятственно размножается. Способность размножаться в макрофагах может быть связанна также с устойчивостью некоторых поверхностных компонентов клетки к переваривающему действию лизосомальных энзимов или с подавлением их синтеза.

Проявления инвазивных свойств бактерий в значительной мере зависит от состояния защитных сил макроорганизма. Изучение молекулярной структуры факторов инвазивности и механизма их действия имеет большое значение для медицины: в основе специфической профилактики большинства инфекций лежит создание антибактериального иммунитета, подавляющего размножение возбудителя в организме.

Характеристика эндо- и экзотоксинов

Представления о природе микробных токсинов получены благодаря исследованиям патогенных бактерий. К 1890 г. были обнаружены первые токсины двух патогенных микроорганизмов: Corynebacterium diphtheriae и Clostridium tetani.

В обоих случаях были поставлены одинаковые опыты: бактерию выращивали в культуральной среде in vitro, и стерильный фильтрат, приготовленный из выросшей культуры, вводили опытным животным. Последние погибали, а при их вскрытии обнаруживали изменения органов, характерные для соответствующей естественной инфекции. Эти токсические вещества оказались белками. Поскольку они представляли продукты обмена бактерий и не были связаны с бактериальными клетками, их назвали экзотоксинами. Экзотоксины образуют ряд других патогенных бактерий (возбудитель ботулизма, инфекционной энтеротоксемии, дизентерии и др.), в основном грамположительных. Однако фильтраты, приготовленные из культур многих других патогенных микроорганизмов, не были токсичны. Кипячением бактериальных культур доказано, что клетки почти всех грамотрицательных патогенных бактерий токсичны сами по себе. Более того, такое же токсическое действие оказывают и убитые нагреванием клетки многих патогенных грамотрицательных бактерий. Устойчивые к нагреванию токсины, связанные с клеточной оболочкой грамотрицательных бактерий, назвали эндотоксинами.

Однако для многих патогенных бактерий, в том числе для возбудителя сибирской язвы, эти подходы не позволили обнаружить никаких сколько- нибудь токсичных продуктов. Условия культивирования в лаборатории всегда отличаются от условий в организме зараженного животного. Осознание этого очевидного факта заставило предпринять поиски бактериальных токсинов, образуемых непосредственно в организме инфицированного животного. Эта работа привела к обнаружению специфического экзотоксина у Bacillus anthracis.

Токсины бывают двух видов - экзотоксины и эндотоксины.

Экзотоксины - высокоактивные яды, выделяемые микроорганизмом на протяжении его жизни в качестве продуктов обмена в окружающую среду (организм животного, пробирка с культурой микроба). Обнаруживаются в высоких концентрациях в жидких средах, содержащих компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий, освобождающиеся при их дезинтеграции полипептиды, ОММ 10000-100000. Липополисахаридные комплексы, липид А, очевидно, ответственен за токсичность.

Эндотоксины - менее ядовитые по сравнению с экзотоксинами вещества, образующиеся в результате распада микробной клетки. Следовательно, эндотоксины представляют собой фрагменты или отдельные химические компоненты микробных клеток.

Экзотоксины в основном образуют грамположительные микроорганизмы (возбудители ботулизма, столбняка, газовой инфекции и др.), а эндотоксины образуют клетки грамотрицательных микробов (сальмонеллы, кишечная палочка, протей и др.).

Специфические факторы защиты организма. Иммунная система. Центральные и периферические органы иммунной системы, их функции

Ответ:

Специфический иммунный ответ является одним из компонентов общей системы защиты организма, в которой все вышеперечисленные клетки и макромолекулы взаимосвязаны. Местом функциональной кооперации всех перечисленных клеток и макромолекул служат органы и ткани иммунной системы организма.

Лимфоциты - это единственные клетки организма, способные специфически распознавать и различать разные антигены и отвечать активацией на контакт с определенным антигеном.

Лимфоциты находятся в состоянии рециркуляции, т.е. постоянно происходит обмен клетками между кровью, лимфой и лимфоидными органами. Это необходимо для реализации специфического иммунного ответа, так как иммунная система должна быть готова ответить на любой из множества чужеродных антигенов, попадающих в любой участок тела. Поскольку каждый отдельный антиген распознается лишь очень небольшой частью популяции лимфоцитов, только постоянная рециркуляция может создать условия для встречи каждого антигена с единичными лимфоцитами, несущими специфические для него антиген-распознающие рецепторы.

Встретив и распознав этот антиген, лимфоциты размножаются (пролиферация) и дифференцируются, благодаря клональной селекции. Большая часть из них принимает непосредственное участие по уничтожению антигена, а меньшая часть остается в виде долгоживущих активированных клеток памяти и в данный момент участие в защите не принимает.

При весьма сходной морфологии малые лимфоциты делятся на две популяции, имеющие различные функции и продуцирующие разные белки. В зависимости от места созревания в организме подразделяются на Т-(тимус) и В- (бурса Фабрициуса, костный мозг) лимфоциты.

В-лимфоциты

Каждая В-клетка генетически запрограммирована на синтез поверхностного рецептора иммуноглобулиновой природы (иммуноглобулиновые антигенраспознающие рецепторы), специфичного к одному определенному антигену. Встретив и распознав этот антиген, В-клетки размножаются и дифференцируются в плазматические клетки, которые образуют и выделяют в растворимой форме большие количества таких рецепторных молекул, называемых антителами. Антитела представляют собой крупные гликопротеины и содержатся в крови и тканевой жидкости. Благодаря своей идентичности исходным рецепторным молекулам они взаимодействуют с тем антигеном, который первоначально активировал В-клетки.

В-лимфоциты после антигенной стимуляции размножаются и дифференцируются в плазматические клетки (ПК), которые образуют и выделяют антитела.

Т-лимфоциты

Другая популяция получила название Т-лимфоциты в связи с их дифференцировкой в тимусе. Имеются несколько субпопуляций Т-клеток с различными функциями. Одни взаимодействуют с мононуклеарными фагоцитами, способствуя разрушению локализованных в них микроорганизмов. Другие взаимодействуют с В-клетками, помогая им размножаться, созревать и образовывать антитела.

Свои функции воздействия на другие клетки Т-лимфоциты осуществляют путем выделения растворимых белков - цитокинов, которые передают сигналы другим клеткам, или путем прямых межклеточных контактов. В цитотоксической реакции атакующая клетка направляет содержимое своих гранул наружу, к клетке-мишени. Гранулы цитотоксических Т-клеток содержат соединения, называемые перфоринами, которые способны создавать каналы в наружной мембране клеток-мишеней. (Подобно этому, антитела, связавшись с поверхностью клетки-мишени, могут привлечь комплемент для перфорирования ее цитоплазматической мембраны). Кроме того гранулы содержат лимфотоксины, которыми цитотоксические лимфоциты, путем введения через проделанное отверстие в мембране, лизируют клетку-мишень.

Как правило, распознавание антигена Т-клетками происходит только при том условии, что он презентирован на поверхности других клеток в ассоциации (комплексе) с молекулами МНС. В распознавании участвует специфичный к антигену Т-клеточный рецептор(ТкР или TCR), функционально и структурно сходный с той поверхностью молекулы иммуноглобулина, которая у В-клеток служит антигенсвязывающим рецептором. При этом Т-хелперы распознают антиген в ассоциации с МНС II класса, Т- киллеры - с МНС I класса.

Иммунная система

Иммунная система включает специализированную, анатомически обособленную лимфоидную ткань, «разбросанную» по всему организму в виде различных лимфоидных образований и отдельных клеток.

Различают первичные - центральные (костный мозг и тимус) и вторичные - периферические (селезенка, лимфатические узлы, скопления лимфоидной ткани) органы иммунной системы. Все они взаимосвязаны системой кровообращения, лимфотока и единой системой иммунорегуляции.