Дослідження експериментальних зразків сечі, висушених на марлі, за допомогою молекулярно-генетичних методів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДОСЛІДЖЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ЗРАЗКІВ СЕЧІ, ВИСУШЕНИХ НА МАРЛІ, ЗА ДОПОМОГОЮ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МЕТОДІВ

Кривда Р.Г.

Одеський національний медичний університет

Досліджено кількісний вихід ДНК при виділенні ДНК з експериментальних зразків сечі, висушених на марлі, при зберіганні протягом різного терміну часу, придатність виділеної ДНК для аналізу методом ПЛР, а також якість отриманих ДНК-профілів. Результати проведених досліджень показали відсутність достовірної різниці (Р > 0,05) у кількості виділеної ДНК на 1, 30, 60 та 90 добу дослідження. Було визначено, що процеси деградації в експериментальних зразках сечі при зберіганні в умовах кімнатної температури (22°С) виражаються в повільному зниженні кількості виділеної ДНК, в середньому, на 2,5% у жінок та на 3,5% у чоловіків. Відповідно до цього, з плями сечі розміром 2,0 х 2,0 см, утвореної рідкою сечею об'ємом 3,0 мл, на 90-у добу зберігання при температурі 22°С теоретично можливо виділити ДНК в кількості достатній для проведення генотипування. На основі висновків проведеного дослідження було розроблено алгоритм проведення судово-медичної експертизи слідів сечі за допомогою молекулярно-генетичних методів.

Ключові слова: судово-медична експертиза, ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, сліди сечі, ДНК- профіль.

Постановка проблеми. В судово-медичній практиці дослідження зразків рідкої сечі, які зберігалися у рідкому стані та у висушеному вигляді на марлі, та слідів сечі на речових доказах займає п'яте місце серед всіх досліджених біологічних об'єктів, що складає 2,7% від загальної кількості досліджених біологічних об'єктів. При цьому судово-медичне дослідження саме таких біологічних об'єктів має суттєве значення при розкритті правопорушень та встановлення істини у випадках, коли це єдині докази, або для підвищення рівня доказовості інших експертних досліджень [11].

Традиційні серологічні методи дослідження у більшості випадків не дають можливості ідентифікувати особу, тобто встановити статеву та групову приналежність зразка сечі або слідів сечі на речових доказах, у зв'язку з чим використання молекулярно-генетичних методів в українській судовій практиці цілком виправдане.

На сьогоднішній день більшість судово-медичних експертиз -- це комплексні дослідження, які направлені на вирішення питань слідства за допомогою різних біологічних, хімічних та фізичних методів.

Аналіз останніх досліджень і публікацій. Зразки сечі в рідкому стані, а також у висушеному стані в більшості випадків досліджуються після проведення судово-медичних токсикологічних експертиз при виникненні підозри на недостовірність результатів, при оскарженні результатів або при виникненні підозри на підміну зразків, які направляються на дослідження.

Судово-медичні токсикологічні дослідження проводяться у встановленому чинним законодавством порядку в обсязі медичного огляду водія або учасника ДТП для визначення стану алкогольного сп'яніння, впливу наркотичних чи токсичних речовин. Для цього відбираються зразки рідкої сечі об'ємом від 10,0 до 12,0 мл, які в опечатаному вигляді у скляних флаконах об'ємом 15,0 мл відправляються у бюро судово-медичної експертизи, де у відділенні судово-медичної токсикології зразки піддаються токсикологічному аналізу з метою визначення присутності в організмі етанолу, наркотичних чи токсичних речовин. Відповідно до Правил проведення судово-медичної експертизи, зразки рідкої сечі після дослідження зберігаються протягом 30 діб в умовах побутового холодильнику (4°С), після чого знищуються [12].

У випадках, коли виникає підозра на підміну або знищення біологічних зразків від осіб, які проходять у справах, працівники слідства призначають по даній справі судово-медичну молекулярно-генетичну експертизу з метою ідентифікації зразка рідкої сечі та проведенням порівняльного аналізу зі зразком крові особи. Для проведення судово-медичної молекулярно-генетичної експертизи залишається 1,0-1,5 мл зразка рідкої сечі, який зберігався протягом 30 діб та більше.

Сліди та плями сечі також досліджуються як речові докази при розкритті правопорушень.

Виділення не вирішених раніше частин загальної проблеми. В рамках науково-дослідної роботи нашої кафедри було проведено дослідження геномної ДНК, виділеної з об'єктів різного біологічного походження. На попередньому етапі досліджувались зразки рідкої сечі, в результаті чого ми дійшли висновків, що кількість ДНК, виділеної із зразків рідкої сечі, залежить від умов зберігання зразків, а також від статевої належності донорів зразків. Продовжуючи роботу в даному напрямку, необхідно аналізувати також вихід та якість ДНК отриманої з висушених на марлі зразків сечі.

Мета статті. Метою нашої роботи є розробка та впровадження в експертну практику уніфікованого алгоритму проведення судово-медичної експертизи речових доказів у вигляді плям сечі за допомогою сучасних молекулярно-генетичних методів з метою ідентифікації особи.

Виклад основного матеріалу. Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:

- визначали кількість виділеної ДНК із експериментальних зразків сечі, висушених на марлі, які зберігалися за однакових температурних умов протягом різного часу;

- визначали придатність виділеної ДНК із висушених на марлі зразків сечі шляхом типування за допомогою ПЛР;

- проводили порівняльний аналіз ДНК- профілів виділеної ДНК із висушених на марлі зразків сечі з ДНК-профілями відповідних зразків для встановлення тотожності за результатами генотипування;

- розробляли рекомендації по проведенню судово-медичної експертизи зразків сечі, висушених на марлі, за допомогою сучасних молекулярно-генетичних методів з метою ідентифікації особи.

Характеристика досліджуваного матеріалу: експериментальні зразки сечі. Для проведення експериментального молекулярно-генетичного дослідження відбирали зразки рідкої сечі від 20 здорових добровольців: 10 чоловіків та 10 жінок, об'єм кожного зразка рідкої сечі складав не менше ніж 200,0 мл, зразки відбирали у стерильні одноразові ємності об'ємом 200,0 мл, після чого зразки рідкої сечі розділяли на аліквоти по 3,0 мл та за допомогою автоматичного дозатора з перемінним об'ємом переносили на стерильну медичну марлю розмірами 6,0 х 6,0 см та маркували. Марлю висушували при кімнатній температурі (22°С), зразки сечі зберігали в паперових конвертах при кімнатній температурі (22°С) протягом 1, 30, 60 та 90 діб.

Контрольну групу зразків сечі сформували з відповідних зразків, біологічний матеріал яких досліджували у день відбору матеріалу.

Від кожного добровольця за його згодою на стерильний ватний тампон за допомогою спеціального набору відбирався зразок букального епітелію, який використовувався для порівняльного аналізу отриманих генотипів.

Вплив факторів зовнішнього середовища був мінімізований: експериментальні зразки розміщували таким чином, щоб пряме сонячне світло та волога на них не потрапляли. Температуру вимірювали аспіраційним психрометром Асмана при точності до 0,1%. Рівень вологості у приміщенні не перевищував 60%.

Виділення ДНК з експериментальних зразків сечі. Процес виділення ДНК з експериментальних зразків сечі проводили на 1 добу, на 30 добу, на 60 добу та на 90 добу. З середини плями з експериментальним зразком сечі, що містилась на марлі, вирізали фрагменти розмірами 2,0 х 2,0 см, які переносили у відповідним чином промарковані мікроцентрифужні пробірки типу «Еппендорф» об'ємом 1,5 мл. Виділення ДНК проводили за допомогою спеціального набору реагентів «PrepFiler® Forensic DNA Extraction Kit» («Applied Biosystems», США) для виділення ДНК з криміналістичних зразків, за стандартним протоколом для виділення геномної ДНК з біологічних об'єктів. Отриману ДНК розчиняли в 5,0 мкл буферу для елюції.

Визначення кількості виділеної ДНК. Кількість виділеної ДНК визначали за допомогою флюорометра Qubit 2.0 Instrument Q 32866 («Invitrogen», США) та набору реагентів виробництва «Invitrogen» (США) з терміном придатності не менш ніж 12 місяців, відповідно до інструкції, яка додається виробниками реагентів.

Типування локусів ДНК. Типування гіпер- варіабельних STR-локусів ДНК геному людини проводили в мультилокусному форматі за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), використовували набір реагентів для ПЛР- ампліфікації «AmpFISTR® Identifiler Plus» («Applied Biosystems», США) із застовуванням систем ензиматичної ампліфікації наступних ло- кусів: локуси D8S1179, D2S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA, Amelogenin), з терміном придатності не менш, ніж 9 місяців, відповідно до інструкції, яка додається виробниками реагентів. При постановці ПЛР здійснювали негативний контроль (реакційна суміш містила всі компоненти, крім ДНК) і позитивний контроль (реакційна суміш містила ДНК із відомим набором алелів по кожному локусу). Для оцінки специфічності реакції використовували позитивний контроль (проба контрольної ДНК 9947A: D8S1179: 13, 13; D21S11: 30, 30; D7S820: 10,11; CSF1PO: 10,12; D3S1358: 14,15; THO1: 8, 9.3; D13S317: 11, 11; D16S539: 11, 12; D2S1338: 19, 23; D19S433: 14, 15; vWA: 17, 18; TPOX: 8, 8; D18S51: 15, 19; D5S818: 11, 11; FGA: 23, 24; Amelogenin: X, X. Зразки контрольної ДНК були надані виробником реагентів. Дослідження проводили з використанням системи «GeneAmp® PCR 2720» («Applied Biosystems», США).

Розділення та детекцію флюоресцентно мічених ампліфікованих фрагментів проводили з використанням пристрою «3130 Genetic Analyzer» («Applied Biosystems», США) у середовищі полімеру РОР-4. Встановлення довжини ампліфі- кованих фрагментів з встановленням алелів проводили за допомогою програми «Gene Mapper ID Software Version 3.1» на підставі внутрішнього стандарту довжини GeneScan-500 LIZ Size Standard («Applied Biosystems», США) та алель- ного леддеру, який входить до складу набору.

Статистична обробка одержаних результатів. Статистичний аналіз результатів дослідження проводили з використанням t-критерію Стьюдента, який визначався за допомогою комп'ютерної програми Statistica -- 6. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними групами при Р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. Результати проведеної науково-дослідної роботи по дослідженню експериментальних зразків сечі, висушених на марлі, оцінювали відповідно до наступних критеріїв:

1. Кількісний вихід ДНК в нг, тобто кількість виділеної геномної ДНК з експериментальних зразків сечі, які зберігалися за однакових температурних умов протягом різного часу;

2. Придатність виділеної ДНК для аналізу методом ПЛР (можливість отримання продуктів ампліфікації на матриці виділеної ДНК та отримання повного генетичного профілю);

3. Якість ДНК-профілів, отриманих з експериментальних зразків сечі, які зберігалися за однакових температурних умов протягом різного часу, оцінювали шляхом проведення порівняльного аналізу отриманих ДНК-профілів з ДНК- профілями відповідних зразків для встановлення тотожності за результатами генотипування.

На першому етапі визначали кількість ДНК, виділеної із експериментальних зразків сечі, які зберігалися при кімнатній температурі (22°С) протягом 1, 30, 60, 90 діб. Дані про кількість виділеної ДНК показані в таблиці 1.

Таблиця 1. Кількість ДНК (нг), виділеної із експериментальних зразків сечі, які зберігалися при кімнатній температурі (22 °С) протягом 1, 30, 60, 90 діб

З даних, наведених у таблиці 1, випливає наступне:

1. Статистичні дані показують, що кількість ДНК, виділеної з експериментальних зразків сечі, висушених на марлі, які зберігалися при температурі 22 °С протягом 1, 30, 60 та 90 діб, залежить від статі, що виражається у співвідношенні 3,3:1,0 відповідно, та від терміну зберігання.

Висновок: відповідно до отриманих даних, з плями сечі розміром 2,0 х 2,0 см, яка утворена рідкою сечею об'ємом 3,0 мл, відібраною від одного чоловіка, та яка зберігалася протягом 90 діб при температурі 22°С, теоретично можливо виділити ДНК в кількості достатньої для проведення 1 генотипування. З аналогічної плями сечі, утвореної рідкою сечею об'ємом 3,0 мл, відібраною від жінки, та яка зберігалася у аналогічних умовах теоретично можливо виділити ДНК в кількості достатній для проведення 4,6 генотипувань.

2. Процеси деградації ДНК в експериментальних зразках сечі, які зберігалися при температурі 22°С протягом 90 діб, виражаються у повільному зниженні кількості виділеної ДНК, в середньому, на 2,5% у жінок та 3,5% у чоловіків відносно контрольної групи зразків. Деградація має поступовий характер: до 90 доби зберігання експериментальних зразків сечі жінок кількість виділеної ДНК зменшилася на 10,5% відносно контрольної групи, та на 21% у чоловіків, відповідно.

Висновок: відповідно до отриманих даних, можливо припустити, що час збереження експериментальних зразків сечі, висушених на марлі, від жінок та чоловіків при температурі 22°С може складати більше, ніж 90 діб, тобто після 90 діб вищевказані зразки сечі ще можливо використовувати для генотипування, при цьому кількість виділеної ДНК буде достатньою для ге- нотипування.

На другому етапі дослідження визначали придатність виділеної з експериментальних зразків сечі жінок та чоловіків ДНК для аналізу методом ПЛР за наступними критеріями: отримання повного або неповного (часткового) генетичного профілю (ДНК-профілю) при типуванні 15 гіперваріабельних STR-локусів ДНК геному людини при використанні набору реагентів для ПЛР-ампліфікації «AmpFlSTR®Identifiler®Plus» («Applied Biosystems», США), враховуючи ефекти «випадіння» алелей або повну відсутність продуктів ензиматичної ампліфікації.

Результати позитивного генотипування -- отримання повного ДНК-профілю при типуванні 15 гіперваріабельних STR-локусів залежали від кількості виділеної ДНК, яка, в свою чергу, залежала від терміну зберігання зразків. судовий медичний сеча генетичний

В процесі дослідження кореляції між терміном зберігання та температурою зберігання експериментальних зразків сечі, які були відібрані,

було встановлено: для зразків сечі, висушених на марлі, відібраних від жінок та чоловіків, максимальний термін зберігання при температурі 22°С складає більше 90 діб.

У зв'язку із цим нами перевірялись на придатність для генотипування лише експериментальні зразки сечі, які зберігалися 90 діб при температурі 22°С (див. табл. 2).

Таблиця 2. Результати типування ДНК, виділеної із експериментальних зразків сечі, які зберігалися 90 діб при температурі 22°С зразків (п=20)