Органический синтез и молекулярный дизайн новых лекарственных препаратов

Логически функционально-ориентированный дизайн ставит перед исследователем гораздо более трудные задачи, чем просто создание молекулярных ансамблей в структурно-ориентированном дизайне. Проектирование новой структуры в функционально-ориентированном дизайне -- это многоступенчатая процедура, включающая несколько дискретных этапов. Прежде всего необходимо перевести «заказ» на язык молекулярных структур. Необходимое свойство будущего вещества должно быть тем или иным путем приведено в соответствие со структурой органического соединения (или хотя бы с какими-то его структурными элементами -- функциональными группами, общей геометрией, наличием гидрофобных или гидрофильных групп и т.п.). Достаточно часто конечные цели синтеза формулируются не химиком, и потому особенно важно, чтобы оба участника работы -- «заказчик» и «исполнитель» -- достигли полного взаимопонимания, могли общаться на одном профессиональном языке, единообразно понимали характер работы над проектом и его ожидаемые результаты. Поясним сказанное таким умозрительным примером.

Допустим, врач-клиницист обращается к химику с «заказом» создать лекарство, скажем, от малярии. Химик в ответ может только пожать плечами. Для того чтобы такой заказ имел для него смысл, между химиком и врачом должна выстроиться целая цепочка «переводчиков» -- специалистов-посредников, конкретизирующих задачу и приводящих ее к состоянию читабельности на молекулярном языке. Это прежде всего эпидемиолог, который устанавливает природу возбудителя -- малярийного плазмодия, затем -- микробиолог, изучивший жизненный цикл и физиологию паразита, далее биохимик, устанавливающий природу «болевых точек» плазмодия, тех ферментов, ингибирование которых способно убить паразита или заблокировать его размножение. После этого энзимолог должен установить структуру активного центра такого фермента, природу его субстрата, а на этой основе сформулировать структурные требования к возможному ингибитору. Только после этого в дело может включиться химик -- специалист по функционально-ориентированному дизайну и начать проектировать структуры возможных ингибиторов -- потенциальных противомалярийных средств. В этой работе он будет постоянно консультироваться и с энзимологом, и с еще одним специалистом -- фармакологом, который укажет ему, каковы должны быть свойства ингибитора для того, чтобы из него можно было приготовить собственно лекарство. Это могут бьггь такие требования, как, например, растворимость в воде, устойчивость при хранении и стерилизации, устойчивость к действию ферментов пищеварительного тракта (если предполагается пероральное введения лекарства) и многое, многое другое. С энзимологом и фармакологом химик может уже разговаривать на привычном ему молеку- лярно-структурном языке, и после этого уже приступить к своей профессиональной деятельности. В ней тоже есть свои этапы. Опираясь на выработанные структурные критерии, генерируют некоторый набор молекулярных конструкций и выбирают среди них оптимальные (как с точки зрения ожидаемой функции, так и с точки зрения доступности для синтеза). Затем следует синтез этих отобранных соединений и проверка их действительных свойств. После этого на основе фактических данных о свойствах полученных соединений производят второй цикл оптимизации структуры и, наконец, если это оказывается необходимым, повторяют такие итеративные циклы оптимизации многократно, пока не будет найдено вещество, в максимальной степени удовлетворяющее всем поставленным требованиям.

Очерченная последовательность этапов -- это идеализированная схема, которая далеко не всегда реализуется в полном объеме. Это -- долгий путь, но очевидно, что он приводит к цели гораздо быстрее и с меньшими затратами, чем старый традиционный метод «проб и ошибок». Последний требует огромного объема рутинного труда -- получения и тестирования сотен и тысяч веществ, где находка оптимального кандидата является в значительной степени вопросом удачи. Напротив, стратегия молекулярного дизайна предполагает глубокое понимание существа задачи, изучение молекулярных механизмов целевой функции вещества, систематическое накопление знаний о связи структуры молекулы с изучаемыми свойствами и проектирование целевого соединения с рациональным учетом всего объема полученной при этом информации и использованием всего доступного химику воображения и интуиции. Понятно, почему в современном мире серьезные успехи в создании практически полезных веществ достигаются главным образом в больших многопрофильных коллективах -- крупных промышленных компаниях или специализированных научно-исследовательских институтах. В то же время даже сейчас нередко бывает, что первоначальный импульс к подобному исследованию дает то или иное случайное открытие или неожиданное наблюдение. Тем не менее, стратегия и методы молекулярного дизайна служат мощными инструментами для ускорения и облегчения переработки такого открытия в объект тщательно спланированного, целенаправленного исследования, доводящего случайную удачу до законченного, практически значимого результата.

4.4 Биомиметика ферментов и молекулярного узнавания

Современная органическая химия может с гордостью заявить о своей способности синтезировать неизвестные Природе соединения огромной сложности и об обладании набором разнообразнейших методов, позволяющих выполнять почти любые химические трансформации. Такое заявление надежно подкрепляется множеством выдающихся достижений органического синтеза последних десятилетий. Тем не менее, впечатление от таких «мажорных аккордов» немедленно тускнеет при сопоставлении с работой химических механизмов даже простейшей живой клетки. Тысячи соединений (и простых, и исключительно сложных) синтезируются ферментами в любой момент жизни клетки при обычных (физиологических) условиях: в воде, в узком интервале значений рН, без применения высоких температур и давлений и без помощи наших суперактивных реагентов типа сверхкислот, сверхсильных оснований, щелочных металлов, галогенов, литийорганических соединений и т. п.. В любой клетке непрерывно осуществляются многостадийные синтезы огромного разнообразия органических соединений, необходимых дня поддержания ее жизни. Все эти синтезы выполняются за считанные минуты с количественными выходами и строго регио- и стереоспецифично! Это означает, что все наиболее трудные проблемы стратегии и тактики органического синтеза уже давно решены на «химических комбинатах», оперирующих в любой живой системе. Такое высочайшее совершенство биосинтеза невольно вызывает у химиков смешанные чувства и восхищения, и подавленности от сравнения своих скромных возможностей с достижениями Природы.

Экспериментальные исследования путей биосинтеза дают обширную информацию о химии этих процессов. Эти знания обеспечивают твердую основу для всей области биомиметических путей синтеза разнообразных природных соединений, которые используют стратегические принципы, разработанные Природой (например, синтез морфина). Однако, несмотря на многочисленные экспериментальные данные о механизме основных биохимических трансформаций, нам все еще слишком мало известно о способе действия фермента как катализатора. Был предложен целый ряд гипотез для объяснения замечательной способности ферментов осуществлять высоко эффективный и селективный катализ. Это было предметом многочисленных исследований по созданию специальных химических моделей ферментативного катализа. Кроме того, имеются еще более важные аспекты ферментативного катализа, а именно: способность ферментов в нужный момент узнавать свой субстрат среди тысяч органических соединений, присутствующих в клетке, и регулируемость активности ферментов. Деятельность сотен и тысяч ферментов, одновременно оперирующих в любой живой системе, требует же - сткого управления с тем, чтобы в каждый данный момент и в каждом конкретном месте вполне определенный набор соединений синтезировался (или подвергался расщеплению), удовлетворяя текущие потребности организма. Более того, на разных стадиях жизненного цикла и при изменяющихся условиях существования потребности организма в тех или иных веществах драматически изменяются. Поэтому регуляторные механизмы должны быть, с одной стороны, очень жесткими, а с другой -- чувствительными к химическому окружению и другим внешним условиям. Ошибки в регулировании могут иметь летальные последствия, а потому правильное функционирование управляющих систем жизненно важно в любой момент и на всех уровнях биологической организации, от органеллы, клетки, ткани или органа до целостного организма и популяции (в последнем случае это дарвинский отбор генов).

Для современной химии нет более вдохновляющей задачи, чем создание искусственной молекулярной системы, способной функционировать подобно ферментам с их эффективностью, селективностью и управляемостью. Не будет преувеличением сказать, что создание искусственного катализатора такого типа будет воистину революционным прорывом в химической науке и приведет к глубоким, принципиального характера изменениям и в лабораторном, и в промышленном синтезе, к изменениям самого лица нашей цивилизации (чтобы не быть голословными, упомянем только такие ожидаемые последствия подобного достижения, как колоссальный прогресс в химической промышленности и тех областях экономики, где используются ее продукция, ликвидация проблемы отходов и связанных с ней экологических затруднений и катастроф, решение продовольственной проблемы с помощью промышленного синтеза, принципиально новые возможности в фармакологии и медицине).

Ферменты -- очень сложные органические молекулы, представляющие собой глобулярные белки. Их каталитические центры состоят их ряда атомных групп, природа и взаимное расположение которых в пространстве строго детерминировано, что, собственно, и определяет каталитическую активность фермента. Все структурные и пространственные особенности каталитического центра заданы как последовательностью аминокислотных остатков полипептидной цепи данного белка (первичной структурой), так и упаковкой этой цепи в фиксированную конформацию белковой глобулы (ее вторичной и третичной структурами). Поэтому для химиков нет смысла пытаться построить искусственный структурный аналог такой чудовищно сложной конструкции, добиваясь сходства со свойствами оригинала. Не говоря уже о практически непреодолимых трудностях подобной задачи, она и смысла большого не имеет (если только мы не хотим создать искусственную жизнь). Дело в том, что каждый фермент решает узко специализированную задачу, а эта специализация лишь изредка совпадает с задачами «человеческой» химии. Смысл всей проблемы не в этом, а в том, чтобы обеспечить дизайн квазиферментов под реальные задачи (ну, например, расщеплять высшие парафины до низших, т.е. делать бензин из мазута), т. е. не копировать или моделировать живые ферменты, а научится делать ферменто-подобные катализаторы на заказ (не копировать природу, а учиться у нее, воспринять ее методологию, а не результаты!). Кроме того, ферменты как катализаторы для лабораторного или промышленного синтеза крайне неудобны из-за своей лабильности [денатурации при повышенных температурах или неблагоприятных (отнюдь не очень жестких) химических воздействиях, а также способности к деградации микроорганизмами внешней среды (попросту говоря, к гниению)]. Наконец, если некий известный фермент потребуется в макроскопических количествах, то получить его сейчас можно наиболее эффективно биосинтезом с помощью методов генной инженерии, а отнюдь не чисто химически.

Создание методов проектирования и синтеза катализаторов, долженствующих воспроизвести все положительные особенности ферментов без их недостатков, -- это проблема головокружительной сложности и трудности. Ее полное решение, безусловно, дело не столь близкого будущего, так что сегодня подобные проекты в практическом плане никто даже не рассматривает. Тем не менее широкие исследования, направленные к этой отдаленной цели, ведутся во многих лабораториях мира. Здесь нет противоречия: просто такие исследования построены не на «лобовой атаке» на проблему, а следуют стратегии «планомерной осады» -- последовательного создания искусственных систем, моделирующих те или иные особенности ферментативного катализа. Постепенно накапливаемые в ходе этих работ опыт и знания создают ту базу, на которой, как можно надеяться, будут со временем найдены решения всей проблемы в целом.

В этом плане особенно поучительно рассмотреть первые результаты исследований по созданию искусственных рецепторов для частиц, более крупных, чем неорганические ионы, с помощью связывания многоцентровыми лигандами. Очень простой и поучительный пример представлен гексаазамакроциклами, построенными из двух триаминных связывающих сайтов, соединенных полиметиленовыми цепями. Такая структура была специально разработана для узнавания линейных двухзарядных частиц, в частности дикарбоксилат-бисанионов, которые превосходно укладываются между связывающими сайтами рецептора. Еще более интересно и важно то, что селективность такого связывания обнаруживает явную корреляцию между длиной мостиковых цепей рецептора (параметр n) и длиной цепи в субстрате (параметр m). Подобным же образом рецепторы (два макро циклических донорных сайта, разделенных мостиками из ароматических остатков различной длины) способны узнавать и селективно связывать бис-аммониевые ионы линейной структуры в зависимости от длины фрагмента, соединяющего аммонийные центры.

Вряд ли нужно в очередной раз повторять, что свойства указанных систем как селективных лигандов -- это не неожиданное открытие, а предвиденный результат тщательно спланированного, целенаправленного молекулярного конструирования простой модели искусственного рецепторов с вариабельной и управляемой картиной субстратной специфичности.

В предыдущем примере геометрия рецептора была ответственна за селективность взаимодействия с субстратом, а собственно связывание обеспечивалось кулоновскими взаимодействиями четко локализованных, почти точечных заряженных групп рецептора и субстрата. В электронейтральных, чисто ковалентных субстратах таких дискретных центров, разумеется, нет. Их связывание может быть основано только на гораздо более слабых и пространственно «рыхлых», диффузных вандерваальсовых взаимодействиях. Поэтому задача создания специфических рецепторов подобных соединений исключительно трудна. Тем не менее, и в этой области уже найдены эффективные решения.

Циклофаны были синтезированы как молекулы-хозяева для ароматических углеводородов. Наличие гидрофобной полости достаточного размера придает соединениям способность комплексоваться с гидрофобными ароматическими соединениями. Четвертичные аммониевые группы на периферии молекулы придают этим моделям растворимость в воде. В ряду соединений варьирование длины цепей позволяет управлять размерами внутренней полости, а введение дополнительных метильных групп -- формой полости и ее гидрофобостыо. В водных растворах эти лиганды способны образовывать прочные комплексы с ароматическими соединениями. Стабильность таких комплексов и селективность связывания молекул-«гостей» весьма чувствительна к упоминавшимся выше вариациям структурных параметром молекул-«хозяев». Удалось даже изучить селективный транспорт ароматических соединений через водную фазу с помощью модифицированных производных лигандов сходного структурного типа.

Для того чтобы создать рецептор, настроенный на более крупные молекулы субстратов, а не только на простые ароматические соединения, был синтезирован аналог, в котором фениленовые остатки в были заменены нафтиленовыми. В результате этой модификации лиганд получил способность образовывать комплексы с такими крупными молекулами, как стероиды, одновременно с резким снижением его сродства к субстратам меньшего размера.

Очень важно подчеркнуть это обстоятельство: увеличение размеров внутренней полости лиганда, его связывающего сайта, -- это не просто возрастание объема «контейнера», в который теперь можно заложить вместо одной маленькой молекулы одну большую или несколько маленьких, а именно изменение характера селективности рецептора (в большом «контейнере» прочно удерживаются крупные молекулы, а мелкие из него «вываливаются»). И дело здесь не просто в размерах -- видимо, не менее важно и определенное структурное соответствие субстрата рецептору. Так, при варьировании структуры стероидного субстрата константа связывания с рецептором может изменяться в пределах двух-трех порядков величины. Таким образом, этот лиганд может служить эффективным инструментом для избирательного связывания определенных стероидов и выделения их из смесей.

Эти примеры показывают, что молекулярный дизайн, основанный даже на достаточно прямолинейном анализе размеров и формы субстрата и рецептора, может служить эффективной стратегией для достижения высокой селективности в узнавании, связывании и переносе различных соединений.

В случае описанном выше управление селективностью связывания достигалось путем варьирования структуры мультидентатных лигандов. Можно ли, однако, построить химические модели, способные имитировать не только ферментоподобное связывание, но и его вариабельность, управляемую внешними условиями? Такое свойство представляет особый интерес из-за очевидного родства со способностью ферментов изменять свою каталитическую активность или даже «включаться» и «выключаться» в ответ на внешние воздействия (такие, как изменение рН, присутствие или отсутствие некоторых ионов металлов, низкомолекулярных регуляторов и т. п.). Имеются также обширные данные о том, что конформация активного центра фермента, ответственного за его каталитическую активность, может изменяться при воздействии на удаленные от этого центра участки белковой глобулы (аллостерические эффекты). Эти явления имеют особое значение как один из основных механизмов управления в живых системах, позволяющих воздействовать на состояние и активность ферментных систем с помощью химических сигналов, продуцируемых эндогенно, т.е. самой клеткой, или поступающих извне.

Известны примеры имитации подобных уникальных свойств ферментов, как катализаторов, путем создания «управляемых молекул», хотя это направление молекулярного дизайна пока еще находится в зачаточном состоянии. Конформационная подвижность полиэфирных цепей лигандов позволяет рассматривать их как подходящую основу для введения в нее химически активных групп-«переключателей», воздействуя на которые можно осуществлять организацию (или дезорганизацию) связывающего сайта лиганда.

Стратегия синтеза всех этих лигандов была подобна стратегии синтеза серий рассматривавшихся выше коронандов и криптандов в том отношении, что она неизменно включала стадии сборки целевой системы из нескольких блоков, один из которых (или даже все) мог быть представлен сходными по структуре и функциональности субстратами с различными размерами молекул. Таким образом, не изменяя ни общую схему синтеза, ни условия проведения реакций на стадии сборки системы, а лишь варьируя природу одного из реагентов, можно было по желанию получать серии структурно аналогичных лигандов с варьируемыми геометрическими параметрами связывающих сайтов. Именно на этой основе и были получены данные по зависимости селективности лигандов по отношению к сериям родственных молекул-гостей.

Исключительно высокие скорости и степень селективности ферментативных реакций с давних пор интригуют химиков-органиков. Многочисленные предположения, начиная с более чем столетней давности идеи «ключ-замок» Эмиля Фишера и до более современной концепции «взаимоиндуцированного соответствия» Кошланда были выдвинуты для объяснения этих явлений. Каковы бы ни были конкретные подробности различных интерпретаций, все они предполагают тот или иной род фиксации субстрата внутри полости активного центра конформационно подвижной молекулы фермента вблизи его реакционноспособных групп. Возникающее в результате взаимодействие между реакционными центрами фермента и реакционноспособной конформацией субстрата считается одной из главных причин высоких скоростей и селективности, свойственных ферментативным реакциям. Дизайн химических структур, пригодных для экспериментального исследования относительной важности различных факторов, определяющих скорости и селективность органических реакций как моделей определенных аспектов ферментативного катализа, был и остается областью, вызывающей напряженное внимание.

Катализируемые ферментами химические реакции могут протекать быстрее их неферментативных аналогов до 1012 раз. Такое поразительное ускорение -- одна из наиболее интригующих сторон ферментативного катализа. До сих пор не было предложено ни одного достаточно убедительного объяснения этого явления. Попытки смоделировать этот аспект на специально сконструированных искусственных системах многочисленны, но в общем случае все трактовки полученных таким путем результатов отнюдь не бесспорны. Тем не менее, небесполезно будет хотя бы кратко рассмотреть некоторые подходы, иллюстрирующие общие тенденции этих исследований.

Прежде всего, необходимо подчеркнуть, что при сравнении внутримолекулярных реакций с их межмолекулярными аналогами часто наблюдается превышение скоростей первых из них над вторыми до восьми порядков величины. Первой стадией любой ферментативной реакции является связывание субстрата с ферментом с образованием фермент-субстратного комплекса. Таким образом, вторая, т. е. собственно ферментативная реакция, оказывается внутримолекулярной, так что должна существовать близкая аналогия между этой стадией и обычными эффектами ускорения во внутримолекулярных чисто химических реакциях. Следует, однако, иметь в виду, что общепринятой трактовки влияния внутримолекулярности на скорости реакций пока не существует.

Высочайшие скорости ферментативно катализируемых реакций не могут заслонить их другую, еще более впечатляющую особенность, а именно уникальную хемо-, регио- и стереоспецифичность. Действительно, ферментативные реакции протекают по одному вполне определенному реакционному центру молекулы субстрата без каких-либо побочных реакций, затрагивающих альтернативные и почти идентичные центры, с полным контролем абсолютной стереохимии продукта, равно как и с выбором единственного стереоизомера субстрата, подвергающегося трансформации. В этом отношении современная органическая химия при всей мощи ее методического арсенала пока еще неспособна сравниться с Природой.

Одна из наиболее жгучих проблем в области биомиметики -- это моделирование региоселективности ферментативного катализа. Так, например, фермент ансатураза превращает стеариновую кислоту в олеиновую, причем ни одно положение молекулы субстрата, за исключением пары С-9 и С-10, в этой реакции не затрагивается. С химической точки зрения такой результат означает, что конформационно подвижная цепь субстрата локализуется внутри некоторой полости активного центра фермента таким образом, что только центральный фрагмент оказывается доступен для действия окислительного сайта каталитического центра фермента. До сих пор не было описано ни одной успешной попытки химического моделирования такой абсолютной селективности реакций одной из СН2-групп из ряда почти неразличимых, входящих в состав длинной алифатической цепи. Имеются, однако, экспериментальные данные, показывающие, что факторы, влияющие на форму длинноцепочечных молекул, могут существенно изменить селективность неферментативных реакций по альтернативным положениям таких систем.

Органические молекулы с жестким скелетом гораздо лучше подходят для дизайна работоспособных моделей, воспроизводящих ферментоподобнуго селективность функционализашш при неактивированных центрах. Внутримолекулярные реакции представляются особенно полезными для этого. В самом деле, жесткость структуры позволяет целенаправленно разместить ре- акционноспособные группы в тесной близости к тому участку молекулы, где желательно произвести функционализацию, обеспечивая тем самым предпочтительную атаку в это положение.

Ферментативный катализ, за редкими исключениями, строго энантиоспе- цифичен (и по отношению к хиральным субстратам, и в смысле образования хиральных продуктов.). Поэтому хиральные природные соединения продуцируются в виде оптически чистых энантиомеров. Это свойство ферментов объясняется многоцентровым связыванием субстрата при образовании фермент- субстратного комплекса, предшествующем ферментативной реакции. Такая фиксация ахирального субстрата в активном центре хиральной молекулы фермента обеспечивает возможность его атаки реагентом только с одной стороны, т. е. по одному из энантиотогтных положений, ориентированного так, что только оно пространственно доступно для реакции. Аналогично при такой хи- ральной фиксации ферментативная реакция оказывается возможной только для одного из энантиомеров хирального субстрата. Создать химические системы, способные функционировать как энантиоселективные (а тем более энан- тиоспецифичные) катализаторы -- это одна из наиболее важных и соблазнительных целей современной химии. В последние десятилетия был разработан целый ряд таких катализаторов, многие из которых находят широкое применение в органическом синтезе. Успехи в этой области достигнуты главным образом на путях эмпирического поиска, основанного на общих сображе - ниях о предпосылках, необходимых для осуществления энантиоселективного катализа. Только в небольшом числе случаев положительные результаты были получены путем продуманного молекулярного дизайна перспективных структур. Вероятно, наиболее ясной иллюстрацией такого подхода могут служить работы группы Кори, которые привели к разработке серии исключительно эффективных катализаторов. Таков, например, оксаазаборолидин, использовавшийся для энантиоселективного восстановления карбонильной группы бораном.

Приведенные выше примеры иллюстрируют плодотворность молекулярного дизайна как для накопления информации о специфических особенностях ферментативного катализа, так и для разработки биомиметических подходов к созданию применимых в препаративной практике органического синтеза инструментов.

Как уже говорилось выше, значение этих моделей для энзимологии состоит не в том, что они буквально воспроизводят те или иные механизмы ферментативного катализа, а скорее в ином. Воспроизведение в чисто органо-химическом плане определенных особенностей действия ферментов позволяет установить те реальные типы механизмов и структурные предпосылки к их реализации, которые вводят гипотезы о механизмах собственно ферментативного катализа в рамки экспериментально проверяемых и/или проверенных представлений, отбрасывая необоснованные и указывая возможные пути подтверждения более правдоподобных предположений. Благодаря накопленному фактическому материалу становится понятным, какого рода структурные особенности и межмолекулярные взаимодействия следует искать в структуре ферментов и фермент-субстратных комплексов для того, чтобы раскрыть интимные подробности ферментативного катализа. Только профессиональный снобизм может помешать энзимологам воспользоваться такими подсказками со стороны химиков-органиков. Разумеется, рассмотренные примеры являются лишь функциональными, а отнюдь не структурными моделями ферментов. Тем не менее, они позволяют на экспериментальной, а не чисто умозрительной основе судить о возможных химических принципах реализации тех или иных особенностей ферментативного катализа -- скажем, оценивать реалистичность возможных трактовок узнавания субстратов природными ферментами или гипотетических механизмов аллостерического эффекта.

Обзор Менгера начинается со ссылки на «анонимного, но видного биохимика», который заявил, что «не имеет значения, какие изящные ферментативные модели вы, химики-органики, сконструируете -- ни один биохимик не обратит на них внимание». В этом столкновении профессиональных менталитетов Менгер, в отличии от уважаемого биохимика, говорит, что результаты, полученные на этой модели, очень поучительны и важны как для понимания катализа вообще, так и для понимания катализа ферментативного, указывая те структурные предпосылки, которые могут обеспечить «ферментоподобное» ускорение реакции.

При всем этом рассматривавшиеся выше модели слишком просты в сравнении с ферментами. Для более многостореннего и более глубокого постижения природы ферментативного катализа требуется привлечение гораздо более изощренных моделей, методологии и концепций недавно появившейся на свет области науки, супрамолекулярной химии.

4.5 Дизайн и создание молекулярных сосудов

«Дизайн молекулярных гостей, хозяев и их комплексов» -- название Нобелевской лекции Дональда Крама. Десятью годами ранее в обзоре «Дизайн комплексов между синтетическими хозяевами и органическими гостями» он привел список указаний (целых восемнадцать!) по рациональному дизайну «хозяев». Среди них наиболее важной, решающей была общая концепция создания структуры лигацда («хозяина»), содержащей жесткую трехмерную матрицу с размещенной на ней системой комплексующих сайтов, организованной так, чтобы они соответствовали связывающим сайтам «гостя». Выбор возможных кандидатов на реализацию и оптимизация их структурных параметров потребовали кропотливой работы с молекулярными моделями. В указанной выше лекции Крам заявил: «С самого начала мы пользовались молекулярными моделями Кори--Полинга--Колтана (КПК), служившими нам компасом в плаваньи без карты по морю потенциально возможных целевых структур. Мы провели сотни часов за строительством КПК моделей потенциальных комплексов и ранжированием их по степени привлекательности как целей исследования».

Среди многочисленных типов «хозяев», разработанных группой Крама, особенно впечатляющими и многообещающими представляются сферанды. В основе этих лигандов лежит система из шести связанных по мета-положениям ароматических ядер, несущих шесть кислородных центров. Неудивительно, что такое расположение донорных центров особенно благоприятно для образования комплексов с неорганическими катионами подходящих размеров. Замечательно при этом, что, согласно данным ренттеноструктурного анализа, конформации свободного сферавда и его литиевых или натриевых комплексов практически идентичны, тогда как во всех ранее описанных случаях подобное комп- лексообразование (например, в краун-эфирах) влечет за собой значительное изменение конформации. В первой публикации в этой области указано: «Таким образом, вся работа по сборке и организации связывающих сайтов этого сферавда перенесена с процесса комплексообразования на синтез лигандной системы, конформация которой упрочнена жесткой опорой». Действительно, именно это обстоятельство послужило главной причиной выбора такой молекулярной системы в качестве первоначальной цели синтеза.

Размер центральной полости и жесткость конформации молекулы делает соединение превосходным «хозяином» для малых катионов, таких, как и но этот лиганд полностью «отвергает» другие катионы в качестве «гостей». Эта селективность воистину беспрецедентна: так, способность связывать Nа+ на 10 порядков величины выше его сродства к К+. Это свойство побудило авторов работы использовать структурную основу соединения для разработки хромогенного лиганда как специфического индикатора на ионы лития и натрия. Этот сферанд содержит в пара-положении к гидроксильной группе дополнительный азо-заместитель в качестве хромофора. Его растворы окрашены бледно-желтый цвет, который при ионизации фенольного гидроксила немедленно изменяется на зеленый и далее на глубокий синий. Прибавление К+, Mg2+ или Са2+ не оказывает заметного влияния на рК соединения. Таким образом, заметное изменение цвета легко происходит, когда в слабощелочной среде приходит в контакт со следовыми количествами Na+ или Li+, способными к образованию комплекса, в то время как ионы К+ никакого влияния на цвет раствора не оказывают. Чувствительность этой цветной реакции поразительна: она позволяет обнаружить катионы первых двух щелочных металлов при концентрациях вплоть до 10-8 М в присутствии других катионов. Это означает, что растворы с концентрацией натриевых солей даже 5 * 10-5 мг/л оказываются слишком грязными для использования этого реагента. Такая чувствительность создает довольно необычные трудности при работе с реактивом. Обычные органические растворители, в том числе СНСl3 или CH2Cl2, хранившиеся в стеклянных сосудах, могут, как оказалось, содержать достаточно ионов натрия для того, чтобы изменять цвет добавляемых к ним следовых количеств. Поэтому приходилось принимать специальные меры предосторожности при работе с этим сферандом, направленные на устранение подобных загрязнений из растворителей и реагентов (между прочим, кому бы раньше могло придти в голову, что хлороформ нужно очищать от примеси... натрия?!), а все операции выполнять только в кварцевой, полипропиленовой или тефлоновой аппаратуре. Очевидно, насколько важным может быть такой сверхчувствительный и строго селективный реагент для аналитической химии. Вот прямой практический результат молекулярного дизайна!

Открытие сферандов и формулирование новых принципов дизайна лигандов повлекли за собой многочисленные последствия в развитии исследований, далеко выходящие за пределы проблем селективности комплексо- образования.

Эффективность и плодотворность исходной концепции, использованной в молекулярном дизайне лигандов с замкнутой оболочкой, была таким образом подтверждена очень убедительным путем. Однако синтез системы «молекула внутри молекулы», будучи сам по себе чрезвычайно увлекательной задачей, имеет гораздо более глубокий смысл, чем просто молекулярная имитация погремушки или «сферы внутри сферы» -- традиционного предмета восточного прикладного искусства.

Как указано в одной из основных статей Крама, «карцерплексы -- это молекулярные ячейки, внутренняя часть которых представляет собой новое и уникальное состояние материи, в которых объем пространства, его заполнение и поверхность стенок могут быть спроектированы, приготовлены и затем изучены как объекты спектральных исследований точно так же, как твердые тела, растворы или частицы в газовой фазе». Действительно, создание этих систем дало авторам уникальную возможность получить данные по необычным спектральным свойствам и поведению одиночной молекулы «гостя», инкарцерированной в полости «хозяина». В частности, было обнаружено, что такое инкарцерирование не лишает «заключенных» «права переписки».

4.6 К дизайну новых лекарственных средств

Уже более столетия химики вовлечены в поиск соединений, которые могут служить медикаментами для лечения разнообразных болезней. В результате этих усилий на счету сегодняшней химиотерапии имеется впечатляющий ряд достижений. Однако, как мы уже говорили в начале этой книги, эти достижения получены ценой огромного труда, потраченного на получение тысяч и тысяч соединений, тщательный скрининг их свойств и параметров активности, после чего только и стало возможным выбрать из этих тысяч кандидатов единичные соединения, удовлетворяющие требованиям медицинской практики. Такой трудоемкий и требующий больших затрат времени подход был неизбежен из-за сложности проблемы, умноженной на почти полное отсутствие понимания механизмов и тонких особенностей взаимодействия живого организма с чужеродными веществами (ксенобиотиками), даже если речь идет о традиционных и хорошо изученных лекарствах. Так, например, аспирин (О-ацетилсалициловая кислота) вошел в медицинскую практику в 70-х годах XIX в. и с тех пор широко применяется как эффективное болеутоляющее и противовоспалительное средство. Только в США его годовое производство достигает 40 млн. фунтов. Тем не менее, многочисленные исследования механизма действия аспирина до сих пор не привели к созданию адекватного объяснения многосторонней картины воздействия аспирина на организм человека.

Эти проблемы, наряду с другими не менее важными, такими, как кратковременные и отдаленные побочные эффекты лекарств, их транспорт к мишеням (поврежденным органам и тканям), пролонгирование действия, совместимость с другими лекарствами, аллергические эффекты и т.д., и т.п., были в центре внимания исследователей на протяжении всей эры химеотерапии. В результате был накоплен громадный фактический материал, позволяющий значительно облегчить первичную оценку соотношений структура/активность внутри серии родственных соединений.

Успехи, достигнутые за последние два десятилетия объединенными усилиями молекулярной биологии, медицинской химии и органической химии привели к кардинальным изменениям в этой области. Стало возможным описать главные биохимические события, происходящие в клетках, тканях или органах, в терминах молекулярной биологии и распознать системы, в наибольшей степени затронутые при патологических состояниях организма. Понимание причин, вызывающих сбой в функционировании биохимических систем, открывает пути для выработки более рациональных подходов к поиску новых лекарственных средств. Основной принцип таких подходов состоит в выяснении мишеней, на которых должно быть нацелено действие потенциальных лекарств, за которым следует дизайн структуры, способной эффективно взаимодействовать с мишенью. Иными словами, общая проблема разработки подходящего лекарства теперь может быть сформулирована более определенно и конкретно, как, например, создание ингибиторов для некоторой ферментативной системы, либо агентов, влияющих на биосинтез ДНК, репликацию или экспрессию генов, либо факторов, воздействующих на гормональную систему, либо что-то иное, способствующее восстановлению нормального функционирования поврежденной биохимической системы. Такая гораздо более детализированная трактовка требований медицинского «заказчика» уже может быть, по крайней мере, в первом приближении, переведена на язык химических структур. «Заказ» становится понятным «исполнителю» -- химику-органику, а его выполнение -- в пределах возможностей его профессионального искусства. Задача становится объектом молекулярного дизайна (в противоположность традиционному пути слепого эмпирического поиска). Разумеется, даже самая современная наука с ее мощным методическим арсеналом и огромным объемом накопленной информации (в сочетании с техническими средствами ее обработки) пока что неспособна с абсолютной точностью предсказать структуру оптимального лекарственного вещества с четко очерченной картиной воздействия на организм. Тем не менее, с помощью такого подхода уже можно резко сузить поле поисков и ограничить его сравнительно немногими кандидатами для выбора оптимальной структуры.

Любое серьезное современное исследование в области создания биологически активных веществ включает элементы молекулярного дизайна.

Развитие атеросклероза -- основного фактора, ответственного за ишемическую болезнь сердца, -- критически зависит от повышенного содержания в плазме крови холестерина, связанного с липопротеинами низкой плотности. Возможный путь к созданию средств борьбы с гиперхолестеринемией может заключаться в поисках соединений, влияющих на биосинтез холестерина. Длинная последовательность реакций, ведущих от ацетилкофермента А к холестерину, была установлена еще в начале 1960-х годов. Одна из ключевых стадий этой последовательности -- восстановление 3-гидрокси-3-метилглутарилкофермента А (НМО-СоА) в мевалонат. Интенсивный поиск соединений, способных блокировать эту стадию, привел к открытию метаболитов грибов -- компактна и мевинолина -- эффективных ингибиторов НМО-СоА-редуктазы. Мевинолин был введен в клиническую практику как эффективное лекарственное средство, снижающее уровень холестерина в плазме крови.

Подробное исследование механизма действия этих ингибиторов позволило предположить, что их биологическая активность связана прежде всего с наличием остатка р-гидроксилактона, очевидно из-за структурного сходства этого фрагмента с естественным субстратом фермента. Это предположение было положено в основу дизайна ряда более доступных синтетических аналогов природных ингибиторов. Некоторые из них, показали очень высокую активность как гипохолестеринемические агенты. (Строго говоря, это пример далек от того идеального функционально-ориентированного молекулярного дизайна, который декларирован в начале этого раздела. Это почти традиционный синтез многочисленных аналогов природных биологически активных соединений. Однако от чисто традиционного его отличает понимание причины ингибирования фермента, учет которых, конечно, сужает поле поисков по сравнению со слепым эмпирическим перебором).

Острейшая сегодняшняя проблема -- создание средств против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Не приходится удивляться тому, что к решению этой огромной сложности проблемы прилагаются огромные усилия. Прежде всего, необходимо было получить подробную информацию о структуре компонентов вируса и биохимии его взаимодействия с клетками хозяина. Накопленные данные были далее использованы для выявления наиболее уязвимых компонентов ВИЧ как мишеней для атаки сконструированного химического агента. Внимание исследователей сосредоточилось на специфической протеазе вируса (ВИЧП), и начались энергичные поиски ингибиторов этого фермента. Как это обычно бывает, при дизайне оптимальной структуры специфических ингибиторов ВИЧП применялись существенно различные подходы. Ниже мы обсудим только один из них, который представляется особенно поучительным примером таких исследований. Мы выбрали его из-за нетривиальности подхода, приведшего к открытию группы экзотических ингибиторов ВИЧП среди (как это ни странным покажется!) производных,., фуллеренов (конкретнее бакибола).

Исследования структуры активного центра ВИЧП показали, что он имеет форму открытого с одного конца цилиндра, внутренняя поверхность которого выстлана почти исключительно остатками гидрофобных аминокислот. Внутренний диаметр пустой полости этого цилиндра оказался приблизительно равным диаметру молекулы бакибола. Выполненное группой Кеньона тщательное компьютерное моделирование показало, что С60 превосходно укладывается в активном центре ВИЧП и способен прочно связываться с ним за счет гидрофобных взаимодействий. Благодаря эффективным ван- дерваальсовым контактам между С60 и поверхностью активного сайта, большая часть последней (около 298 А2) оказывается выведенной из контактов со средой (растворителем) и тем самым практически блокированной. Установленная таким образом пространственная и химическая комплиментарность делала поиски ингибиторов ВИЧП среди производных бакибола предприятием, почти «обреченным» на успех.

Первыми прошли проверку метанофуллереновые производные, получаемые путем присоединения генерируемых in situ замещенных диарилкарбенов к одной из двойных связей бакибола с последующей обычной трансформацией карбоксамидных групп в боковых цепях. Бис-сук- циноиламидопроизводное оказалось растворимым в воде при рН > 7 и представлялось особенно многообещающим кандидатом на изучение его биологической активности. Компьютерное моделирование показало, что в комплексе этого соединения с ВИЧП фуллереновый кор помещается в центре активного сайта фермента, а гидрофильные боковые цепи ориентированы наружу, в водный раствор. Согласно экспериментальным данным, соединение обнаруживает значительную активность как конкурентный ингибитор ВИЧП. В дополнение к этому было найдено, что соединение ингибирует действие ВИЧ-1 инфицированных периферийных моноядерных клеток крови человека при отсутствии цитотоксичности по отношению к неинфицированным клеткам.

Эти результаты подтвердили справедливость исходной концепции связывания и вдохновили авторов работы на поиски возможностей улучшить ин- гибирующий эффект. Более подробный анализ модели позволил предположить, что связывание бакибола с ВИЧП можно значительно усилить, если вандерваальсовы взаимодействия дополнить солевыми (ионными) мостиками с двумя остатками аспарагина, присутствующими в каталитическом центре фермента. Таким образом, молекулу фуллеренового ингибитора следовало оснастить должным образом расположенными основными функциями, способными взаимодействовать с карбоксильными группами. Молекулярное моделирование, выполненное для 1,4-диамина, показало, что в комплексе этого соединения с ВИЧП аминогруппы расположены в тесной близости к аспартатным карбоксильным группам и, следовательно, способны образовывать желанные солевые мостики. Таким образом, в целом связывание должно значительно усилиться, т.е. препарат должен стать лучшим ингибитором ВИЧП, чем первоначально испытанное соединение.

Было бы, конечно, преждевременно даже рассуждать о возможности развития антивирусной терапии на основе производных фуллерена, хотя бы потому, что существующие методы получения самих фуллеренов, даже наиболее доступного из них -- бакибола, и их дороговизна не позволяют оперировать килограммами и тоннами этих соединений (т. е. о масштабах, нужных для практической медицины, речь пока не идет). Тем не менее, примененный в этом исследовании подход представляется чрезвычайно многообещающим, поскольку основывается на четко сформулированных и проверяемых предположениях.

Может быть, имеет смысл здесь заметить, что «чисто академические», «оторванные от жизни» исследования фуллеренов, истоки открытия которых, как помнит читатель, лежали далеко за пределами не только земных нужд, но и Солнечной системы, соприкоснулись сейчас с перспективами решения одной из острейших, глобальных проблем современной медицины. Впрочем, о значении фундаментальных научных исследований мы уже много говорили в первой главе нашей книги, да и без нас об этом сказано предостаточно (жаль только, что те, от кого зависит финансирование науки на Украине, не слышат эти доводы).

Теперь рассмотрим пример, относящийся к исследованиям нового, недавно вышедшего на сцену класса исключительно перспективных противоопухолевых агентов -- природных соединений, называемых ендииновыми антибиотиками. Но сначала следует очень коротко рассказать об одном из принципов химиотерапии опухолей, при котором мишенью терапевтического воздействия является ДНК опухолевых клеток.

Биохимически опухолевые клетки практически неотличимы от нормальных. Бесчисленные работы типа: «Уровень (чего-то) в клетках печени в норме и патологии» не привели к желанному обнаружению каких-либо биохимических систем, специфичных для опухолей и представляющих перспективную мишень для атаки подходящего агента, что позволило бы селективно воздействовать на опухоль, но не на нормальные ткани. Феноменологически единственное кардинальное отличие опухолевой ткани от нормальной -- это быстрый неконтролируемый рост. Вот на этом и строится рассматриваемая стратегия химиотерапии в онкологии.

В стационарной фазе жизни клетки ее ДНК в плотно упакованных хромосомах почти недоступна для внешних повреждающих воздействий. Напротив, при делении клеток (митозе) хромосомы развернуты, ДНК почти обнажена и в таком состоянии уязвима для повреждающего воздействия внешних факторов (химические агенты, облучение и т.п.). Это значит, что агенты, способные вызывать повреждения ДНК, особенно активны по отношению к клеткам быстро пролиферирующих тканей, а это прежде всего ткани опухолей (и ткани кроветворных органов). Химиотерапия опухолей рассматриваемого типа -- это прежде всего действие веществ, повреждающих ДНК, и потому губительных для атакованных клеток (а это, как мы только что сказали, клетки опухолей и, к сожалению, кроветворных органов). Ендииновые антибиотики также относятся к классу веществ, вызывающих повреждения ДНК. Кроме того, у них есть одна важная с точки зрения химиотерапии особенность. Дело в том, что генетический аппарат клетки устроен очень надежно и предусматривает механизмы исправления случайных повреждений. В частности, при повреждении одной из комплементарных нитей ДНК соответствующие системы ферментов способны «вырезать» из нее дефектный участок и достраивать вместо него исходный, пользуясь неповрежденной второй нитью как матрицей. В связи с этим двунитевое повреждение, осуществляемое некоторыми ендииновыми антибиотиками (см. ниже), оказывается не подлежащим репарации, т. е. необратимым.

История ендиинов началась в 1965 г. с выделения нового противоопухолевого антибиотика, неокарциностатина из культуральной жидкости Streptomyces carzinostaticus var. F-41. Первоначально этот антибиотик был охарактеризован как простой белок с молекулярной массой около 11000, первичная структура которого была вскоре установлена. Из-за своей противоопухолевой активности в сочетании с низкой токсичностью неокар- циностатин быстро нашел применение при лечении рака поджелудочной железы, рака желудка и лейкемии. Было установлено, что первичная атака неокарциностатина направлена на ДНК и вызывает разрыв ее нитей как in vivo, так и in vitro. Для его активности необходимо присутствие тиолсодержащих кофакторов (таких, как тиогликолят). Особенно удивительным был тот факт, что действие этого антибиотика вполне аналогично действию радиации -- классического ДНК повреждающего агента, генерирующего радикалы. Это было наиболее неожиданным и непонятным типом активности для антибиотика, для которого была принята структура более или менее обычного полипептида! Однако в 1979 г. было обнаружено, что никаких «чудес», связанных с белком, тут нет -- после более тщательной очистки этого белка его активность падала до нуля, а все упомянутые выше эффекты ассоциировались с низкомолекулярным небелковым соединением, хромофором неокарциностатина (NCS-Chrom), который в нативном антибиотике неко- валентно связан с белком. Роль белкового компонента -- просто защита этого (в свободном состоянии очень лабильного) соединения.

Структура активного компонента, установленная группой Эдо в 1985 г., оказалась абсолютно беспрецедентной -- присутствующую в нем бициклододекадиендииновую систему никогда раньше не обнаруживали в природе и не синтезировали в лаборатории. К счастью, несколько моноциклических сопряженных ендиинов уже были получены в ходе исследований совсем другого плана, так что экспериментальные данные по их реакционной способности послужили определенными указаниями для понимания химических механизмов биологической активности.

Более пятнадцати лет после своего открытия неокарциностатин оставался единственным известным антибиотиком с такой уникальной картиной повреждающего действия на ДНК. Однако интенсивные поиски других природных соединений с подобной активностью привели к обнаружению нескольких других антибиотиков, содержащих ендииновый фрагмент. Так, в 1987 г. почти одновременно из культуры Асtinотаdиrа vеrrисоsоsроrа, собранного в Аргентине, и из культуральной жидкости Micromonospora есhinоsроrа sр. саliсhепis (грибов из образца почвы, взятого в Техасе) были выделены антибиотики эсперамицин А1 и каликеамицин ?11, соответственно. За этим последовали дайнемицин А, продуцируемый Мicrотопоsроrа сhestinа (плесень, выращенная из образцов почвы из штата Гуджарат, Индия), и кедарцидин, продуцируемый новым штаммом актиномицетов. Разнообразие географических районов и организмов-продуцентов ясно указывает на широкую (хотя раньше и не заподозренную!) распространенность ендиинов в Природе. Смело можно предположить, что еще многие антибиотики, принадлежащие к этому семейству, ждут своего открытия.