Розробка живої культуральної вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби

3. Перещеплювані культури клітин ТрТ, ВНК-21/13 та КСТ мають високу проліферативну активність у процесі вирощування в суміші з рівних об'ємів поживних середовищ 199 та Ігла і 10 % нормальної сироватки крові великої рогатої худоби. Посівна концентрація з розрахунку 300 тисяч клітин/см³ поживного середовища забезпечує відповідно в 2,6; 4,8 і 4,9 рази вищий їх приріст за ролерного способу культивування, який скорочує на 20-48 годин термін накопичення біомаси клітин для напрацювання вихідної для виготовлення вакцини вірусної сировини порівняно зі стаціонарним у матрасах.

4. Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї, адаптований до розмноження в культурі перещеплюваних клітин у ролерних бутлях, зберігає активну репродуктивну здатність і має високу інфекційність. Оптимальний час репродукції та титр його інфекційності становить у культурі перещеплюваних клітин ТрТ відповідно 46 годин і 7,05 lg ТЦД₅₀/см³, ВНК-21/13 - 64 години і 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Більш придатною для репродукції та накопичення біомаси штаму ВК-1М є перещеплювана культура КСТ, яка забезпечує його репродукцію впродовж 40 годин з інфекційністю 7,6 lg ТЦД₅₀/см³.

5. Щеплення вакцини живої культуральної проти вірусної діареї в об'ємах 2 і 5 см³, що вміщують відповідно 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ і 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ вакцинного вірусу, забезпечує в імунізованих телят індукцію вірусонейтралізуючих антитіл, які виявляються на 7 добу після введення препарату в титрах 5,0 і 6,0 log₂ відповідно, рівень яких зростає на 28 добу після повторного введення з інтервалом у 14 діб до 6,0 і 7,7 log₂, відповідно, та утримуються на цьому рівні до 60 доби, після чого на 180 добі дещо знижуються до 5,9 і 6,75 log₂.

6. Обґрунтовано та практично підтверджено в експерименті залежність імуногенності виробничого штаму ВК-1М від його інфекційності в щепному об'ємі та кратності введення. Установлено, що з підвищенням дози вірусу в щепному об'ємі від 0,5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ до 1Ч10^5,45 ТЦД₅₀ для морських свинок і від 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ до 5Ч10^5,45ТЦД₅₀ для телят за дворазового введення зростає індукція вірусонейтралізуючих антитіл у 1,5 рази в порівнянні з одноразовим і становить 7,3 і 8,0 log₂ відповідно.

7. Вакцинний вірус (штам ВК-1М), у дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ в щепному об'ємі виявляє імуносупресивні властивості, про що свідчить підвищення в 3,5 рази серомукоїдів у організмі щеплених проти вірусної діареї телят. Застосування бактеріального ліпополісахариду ЛПС-1, виготовленого з культури Bacillus alvei (штам 413), із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла телят одночасно із щепленням вакцини живої культуральної проти вірусної діареї активізує як специфічні, так і неспецифічні фактори резистентності у тварин, чинить імунореабілітуючу дію на імунну систему, згладжує імуносупресивність і підвищує імунну відповідь на виробничий штам вірусу діареї з продукцією вірусонейтралізуючих антитіл на 2 log₂ вище порівняно з щепленням однієї вакцини в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол.

8. Запропоновано спосіб імунізації телят проти вірусної діареї в неблагополучних щодо цієї хвороби господарствах із застосуванням дворазового введення з інтервалом 14 діб внутрішньом'язово 2 см³ вакцини живої культуральної, що вміщує 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ виробничого штаму ВК-1М вірусу діареї, одночасно з ЛПС-1 з розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварини, що забезпечує формування гуморального імунітету, починаючи з 7-ї доби після щеплення, і захищає тварин від захворювання впродовж 180 діб (термін спостереження).

1. Вакцина жива культуральна проти вірусної діареї великої рогатої худоби та нормативна документація (інструкція з виготовлення та контролю за показниками якості вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби, ТУУ на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби та листівка-вкладка із застосування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби), що розглянута й схвалена на засіданні методичної комісії ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 р.). Досьє на вакцину подано на експертизу до ДНКІБШМ та узгодження до Державного комітету ветеринарної медицини України.

2. Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, що передбачає одночасне застосування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та імуностимулюючого ліпополісахариду ЛПС-1, виготовленого з Bacillus alvei.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стеценко, В.І. Антигенна спорідненість та відмінність різних штамів вірусу діареї великої рогатої худоби [Текст] / В. І. Стеценко, О. В. Годовський, Л. І. Кучерявенко, Л.П. Тризна, Ю. С. Голуб, І.В. Чебанюк // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х, 2002. -- Вип. 80. -- С. 589-594. (Дисертанткою проведено накопичення клітинної біомаси перещеплюваних клітин ПТ, ТрТ, КСТ, 9_разові пасажі трьох штамів вірусу діареї в цих культурах клітин, визначення їх інфекційності та антигенної спорідненості).

2. Стеценко, В. І. Вивчення реактогенних та антигенних властивостей різних штамів вірусу діареї великої рогатої худоби [Текст] / В. І. Стеценко, Л. П. Тризна, І.В. Чебанюк, Л. Н. Покусай // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2003. -- Вип. 81. -- С. 351-356. (Дисертанткою проведено накопичення вірусовміщуючої культуральної суспензії трьох штамів ВД і вивчено в біопробі на кроликах їх реактогенність з оцінкою стану клітинного імунітету).

3. Чебанюк, І.В. Корекція імунітету ліпополісахаридом Bacіllus alvei при застосуванні живої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби [Текст] / І.В. Чебанюк, В.І. Стеценко, Л.П. Тризна // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2004. -- Вип. 83. -- С. 258-262. (Дисертанткою вивчались властивості ліпополісахаридного імуностимулятора та дослідних зразків вакцини проти ВД ВРХ).

4. Коваленко, Л. В. Динамика гуморального иммунитета телят, привитых живой вакциной против вирусной диареи крупного рогатого скота [Текст] / Л. В. Коваленко, И. В. Чебанюк, С. А. Михайлова, М. Е. Романько, В. С. Бойко // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2004. -- Вип. 84. -- С. 341-345. (Дисертанткою проведено щеплення тварин та дослідження сироваток крові в реакції нейтралізації на наявність антитіл до вірусу діареї, здійснено аналіз стану гуморального імунітету).

5. Чебанюк, І. В. Випробування вакцини живої проти вірусної діареї великої рогатої худоби [Текст] / І. В. Чебанюк // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. -- Х., 2005. -- Вип. 85. -- Т. 2. -- С. 1110-1113.

6. Деклараційний патент на корисну модель № 5153 Україна мпк⁷ А61К39/12. Спосіб профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби [Текст] / Стеценко В. І., Кучерявенко Л. І., Чебанюк І. В., Тризна Л. П. ; заявник і патентовласник Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини. -- № 20040705657 ; заявл. 12.07.04 ; опубл. 15.02.05, Бюл. № 2. -- 4 с.

АНОТАЦІЇ

Малакєєва-Чебанюк Ірина Владиславівна. Розробка живої культуральної вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини». Харків, 2008.

Захищаються матеріали, які містять результати експериментальних досліджень із розробки технології виготовлення на основі модифікованого штаму ВК-1М вірусу діареї вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та вивчення її імуногенної ефективності в лабораторних і виробничих умовах.

Випробувана культура клітин КСТ, що має високу продуктивну здатність щодо формування моно шару під час ролерного культивування, забезпечує активну репродукцію вірусу та накопичення його вихідної біомаси для виготовлення вакцини.

У лабораторних умовах на білих мишах, морських свинках, кроликах та на телятах у неблагополучних щодо вірусної діареї великої рогатої худоби господарствах вивчено антигенні властивості вакцини та імуногенність зразків рідкої й сухої живої вакцини проти вірусної діареї.

Показано, що атенуйований штам вірусу діареї, репродукований у культурі перещеплюваних клітин КСТ із кінцевим титром інфекційності 7,6 lg ТЦД₅₀/см³, активно індукує в організмі щеплених тварин вірусонейтралізуючі антитіла.

Запропонована технологія культивування клітин та вірусу дозволяє одержувати неконтаміновану сторонньою мікрофлорою (бактеріями, грибами, вірусами), нешкідливу для тварин та високоімуногенну вакцину. У дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. за одночасного введення з бактеріальним ліпополісахаридом з розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин дворазово з інтервалом 14 діб вона активізує в організмі щеплених тварин усі ланки імунної системи, забезпечуючи індукцію вірусонейтралізуючих антитіл у титрах до 8,0 log₂ і захист від захворювання на вірусну діарею.

Розроблено проект нормативної документації на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби, який надіслано для експертизи до ДНКІБШМ та узгодження в Державному комітеті ветеринарної медицини України.

Ключові слова: вірусна діарея, велика рогата худоба, виробничий штам вірусу, культура клітин, антигенні властивості, вакцина, імуномодулятор, специфічна профілактика.

Малакеева-Чебанюк Ирина Владиславовна. Разработка живой культуральной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины». Харьков, 2008.

Диссертация посвящена разработке вакцины и способа специфической профилактики вирусной диареи телят в неблагополучных по данной вирусной инфекции хозяйствах, основанного на принципе одновременного введения живой вакцины и иммуностимулирующего бактериального липополисахарида ЛПС-1 из Bacillus alvei.

Защищаются материалы, которые включают результаты экспериментальных исследований по разработке технологии изготовления вакцины живой культуральной против вирусной диареи крупного рогатого скота и изучения её имуногенной эффективности в лабораторных и производственных условиях.

Подобрана культура клеток, обладающая высокой продуктивной способностью к формированию монослоя при роллерном культивировании, которая обеспечивает активную репродукцию вируса и накопление его исходной биомассы для изготовления вакцины.

В лабораторных условиях на белых мышах, морских свинках, кроликах и на телятах в неблагополучных по вирусной диарее крупного рогатого скота хозяйствах испытаны антигенные свойства и имуногенность образцов жидкой и сухой вакцины против вирусной диареи.

Показано, что аттенуированный штамм вируса диареи, репродуцированный в культуре перевиваемых клеток КСТ с конечным титром инфекционности 7,6 lg ТЦД₅₀/мл, активно индуцирует в организме привитых животных вируснейтрализующие антитела.

Предложенная технология культивирования клеток и вируса позволяет получать не контаминированную посторонней микрофлорой (бактериями, микоплазмами, грибами, вирусами), безвредную для животных и высокоиммуногенную вакцину. В дозе 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. при одновременном введении с липополисахаридом бактериального происхождения из расчёта 7 мкг/кг массы тела животного двукратно с интервалом 14 суток она активизирует в организме вакцинированных животных индукцию вируснейтрализующих антител в титрах до 8,0 log₂ и защищает от заболевания вирусной диареей.

Применение бактериального липополисахарида ЛПС-1, полученного из культуры Bacillus alvei (штамм 413), из расчёта 7 мкг/кг массы тела телят одновременно с введением вакцины живой культуральной против вирусной диареи активизирует как специфические, так и неспецифические факторы резистентности у животных, проявляет иммунореабилитирующее действие на иммунную систему, сглаживает имуносупрессивность и повышает иммунный ответ на введение производственного штамма вируса диареи.

Разработан проект нормативной документации на вакцину живую культуральную против вирусной диареи крупного рогатого скота, который направлен на экспертизу в Государственный научно-контрольный институт биотехнологии и штаммов микроорганизмов и для согласования в Государственном комитете ветеринарной медицины Украины.

Ключевые слова: вирусная диарея, крупный рогатый скот, производственный штамм вируса, культура клеток, антигенные свойства, вакцина, иммунитет, иммуномодулятор, специфическая профилактика.

Malakeyeva-Chebanyuk Irina Vladislavovna. Development of an alive cultural vaccine against virus diarrhea of cattle.- Manuscript.

Dissertation presented for obtaining the scientific degree of a candidate of veterinary

sciences in speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virology. National scientific center «Institute of experimental and clinical veterinary medicine». Kharkiv, 2008.

Materials are defended that contain the experimental research results of alive cultural against virus diarrhea vaccine's making technology development on the basis of a modified strain of BK-1M virus diarrhea and its immunogenic efficiency in laboratory and production conditions.

A calf coroner vessels cell culture is chosen that has a high productive ability in relation to forming a monolayer at roller cultivation, provides an active virus reproduction and accumulation of the virus output biomass for vaccine making.

Antigen vaccine's properties and immunogenity of liquid and dry alive against virus diarrhea vaccine's samples are studied in laboratory conditions on white mice, guinea-pigs, rabbits, and calves at the farms unfortunate in relation to virus diarrhea of cattle.

It is shown that attenuated virus diarrhea strain reproduced in the culture of revaccinated calf coronary vessels' cells with the final infectiousness title of 7,6 lg ТCID ₅₀/см³, actively induces virus neutralizing antibodies in the organisms of the vaccinated animals.

Proposed cells and virus cultivation technology allows to obtain non-contaminated with extraneous microflora (by bacteria, candida, viruses), harmless for animals and highly immunogenic vaccine. In a dose 2Ч10^5,45 ТCID ₅₀/animal with a simultaneous injection with bacterial lipopolysaccharide from the calculation of 7 mkg/kg of animal mass, twice with a fortnight interval, it activates all links of the immune system in the organism of the vaccinated animals, providing induction of virus neutralizing antibodies in titles to 8,0 log₂ and defense against virus diarrhea.

The developed project of normative documents on a vaccine alive cultural against virus diarrhea of cattle is sent for examination of The State Scientific Control Institute of Biotechnology and Strains of Microorganisms and coordination at the State Department of Veterinary Medicine of Ukraine.

Keywords: virus diarrhea, cattle, production virus strain, cell culture, antigen properties, vaccine, immunomodulator, specific prevention.