Создание РНК-аптамеров, способных связываться с аутоантителами, вырабатываемыми организмом человека при рассеянном склерозе
Химико-ферментативный синтез модифицированной комбинаторной РНК-библиотеки. Способы получения РНК-аптамеров, устойчивых в биологических средах, способных селективно и с высокой аффинностью связывать аутоантитела человека, больного рассеянным склерозом.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | дипломная работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 08.05.2012 |
| Размер файла | 2,6 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Амплификацию проводили в следующих условиях: 97°С 1 мин, 97°С 10 сек, 50°С 5 сек, 60°С 4 мин, затем повтор еще 30 циклов, 94°С 3 мин, охлаждение до 4°С.
Полученные реакционные смеси очищали различными способами:
Вариант 1. (с использованием набора IllustraTM AutoSeq G-50 Dye Terminator Removal Kit (GE Healthcare, Великобритания)):
1) сорбент колонки суспензировали перемешиванием на вортексе REAX control (Heidolph, Германия);
2) крышку колонки открывали на четверть оборота, отламывали наконечник колонки, помещали ее в пробирку на 1.5 мл и центрифугировали в течение 1 мин при 4600 об./мин, 20°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf));
3) переносили колонку в новую пробирку 1.5 мл;
4) на колонку наносили реакционную смесь (25 мкл) и центрифугировали в течение 1 мин при 4600 об./мин, 20°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf)).
Полученную пробу упаривали досуха на вакуумном испарителе Concentrator 5301 (Eppendorf) в течение 20 мин при 45°С и отдавали в ЦКП “Секвенирование ДНК” СО РАН.
Вариант 2. (осаждение с использованием изопропанола):
1) к реакционным смесям добавляли равный объем бидистиллированной воды, перемешивали и переносили в пробирки на 1.5 мл;
2) в каждую пробирку добавляли 75 мкл 100%-ного изопропанола (осч), перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 25 мин;
3) центрифугировали пробы в течение 25 мин при 13200 об/мин, 18°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf));
4) отбирали супернантант, промывали осадок 250 мкл 75%-ного этанола, центрифугировали пробы в течение 10 мин при 13200 об/мин, 18°С (центрифуга Centrifuge 5415 R (Eppendorf));
5) повторяли промывку 75%-ным этанолом, сушили пробы в течение 20 мин при 2-4 мм. рт. ст.
Полученные пробы были анализированы на секвенаторе ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems, Великобритания). Данные были обработаны в программном пакете Sequence Scanner (Applied Biosystems).
2.3.18 Поиск гомологичных участков РНК-клонов фракций I, II и III [90]
Поиск гомологичных участков РНК-клонов фракций I, II и III был проведен с помощью программного пакета MEME version 4.3.0.
2.3.19 Компьютерное моделирование вторичной структуры РНК-клонов фракций I, II и III [92]
Компьютерное моделирование вторичной структуры полученных РНК-клонов было проведено на основе алгоритма минимизации свободной энергии с помощью программного пакета mfold version 2.3. Вычисления проводили для 22°С.
3. Получение аптамеров к поликлональным аутоантителам, вырабатываемым организмом человека при рассеянном склерозе (результаты и обсуждение)
Рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы, представляющее собой острую медико-социальную проблему. При рассеянном склерозе поражаются головной мозг, зрительные нервы, спинной мозг, что приводит к нарушению соответствующих функций организма. Данное заболевание характеризуется образованием хаотически рассеянных очагов демиелинизации, т.е. утраты миелина - белково-липидной мембраны, покрывающей нервное волокно. Около 30% всех белков миелина составляют три изоформы так называемого основного белка миедина (ОБМ), который является одним из основных аутоантигенов при РС. Ранее было показано, что в деградации ОБМ могут принимать участие каталитические антитела [28, 29, 163-167].
Целью данной работы являлось получение РНК-аптамеров, устойчивых в биологических средах, способных селективно и с высокой аффинностью связывать аутоантитела человека, больного рассеянным склерозом.
НК-Аптамеры - это одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, способные селективно связывать свои молекулы-мишени. Аптамеры часто называют синтетическими антителами, но они превосходят их по многим параметрам: конформация аптамеров может изменяться при взаимодействии с молекулой-мишенью, что повышает их сродство к мишени; в отличие от антител аптамеры могут быть получены к любым молекулам-мишеням; по сравнению с антителами, аптамеры химически более стабильны, неиммуногенны и могут быть синтетически получены синтетически в чистом виде в препаративных количествах.
Как уже говорилось в обзоре литературы (п. 1.4.), РНК-аптамеры по сравнению с ДНК-аптамерами способны образовывать большее количество разнообразных вторичных структур. В свою очередь ДНК-аптамеры более стабильны в биологических средах. Деградация ДНК нуклеазами в сыворотке крови занимает минуты, РНК - секунды [66]. Для повышения стабильности РНК-аптамеров в биологических средах могут быть использованы различные модификации межнуклеозидной фосфатной группы и остатков рибозы [8, 66] (п. 1.5.). Как следует из обзора литературы, одной из наиболее часто применяемых при создании комбинаторных РНК-библиотек модификаций является замена пиримидиновых нуклеотидов их 2'-F-модифицированными аналогами. Такая модификация позволяет повысить устойчивость олигонуклеотидов к деградации нуклеазами, не изменяя их специфичности [77]. Поэтому в качестве исходной комбинаторной библиотеки для создания устойчивого в биологических средах РНК-аптамера, способного высокоспецифично связывать аутоантитела человека при РС, была выбрана 2'-F-пиримидинсодержащая РНК-библиотека.
В рамках данной дипломной работы предстояло решить следующие задачи:
- провести химико-ферментативный синтез 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки;
- создать и апробировать методику отбора аптамеров к поликлональным аутоантителам человека, больного рассеянным склерозом;
- исследовать эффективность связывания обогащенной 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки с поликлональными аутоантителами;
- изучить влияние обогащенной 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки на протеолитическую активность аутоантител;
- провести пробное клонирование и секвенирование полученной обогащенной 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки;
- провести анализ первичной последовательности полученных РНК-клонов и компьютерное моделирование их вторичной структуры.
3.1 Химико-ферментативный синтез 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки
Как было ранее сказано в обзоре литературы, комбинаторную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку получают химико-ферментативным путем, состоящим из 3-х этапов:
1) химический синтез комбинаторной оцДНК-библиотеки;
2) репликация оцДНК-библиотеки с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli и 5'-праймера для амплификации, содержащего последовательность промотора Т7 РНК-полимеразы;
3) транскрипция in vitro дцДНК-библиотеки с использованием 2'-F-UTP и 2'-F-CTP.
В данной работе в качестве исходной олигонуклеотидной библиотеки была выбрана, по аналогии с литературными данными [168], оцДНК-библиотека с рандомизированным районом длиной 40 нт и константными 5'- и 3'-участками длиной 16 нт и 15 нт, соответственно (рис. 8). В качестве праймеров для амплификации комбинаторной библиотеки были выбраны 3'-праймер dm 29 (16 нт), комплементарный 5'-фиксированному району оцДНК-библиотеки, и 5'-праймер dm 28 (32 нт), комплементарный 3'-фиксированному району оцДНК-библиотеки и содержащий промоторную последовательность для Т7 РНК-полимеразы (помечена желтым цветом). Протяженные природные дцДНК-матрицы транскрибируются РНК-полимеразами более эффективно, нежели короткие синтетические дцДНК. Считается, что это связано с наличием предпромоторного участка, облегчающего образование комплекса фермента с матрицей. Для того, чтобы узнать, как влияет удлинение 5'-участка дцДНК-библиотеки на количество получаемого транскрипта, был использован удлиненный 5'-праймер dm 28 long (37 нт), дополнительно содержащий 5 нуклеотидов перед промоторной последовательностью (рис. 8).
5'-праймер dm 28
5'-TAATACGACTCACTATAGGG AGG ACG ATG CGG-3' оцДНК-библиотека
3'-CCC TCC TGC TAC GCC<40N>GTC TGC TG AGC GCG CT-5'
5'-TCG CGC GA GTCGTCTG-3'
3'-праймер dm 29
5'-праймер dm 28 long
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAG GGA GGA CGA TGC GG - 3' оцДНК-библиотека
3'- C CCT CCT GCT ACG CC <40N>G TCT GCT GAG CGC GCT - 5'
5'-TC GCG CGA GTCGTCTG-3'
3'-праймер dm 29
Рис. 8. Система комбинаторной оцДНК-библиотеки с 5'- и 3'-праймерами.
На первом этапе работы была синтезирована комбинаторная оцДНК-библиотека. Для этого был использован автоматический твердофазный фосфитамидный метод (рис. 9). Синтез вели на автоматическом синтезаторе ДНК/РНК ASM-800 (“Биоссет”, Россия) в масштабе 0.4 мкмоль согласно протоколу, представленному в табл. 3 (п. 2.3.1.). Цикл присоединения одного нуклеотидного звена занимал вместе с промывками 7-10 мин.
Рис. 9. Схема синтетического цикла фосфитамидного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов.
В качестве полимерного носителя использовали модифицированное стекло с контролируемым размером пор CPG-500 c присоединенным 5'-O-диметокситритил-N4-ацетилдезоксирибоцитидином (емкость по первому присоединенному звену составляла 30-35 мкмоль/г). В качестве мономерных синтонов были использованы коммерчески доступные 5',N-защищенные дезоксирибонуклеозид-3'-фосфитамиды с лабильными защитными группами по гетероциклическим основаниям: ацетильной для цитидина, бензоильной для аденозина и изобутирильной для гуанозина.
Как видно из рис. 9, синтетический цикл состоит из стадий детритилирования, конденсации, кэпирования и окисления.
Стадия детритилирования необходима для удаления диметокситритильной защитной группы с 5'-гидроксила растущей олигонуклеотидной цепи. Для этих целей была использована обработка 3%-ным раствором дихлоруксусной кислоты в дихлорметане в течение двух минут.
Наиболее важной стадией синтетического цикла является стадия конденсации. В качестве активирующего реагента обычно используют тетразол или его производные. Показано, что использование 5-этилтио-1H-тетразола вместо тетразола позволяет сократить время конденсации в несколько раз [169]. Концентрация для дезоксирибофосфитамидов в случае синтеза константных участков составляла 0.05 М, а в случае синтеза рандомизированного района готовили “общий” раствор четырех дезоксирибофосфитамидов в абс. CH3CN с концентрациями 0.058 М dА-CE, 0.058 М dC-CE, 0.070 М dG-CE и 0.056 М dТ-CE.
При синтезе целевого олигонуклеотида образуются побочные продукты - олигомеры с длиной n-1, n-2 и т.д., что происходит из-за наличия непрореагировавших 5'-гидроксильных групп, которые необходимо блокировать (“кэпировать”) после каждой стадии конденсации. Для “кэпирования” нами были использованы последовательно 16% N-MeIm в THF и Ac2O:2,6-лутидин:THF (1:1:8), что обеспечивает “кэпирование” с эффективностью 95-98% [170].
Заключительной стадией синтетического цикла является стадия окисления, в ходе которой происходит превращение фосфиттриэфирных межнуклеозидных связей в фосфотриэфирные. В случае неполного окисления межнуклеозидный фосфиттриэфир подвергается расщеплению в кислотных условиях при удалении диметокситритильной группы, что приводит к падению выхода целевого олигомера. Для окисления был использован 0.02 М I2 в смеси THF/Py/H2O (90:1:9). После проведения необходимого числа синтетических циклов и удаления 5'-концевой диметокситритильной группы получали защищенную полимерсвязанную оцДНК-библиотеку. Защищенные полимерсвязанные 3'-праймер dm 29, 5'-праймер dm 28, 5'-праймер dm 28 long и оцДНК-библиотеку деблокировали (п. 2.3.2.) с последующим выделением препаративным гель-электрофорезом (п. 2.3.3.).
Гомогенность полученных олигодезоксирибонуклеотидов подтверждали электрофоретически (рис. 10).
А) ДНК 5'-праймер Б) 3'-праймер
(1) (2) dm 28 dm 28 long (1) (2)
(1) (2) (1) (2)
Рис. 10. Электрофоретический анализ гомогенности: А) оцДНК-библиотеки (ДНК), короткого и удлиненного 5'-праймеров в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях ((1) - 0.02 о.е., (2) - 0.04 о.е.); Б) 3'-праймера в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях ((1) - 0.01 о.е., (2) - 0.04 о.е.). Визуализация полос олигонуклеотидов окрашиванием геля “Stains-All”.
На следующем этапе работы на основе оцДНК-библиотеки с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli, 5'-праймеров dm 28 и dm 28 long, было получено 24 мкг короткой дцДНК-библиотеки (дцДНК 1) и 20 мкг удлиненной дцДНК-библиотеки (дцДНК 2).
Для того чтобы проверить, могут ли полученные дцДНК-библиотеки быть субстратом для Т7 РНК-полимеразы, были проведены реакции транскрипции in vitro отдельно для каждой библиотеки с использованием набора для транскрипции “TranscriptAid T7 high yield transcription kit” (Fermentas) (п. 2.3.4.). Использование данного набора позволяет эффективно проводить транскрипцию с коротких дцДНК-матриц. После выделения было получено 0,93 нмоль и 1 нмоль РНК-библиотеки с дцДНК 1 и 2, соответственно (рис. 11).
РНК 1 РНК 2 РНКконтроль
Рис. 11. Электрофоретический анализ РНК-транскриптов (РНК 1 и РНК 2) после реакции транскрипции in vitro с дцДНК 1 и 2, соответственно, с помощью “TranscriptAid T7 high yield transcription kit” в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. В качестве контроля использовали 71-звенную комбинаторную РНК-библиотеку со случайным районом 40 нт (РНКконтроль), любезно предоставленную А.С. Приваловой.
Таким образом, было показано, что выбранная система оцДНК-библиотеки и праймеров способна реплицироваться посредством фрагмента Кленова; полученные дцДНК-библиотеки являются субстратом для Т7 РНК-полимеразы; длина 5'-участка дцДНК-библиотеки не влияет на количество получаемого транскрипта.
На третьем этапе работы для получения 2'-F-модифицированного транскрипта с использованием Т7 РНК-полимеразы был выбран протокол [54], разработанный для проведения реакции транскрипции in vitro с использованием 2'-F-модифицированных пиримидинтрифосфатов. В качестве матрицы в реакции транскрипции in vitro была использована дцДНК 2. После выделения была получена 2'-F-модифицированная РНК-библиотека (рис. 12) в количестве 1 нмоль, что соответствует приведенным в протоколе данным. Поэтому далее для получения 2'-F-модифицированного транскрипта мы придерживались протокола [54].
оцДНК дцДНК 2 2'-F-РНК
Рис. 12. Электрофоретический анализ РНК-транскрипта (2'-F-РНК) после реакции транскрипции in vitro с использованием дцДНК 2, 2'-F-UTP и 2'-F-CTP по протоколу [54]. В качестве контроля использованы оцДНК-библиотека (оцДНК) и дцДНК 2. Электрофорез проведен в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.
Таким образом, нами были получены в препаративных количествах праймеры для амплификации комбинаторной библиотеки dm 29, dm 28 и dm 28 long, а также проведен химико-ферментативный синтез 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки, что позволило нам перейти к созданию методики отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров.
3.2. Оптимизирование и апробация методики отбора аптамеров к поликлональным аутоантителам
Один раунд отбора аптамеров состоит из нескольких стадий (п.1.1.) (рис. 2): образование комплекса мишени и комбинаторной библиотеки; отделение комплексов от несвязавшихся молекул; разрушение комплексов мишени и комбинаторной библиотеки; амплификация связавшихся с мишенью молекул комбинаторной библиотеки. Поэтому для оптимизирования методики отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров необходимо было решить следующие задачи:
1) апробировать все реакции стадии амплификации 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки;
2) выбрать и апробировать метод разделения комплексов молекул-мишеней с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой и несвязавшихся молекул.
Стадия амплификации 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки включает несколько реакций: обратную транскрипцию, ПЦР, транскрипцию in vitro.
Для решения первой задачи была проведена реакция обратной транскрипции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в соответствии с протоколом [54] с использованием обратной транскриптазы AMV. Полученную кДНК далее использовали в ПЦР. Одним из варьируемых параметров ПЦР является температура отжига праймеров с кДНК. Обычно температура отжига праймеров на 4-5 градусов ниже их температуры плавления с кДНК [171]. Чем ниже температура отжига праймеров, тем больше вероятность образования неспецифичного продукта. При помощи программы OligoAnalyzer 3.1 [172] нами были рассчитаны температуры плавления праймеров с кДНК. Они составляют 72.7єC и 68.5єС для дуплексов кДНК c 5'-праймером и 3'-праймером, соответственно. Для подбора оптимального температурного режима нами была проведена ПЦР в градиенте температур отжига праймеров от 43.1єС до 63.2єС. Пробы анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All” (рис. 13). В качестве контроля использовали реакционную смесь репликации ДНК-библиотеки фрагментом Кленова с использованием 5'-праймера dm 28 long.
контроль без матрицы реакционная смесь ПЦР
с dm 28 dm 28 long с dm 28 dm 28 long дцДНКконтр
60 55 49 45 43 60 55 49 45 43 63 60 55 49 45 43 63 60 55 49 45 43
Рис. 13. Электрофоретический анализ реакционных смесей ПЦР в градиенте температур отжига праймеров (слева направо): 63.2єС (63), 60.1єС (60), 55.1єС (55), 49.7єС (49), 45.3єС (45), 43.1єС (43). В качестве контроля использованы реакционные смеси ПЦР, не содержащие матрицу, и реакционная смесь репликации ДНК-библиотеки с использованием фрагмента Кленова и 5'-праймера dm 28 long. Электрофорез был проведен в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.
Количество ПЦР-продукта в реакционных смесях практически не зависело от температуры отжига праймеров и составило 42 пмоль и 50 пмоль на 100 мкл реакционной смеси с использованием 5'-праймеров dm 28 и dm 28 long, соответственно. Поэтому было решено проводить отжиг праймеров при 63єС для максимальной специфичности связывания праймеров с ДНК-матрицей. После очистки было выделено 247,8 пмоль дцДНК 1 и 300 пмоль дцДНК 2. С использованием полученных дцДНК были проведены реакции транскрипции in vitro с использованием 2'-F-модифицированных пиримидинтрифосфатов отдельно для каждой дцДНК-библиотеки. После очистки количество продукта составило 308 пмоль и 866 пмоль 2'-F-РНК с дцДНК 1 и дцДНК 2, соответственно. На основании полученных данных был сделан вывод, что эффективность транскрипции in vitro с 2'-F-модифицированными пиримидинтрифосфатами повышается при использовании в качестве матрицы удлиненной дцДНК-библиотеки (дцДНК 2). Поэтому для амплификации 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки мы использовали 5'-праймер dm 28 long.
Таким образом, были оптимизированы и апробированы все реакции стадии амплификации 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки, что позволило нам получить 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку в требуемых количествах и перейти к решению следующей задачи.
Как ранее было отмечено в обзоре литературы, одной из важнейших стадий отбора аптамеров является стадия отделения комплексов олигонуклеотидов с молекулой-мишенью от несвязавшихся молекул (п. 1.1.). Способ отделения комплексов от несвязавшихся молекул в первую очередь определяется свойствами мишени. В качестве мишени для создания аптамеров нами были выбраны поликлональные аутоантитела класса G, вырабатываемые организмом человека, больного рассеянным склерозом. Использование в качестве мишени поликлональных аутоантител повышает вероятность получить модифицированные РНК-аптамеры, способные связывать аутоантитела к ОБМ у большинства больных рассеянным склерозом. Поликлональные аутоантитела класса G были выделены из 10 образцов сыворотки крови больных рассеянным склерозом и хроматографически разделены на 2 фракции по сродству к ОБМ в Лаборатории ферментов репарации ИХБФМ СО РАН Безугловой А.М. Для отбора РНК-аптамеров была использована фракция аутоантител с меньшим сродством к ОБМ.
На основе литературных данных в качестве метода разделения комплексов и несвязавшихся молекул нами была выбрана нековалентная иммобилизация АТ на стенках ПЦР-пробирки с последующей промывкой буфером (п. 1.1.). В этом случае образование комплексов олигонуклеотидов с белком-мишенью и все реакции стадии амплификации проводят в одной ПЦР-пробирке. Такой метод отбора гарантирует наличие всех связавшихся с белком-мишенью олигонуклеотидов. Как и в случае ковалентной иммобилизации мишени, при адсорбции антител возможно связывание их активных центров со стенками ПЦР-пробирки. Однако те сайты, что были закрыты для связывания с комбинаторной библиотекой в первом раунде, могут быть доступны в следующем раунде отбора, при этом количество белка-мишени для одного раунда отбора существенно меньше, чем в случае ковалентной иммобилизации мишени.
С использованием данного подхода ранее был получен ДНК-аптамер к иммуноглобулину C595 [17]. Нами было решено использовать этот подход для получения РНК-аптамеров.
Иммобилизацию поликлональных аутоантител класса G на стенках ПЦР-пробирки и связывание с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой проводили по аналогии с протоколом [50].
Для получения РНК-аптамеров в процедуру SELEX, описанную в протоколе [50], необходимо было добавить стадии обратной транскрипции и транскрипции, а также подобрать условия разрушения комплексов антител со связавшимися 2'-F-модифицированными олигорибонуклеотидами. Было апробировано два метода. Количество 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в обоих случаях составило порядка 450 пмоль. В первом варианте комплексы аутоантител с олигонуклеотидами разрушали добавлением 7 М мочевины с последующей экстракцией смесью Tрис-HCl (pH 8.0): хлороформ:фенол (1:2:5) и осаждением этанолом. Полученную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку использовали в реакции обратной транскрипции [54]. Во втором случае комплексы 2'-F-РНК и аутоантител разрушали инкубированием при 90єС в течение 2 мин в присутствии 3'-праймера dm 29. Полученный дуплекс использовали в реакции обратной транскрипции. После проведения всех реакций стадии амплификации было получено 226 пмоль и 233 пмоль 2'-F-РНК для 1-го и 2-го случаев, соответственно. Поскольку второй вариант намного быстрее, далее мы придерживались его (рис. 14).
Рис. 14. Схема отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров к поликлональным аутоантителам класса G , вырабатываемым организмом человека при рассеянном склерозе.
Таким образом, нами была разработана и апробирована методика отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров к поликлональным аутоантителам человека, больного рассеянным склерозом.
По разработанной методике первоначально было проведено минимальное количество раундов отбора - 6 раундов. На первый раунд был взят 1 нмоль 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки. Для повышения аффинности полученной после 6-го раунда SELEX 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки были проведены еще 4 раунда SELEX с ужесточением условий отбора. Для предотвращения отбора аптамеров к какому-либо компоненту используемых буферов перед каждым раундом отбора был проведен “негативный” SELEX (п. 2.3.7.). Время инкубирования 2'-F-РНК с ПЦР-пробиркой увеличивали от 20 мин до 35 мин с интервалом в 5 мин. Несвязавшиеся с компонентами буфера молекулы 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки использовали в следующем раунде SELEX. Время инкубирования 2'-F-РНК с аутоантителами составило 60, 50, 40 и 30 мин для 7-го, 8-го, 9-го и 10-го раундов SELEX, соответственно.
Для того чтобы узнать, позволяет ли данная методика обогащать комбинаторную РНК-библиотеку последовательностями, обладающими сродством к молекуле-мишени, были измерены константы диссоциации комплексов антител с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой и 2'-F-модифицированными РНК-библиотеками после 6-го и после 10-го раундов SELEX (п. 3.3.).
3.3 Изучение эффективности связывания обогащенной 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки с поликлональными аутоантителами
Измерение констант диссоциации комплексов аутоантител с исходной и обогащенными 2'-F-модифицированными РНК-библиотеками было проведено в соответствии с протоколами [54, 161] (п. 2.3.9.). Первоначально нами было проведено “пробное” измерение Kd комплексов аутоантител с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой согласно протоколу [54]. Исходя из полученных данных, была определена область концентраций аутоантител, в которой происходит диссоциация их комплекса с исходной 2'-F-модифицированный РНК-библиотекой, и проведено повторное измерение Kd данного комплекса. Аналогичным образом было проведено измерение Kd комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой после 6-го и после 10-го раундов отбора. Данные, использованные для расчета Kd комплексов аутоантител и 2'-F-модифицированных РНК-библиотек (табл. 4), описывали приведенным ниже уравнением [161]:
f = С·(Kd + [RNA] + [P] - ((Kd + [RNA] + [P])2 - 4·[RNA]·[P])0.5)/(2·[RNA]),
где [P] - концентрация аутоантител; [RNA] - концентрация 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки; f - доля связавшихся олигонуклеотидов; Kd - константа диссоциации комплексов 2'-F-РНК с аутоантителами; С - константа эффективности связывания комплексов аутоантител и 2'-F-олигорибонуклеотидов с нитроцеллюлозными фильтрами.
Используя полученные данные, находили константу С. Отношение f/С давало fнорм - нормированное значение доли комплексов 2'-F-РНК с аутоантителами. Нормированные данные описывали тем же уравнением, принимая С равной 1, и находили Kd (табл. 5).
Таблица 4. Расчетные данные для измерения Kd комплексов аутоантител и 2'-F-модифицированных РНК-библиотек: 1) исходной; 2) после 6-го раунда отбора; 3) после 10-го раунда отбора.
1) 2) 3)
|
[P], нМ |
f, % |
fнорм, % |
|
|
12000.0 |
36.6 |
100.7 |
|
|
6000.0 |
40.6 |
93.8 |
|
|
3000.0 |
34.1 |
85.7 |
|
|
1000.0 |
31.2 |
77.6 |
|
|
330.0 |
28.2 |
48.6 |
|
|
110.0 |
17.7 |
31.1 |
|
|
37.0 |
11.3 |
30.4 |
|
|
4.1 |
11.0 |
22.1 |
|
|
[P], нМ |
f, % |
fнорм, % |
|
|
1800 |
60.0 |
68.2 |
|
|
600 |
86.6 |
98.4 |
|
|
200 |
93 |
121.1 |
|
|
66 |
29.9 |
37.9 |
|
|
22 |
4.3 |
5.4 |
|
|
7.4 |
4.2 |
5.3 |
|
|
2.4 |
2.5 |
3.2 |
|
|
0.8 |
2.2 |
2.9 |
|
|
0.3 |
2.1 |
2.7 |
|
|
[P], нМ |
f, % |
fнорм, % |
|
|
600 |
86,3 |
87,7 |
|
|
200 |
110,0 |
111,7 |
|
|
66 |
85,9 |
87,2 |
|
|
22 |
69,4 |
70,5 |
|
|
7,4 |
30,9 |
31,4 |
|
|
2,4 |
25,6 |
26,0 |
|
|
0,8 |
17,8 |
18,1 |
|
|
0,3 |
3,5 |
3,6 |
Таблица 5. Kd комплексов аутоантител с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой, библиотекой после 6-го и после 10-го раундов SELEX
|
2'-F-модифицированная РНК-библиотека |
С, % |
Kd, нМ |
|
|
Исходная |
С = 36 ± 3 |
Kd = 256 ± 74 |
|
|
После 6-го раунда SELEX |
С = 70 ± 10 |
Kd = 96 ± 39 |
|
|
После 10-го раунда SELEX |
С = 98 ± 8 |
Kd = 6 ± 2 |
На основе приведенных в табл. 5 значений Kd можно сделать вывод, что данная методика отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров позволяет обогащать комбинаторную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку последовательностями, обладающими сродством к аутоантителам человека, больного рассеянным склерозом.
Было исследовано влияние 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX на реакцию деградации ОБМ аутоантителами, вырабатываемыми организмом человека при рассеянном склерозе (рис. 15).
Рис. 15. Влияние 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX на протеолитическую активность аутоантител. Каждая реакционная смесь (12 мкл) содержала 6 мкг ОБМ, 6 мкг аутоантител, 17 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 17 мМ NaCl. Концентрация 2'-F-РНК библиотеки составляла 0 мкМ, 0.1 мкМ, 0.3 мкМ, 0.5 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 5 мкМ и 7 мкМ. Реакцию деградации ОБМ проводили при 30°С в течение 24 ч. Реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ с последующим окрашиванием Coomassie Blue R-250. Данные получены в ЛФР ИХБФМ СО РАН Безугловой А.М.
На основании полученных данных можно сделать предварительный вывод, что 2'-F-модифицированная РНК-библиотека после 10-го раунда отбора содержит олигонуклеотиды, ингибирующие протеазную активность патогенных аутоантител.
3.4 Хроматографическое разделение 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки после 10-го раунда отбора на фракции по сродству к поликлональным аутоантителам
Для выделения фракции 2'-F-модифицированных олигорибонуклеотидов, обладающей наибольшим сродством к патогенным аутоантителам и/или ингибирующей активностью по отношению к аутоантителам, часть полученной после 10-го раунда отбора 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки была амплифицирована до 3.55 о.е. и разделена хроматографически на колонке с иммобилизованным на BrCN-активированной сефарозе пулом поликлональных аутоантител. Цифрами I, II и III отмечены объединенные фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки (рис. 16).
Рис. 16. Хроматографическое разделение 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после 10-го раунда SELEX по сродству к поликлональным аутоантителам. На колонку наносили 3.55 о.е. 2'-F-РНК библиотеки в 60 мкл бидистиллированной воды и промывали 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 1). Далее проводили ступенчатую элюцию 2'-F-РНК растворами следующего состава: 0.1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 2); 0.3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 3); 0.5 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 4); 1 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 5); 2 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 6); 3 М NaCl в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 7); 1 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 8); 2 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 9); 3 М MgCl2 в 20 мМ Tрис-HCl, pH 7.5 (фр. 10); 0.1 М глицином, pH 2.6 (фр. 11). Цифрами I, II и III отмечены объединенные фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки.
Фракции I, II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после хроматографического разделения обессолили и сконцентрировали на колонках Microcon YM-30 (условия приведены в п. 2.3.10.). Количество 2'-F-РНК во фракции I составило 2,5 о.е. (4 нмоль). Фракции II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки амплифицировали как описано в п. 2.3.5., получив в среднем по 0.7 о.е. (1 нмоль) каждой фракции.
Было исследовано влияние каждой фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки на реакцию деградации ОБМ аутоантителами, вырабатываемыми организмом человека при рассеянном склерозе (рис. 17).
1) 2)
Рис. 17. Ингибирование протеазной активности аутоантител фракциями 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки после хроматографического разделения: 1) индивидуальными фракциями, 2) комбинациями фракций. Каждая реакционная смесь (12 мкл) содержала 6 мкг ОБМ, 6 мкг аутоантител, 17 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 17 мМ NaCl. Концентрация 2'-F-РНК библиотеки в реакционных смесях для каждой фракции составила 0 мкМ, 0.1 мкМ, 0.3 мкМ, 0.5 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 5 мкМ и 7 мкМ. Реакцию деградации ОБМ проводили при 30°С в течение 24 ч. Реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ с последующим окрашиванием Coomassie Blue R-250. Данные получены в ЛФР ИХБФМ СО РАН Безугловой А.М.
Исходя из полученных данных, можно сделать следующие выводы: ингибирующая активность 2'-F-модифицированных олигорибонуклеотидов не коррелирует с их сродством к поликлональным аутоантителам; каждая фракция 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки ингибирует определенную группу поликлональных аутоантител, вырабатываемых организмом человека при РС.
Для получения индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров было проведено клонирование и секвенирование полученных фракций 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки.
3.5 Клонирование и секвенирование фракций 2'-F- пиримидинсодержащей РНК-библиотеки
Для проведения клонирования фракций I, II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки были использованы олигонуклеотиды-праймеры, комплементарные 3'- и 5'-константным участкам комбинаторной ДНК-библиотеки и содержащие сайты рестрикции эндонуклеаз рестрикции HindIII и BamHI, соответственно (рис. 18).
5'-праймер HindIII
5'-CCGAAGCTTGAAATAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGC GG-3' кодирующая цепь дцДНК-библиотеки
3'-CCC TCC TGCTACG CC<40N>GTC TGC TG AGC GCG CT-5'
транскрибируемая цепь дцДНК-библиотеки
5'-GGGAGGACGATGCGG<40N>CAG ACG ACT CGCGCGA-3'
3'-GTC TGC TGAGCC GGCTCCTAGGGCG-5'
3'-праймер BamHI
Рис. 18. Система комбинаторной дцДНК-библиотеки с 5'-праймером HindIII и 3'-праймером BamHI. Цветом выделены: ….. - сайт рестрикции HindIII, ….. - сайт рестрикции BamHI.
Фракции I, II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки переводили в дцДНК-форму методом ОТ-ПЦР высокой точности с использованием 3'-праймера BamHI и 5'-праймера HindIII. Полученную дцДНК-библиотеку фракций I, II и III клонировали в векторе pUC18 по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII (рис. 19).
5'-G TAA AAC GAC GGC CAG TGC CAA GCT TGC ATG CCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TAC CGA GCT CGA ATT CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG - 3'
Рис. 19. Полилинкерный участок (ПЛУ) вектора pUC18. Цветами выделены: … - сайт рестрикции эндонуклеазы HindIII, … - сайт рестрикции эндонуклеазы BamHI, … - сайт рестрикции эндонуклеазы PstI. Жирным шрифтом отмечен ПЛУ вектора pUC18.
Предварительно была проведена проверка рестриктазной активности отдельно каждой эндонуклеазы рестрикции. Для этого 0.2 мкг pUC18 инкубировали с 0.2 е.а. BamHI или HindIII при 37°С в течение 5 мин с последующим инактивированием ферментов при 80°С в течение 10 мин. Продукт реакции гидролиза анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (рис. 20).
Рис. 20. Электофоретический анализ реакционных смесей гидролиза вектора pUC18 рестриктазами BamHI и HindIII в 1%-ном агарозном геле. В качестве контроля использован вектор pUC18 (0.2 мкг). Визуализацию полос олигонуклеотидов проводили с помощью системы гель-документации “Gel imager 2” (“НПФ” Биоклон).
Из полученных данных можно сделать вывод, что 1 е. а. рестриктазы BamHI или HindIII достаточно, чтобы за 5 мин перевести в линейную форму 1 мкг pUC18. С учетом этого соотношения была проведена реакция рестрикции ДНК вектора pUC18 и фракций I, II и III эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII с последующим лигированием полученных ДНК с “липкими” концами в соотношении 1:20. В полученную реакционную смесь добавляли эндонуклеазу рестрикции PstI для расщепления по ПЛУ молекул вектора pUC18, не содержащих вставок дцДНК фракций. Полученную реакционную смесь, содержащую плазмидную ДНК с вставкой дцДНК фракций I, II или III, использовали для трансформации компетентных клеток E.coli штамма DH5б (п. 2.3.13.).
Для отбора колоний E.coli, содержащих плазмидную ДНК, был использован метод фенотипической селекции. Поскольку вектор pUC18 содержит ген устойчивости к ампициллину, полученную после трансформации суспензию клеток E.coli высевали на чашку Петри с селективным LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. В качестве контроля на две других чашки Петри с селективным LB-агаром высевали клетки E.coli, трансформированные вектором pUC18, и исходные компетентные клетки E.coli. Все чашки Петри инкубировали в суховоздушном термостате при 37°С в течение 16-18 ч. В результате чашка Петри с нетрансформированными клетками E.coli была пуста; чашка Петри с клетками E.coli, трансформированными вектором pUC18, содержала множество колоний разной величины и окраски - от белой до синей; чашка Петри с клетками E.coli, трансформированными плазмидной ДНК с вставкой дцДНК фракций I, II или III, содержала несколько колоний разного размера белой или светло-голубой окраски. Таким образом было показано, что трансформация клеток E.coli проходит эффективно, а используемого количества антибиотика достаточно для проведения фенотипической селекции.
Для разделения разных колоний, трансформированных E.coli, полученные колонии высевали на чашку Петри с селективным LB-агаром (по 4 колонии на чашку). В качестве контроля на новую чашку Петри также переносили одну колонию E.coli, трансформированную вектором pUC18. Для выявления колоний E.coli, содержащих плазмидную ДНК с вставкой экзогенной ДНК, обычно используют метод бело-голубой селекции [173]. Полилинкерный участок вектора pUC18 расположен в гене lacZ, кодирующем в-галактозидазу - фермент класса гидролаз, катализирующий расщепление лактозы на галактозу и глюкозу. в-Галактозидаза расщепляет 5-бром-4-хлор-3-индолил-в-D-галактопиранозид (X-Gal) на галактозу и 5-бром-4-хлорo-3-гидроксииндол, который в присутствии IPTG окисляется до 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго (нерастворимый осадок синего цвета). При встраивании экзогенной ДНК в вектор pUC18 по ПЛУ сбивается рамка считывания в-галактозидазы, и фермент не вырабатывается. Таким образом, колонии, содержащие вектор pUC18, при выращивании на селективном LB-агаре с добавлением X-Gal и IPTG приобретают синий цвет, а колонии, содержащие вектор pUC18 с вставкой экзогенной ДНК по ПЛУ, остаются белыми.
К сожалению, применить метод бело-голубой селекции для полученных колоний оказалось невозможным, поскольку колония-контроль была такого же светло-голубого цвета, как и большинство полученных колоний. Это может быть связано с тем, что длины ДНК фракций I, II и III было недостаточно для того, чтобы сбить рамку считывания в-галактозидазы. Поэтому наличие плазмидной ДНК в колонии клеток E.coli определяли методом ПЦР. Для этого были использованы 5'-праймер seq 1 и 3'-праймер seq 2, комплементарные 3'- и 5'- константным районам вектора pUC18, фланкирующим ПЛУ (рис. 21).
3'-константный район ПЛУ pUC18 5'-константный район ПЛУ pUC18
3'-AAAGGGTCAGTGCTGCAACATTTTGC-5' 3'- GGACACACTTTAACAATAGGCGA-5'
5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3' 5'-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT-3
5'-праймер seq 1 3'-праймер seq 2
Рис. 21. Комплексы 5'-праймера seq 1 с 3'-константным районом, фланкирующим ПЛУ вектора pUC18, и 3'-праймера seq 2 с 5'-константным районом, фланкирующим ПЛУ вектора pUC18.
В качестве примера на рис. 22 приведена электрофореграмма реакционных смесей ПЦР для колоний клеток E.coli, трансформированных плазмидной ДНК, содержащей дцДНК фракции I.
Фракция I
pUC18контр. к1 к2 к3 к4 к5
Рис. 22. Электрофоретический анализ реакционных смесей ПЦР для колоний E.coli с плазмидной ДНК фракции I (фракция I, к1, к2, к3, к4, к5 - ПЦР-продукт соответствующих колоний клеток E.coli). В качестве контроля использовали ПЦР-продукт вектора pUC18 (pUC18 контр.). Визуализация полос окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.
Многокопийную плазмидную ДНК выделяли из индивидуальных колоний клеток E.coli с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) и проверяли наличие дцДНК фракций I, II и III повторно (рис. 23).
Фракция I
к3 к2 к1 pUC18контр.
Рис. 23. Электрофоретический анализ реакционных смесей ПЦР для плазмидных ДНК, содержащих дцДНК фракции I (фракция I, к1, к2, к3 - ПЦР-продукт плазмидных ДНК соответствующих колоний клеток E.coli). В качестве контроля использовали ПЦР-продукт вектора pUC18 (pUC18 контр.). Визуализация полос окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.
Как видно из электрофореграмм на рис. 22 и рис. 23, полученные ПЦР-продукты обладали меньшей электрофоретической подвижностью, чем контрольный ПЦР-продукт, что связано с наличием вставки ДНК фракции I. Однако практически все ПЦР-продукты обладают разной электрофоретической подвижностью, что может быть связано с потерей части ДНК вставки, встраиванием в вектор pUC18 двух и более молекул ДНК фракций или рекомбинацией двух и более молекул ДНК фракций в составе разных плазмидных ДНК.
Для определения нуклеотидной последовательности ДНК-клонов полученные плазмидные ДНК секвенировали с использованием набора Big Dye Terminators v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в ЦКП “Секвенирование ДНК” СО РАН. Нуклеотидные последовательности полученных клонов ДНК фракций I, II и III приведены в табл. 6.
Таблица 6. Нуклеотидные последовательности ДНК-клонов фракций I, II и III
|
Плазмидная ДНК |
Нуклеотидная последовательность |
|
|
Фракция I клон 1 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACGGTAGCGAGGTGCTCTCATTGGGAAGTTTG GGTTGAGACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция I клон 2 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCCCAGGCTACACGCATGTTGATTCTGATGATCG CGCGAGTCGTCTGGCCACGGAGTTTAGGTTCCATGTTTCCGCTGTATGACGATCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция I клон 3 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGCAGCACCCGAACGAGAGCGCGAGACTGAGG ATTGCCCTCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция I клон 4 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCGGCAGGATCAGGAATTGATTAGAAGTTCTTA CTCCGTTCCGCATCGTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCAGTCCTCACCGCATCGTCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция II клон 1 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCACGGGCAGGGGATACGAGTGACGTTGGCGT CAACACTACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция II клон 2 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCAGGGGAGAGGATAATGTTCAGCTAGACCGGG CTTCAATCCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция II клон 3 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACACACAGGCAACAAACTGTGTCGCGCGAGT CGTCTGTGGGTAAACGAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция II клон 4 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCGACACGTGGCATGACGAGGTTAATCGCGCG AGTCGTCTGCACGATAGTGGTGAGGCCGGGGCATGTGTGGGTATGCTTAACCGCATCGTCCTCCC - 3' |
|
|
Фракция II клон 5 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACACACAGGCAACAAACTGTGTCGCGCGAGT CGTCTGCAGGGTGAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция III клон 1 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCACGATCGCAGCATTTGGCAACACTGGTCGC GCGAGTCGTCTGGGCATAATGAGCCACAGGTTGGAAGTATTGCTTCACTTGGCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция III клон 2 |
5'- GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGGAGGGCGAGTCGTCTGGCTCGAGCTAGGCT GTGCATTCGCAACCACTCACATCGAACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция III клон 3 |
5'- GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGCACGCGGAAAGACGACGAGCCGTGGCATCG TAGCTCAACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция III клон 4 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGGATGAGCGTTGTTACACGCATCATCGCGCG AGTCGTCTGGGGAGGGGAGTAGCTTTTCCGATGGAGACTGAATGCTCCACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция III клон 5 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACACACAGGCAACACCATGTGTCGCGCGAGT CGTCTGGCGGGGGCCGCGGCAGGCATGAACGATGCAACTCATCAGACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
|
|
Фракция III клон 6 |
5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCGGGTAAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACT CAGAAAACACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
Цветами отмечены: … - 5'-константная часть ДНК-библиотеки, … - 3'-константная часть ДНК-библиотеки, … - последовательность вектора pUC18, … - 40N-участок ДНК-клонов.
При секвенировании клонированных фрагментов было обнаружено, что в ходе трансформации клеток E.coli происходит рекомбинация двух молекул ДНК фракций, что объясняет различия в электрофоретической подвижности ПЦР-продуктов трансформированных колоний E.coli и полученных плазмидных ДНК. Таким образом, нами были проведены клонирование и секвенирование полученных фракций I, II и III 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки; были получены первичные последовательности 40N-участков ДНК-клонов фракций I, II и III.
3.6 Определение гомологичных участков и компьютерное моделирование вторичной структуры индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров фракций I, II и III
Как известно, аптамеры связывают молекулы-мишени за счет своей особой пространственной структуры. Обычно участки аптамеров, отвечающие за связывание мишени, встречаются в большинстве полученных клонов и обладают сложной вторичной структурой (п. 1.4.). Определение гомологичных последовательностей в полученных 40N-участках ДНК-клонов проводили в программном пакете MEME version 4.3.0 [90] как отдельно для клонов каждой фракции (рис. 24), так и для клонов всех фракций (рис. 25).
|
Фракция I Клон 1 CACGGTAGCGAGGTGCTCTCATTGGGAAGTTGGGTTGAGA |
|
|
Клон 2 GCCACGGAGTTTAGGTTCCATGTTTCCGCTGTATGACGAT |
|
|
Клон 3 GGCAGCACCCGAACGAGAGCGCGAGACTGAGGATTGCCCT |
|
|
Клон 4 GCGGCAGGATCAGGAATTGATTAGAAGTTCTTACTCCGTT |
|
|
Фракция II Клон 1 GCACGGGCAGGGGATACGAGTGACGTTGGCGTCAACACTA |
|
|
Клон 2 CAGGGGAGAGGATAATGTTCAGCTAGACCGGGCTTCAATC |
|
|
Клон 3 TGGGTAAACGAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACA |
|
|
Клон 4 CACGATAGTGGTGAGGCCGGGGCATGTGTGGGTATGCTTAA |
|
|
Клон 5 CAGGGTGAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACA |
|
|
Фракция III Клон 1 GGCATAATGAGCCACAGGTTGGAAGTATTGCTTCACTTGG |
|
|
Клон 2 GCTCGAGCTAGGCTGTGCATTCGCAACCACTCACATCGAA |
|
|
Клон 3 GGCACGCGGAAAGACGACGAGCCGTGGCATCGTAGCTCAA |
|
|
Клон 4 GGGAGGGGAGTAGCTTTTCCGATGGAGACTGAATGCTCCA |
|
|
Клон 5 GCGGGGGCCGCGGCAGGCATGAACGATGCAACTCATCAGA |
|
|
Клон 6 CGGGTAAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACA |
Рис. 24. Гомологичные последовательности 40N-участков ДНК-клонов фракций I, II и III, полученные в программном пакете MEME version 4.3.0 отдельно для каждой фракции.
|
Фракция I Клон 1 CACGGTAGCGAGGTGCTCTCATTGGGAAGTTGGGTTGAGA |
|
|
Клон 2 GCCACGGAGTTTAGGTTCCATGTTTCCGCTGTATGACGAT |
|
|
Клон 3 GGCAGCACCCGAACGAGAGCGCGAGACTGAGGATTGCCCT |
|
|
Клон 4 GCGGCAGGATCAGGAATTGATTAGAAGTTCTTACTCCGTT |
|
|
Фракция II Клон 1 GCACGGGCAGGGGATACGAGTGACGTTGGCGTCAACACTA |
|
|
Клон 2 CAGGGGAGAGGATAATGTTCAGCTAGACCGGGCTTCAATC |
|
|
Клон 3 TGGGTAAACGAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACA |
|
|
Клон 4 CACGATAGTGGTGAGGCCGGGGCATGTGTGGGTATGCTTAA |
|
|
Клон 5 CAGGGTGAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACA |
|
|
Фракция III Клон 1 GGCATAATGAGCCACAGGTTGGAAGTATTGCTTCACTTGG |
|
|
Клон 2 GCTCGAGCTAGGCTGTGCATTCGCAACCACTCACATCGAA |
|
|
Клон 3 GGCACGCGGAAAGACGACGAGCCGTGGCATCGTAGCTCAA |
|
|
Клон 4 GGGAGGGGAGTAGCTTTTCCGATGGAGACTGAATGCTCCA |
|
|
Клон 5 GCGGGGGCCGCGGCAGGCATGAACGATGCAACTCATCAGA |
|
|
Клон 6 CGGGTAAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACA |
Рис. 25. Гомологичные последовательности 40N-участков ДНК-клонов фракций I, II и III, полученные в программном пакете MEME version 4.3.0 для клонов всех фракций.
Как было показано ранее (п. 3.4.), все полученные фракции 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки различаются по сродству к поликлональным аутоантителам человека, больного РС. Однако, как видно из рис. 24 и 25, как клоны одной фракции, так и клоны из разных фракций обладают гомологичными участками нуклеотидной последовательности. Три из указанных ДНК-клонов (фракция II, клон 3, клон 5 и фракция III, клон 6) обладают высокой гомологичностью, а два ДНК-клона (фракция I, клон 2 и фракция III, клон 4) - более низкой гомологичностью нуклеотидных последовательностей. Присутствие гомологичных участков в последовательностях полученных клонов дает возможность предположить, что эти участки отвечают за связывание поликлональных аутоантител человека, больного РС.
Для записи нуклеотидной последовательности индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров фракций I, II и III проводили замену константных участков ДНК-библиотеки в последовательности полученных ДНК-клонов на константные участки 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки, замену тимидина на уридин и всех пиримидиновых нуклеотидов на их 2'-F-модифицированные аналоги (табл. 7).
Ранее было показано, что главную роль в связывании аптамера с мишенью играют неспаренные участки олигонуклеотида, а часть аптамера, обладающая стабильной вторичной структурой, служит для поддержания правильного расположения участков, узнающих мишень. Для определения вторичной структуры полученных индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров использовали программный пакет mfold version 2.3 [92] (рис. 26, 27, 28). Цветом обозначена вероятность нахождения нуклеотидной последовательности в одноцепочечном состоянии (табл. 8). В полученных вторичных структурах индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров геометрическими фигурами выделены их гомологичные участки, полученные отдельно для клонов каждой фракции .
Таблица 7. Нуклеотидная последовательность индивидуальных 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров фракций I, II и III
|
2'-F-РНК |
Нуклеотидная последовательность |
|
|
Фракция I аптамер 1 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGCACGGUAGCGAGGUGCUCUCAUUGGGAA GUUGGGUUGAGACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция I аптамер 2 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGCCACGGAGUUUAGGUUCCAUGUUUCCG CUGUAUGACGAUCCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция I аптамер 3 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGGCAGCACCCGAACGAGAGCGCGAGACU GAGGAUUGCCCUCCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция I аптамер 4 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGCGGCAGGAUCAGGAAUUGAUUAGAAG UUCUUACUCCGUUCCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция II аптамер 1 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGCACGGGCAGGGGAUACGAGUGACGUUG GCGUCAACACUACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция II аптамер 2 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGCAGGGGAGAGGAUAAUGUUCAGCUAGA CCGGGCUUCAAUCCCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция II аптамер 3 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGUGGGUAAACGAGGGUGGGGCAGAGAUG UACUCAGAAAACACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция II аптамер 4 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGCACGAUAGUGGUGAGGCCGGGGCAUGUG UGGGUAUGCUUAACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция II аптамер 5 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGCAGGGUGAACAAGGGUGGGGCAGAGAU GUACUCAGAAAACACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция III аптамер 1 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGGCAUAAUGAGCCACAGGUUGGAAGUAU UGCUUCACUUGGCCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция III аптамер 2 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGCUCGAGCUAGGCUGUGCAUUCGCAACC ACUCACAUCGAACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция III аптамер 3 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGGCACGCGGAAAGACGACGAGCCGUGGC AUCGUAGCUCAACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция III аптамер 4 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGGGAGGGGAGUAGCUUUUCCGAUGGAG ACUGAAUGCUCCACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция III аптамер 5 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGGCGGGGGCCGCGGCAGGCAUGAACGAUG CAACUCAUCAGACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
|
|
Фракция III аптамер 6 |
5'-CAGACGACUCGCGCGAGUCGUCUGCGGGUAAACAAGGGUGGGGCAGAGAUG UACUCAGAAAACACCGCAUCGUCCUCCC- 3' |
Цветами отмечены: … - 5'-константный участок РНК-библиотеки, … - 3'-константный участок РНК-библиотеки, … - 40N-участок РНК-библиотеки, N - 2'-F-модифицированные пиримидиновые нуклеотиды.
Рис. 26. Вторичные структуры 2'-F- модифицированных РНК-аптамеров фракции I, полученные компьютерным моделированием в программном пакете mfold version 2.3. Условия моделирования: 22°C, 1М NaCl. Аптамер 1 dG = -38,99 ккал/моль, аптамер 2 dG = -38,54 ккал/моль, аптамер 3 dG = -43,59 ккал/моль, аптамер 4 dG = -41,08 ккал/моль.
Рис. 27. Вторичные структуры 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров фракции II, полученные в программном пакете mfold version 2.3. Условия моделирования: 22°C, 1М NaCl. Аптамер 1 dG = -42,43 ккал/моль, аптамер 2 dG = -41,17 ккал/моль, аптамер 3 dG = -40,75 ккал/моль, аптамер 4 dG = -42,03 ккал/моль, аптамер 5 dG = -36,37 ккал/моль.
Таблица 8. Цветовая схема вероятности нахождения нуклеотидной последовательности в одноцепочечном состоянии.
Как видно из рис. 26, 27, 28, все клоны обладают сложной вторичной структурой, что коррелирует с литературными данными. Среди представленных клонов встречаются олигонуклеотиды, обладающие схожей вторичной структурой: фракция I, клон 2 и фракция III, клон 4, обладающие сходной нуклеотидной последовательностью; фракция II, клон 5 и фракция III, клон 6, обладающие сходной нуклеотидной последовательностью; фракция I, клоны 3 и 4, не обладающие сходством нуклеотидной последовательности. Полученный результат свидетельствует о том, что, в случае клона 5, фракция II и клона 6, фракция III, введение одного нуклеотида и замена одного нуклеотида в последовательности привели к изменению сродства 2'-F-РНК к мишени. Это дает возможность предположить, что участок вышеуказанных изменений (петля с 25 по 37 нт) играет роль в связывании поликлональных аутоантител человека, больного РС.
Для определения участков, важных для связывания аутоантител, гомологичные участки, полученные отдельно для клонов каждой фракции, были выделены на вторичных структурах 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров. При этом было выявлено, что часть полученных гомологичных участков формирует схожие вторичные структуры в разных 2'-F-модифицированных РНК-аптамерах. Это позволяет предположить, что данные гомологичные участки участвуют в связывании поликлональных аутоантител человека, больного РС.
Подобные документы
Исследование психологических особенносттей больных рассеянным склерозом. Принципы когнитивно-бихевиоральной терапии. Применение когнитивно-бихевиоральной терапии в виде гетеросуггестивной психомышечной релаксации в терапии больных рассеянным склерозом.
дипломная работа [2,6 M], добавлен 04.05.2011Оценка риска для здоровья человека. Характеристика вредных эффектов, способных развиться в результате воздействия факторов окружающей среды на группу людей. Передача информации о риске. Анализ продолжительности воздействия факторов риска на человека.
презентация [211,5 K], добавлен 01.10.2014Биологическое значение гемоксигеназной системы. Тетрапиррольная структура уропорфиринoгена III. Ферментативный, химический механизм. Регуляция активности гемоксигеназы на уровне генома. Структура гемоглобина человека. Синтез гемма в митохондриях.
курсовая работа [2,2 M], добавлен 08.07.2016Строение, расстройства и функции мозжечка. Дисметрия и атаксия как наиболее важные симптомы поражения. Сестринская помощь пациентам. Занятия с больными по указаниям методиста лечебной физкультуры. Помощь пациентам, страдающим рассеянным склерозом.
реферат [22,8 K], добавлен 07.06.2014Требования, предъявляемые к материалам для медико-биологического применения. Проблема биологической совместимости, реакция организма на токсическое воздействие. Воздействие материалов на человека, роль стерилизации. Углеродные материалы в медицине.
реферат [32,9 K], добавлен 26.02.2012Исследование благосостояния пациентов, страдающих хроническими заболеваниями, такими как рассеянный склероз. Характеристика методики оценки благосостояния с учетом психологических особенностей восприятия пациентом заболевания на различных его стадиях.
контрольная работа [26,6 K], добавлен 25.11.2010Применение криотерапии в биологических исследованиях. Реологические свойства крови. Атомно-силовая микроскопия в исследованиях биологических объектов. Влияние холодового воздействия на клетки крови человека. Результаты эксперимента и его обсуждение.
дипломная работа [4,4 M], добавлен 14.07.2013История развития табачного производства. Основные виды и особенности выращивания табака. Описание получения покровных листьев табака для сигар. Анализ влияния курения на организм человека и способы борьбы с ним. Понятие и сущность пассивного курения.
презентация [1,3 M], добавлен 05.03.2010Идея учения о биоритмах - периодически повторяющихся изменениях характера и интенсивности биологических процессов и явлений. Классификация биоритмов человека по их характеристикам, биологической системе, роду процесса и функции, которую выполняет ритм.
презентация [1,3 M], добавлен 11.03.2015Классы интерферонов: естественного происхождения и искусственно синтезируемые. Способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови и микробиологическим синтезом. Механизмы действия интерферонов, терапевтическое применение.
реферат [22,6 K], добавлен 27.01.2010
