2.3.1 Твердофазный фосфитамидный синтез комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов

Приготовление растворов мономеров

Качество коммерческих препаратов фосфитамидов, используемых в работе, проверяли методом ТСХ в системе этанол:хлористый метилен (5:95). Защищенные дезоксирибофосфитамиды перед работой сушили над Р₂О₅ при 2-4 мм рт. ст. в течение 1 ч. Количество мономеров рассчитывали, исходя из того, что на каждую стадию конденсации требуется 60 мкл 0.05 М раствора мономера. Для синтеза константных участков комбинаторной оцДНК-библиотеки растворы фосфитамидов готовили из расчета 0.05 г мономера на 1 мл абс. CH₃CN. Для синтеза рандомизированного участка комбинаторной оцДНК-библиотеки смешивали все четыре фосфитамида в одном флаконе из расчета 0.05 г dА-CE, 0.045 г dC-CE, 0.059 г dG-CE и 0.042 г dТ-CE на 1 мл абс. CH₃CN. К готовым растворам фосфитамидов добавляли молекулярные сита.

Синтез комбинаторной оцДНК-библиотеки

Синтез вели на синтезаторе ASM-800 (“Биоссет”, Россия) в масштабе 0.4 мкмоль (реактор на 50 мкл) твердофазным фосфитамидным методом согласно протоколу, приведенному в табл. 3.

Таблица 3. Протокол операций автоматического фосфитамидного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов

*-в случае синтеза рандомизированного участка использовали раствор 4-х фосфитамидов в абс. CH₃CN.

2.3.2 Деблокирование олигодезоксирибонуклеотидов [160]

Полимер после синтеза (из одного реактора) сушили в вакууме мембранного насоса DOA V130 BN (Waters, США) в течение 2 мин и переносили в пробирку на 0.6 мл. К полимеру приливали 0.3 мл 40 %-ного водного метиламина и выдерживали в течение 15 мин при 65°С и постоянном перемешивании (термостатируемый шейкер Thermomixer compact (Eppendorf, Германия), 14000 об./мин). Затем раствор выдерживали при -20°С в течение 15-20 мин и отделяли от полимера. Полимер промывали 3х100 мкл смеси этанол:ацетонитрил:вода (1:1:1). Растворы объединяли и упаривали до сухого остатка в вакуумном испарителе Speed-Vac (Eppendorf, Германия). Сухой остаток растворяли в 100 мкл воды и измеряли оптическую плотность полученного раствора.

2.3.3 Выделение олигодезоксирибонуклеотидов

Выделение олигодезоксирибонуклеотидов - праймеров

К реакционным смесям после синтеза и деблокирования олигонуклеотидов (п. 2.3.2.) добавляли равный объем денатурирующего буфера А и наносили на 15%-ный ПААГ толщиной 0.8 мм из расчета 3-4 о.е. на карман. После проведения электрофореза олигонуклеотиды в геле визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Учасок геля, содержащий целевой олигонуклеотид, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М NaClO₄ и перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, Eppendorf, Германия, 400 об./мин). Элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Объединенные элюаты обессоливали на картридже Alltech C 18 (США), промывая колонку сначала 0.05 М водным раствором NaClO₄, затем 0.05 М NaClO₄ в 50%-ном CH₃CN. Растворы олигонуклеотидов упаривали на испарителе SpeedVac (Eppendorf, Германия) до объема 0.1 мл. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 1 мл 2%-ного NaClO₄ в ацетоне с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, Eppendorf, Германия, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернатант отбирали, осадок промывали ацетоном и высушивали в течение 5 мин при 37°С.

Гомогенность выделенных олигонуклеотидов анализировали гель-электрофорезом в 15%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

Выделение комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов

К реакционной смеси после синтеза и деблокирования библиотеки олигонуклеотидов (п. 2.3.2.) добавляли равный объем денатурирующего буфера А и наносили на 12%-ный ПААГ толщиной 0.8 мм из расчета 3-4 о.е. на карман. После проведения электрофореза олигонуклеотиды в геле визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий целевой олигонуклеотид, вырезали и заливали 1 мл 2 мМ Na₂EDTA в 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 7.8), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, Eppendorf, Германия, 400 об./мин). Элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка (по объему) этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, Eppendorf, Германия, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернатант отбирали, осадок промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Гомогенность выделенной библиотеки анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

2.3.4 Получение 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки

Синтез дцДНК-библиотеки с использованием оцДНК-матрицы [54]

5'-Праймер dm 28 или dm 28 long (2 нмоль) и оцДНК-библиотеку (п. 2.3.3.) (1 нмоль) предварительно инкубировали в буфере (90 мкл), содержащем 10 мM Tрис-HCl (pH 8.0) и 10 мM MgCl₂, в течение 5 мин при 90°С (микротермостат “Модель 206”, ООО “БИС-Н”, Россия). Реакционную смесь охлаждали во льду в течение 5 мин и добавляли в буфер (600 мкл), содержащий 10 мM Tрис-HCl (pH 7.5), 5 мM MgCl₂, 7.5 мM DTT, 0.5 мM dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 50 е.а./мл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч (суховоздушный термостат, Jouan, Франция). Для остановки реакции добавляли 12 мкл 100 мМ Na₂EDTA (pH 8.3). Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка этанола в присутствии 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 7.8) с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернантант отбирали, осадок промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученный осадок растворяли в 18 мкл бидистиллированной воды. К раствору добавляли 2 мкл буфера В и наносили на 12%-ный нативный ПААГ толщиной 0.8 мм. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий дцДНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 2 мМ Na₂EDTA в 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 7.8) и перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин). Элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка этанола как описано выше. Осадок дцДНК-библиотеки растворяли в 20 мкл буфера (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0) и 1 мМ Na₂EDTA). Полученный раствор дцДНК-библиотеки использовали в качестве матрицы в реакции транскрипции in vitro.

Транскрипция in vitro с использованием набора “TranscriptAid T7 high yield transcription kit” (Fermentas)

Реакцию синтеза 2'-F-РНК проводили в однократном буфере TranscriptAid™ (Fermentas) (20 мкл), содержащем 2 мкл TranscriptAid™ смеси ферментов (Fermentas), 2 мкг дцДНК-библиотеки, по 2 мкл 100мМ ATP, GTP, CTP, UTP (Fermentas) при 37°С в течение 7 ч (суховоздушный термостат). По окончании инкубации в реакционную смесь добавляли 10 мкл ДНКазы I, свободной от РНКаз, и инкубировали в течение 15 мин при 37°С (суховоздушный термостат). Затем в реакционную смесь добавляли 100 мМ Na₂EDTA (pH 8.0) до концентрации 40 мкM в реакционной смеси и инкубировали при 65°С в течение 10 мин (микротермостат “Модель 206”). К реакционной смеси добавили 50 мкл 3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2) и последовательно экстрагировали смесью фенол:хлороформ (1:1) (500 мкл) и хлороформом (500 мкл). РНК-транскрипт осаждали добавлением 2.5-кратного избытка этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок 2'-F-РНК отделяли центрифугированием (центрифуга Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Германия, 13000 об./мин, 10 мин, 4°С), промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученный осадок РНК-транскрипта растворяли в буфере А и проводили гель-электрофорез в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали этанолом как описано выше. Полученную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку растворяли в бидистиллированной воде и хранили при -20°С.

Гомогенность выделенного транскрипта анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

Транскрипция in vitro и выделение 2'-F-пиримидинсодержащего РНК-транскрипта [54]

Реакцию синтеза 2'-F-РНК проводили в буфере (500 мкл), содержащем 4% (масса/объем) полиэтиленгликоля 8000, 40 мM Tрис-HCl (pH 8.0), 12 мM MgCl₂, 5 мM DTT, 1 мM спермидин гидрохлорид, 0.002% (по объему) Tритона X-100, 1 мM ATP, 1 мM GTP, 3 мМ 2'-F-CTP, 3 мM 2'-F-UTP, раствор 250 пмоль дцДНК-библиотеки в буфере (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ Na₂EDTA), 3500 е.а./мл Т7 РНК-полимеразы, при 37°С в течение 7 ч (суховоздушный термостат). По окончании инкубации в реакционную смесь добавляли 10 мкл ДНКазы I, свободной от РНКаз, и инкубировали в течение 15 мин при 37°С (суховоздушный термостат). Затем в реакционную смесь добавляли 100 мМ Na₂EDTA (pH 8.0) до концентрации 40 мкM в реакционной смеси и инкубировали при 65°С в течение 10 мин (микротермостат “Модель 206”). К реакционной смеси добавили 50 мкл 3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2) и последовательно экстрагировали смесью фенол:хлороформ (1:1) (500 мкл) и хлороформом (500 мкл). РНК-транскрипт осаждали добавлением 2.5-кратного избытка этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок 2'-F-РНК отделяли центрифугированием (центрифуга Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Германия, 13000 об./мин, 10 мин, 4°С), промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученный осадок РНК-транскрипта растворяли в буфере А и проводили гель-электрофорез в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали этанолом как описано выше. Полученную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку растворяли в бидистиллированной воде и хранили при -20°С.

Гомогенность выделенного транскрипта анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

2.3.5 Амплификация 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки (по оптимизированному нами протоколу [54])

Обратная транскрипция 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки 2'-F-РНК (3 пмоль) и 3'-праймер dm 29 (100 пмоль) в 30 мкл бидистиллированной воды предварительно инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. Полученный дуплекс 2'-F-РНК и 3'-праймера dm 29 использовали в реакции обратной транскрипции. Синтез кДНК проводили в буфере (50 мкл), содержащем 50 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 8 мM MgCl2, 30 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 400 е.а./мл AMV RT, при 37°С в течение 30 мин, затем при 48°С в течение 30 мин (термостатируемый шейкер, BIOER, США).

Амплификация кДНК, полученной в ходе обратной транскрипции

Реакционную смесь после обратной транскрипции использовали для последующей амплификации. Реакционная смесь для ПЦР (1000 мкл) содержала 7.5 мМ MgCl₂, 1 мM dGTP, 1 мM dATP, 1 мM dCTP, 1 мM dTTP, 2 мкМ 3'-праймера dm 29, 2 мкМ 5'-праймера dm 28/ dm 28 long, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl. Реакционную смесь переносили в 10 ПЦР-пробирок на 0.5 мл по 100 мкл реакционной смеси в каждую и помещали в амплификатор Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия).

Амплификацию проводили в следующих условиях: 93°С 3 мин, 93°С 30 сек, 63°С 1 мин, 72°С 1 мин, затем повтор еще 20 циклов, охлаждение до 4°С. Продукты амплификации анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.

Очистка ПЦР-продукта

Способ 1. ПЦР-продукт выделяли препаративным гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в нативных условиях, используя гель толщиной 0.4 мм. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий дцДНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 2 мМ Na₂EDTA в 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 7.8), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок ПЦР-продукта отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернантант отбирали, осадок промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Полученную дцДНК растворяли в буфере (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ Na₂EDTA) и хранили при -20°С.

Способ 2. ПЦР-продукт очищали от праймеров, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и фермента с использованием набора “DNA clean & concentrator-25” (Zymo Research, США):

1. колонку Zymo-Spin помещали в пробирку на 2 мл;

2. к реакционной смеси (1000 мкл) после проведения ПЦР добавляли 2-кратный избыток (по объему) ДНК-связывающего буфера (Zymo Research), перемешивали, центрифугировали в течение 15 сек при 14400 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

3. 800 мкл полученного раствора наносили на колонку и центрифугировали в течение 30 сек при 14400 об./мин, 20°С;

4. колонку промывали 2х200 мкл промывочного буфера (Zymo Research), центрифугировали в течение 30 сек при 14400 об./мин, 20°С;

5. колонку переносили в новую пробирку на 1.5 мл;

6. элюировали олигонуклеотидный материал с колонки добавлением 30 мкл буфера (10 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ Na₂EDTA), центрифугировали в течение 30 сек при 14400 об./мин, 20°С.

In vitro транскрипция

Полученную дцДНК-библиотеку далее использовали в реакции транскрипции in vitro как описано в п. 2.3.4. 2'-F-Модифицированную РНК-библиотеку очищали препаративным гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ толщиной 0.4 мм в денатурирующих условиях. Олигонуклеотиды визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, 400 об./мин), элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали этанолом как описано выше. 2'-F-РНК растворяли в бидистиллированной воде и хранили при - 20°С.

2.3.6 SELEX, один раунд (по оптимизированному нами протоколу [50])

Иммобилизация аутоантител, образование комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой

Поликлональные аутоантитела класса G (2.6 мг/мл, 0.7 мкл) в 50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), разбавляли 0.05 М NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9.6) до концентрации 10 мкг/мл. 100 мкл полученного раствора помещали в ПЦР-пробирку и инкубировали при 4°С в течение 16-20 ч. Раствор несвязавшихся со стенками пробирки антител удаляли. Иммобилизованные на стенках ПЦР-пробирки антитела промывали 4х100 мкл промывочного буфера (50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl, 0.05%-ный (по объему) Твин 20). Далее в ПЦР-пробирку с иммобилизованными антителами добавляли 500 мкл блокирующего буфера (50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl, 0.1%-ный (масса к объему раствора) казеин) и инкубировали при комнатной температуре 1 ч, после чего еще раз промывали антитела 500 мкл промывочного буфера.

2'-F-Модифицированную РНК-библиотеку в 100 мкл буфера для связывания (50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl) инкубировали при 90°С в течение 3 мин (микротермостат “Модель 206”). Охлаждали до комнатной температуры, помещали в ПЦР-пробирку с иммобилизованными антителами и инкубировали при комнатной температуре 1 ч. Несвязавшиеся с аутоантителами олигонуклеотиды удаляли. Комплекс иммобилизованных аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой промывали 500 мкл промывочного буфера.

Разрушение комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой. Реакция обратной транскрипции

Вариант 1. В ПЦР-пробирку с иммобилизованными комплексами аутоантител и 2'-F- РНК добавляли 100 мкл 7 М мочевины, 200 мкл смеси Tрис-HCl (pH 8.0): фенол (1:5) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли 50 мкл бидистиллированной воды и 100 мкл хлороформа, центрифугировали (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 15 сек, 20°С) и отбирали водный слой. К нему добавляли 200 мкл смеси Tрис-HCl (pH 8.0): фенол (1:5), 100 мкл хлороформа и центрифугировали (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 15 сек, 20°С). К отобранному водному слою добавляли 20 мкл 3М CH₃CO₂Na (pH 5.2). Олигонуклеотидный материал осаждали 2.5-кратным избытком этанола (п. 2.3.4). Полученный осадок 2'-F-РНК растворяли в 20 мкл бидистиллированной воды. К раствору добавляли 100 пмоль 3'-праймера dm 29, инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. Полученный дуплекс 2'-F-РНК и 3'-праймера dm 29 использовали в реакции обратной транскрипции. Синтез кДНК проводили в буфере (50 мкл), содержащем 50 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 8 мM MgCl₂, 30 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 400 е.а./мл AMV RT, при 37°С в течение 30 мин, затем при 48°С в течение 30 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученную кДНК использовали в ПЦР.

Вариант 2. В ПЦР-пробирку с иммобилизованными комплексами аутоантител и 2'-F- РНК добавляли буфер (100 мкл), содержащий 50 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 8 мM MgCl₂, 30 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 100 пмоль 3'-праймера dm 29, инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. К полученной реакционной смеси добавляли обратную транскриптазу AMV до концентрации 400 е.а./мл и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, затем при 48°С в течение 30 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученную кДНК использовали в ПЦР.

Полимеразная цепная реакция и реакция транскрипции in vitro

С использованием полученной кДНК (вариант 1 или 2) проводили ПЦР в буфере (1000 мкл), содержащем 7.5 мМ MgCl₂, 1 мM dGTP, 1 мM dATP, 1 мM dCTP, 1 мM dTTP, 2 мкМ 3'-праймера dm 29, 2 мкМ 5'-праймера dm 28 long, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl. Реакционную смесь переносили в 10 ПЦР-пробирок на 0.5 мл по 100 мкл реакционной смеси в каждую и помещали в амплификатор Mastercycler gradient.

Амплификацию проводили в следующих условиях: 93°С 3 мин, 93°С 30 сек, 63°С 1 мин, 72°С 1 мин, затем повтор еще 20 циклов, охлаждение до 4°С.

ПЦР-продукт очищали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в нативных условиях или с помощью набора “DNA clean & concentrator-25” как описано в п. 2.3.3.

Очищенную таким образом дцДНК-библиотеку использовали в качестве матрицы для реакции транскрипции in vitro (п. 2.3.4). Полученную при этом 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку растворяли в бидистиллированной воде и использовали для следующего раунда SELEX.

2.3.7 “Негативный” SELEX

В ПЦР-пробирку на 0.5 мл помещали 100 мкл 0.05 М NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9.6) и инкубировали при 4°С в течение 16-20 ч. Буфер удаляли, ПЦР-пробирку промывали 4х100 мкл промывочного буфера. Далее в ПЦР-пробирку добавляли 500 мкл блокирующего буфера и инкубировали при комнатной температуре 1 ч, после чего еще раз промывали пробирку 500 мкл промывочного буфера.

2'-F-Модифицированную РНК-библиотеку в 100 мкл буфера для связывания инкубировали при 90°С в течение 3 мин (микротермостат “Модель 206”). Затем охлаждали до комнатной температуры, переносили в ПЦР-пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Буфер с несвязавшимися олигонуклеотидами удаляли и использовали в следующем раунде SELEX.

2.3.8 Введение радиоактивной метки по 5'-концу 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки

Дефосфорилирование. Реакцию дефосфорилирования 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки проводили в буфере (100 мкл), содержащем 0.01 М Tрис-HCl (pH 7.5), 0.01 M MgCl₂, 160 пмоль 2'-F-РНК, 120 е.а./мл бактериальной щелочной фосфатазы, при 50°С в течение 1 ч (термостатируемый шейкер, BIOER). Реакционную смесь последовательно экстрагировали смесью Tрис-HCl (pH 7.0):хлороформ:фенол (1:24:25) (100 мкл) и серным эфиром (100 мкл). Полученную дефосфорилированную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку осаждали добавлением 2.5-кратного избытка этанола в присутствии 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2) с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок 2'-F-РНК отделяли центрифугированием (центрифуга Centrifuge 5415 R, Eppendorf, 13000 об/мин, 4°С, 10мин), промывали 75%-ным этанолом, сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин и растворяли в бидистиллированной воде.

Введение радиоактивной метки. Введение радиоактивной метки по 5'-концу 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки проводили в буфере (20 мкл), содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl₂, 5 мМ DTT, 0.1 мМ Na₂EDTA, 0.1 мМ спермидин гидрохлорид, 0.1 мКи г-[³²P]-АТP, 10% (по объему) диметилсульфоксида, 500 е.а./мл полинуклеотидкиназы фага Т4, в течение 2 ч при 37°С (термостатируемый шейкер, BIOER). Затем к реакционной смеси добавляли 5 е.а. полинуклеотидкиназы фага Т4 и инкубировали еще 1 ч при 37°С.

После окончания инкубации к реакционной смеси добавляли равный объем буфера А. [³²P]-Меченую РНК-библиотеку выделяли гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ. Визуализацию 5'-[³²P]-меченых олигорибонуклеотидов в геле проводили с помощью радиоавтографии на рентгеновскую пленку Agfa (Бельгия). Полосу 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки вырезали из геля, элюировали 0.3 М CH₃CO₂Na (pH 5.2) и осаждали добавлением этанола как описано выше.

2.3.9 Определение констант диссоциации комплексов 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки с поликлональными аутоантителами [54, 161]

Определение области концентраций аутоантител для измерения K_d

Для определения области концентраций аутоантител, в которой происходит диссоцияция их комплексов с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой, готовили 12 проб аутоантител (20 мкл каждая) в буфере для связывания состава 50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl. Концентрации антител варьировали от 3 мкМ до 17 пМ путем трехкратного разбавления каждой последующей пробы. [³²P]-Меченую 2'-F-пиримидинсодержащую РНК-библиотеку растворяли в буфере для связывания до концентрации 13 нМ, инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. Затем к каждой пробе аутоантител добавляли 80 мкл раствора 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в буфере для связывания и инкубировали при комнатной температуре в течение 14 ч. В качестве контроля использовали пробу, содержащую 1 пмоль [³²P]-меченой 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в 100 мкл буфера для связывания.

Нитроцеллюлозные фильтры для радиоавтографии диаметром 2.5 см вырезали из нитроцеллюлозных фильтров MF-Millipore^TM диаметром 9 см. Фильтры для нанесения проб выдерживали в буфере для связывания в течение 12-14 ч при 4°С. Фильтры, использующиеся для контроля, оставляли сухими. Перед нанесением пробы фильтры промывали 3 мл буфера для связывания. Пробы (95 мкл) наносили на фильтр, промывали 5 мл буфера для связывания и высушивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Контроль (95 мкл) наносили на сухой фильтр и высушивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Высушенные фильтры сканировали при помощи фосфоримиджера Molecular Imager FX (BioRad, США). Для получения количественных характеристик радиоавтографы нитроцеллюлозных фильтров переводили в цифровую форму в программном пакете Quantity one (BioRad, США). Долю комплексов олигонуклеотидов с белками определяли как отношение интенсивности пятна комплексов к интенсивности пятна свободных олигонуклеотидов. Полученные данные описывали приведенным ниже уравнением, используя программу SigmaPlot 8.0:

f = С·(K_d + [140] + [P] - ((K_d + [140] + [P])² - 4·[140]·[P])^0.5)/(2·[140]),

где [P] - концентрация белка; [140] - концентрация 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки; f - доля связавшихся олигонуклеотидов; K_d - константа диссоциации комплексов 2'-F-РНК с антителами; С - константа эффективности связывания комплексов аутоантител и олигонуклеотидов с нитроцеллюлозными фильтрами.

Используя полученные данные, находили константу С. Отношение f/С давало f_норм - нормированное значение доли комплексов олигонуклеотидов с аутоантителами. Нормированные данные описывали тем же уравнением, принимая С равной 1, и находили K_d.

Определение K_d комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированными РНК-библиотеками

Определение K_d проводили аналогичным образом. Пробы аутоантител готовили с учетом полученных значений доли комплексов аутоантител и 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в зависимости от концентрации аутоантител. Концентрации антител для определения K_d комплексов аутоантител с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой были равны: 12000 нМ, 6000 нМ, 3000 нМ, 1000 нМ, 330 нМ, 110 нМ, 37 нМ, 4.1 нМ. Концентрации антител для определения K_d комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой после 6-го раунда отбора были равны: 1800 нМ, 600 нМ, 200 нМ, 66 нМ, 22 нМ, 7.4 нМ, 2.4 нМ, 0.8 нМ, 0.3 нМ. Концентрации антител для определения K_d комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой после 10-го раунда отбора были равны: 600 нМ, 200 нМ, 66 нМ, 22 нМ, 7.4 нМ, 2.4 нМ, 0.8 нМ, 0.3 нМ. [³²P]-Меченую 2'-F-пиримидинсодержащую РНК-библиотеку растворяли в буфере для связывания из расчета (n+1) пмоль РНК, где n - количество проб аутоантител. Комплексообразование, мобилизацию на нитроцеллюлозных фильтрах и расчет K_d проводили как указано выше.

2.3.10 Хроматографическое разделение 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX по сродству к поликлональным аутоантителам

Хроматографию проводили на хроматографе BioCAD Sprint (Perseptive Biosystems, США), измерение оптической плотности вели при 260 нм. Колонку (9x30 мм) с иммобилизованным на BrCN-активированной сефарозе пулом поликлональных аутоантител предварительно промывали 20 мМ Tрис-HCl (pH 7.5) со скоростью потока элюента, равной 0,2 мл/мин. На колонку наносили 3.55 о.е. 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX (60 мкл) и промывали 20 мМ Tрис-HCl (pH 7.5) (фр. 1) для удаления несвязавшихся молекул 2'-F-РНК. Окончание стадии промывки контролировали по изменению оптической плотности. Далее проводили ступенчатую элюцию 2'-F-РНК растворами следующего состава, контролируя оптическую плотность фракций: 0.1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 2); 0.3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 3); 0.5 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 4); 1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 5); 2 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 6); 3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 7); 1 М MgCl₂ в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 8); 2 М MgCl₂ в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 9); 3 М MgCl₂ в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 10) и 0.1 М глицином, pH 2.6 (фр. 11) (рис. 18). К фракции 11 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в 0.1 М глицине добавляли 1 М Tрис-HCl (pH 8.0) до pH ~7.5. Полученные фракции 2'-F-РНК обессоливали и концентрировали на колонках Microcon YM-30 (Millipore, Ирландия), проводя следующие операции:

1. колонку Microcon YM-30 помещали в пробирку на 1.5 мл;

2. 500 мкл олигонуклеотидной фракции наносили на колонку;

3. центрифугировали пробу 8 мин при 14400 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

4. переворачивали колонку и помещали ее в новую пробирку на 1.5 мл;

5. центрифугировали пробу 3 мин при 3800 об./мин, 20°С;

6. для повторной элюции олигонуклеотидного материала на колонку наносили 10 мкл бидистиллированной воды, колонку переворачивали и помещали в пробирку с 2'-F-РНК библиотекой (п. 5);

7. центрифугировали 3 мин при 3800 об./мин, 20°С;

8. каждую фракцию 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки (п. 5,7) собирали в одну пробирку на 1.5 мл.

Обессоленную фракцию 2 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки разделили на две части: фракцию I (основная часть фракции 2) и фракцию II (“конечная” часть фракции 2). Обессоленную фракцию 11 обозначили как фракцию III. Фракцию I осадили добавлением 2.5-кратного избытка (по объему) этанола как описано в пункте 2.3.4. Осадок растворили в бидистиллированной воде и хранили при - 20°С. Фракции II и III 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки после обессоливания амплифицировали как описано в пункте 2.3.5. с целью наработки необходимых количеств фракций 2'-F-РНК.

2.3.11 Получение плазмидной ДНК на основе вектора pUC18 и дцДНК-библиотеки фракций I, II и III

Проверка рестриктазной активности эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII

Проверку рестриктазной аутивности вели на примере вектора pUC18. Реакции гидролиза проводили отдельно для каждой рестриктазы в однократном буфере FastDigest (Fermentas) (10 мкл), содержащем 0.1 пкмоль pUC18, 200 е.а./мл рестриктазы BamHI или 200 е.а./мл рестриктазы HindIII при 37°С в течение 5 мин, а затем при 80°С в течение 10 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученные реакционные смеси анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (п. 2.2.).

Получение дцДНК-библиотеки фракций I, II и III методом ОТ-ПЦР “высокой точности” (high-fidelity)

Обратную транскрипцию фракций I, II и III (п. 2.3.10.) 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки проводили, как описано в п. 2.3.5, используя в качестве матрицы 20 пкмоль 2'-F-РНК. Реакционная смесь ПЦР высокой точности (1000 мкл) содержала 1 мМ MgCl₂, 50 мкM dGTP, 50 мкM dATP, 50 мкM dCTP, 50 мкM dTTP, 2 мкМ 5'-праймера HindIII, 2 мкМ 5'-праймера BamHI, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 50 мкл реакционной смеси ОТ, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl. Реакционную смесь переносили в 10 ПЦР-пробирок на 0.5 мл по 100 мкл реакционной смеси в каждую и помещали в амплификатор Mastercycler gradient.

Амплификацию проводили в следующих условиях: 93°С 3 мин, 93°С 30 сек, 63°С 1 мин, 72°С 1 мин, затем повтор еще 20 циклов, охлаждение до 4°С.

ПЦР-продукт очищали с помощью набора “DNA clean & concentrator-25” как описано в п. 2.3.5.

Эндонуклеазное расщепление вектора pUC18 и дцДНК-библиотеки фракций I, II и III рестриктазами BamHI и HindIII

Полученную дцДНК-библиотеку каждой фракции подвергали эндонуклеазному расщеплению рестриктазами BamHI и HindIII. Реакцию гидролиза проводили в однократном буфере FastDigest (Fermentas) (50 мкл), содержащем 55 пкмоль дцДНК-библиотеки, 40 е.а./мл рестриктазы BamHI и 40 е.а./мл рестриктазы HindIII, в течение 2 ч 30 мин при 37°С (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученную дцДНК-библиотеку с “липкими” концами очищали с помощью набора “DNA clean & concentrator-5” как описано в п. 2.3.5.

Вектор pUC18 также подвергали эндонуклеазному расщеплению. Реакцию гидролиза проводили в однократном буфере FastDigest (Fermentas) (20 мкл), содержащем 1.5 пкмоль pUC18, 50 е.а./мл рестриктазы BamHI и 50 е.а./мл рестриктазы HindIII при 37°С в течение 10 мин, а затем при 80°С в течение 10 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). К реакционной смеси добавляли 150 ед. акт. бактериальной щелочной фосфатазы и инкубировали при 60°С в течение 1 ч. Полученный линеаризованный вектор очищали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (п. 2.2.). Участок геля, содержащий линеаризованный вектор, вырезали, измельчали скальпелем и проводили выделение вектора из геля на колонках GenElute^TM Minus EtBr Spin Columns (Sigma-Aldrich, США):

1) колонку GenElute^TM Minus EtBr Spin Column помещали в пробирку на 1.5 мл;

2) на колонку наносили 100 мкл бидистиллированной воды и центрифугировали 5 сек при 3500 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

3) помещали колонку в новую пробирку на 1.5 мл;

4) переносили гель с вектором на колонку, центрифугировали 10 мин при 14500 об./мин, 20°С.

Полученный при этом линеаризованный вектор осаждали добавлением 2.5-кратного избытка (по объему) этанола как описано в пункте 2.3.4. Осадок растворяли в бидистиллированной воде и хранили при - 20°С.

Получение плазмидной ДНК

Реакцию лигирования проводили в однократном буфере Tango (Fermentas) (20 мкл), содержащем 4 пкмоль дцДНК-библиотеки с “липкими” концами, 0.2 пкмоль вектора pUC18, 0.5 мМ DTT, 1мМ ATP, 33 мМ Tрис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ (CH₃CO₂)₂Mg, 66 мМ CH₃CO₂K, 0.1 мг/мл BSA, 50 е.а./мл T4 ДНК-лигазы при 14°С в течение 14-16 ч (термостатируемый шейкер, BIOER). Затем реакционную смесь в течение 5 мин инкубировали при 65°С и охлаждали до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляли 20 ед. акт. эндонуклеазы рестрикции PstI и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Полученную реакционную смесь хранили при -20°С.

2.3.12 Приготовление компетентных клеток

Компетентные клетки E.coli штамма DH5б готовили с использованием набора “ Z-Competent E.coli Transformation Kit ” (Zymo Research, США). Среду LB готовили из расчета 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л воды и стерилизовали автоклавированием. В полученную среду LB (2 мл) вносили суспензию клеток E.coli и инкубировали 12-16 ч при 37°С и 250 об./мин в термостатируемом шейкере Environmental Shaker - Incubator ES-20 (BIOSAN, Латвия). Полученную суспензию клеток (0.5 мл) вносили в 50 мл среды ZymoBroth^TM (Zymo Research) и инкубировали при 250 об./мин и 30°С на термостатируемом шейкере до достижения клеточной суспензией оптической плотности D₅₅₀ = 0.4-0.6 о.е./мл (Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer, Milton Roy, США).

Полученную культуру переносили в пробирку для центрифугирования, охлаждали во льду 20 мин и осаждали центрифугированием (центрифуга Centricon T-42K (Kontron Instruments, США) ротор A-16C, 3000 об./мин, 10 мин, 2°С). Супернатант сливали, края пробирки вытирали насухо. Клетки суспензировали в 5 мл предварительно охлажденного до 0°С однократного промывочного буфера (Zymo Research), инкубировали во льду 20 мин и осаждали центрифугированием (центрифуга Centricon T-42K, Kontron Instruments, США, ротор A-16C, 3000 об./мин, 10 мин, 2°С). Супернатант сливали, края пробирки вытирали насухо. Клетки ресуспензировали в 5 мл предварительно охлажденного до 0°С однократного буфера Competent (Zymo Research). Клеточную суспензию расфасовывали по 200 мкл в стерильные предварительно охлажденные до 0°С пробирки на 1.5 мл и хранили при -70°С.

2.3.13 Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК

Трансформацию компетентных клеток проводили согласно протоколу “Fast Transformation of Z-competent^TM Cells” (Zymo Research). Перед трансформацией компетентные клетки размораживали при 0°С. К 200 мкл суспензии компетентных клеток E.coli добавляли лигазную смесь (см. выше) (5 мкл) и аккуратно перемешивали. Полученную суспензию клеток (50 мкл) высевали на предварительно нагретую до 37°С чашку Петри с селективной средой LB, покрытой 10%-ным X-Gal в DMF_абс. (40 мкл) и содержащей 1.5% агара, 100 мкг/мл ампициллина и 0.8 мМ IPTG, и инкубировали при 37°С в течение 16-18 ч. Индивидуальные колонии трансформированных клеток E.coli переносили на чашки Петри с селективной средой LB (по 4 колонии на чашку) и инкубировали при 37°С в течение 16-18 ч.

2.3.14 Определение наличия дцДНК-библиотеки в плазмидной ДНК трансформированных клеток [162]

Наличие дцДНК-библиотеки в плазмидной ДНК трансформированных клеток E.coli проверяли с помощью ПЦР. Для этого часть каждой трансформированной колонии E.coli переносили в 5 мкл воды и суспензировали. Для каждой колонии проводили ПЦР в буфере (100 мкл), содержащем 7.5 мМ MgCl₂, 1 мM dGTP, 1 мM dATP, 1 мM dCTP, 1 мM dTTP, 2 мкМ 5'-праймера seq 1, 2 мкМ 3'-праймера seq 2, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl, 5 мкл клеточной суспензии. ПЦР-пробирки с реакционными смесями помещали в амплификатор Mastercycler gradient.

Амплификацию проводили в следующих условиях: 94°С 1 мин, 94°С 15 сек, 55°С 1 мин, 72°С 2 мин, затем повтор еще 30 циклов, 72°С 2 мин, охлаждение до 4°С.

Полученные реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

2.3.15 Выделение плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, США). Селективную среду LB (3 мл), содержащую 100 мкг/мл ампициллина, инокулировали трансформированными клетками E.coli и инкубировали 12-16 ч при 37°С и 250 об./мин в термостатируемом шейкере Environmental Shaker - Incubator ES-20 (BIOSAN, Латвия). Клетки осаждали центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 3 мин, 8500 об./мин, 20°С). Супернатант удаляли, клетки суспензировали в 250 мкл буфера P1 (QIAGEN). К полученной суспензии добавляли 250 мкл буфера P2 (QIAGEN), пробирку переворачивали несколько раз, пока суспензия не приобрела однородный синий цвет. К полученной суспензии добавляли 350 мкл буфера N3 (QIAGEN), пробирку переворачивали несколько раз до образования однородной белой взвеси в прозрачном растворе. Взвесь осаждали центрифугированием (центрифуга MiniSpin, 10 мин, 13000 об./мин, 20°С) и отбирали супернантант, содержащий плазмидную ДНК. Плазмидную ДНК очищали на колонках QIAprep Spin Column (QIAGEN):

1) колонку помещали в пробирку на 2 мл, наносили супернантант и центрифугировали в течение 45 сек при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

2) промывали колонку 750 мкл буфера PE (QIAGEN), центрифугировали в течение 45 сек при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

3) очистив пробирку-премник, дополнительно центрифугировали колонку в течение 1 мин при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);

4) переносили колонку в новую пробирку на 1.5 мл, наносили на колонку 50 мкл 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.5), выдерживали при комнатной температуре в течение 1 мин, центрифугировали 1 мин при 13000 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin).

2.3.16 Определение наличия дцДНК-библиотеки в полученных плазмидных ДНК

Наличие дцДНК-библиотеки в полученных плазмидных ДНК определяли с помощью ПЦР, как описано в п. 2.3.14. В качестве матрицы использовали 0.2 пкмоль выделенной плазмидной ДНК. Полученные реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.

2.3.17 Определение нуклеотидной последовательности плазмидных ДНК

Определение нуклеотидной последовательности полученных плазмид проводили по методу Сенгера с использованием набора Big Dye Terminators v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Реакционная смесь (25 мкл) содержала однократный буфер для секвенирования (Applied Biosystems), 1.5 мкл флуоресцентно меченых дидезоксинуклеозидтрифосфатов Big Dye (Applied Biosystems), 250 фмоль плазмидной ДНК и 5 мкмоль праймера M13 reverse. ПЦР-пробирки с реакционными смесями помещали в амплификатор Mastercycler gradient.