Люминесценция и её применение

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы люминесцентной вирусологии

люминесценция флуорохромирование антитело

Сущность явления люминесценции заключается в способности некоторых веществ светиться под воздействием различных видов энергии.

Для возбуждения люминесцентного свечения многих веществ чаще используют ультрафиолетовый участок спектра света, однако в ряде случаев применяют и видимую часть, прилегающую к ультрафиолетовой области.

При люминесцентном анализе следует иметь в виду одну закономерность, именуемую правилом Стокса: спектр излучения люминесцирующих веществ сдвинут по отношению к спектру возбуждающего источника в сторону более длинных волн. Следовательно, у веществ, поглощающих ультрафиолетовый свет, флуоресценция может быть любого цвета, но вещества, флуоресценция которых возбуждается синим светом, не могут светиться фиолетовым, а только зелёным, жёлтым или красным. Надо помнить не менее важное обстоятельство - выход флуоресценции. Понятие выхода флуоресценции было введено С.И. Вавиловым и выражает отношение энергии излучения к энергии, поглощенной люминесцирующим веществом. Выход флуоресценции зависит от различных условий: температуры, концентрации вещества и т.п. Так, многие органические соединения в кристаллическом состоянии не флуоресцируют, но очень сильно флуоресцируют в растворах. При этом нет прямой зависимости между концентрацией вещества в растворе и степенью флуоресценции. Как правило, более концентрированные растворы дают меньшую флуоресценцию, чем разведенные.

Для каждого флуоресцирующего соеденения существует оптимальная концентрация его в растворе, при которой оно флуоресцирует в наибольшей степени.

В биологии использование феномена люминесценции развивалось в 2 направлениях.

1. Изучение собственной, т.е. первичной, люминесценции тканей животных, растений, микробов… Этот способ применяют при диагностике некоторых заболеваний, в частности грибковых, при определении степени и характера порчи мясных, рыбных и овощных продуктов.

2. Изучение вторичной, т.е. извне привнесённой, люминесценции. Для этого препараты окрашивают флуоресцирующими красителями -флуорохромами.

Флуорохромы обычно применяют в больших разведениях, что позволяет осуществлять прижизненную окраску исследуемых объектов.

Для люминесцентного окрашивания препаратов предложены флуоресцеин, родамин, акридиновый оранжевый, акридиновый жёлтый, аурамин, корифосфин, примулин.

Перед окрашиванием флуорохромами препараты фиксируют. Для этого их предварительно высушивают при 18-22⁰ или в термостате (37⁰) и на 10-15 минут помещают в фиксирующую жидкость. Фиксированные препараты высушивают и наносят на них раствор флуорохрома.

Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который, взаимодействуя с составными компонентами клеток, вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует жёлто-зелёным цветом, а рибонуклеиновая кислота - рубиново-красным. Акридиновый оранжевый можно применять для прижизненной окраски с целью изучения динамики изменений внутриклеточных нуклеиновых кислот.

Выявление нуклеиновых кислот люминесцентным методом в большинстве согласуется с данными, полученными при использовании других методов, применяемых в гистохимии.

Специфичность окраски акридиновым оранжевым следует проверять в контрольных опытах путём обработки препаратов соответствующими ферментами -дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой.

Метод простого флуорохромирования не сложен, но в большинстве случаев он не даёт возможности полно дифференцировать возбудителя заболевания.

Люминесцентное иммунохимическое обнаружение микробов, вирусов, антигенов основанона том, что антитела, будучи соединены аминным или карбоксильными группами с флуоресцирующим красителем, сохраняют способность вступать в специфическую связь с антигеном, образуя при этом комплекс антиген-антитело. Благодаря присутствию в таком комплексе флуорохрома эта связь может быть обнаружена при люминесцентной микроскопии.

Преимущество метода по сравнению с обычными серологическими реакциями заключается в значительном сокращении срока исследования. Нет необходимости в большом количестве антигена или в получении его в чистом виде. Использование адсорбированных, хорошо титрованных сывороток позволяет с большой точностью идентифицировать антигены.

Флуоресцирующие сыворотки (антитела) применяют для индикации вирусов в патологическом материале, выделениях больных животных.

Существует два основных способа диагностического применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод. Для обнаружения антигенов используют флуоресцирующие антитела, приготовленные из специфических иммунных сывороток.

Непрямой (двухступенчатый) метод. Вначале антиген обрабатывают обычной нефлуорецирующей диагностической сывороткой. Если антитела сыворотки гомологичны антигену, то они вступят с ним в связь. Для обнаружения этой связи применяют флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного- продуцента диагностической сыворотки. Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя животных глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами диагностических сывороток. Наиболее часто применяют антикроличьи сыворотки, антилошадиные и сыворотки против глобулинов морских свинок.

Существует несколько модификаций непрямого метода, наибольшее внимание из которых заслуживает метод с использованием комплимента. Было доказано, что комплимент, фиксированный на первой ступени непрямого метода, может быть выявлен окрашиванием его на второй ступени флуоресцирующей сывороткой, иммунной к сыворотке, послужившей источником комплемента.

Пользуясь методом флуоресцирующих антител, лучше использовать их глобулиновые фракции. Есть много способов выделения глобулинов из сыворотки крови: высаливание сернокислым аммонием, сернокислым натрием; осаждение этиловым спиртом, риванолом. К методам наиболее щадящим молекулы белков, можно отнести препаративный электрофорез и разделение при помощи обменников.

Для люминесцентной метки сывороток или их глобулиновых фракций используют специальные флуорохромы. Наиболее распространённые - изоцианат и изотиоционатфлуоресцеина, 1-диметил-аминонафталин-5-сульфохлорид, изоцианат родамина В, изотиоцианат родамина В-200, хлорид-3-гидроокиси-5-8-10-пирен-три-сульфокислоты.

При исследовании гистологических срезов, тканевых культур, клеток большое значение имеет характер собственной флуоресценции этих объектов. Большинство тканей обладает желто-зеленым свечением. Поэтому для дифференцирования полезно использовать сыворотки, меченные соединениями родамина.

Наиболее хорошие результаты даёт мечение белков соединениями типа изотиоционатафлуоресцеина и изотиоцианата родамина В-200.

Соединение (конъюгирование) белков сывороток или их глобулиновых фракций с флуорохромами можно проводить различными способами. Для изоцианатафлуоресцеина метод разработан Кунсом и сводится к следующему.

Определяется общее количество белка сыворотки (глобулинов), подлежащей мечению. Пользуясь рефрактометром или таблицей Рейса или микрометодомКъельдаля. Зная количество белка, подлежащего мечению, составляется реакционная смесь. Общее количество смеси должно быть таким, чтобы содержание белка в ней было равно 1 проценту. В состав смеси входят : карбонат-бикорбанатный буферный раствор 0,5М, рН 9,0-15%, диаксан 15%, ацетон 7%, изоцианатфлуоресцеина 5 мг на 100 мг белка. До 100% объёма смесь доводят 0,15 М раствором хлористого натрия. Если изоцианатфлуоресцеина используют в форме раствора в смеси диаксан-ацетон, то следует соответственно уменьшить количество этих реактивов в общем количестве смеси. Обычно растворы изоцианатафлуоресцеина содержат 1 часть диоксана и 2 части ацетона.

Составные части реакционной смеси соединяют при 4⁰, постоянно помешивая, и внося каждый компонент по каплям, используя магнитную мешалку. Смесь ставят в холодильник на 16-18 часов.

Обычно используют 2 метода метки изотиоцианатомфлуоресцеина.

Метод Риггса. К охлаждённой до 0-0,5⁰ смеси, состоящей из 10 мл 0,15 М раствора хлористого натрия, 3 мл карбонат- бикарбонатного буфера, рН 9,0, и 2 мл ацетона, прибавляют 10 мл разведённого глобулина, количество белка в котором известно. При помешивании в смесь вносят по каплям 1,5 мл ацетона с растворенным в нём изотиоцианатом. На каждые 100 мг белка добавляют по 5 мг красителя. Приготовленную реакционную смесь оставляют в холоде при 4⁰ для перемешивания на магнитной мешалке на 16-20 часов.

Метод Маршала. Глобулин разводят 0,15 М раствором хлористого натрия и 0,5 М карбонат-бикарбонатным буфером, рН 9,0, так чтобы в 1 мл было 10 мг белка и 10% буфера. Краситель вносят в смесь в виде порошка из расчёта 5 мг на 100 мг белка.

В процессе конъюгации не весь краситель вступает в прочную химическую связь с белком, в результате чего из сыворотки необходимо удалить несвязанный или непрочно связанный флуорохром (диализом или колоночной хромотографией).

Диализ ведут в целлофановых мешочках или гильзах против 0,15 М раствора хлористого натрия в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2-7,4, при температуре 4⁰ в течение 5-7 дней, периодически меняя диализационную жидкость. Диализ прекращают когда в наружной диализационной жидкости будет отсутствовать краситель. Чтобы в этом убедиться, необходимо пробу жидкости периодически исследовать в ультрафиолетовых лучах на отсутствие флуоресценции. Сократить время диализа можно, предварительно переосадив меченые глобулины пятикратными объёмами ацетона, охлаждённого до -15, -17⁰, и отделяя осадки центрифугированием. После удаления надосадочной жидкости осадок растворяют в 0,15 М растворе хлористого натрия, рН 7,2-7,4. Вместо обработки ацетоном можно использовать насыщенный раствор сернокислого аммония. Весьма эффективный метод удаления красителя, не связанного глобулином - колоночнаяхромотография с использованием сефадекса Г-50 и диэтиламиноэтил целлюлозы.

Последовательность колоночной хроматографии: сефадекс трижды отмывают 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,5, для удаления мелких частиц. Приготовленную суспензию вливают в колонку и дают ей осесть. Затем, выпустив излишек буферного раствора, вносят неочищенный конъюгат глобулина и при медленном токе элюируют 0,01 М буферным раствором.

Для более полного освобождения меченых глобулинов от несвязанного красителя проводят хромотографию на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой. В этом случае осуществляют градиентнуюэлюцию 0,01М фосфатным буфером при концентрации хлористого натра, возрастающей от 0 до 0,2М.

1 раз снаряжённые обменные колонки можно использовать многократно, но после каждого опыта их нужно регенерировать.

Для повышения специфичности и полного устранения свободного флуорохрома сыворотку адсорбируют порошком, приготовленным из печени белых мышей или животных тех видов, материал от которых предполагается исследовать.

Приготовление порошка из печени. Печень здоровых животных освобождают от желчного пузыря, многократно промывают 0,15 М раствором хлористого натрия и измельчают в гомогенизаторе. Затем, центрифугируя гомогенат, поочередно отмывают ацетоном и 0,15 М раствором хлористого натрия и промывают раствором хлористого натрия, высушивают и измельчают в тонкий порошок. Приготовленный порошок хранят при низкой температуре в эксикаторе или запаянным в ампулы, в вакууме. Для адсорбирования флуоресцирующей сыворотки на 1 мл берут 80-100 мг порошка. Смесь сыворотки и порошка смешивают при температуре 18-22 градуса в течение часа, а затем центрифугируют и фильтруют через мембранный фильтр № 3-5. При исследовании инфицированных культур клеток тканей адсорбцию ведут отмытыми нормальными клетками этой ткани, предварительно высушенными и измельчёнными.

Полноту очистки сыворотки от несвязанного красителя проверяют методом электрофореза на бумаге или в агаровом теле. Присутствие неспецифических антител выявляют люминесцентной микроскопией контрольных препаратов, т.е. препаратов, не содержащих антигенов, гомологичных сыворотке. Флуоресцирующие сыворотки или их глобулины длительное время сохраняют специфическую активность в лиофилизированном состоянии.

Методы работы с флуоресцирующими антителами

Приготовление и фиксация препаратов. В зависимости от цели в качестве объектов исследования могут быть использованы различные препараты: мазки-отпечатки, соскобы, гистологические срезы и т.п.

Предметные стекла для препаратов должны быть чистыми, обезжиренными и не иметь царапин. Мазки-отпечатки и препараты соскобов готовят обычными способами. Гистологические срезы делают на замораживающем микротоме или криостате.

Перед окрашиванием препараты из культуры клеток отмывают от питательной среды 0,15 М раствором хлористого натрия в фосфатном буфере 0,01 М, рН 7,2-7,4 и высушивают. Выбирают такой фиксатор препаратов, который не ведет к растворению антигенов вирусов и не нарушает их иммунологической специфичности. Чаще всего применяют этиловый или метиловый спирт, а ещё лучше - чистый ацетон, охлаждённый до -15 градусов. Фиксируют препараты 10-15 минут. В таком состоянии препараты могут храниться довольно длительное время.

Окрашивание препаратов флуоресцирующими антителами. При прямом методе на фиксированный и высушенный препарат наносят 1-2 капли цельного или разведенного конъюгата. Степень разведения подбирают для каждой серии сыворотки индивидуально, в зависимости от характера исследуемого материала, степени и способа очистки конъюгата, содержания в нём белка и других условий. Длительность окрашивания, как и разведение сыворотки, устанавливают опытным путём. Обычно обработку ведут при комнатной температуре или в термостате, во влажной камере, для чего препараты помещают в закрытые чашки Петри с вложенными в них влажными тампонами ваты.

Длительность контакта конъюгата с препаратом варьирует от 1 до 60 минут. Окрашенные препараты отмывают 10-15 минут 0,15 М раствором хлористого натрия в фосфатном буфере 0,01 М.

При непрямом методе препарат сначала обрабатывают во влажной камере 3-5 минут специфической нефлуоресцирующей сывороткой, разведённой в несколько раз, в зависимости от её активности, а затем тщательно отмывают слегка подсушенный препарат окрашивают 15-20 минут флуоресцирующимантиглобулином. Антиглобулин получают от животного, иммунизированного сывороткой того вида животного, которое было продуцентом специфической сыворотки. Антивидовые сыворотки для данных целей получают более активными, если иммунизацию проводят специфической сывороткой, которой пользуются в первом этапе. В модификации непрямого метода с окраской комплемента на окрашиваемый препарат наносят каплю смеси комплемента и сыворотки, иммунной к изучаемому антигену сыворотки. Перед смешиванием комплемент - свежую сыворотку морской свинки разводят 1:10 физиологическим раствором, а иммунную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 градусах. Приготовленный препарат заключают во влажную камеру и помещают в термостат(37 градусов) на 30 минут. Затем 10-15 минут его промывают буферным раствором и подсушивают, осторожно удаляя избыток жидкости фильтровальной бумагой. Далее препарат окрашивают флуоресцирующей сывороткой против глобулинов морской свинки, разведенной 1:2 буферным раствором .

Время контакта сыворотки с препаратом может длиться 5-30 минут.

Флуоресцирующую сыворотку с препарата удаляют промыванием буферным раствором в течение 10-15 минут.

Для микроскопирования препараты заключают в смесь из 9 частей глицерина и 1 части фосфатного буфера рН 7,0. Для предотвращения испарения жидкости края покровного стекла заливают парафином.

Люминесцентная микроскопия окрашенных препаратов. Для люминесцентной микроскопии нужны люминесцентные осветители, микроскопы и светофильтры. При данном виде микроскопии препаратов, обработанных флуоресцирующими антителами, часто пользуются отраженными лучами, которые падают на объект сверху, через объектив микроскопа. Свет концентрируется в очень узкий и яркий пучок, освещающий только участок поля зрения.

Четкое изображение в поле зрения люминесцентного микроскопа можно получить только при правильном подборе светофильтров. К люминесцентному микроскопу прилагается 2 вида светофильтров:

Первичные светофильтры, возбуждающие люминесценцию исследуемых объектов, и окулярные, или «запирающие», предназначенные для пропускания света люминесценции и гашения света, прошедшего через первичные фильтры. Запирающие фильтры надевают на окуляр микроскопа при использовании люминесцентного устройства типа ОИ-17, а в микроскопе МЛ-1 или МЛ-2 они вмонтированы в специальный револьверный диск. Запирающий фильтр и его сочетание с первичным исследователь выбирает на основании сравнительного изучения, в зависимости от характера и качества препаратов. Обычно запирающий фильтр ЖС-3 применяют со светофильтром УФС-3, а светофильтры ЖС-18, Т-1Н или Т-2Н - с первичным фиолетово-синим или синим - ФС-14 или СС-4+ +СС-8.

Для вирусологических целей в большинстве случаев используют объективы-ахроматы 90*1,25 и окуляры 7*, 10*, 15*. В качестве иммерсионной среды служат нефлуоресцирующее иммерсионное масло или его заменители.

Исследование препаратов проводится в тёмном или затемненном помещении.

Учёт результатов люминесцентной микроскопии и устранение некоторых артефактов. Результаты микроскопии учитывают визуально, по интенсивности свечения отдельных элементов препарата. Судить о специфичности свечения относительно трудно, так как величина вирусных частиц лежит за пределами разрешающей способности оптических микроскопов, и связь флуоресцирующих антител с антигеном - частицами вируса - может быть выявлена только при значительной концентрации последних. В таких случаях на препаратах видны гомогенно флуоресцирующие участки. Кроме того, четкая картина связи антигена с антителом иногда затушевывается неспецифической люминесценцией некоторых элементов препарата, которая может быть двух видов.

Аутолюминесценция, или собственная люминесценция, некоторых тканевых элементов. Так, в культуре клеток тканей сильную люминесценцию наблюдают в случае травматизации клеточных структур при смыве или чрезмерном высыхании фиксированных препаратов.

Наведенная флуоресценция зависит от способности некоторых тканей к неспецифической адсорбции белков, в том числе и меченных антител. Как в первом, так и во втором случаях появляются артефакты, затрудняющие исследования или делающие их невозможными.

Для гашения собственной люминесценции применяют слабые растворы анилиновых красок, которыми воздействуют на фиксированный препарат в течение 5-30 секунд, но такая обработка снижает яркость специфического свечения.

Неспецифическую адсорбцию предупреждают обработкой препарата нормальными сыворотками, отличающимися по своей принадлежности к антигенам исследуемых объектов. При этом происходит блокирование (насыщение) свободных сорбирующих элементов препарата до обработки их иммунными глобулинами. Желательно такие нормальные сыворотки конъюгировать с флуорохромами, излучающими свет, отличный от спектра иммунного конъюгата. Чёткость и контрастность микроскопической картины при этом значительно возрастают.

Активность и специфичность меченых сывороток, предназначенных для второго этапа непрямого метода индикации вирусов, можно проверять на микробных антигенах. Для этого берут специфическую сыворотку, соединяют с фиксированным на предметном стекле гомологичным микробным антигеном, а затем, после промывания, обрабатывают флуоресцирующим антиглобулином.

Исследования с помощью флуоресцирующих антител, так же как и любые другие серологические методы, должны сопровождаться соответствующим контролем. При прямом методе окраски специфичность флуоресцирующих сывороток проверяют следующим образом. Готовят две серии препаратов, одна из которых содержит вирус, другая лишена его. По нескольку препаратов той и другой серии обрабатывают специфической и нормальной меченой сывороткой. Отчётливая флуоресценция должна быть только у тех препаратов, которые содержали вирус и были обработаны специфическим флуоресцирующим глобулином.

Специфичность антиглобулиновых флуоресцирующих сывороток при непрямом способе испытывают постановкой соответствующего контроля с учетом двухступенчатости метода (препараты, содержащие вирус и не содержащие его, обрабатывают на первом этапе специфической и нормальной сыворотками; на втором - мечеными антиглобулинами и нормальными мечеными глобулинами).

Специфичность реакции антиген+флуоресцирующее антитело оценивают на глаз (визуально), по интенсивности свечения:

+ - слабо выраженная специфическая флуоресценция с нечётким свечением участков скопления антигена;

++ - выраженная специфическая флуоресценция с отчётливым свечением участков;

+++ - яркая специфическая флуоресценция с хорошо выраженным свечением в местах скопления антигена;

++++ - сверкающая флуоресценция антигенных комплексов.

Такая система учета степени специфической флуоресценции вносит элементы субъективности, но для практических целей её можно считать пригодной.

Список литературы

1.Левина Е.Н. Гос.изд. медицинской литературы.М., 1992

2.Левшин В.Л. Люминесценция и её техническое применение.Изд.АН СССР,М., 1976

3.Мейсель М.Н., Кабанова Е.А. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2, 1998

4.Меклер Л.Б. Наумова В.К. «вопросы вирусологии» 2,1965

5.Михайлов И.Ф. Люминисцентнаямикроскопия.Медгиз, 1997

6. Stair E.L. Pros. Soc. Exp. Biol. Med., 7, 1963

Размещено на Allbest.ru